Xây dựng quy trình nhân nhanh một số giống mía YT006, Br3280 và TQ2 bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào.

Mục đích nghiên cứu Xác định được các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp và nồng độ cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy một số giống mía YT006, Br3280 và TQ2 bằng công nghệ nuôi cấy mô

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-  -

PHẠM THỊ NGUYỆT

Tên đề tài:

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH MỘT SỐ GIỐNG MÍA YT006,

BR3280 VÀ TQ2 BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH - CNTP Khóa học : 2010 - 2014

Thái Nguyên, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

-  -

PHẠM THỊ NGUYỆT

Tên đề tài:

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN NHANH MỘT SỐ GIỐNG MÍA YT006,

BR3280 VÀ TQ2 BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoa : Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm Khóa học : 2010 – 2014

Người hướng dẫn : 1 TS Hà Thị Thúy

Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam

2 PGS.TS Ngô Xuân Bình

Khoa CNSH & CNTP - ĐH Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014

LỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS Hà Thị Thuý, phó Viện trưởng Viện Di truyền Nông nghiệp, người đã tận tình chỉ bảo

và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy PGS TS Ngô Xuân Bình đã hướng dẫn, giúp đỡ tôi thực tập và hoàn thành khoá luận

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới chị Đỗ Thị Vân đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực tập cùng toàn thể các cô chú, anh chị làm việc tại Trạm thực nghiệm Công nghệ cao Văng Giang – Hưng Yên, trực thuộc Viện Di truyền Nông Nghiệp Việt Nam

Tôi xin gửi lời tri ân và biết ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô khoa Công Nghệ Sinh Học và Công Nghệ Thực Phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã hướng dẫn giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và bạn bè, những người luôn

hỗ trợ, giúp đỡ tôi và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 02 tháng 06 năm 2014

Sinh viên

Phạm Thị Nguyệt

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng mía giai đoạn 1995 – 2010 5 Bảng 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng mía phân theo vùng năm 2010 5 Bảng 4.1 Khả năng bật chồi của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 sau 3 tuần nuôi cấy 22 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của IBA 0,1mg/l kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 (tính theo tỷ lệ %) 24 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin 0,2mg/l lên quá trình tái sinh chồi từ callus của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2 sau 3 tuần nuôi cấy 27 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 sau 3 tuần nuôi cấy 29 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành chồi của giống mía YT006, Br3280 sau 4 tuần nuôi cấy 31 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành chồi của giống mía TQ2 sau 4 tuần nuôi cấy 32 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình hình thànhchồi của giống mía YT006, Br3280 sau 4 tuần nuôi cấy 34 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình hình thành chồi của giống mía TQ2 sau 4 tuần nuôi cấy 35 Bảng 4.9 Ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của giống mía YT006 sau 2 tuần nuôi cấy 38 Bảng 4.10 Ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của giống mía Br3280 sau 2 tuần nuôi cấy 38 Bảng 4.11 Ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của giống mía TQ2 sau 2 tuần nuôi cấy 39 Bảng 4.12 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sống của giống mía YT006 trên vườn ươm 41 Bảng 4.13 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sống của giống mía Br3280 trên vườn ươm 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang Hình 4.1: Phát sinh chồi mới từ chồi đỉnh giống Br3280 và TQ2 23 Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với IBA 0,1mg/l lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non sau 4 tuần nuôi cấy (theo tỷ lệ %) 25 Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với IBA 0,1mg/l lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non sau 8 tuần nuôi cấy (theo tỷ lệ %) 25 Hình 4.4: Callus phát sinh sau 4 tuần (bên trái) và 8 tuần (bên phải) 26 Hình 4.5: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin 0,2mg/l lên quá trình tái sinh chồi từ callus sau 3 tuần nuôi cấy 27 Hình 4.6: Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi của giống mía YT006 sau 3 tuần nuôi cấy 29 Hình 4.7: Biểu đồ ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 sau 3 tuần nuôi cấy 30 Hình 4.8.: Biểu đồ ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành chồi sau 4 tuần nuôi cấy 32 Hình 4.9: Ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành chồi giống Br3280 sau 4 tuần nuôi cấy 33 Hình 4.10: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình hình thành chồi sau 4 tuần nuôi cấy 35 Hình 4.11: Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình hình thành chồi giống Br3280 sau 4 tuần nuôi cấy 36 Hình 4.12: Biểu đồ ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ sau 2 tuần nuôi cấy 39 Hình 4.13: Ảnh hưởng của NAA 0 mg/l (hình bên trái) và NAA 0,5 mg/l (hình bên phải) lên quá trình ra rễ giống TQ2 sau 2 tuần nuôi cấy 40 Hình 4.14 Mía sau 30 ngày ra cây ngoài vườn ươm trên công thức V 43

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BAP : 6- Benzyl Amino Purin

IBA : 3-Indol Butyric acid

NAA : α-Naphthyl Axetic acid

2,4 – D : 2,4-Dichlorophenoxy Axetic acid

MS : Mura Shige và Skoog

CTMT : Công thức môi trường

TB : Trung bình

CV : Coefficient of Variation (Độ tin cậy)

LSD : Least Significant Difference Test (Sai số nhỏ nhất có ý nghĩa)

Đ/C : Đối chứng

CTTN : Công thức thí nghiệm

MỤC LỤC

Trang

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây mía 3

2.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại cây mía 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh trưởng và phát triển của cây mía 3

2.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của cây mía 4

2.1.4 Tình hình sản xuất và phân bố 5

2.1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống mía bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro trên thế giới và ở Việt Nam 6

2.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng 7

2.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật 7

2.2.3 Các bước trong nhân giống in vitro 12

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

3.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu 14

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 14

3.3 Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi 14

3.3.1 Nội dung nghiên cứu 14

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 15

3.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi 20

3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 21

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng tạo chồi và hình thành mô sẹo của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 22

4.1.1 Nghiên cứu khả năng bật chồi của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 22

4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA0,1mg/l kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của Giống mía

YT006, Br3280 và TQ2 24

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất điều tiết sinh trưởng và nồng độ nước dừa đến quá trình tái sinh chồi từ callus của 3 giống mía 26

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin 0,2mg/l kết hợp với BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình tái sinh chồi từ callus của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 26

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình tái sinh chồi của 3 Giống mía YT006, Br3280 và TQ2 28

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường và chất điều tiết sinh trưởng (BAP) lên quá trình nhân nhanh chồi 31

4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường lên quá trình hình thành chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2 31

4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình hình thành chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2 33

4.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của Giống mía YT006, TQ2 và Br3280 37

4.5 Kết quả giai đoạn ngoài vườn ươm 41

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 45

Ngoài ra, các phụ phẩm của ngành công nghiệp đường còn là nguồn nguyên liệu quý báu cho các ngành công nghiệp giấy, bia, rượu, cồn Nhưng trong những năm gần

đây ngành sản xuất mía đường gặp nhiều khó khăn trong việc tìm nguồn giống mía có

năng suất và chất lượng cao, nhiều giống đã bị thoái hoá, năng suất chất lượng thấp, mức

độ dịch hại nhiều Trong khi đó, các nhà máy chế biến đường vẫn thiếu một nguồn cung

cấp nguyên liệu mía ổn định và đảm bảo về mặt giá cả và chất lượng

Mía là loại cây khỏe, có khả năng thích nghi cao với nhiều loại đất từ loại đất bãi ven sông, cho đến đất pherarít ở vùng đồi thấp cho đến đất phù sa trong đê Mía được trồng rộng rãi ở nhiều địa phương ở nước ta như các tỉnh đồng bằng sông Hồng, đồng bằng Cửu Long, Thanh Hóa, Nghệ An, Đồng Nai Nuôi cấy mô tế bào

in vitro là một công nghệ hiện đại cho phép sản xuất những cây giống sạch bệnh với

quy mô lớn, cung cấp cây giống với số lượng lớn cho sản xuất trong thời gian ngắn nhất, cây con giống hệt bố mẹ về các đặc tính di truyền, hệ số nhân cao, độ đồng

đều lớn, thể hiện tính ưu việt so với các phương pháp nhân giống truyền thống khác

Nhiều nước như Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, Pháp… đều sử dụng công nghệ cấy

mô như một mắt xích ổn định, hiệu quả kinh tế cao trong hệ thống giống của nhà máy Nuôi cấy mô còn là biện pháp an toàn trong cung cấp giống sạch bệnh, giảm chi phí thuốc hoá học, giúp cho việc nhập nội giống và trao đổi nguồn gen

Xuất phát từ những vấn đề trên, để tìm hiểu và nghiên cứu sâu hơn về kỹ

thuật nuôi cấy mô tế bào in vitro, đặc biệt là nghiên cứu việc nhân nhanh giống mía bằng công nghệ invitro góp phần cung cấp dữ liệu hoàn thiện công nghệ nhân nhanh

giống mía YT006, Br3280 và TQ2 để có được nguồn giống tốt, đảm bảo cả về số

lượng và chất lượng cho người dân, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây

dựng quy trình nhân nhanh một số giống mía YT006, Br3280 và TQ2 bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Xác định được các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp và nồng độ cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy một số giống mía YT006, Br3280 và TQ2 bằng công

nghệ nuôi cấy mô tế bào để đạt hiệu quả nhân nhanh cao nhất

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định được ảnh hưởng của hàm lượng một số chất kích thích sinh trưởng

đến khả năng tạo chồi và hình thành mô sẹo của 3 giống mía YT006, Br3280 và

- Xác định được ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến khả năng ra rễ tạo cây

hoàn chỉnh của 3 giống YT006, Br3280 và TQ2

- Xác định được giá thể thích hợp để đưa cây in vitro ra vườn ươm trước khi

đưa cây ra ngoài đồng ruộng

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

- Bước đầu hoàn thiện quy trình nuôi cấy mô 3 giống mía YT006, Br3280 và

TQ2 bằng phương pháp invitro

- Biết được phương pháp nghiên cứu một vấn đề khoa học, xử lý và phân tích

số liệu, cách trình bày một bài báo khoa học

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề xuất được quy trình nhân nhanh Giống mía YT006, Br3280 và TQ2 bằng

công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro, tạo ra số lượng lớn 3 giống mía trên góp

phần tạo cơ cấu giống phù hợp cho từng vùng nguyên liệu với tốc độ nhanh nhất, tạo nguồn vật liệu cho nghiên cứu khoa học, nuôi cấy mô làm trẻ hóa, sạch bệnh, tăng năng suất mía một cách đáng kể

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu về cây mía

2.1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại cây mía

Cây mía có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới, với hai trung tâm phát sinh là đảo Tân Ghinê và Ấn Độ, sau đó lan rộng ra toàn bộ khu vực Đông Nam Á và châu Đại Dương Sau thế kỷ XVI, mía được người châu Âu đưa sang trồng ở châu Mỹ và châu Phi…(Nguyễn Minh Tuệ, Lê Thông, 2012) [11]

Tên Việt Nam: Cây mía

Tên khoa học: Succharum officinarum

Ngành: Spermatophyta

Lớp: Monocotyledoneae

Họ Hòa thảo: Poaceae

Chi: Saccharum

Mía là thực vật nhiệt đới và cận nhiệt đới, phân bố từ 350 Bắc đến 350 Nam,

ít ở xích đạo, tập chung ở chí tuyến, phân bố theo độ cao từ đất thấp duyên hải đến

1000 - 1200m (ở xích đạo) và 700m (chí tuyến) (Trần Văn Sỏi, 1977) [7]

2.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh trưởng và phát triển của cây mía

Mía là cây thân thảo, được trồng chủ yếu ở các nước nhiệt đới, năng suất có thể đạt 200 tấn/ ha Chúng có thân to mập, chia đốt, chứa nhiều đường, cao từ 2 – 6

m Trên cây mía, thông thường phần ngọn sẽ nhạt hơn phần gốc (trong chiết nước mía) Đó là đặc điểm chung của thực vật: chất dinh dưỡng (ở đây là hàm lượng

đường) được tập trung nhiều ở phần gốc (vừa để nuôi dưỡng cây vừa để dự trữ) Đồng thời, do sự bốc hơi nước của lá mía, nên phần ngọn cây lúc nào cũng phải được cung cấp nước đầy đủ để cung cấp cho lá, gây ra hàm lượng nước trong tỉ lệ đường/nước phần ngọn sẽ nhiều hơn phần gốc, làm cho ngọn cây mía nhạt hơn

Cấu tạo cây mía gồm 3 phần:

- Thân: Gồm phần nằm dưới đất gọi là thân rễ (Rhizome) và thân cây gồm lóng và đốt Mỗi đốt thông thường có một mầm (chồi nách) hoặc nhiều hơn Ngoài

ra mỗi ngọn mía còn có một chồi đỉnh mà tại đây mô phân sinh phát triển mạnh (Artschwager,1958)

- Lá: Lá mía hình dải gồm phiến lá và bẹ lá Bên trong bẹ lá là chồi nách, ở phần ngọn chồi nách non và chồi đỉnh thường được bao bọc bởi nhiều lớp bẹ lá và

lá non nên rất sạch Trong nuôi cấy mô, chồi nách và chồi đỉnh được bóc cẩn thận

có thể cấy trực tiếp vào môi trường mà không cần khử trùng bằng hoá chất

- Rễ: rễ mía thuộc loại rễ chùm, so với những cây hoà thảo khác cây mía có

bộ rễ phát triển rất mạnh, một khóm có từ 500 – 2.000 rễ, tổng chiều dài có thể tới

100 – 500 m [1]

2.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của cây mía

Cây mía có khả năng thích ứng rộng, tận dụng tốt năng lượng ánh sáng mặt trời Cây mía có các yêu cầu cơ bản sau đây để cho năng suất, chất lượng cao:

- Nhiệt độ

Mía là loại cây nhiệt đới nên đòi hỏi điều kiện độ ẩm rất cao Nhiệt độ bình quân thích hợp cho sự sinh trưởng của cây mía là 15-26⁰C, thời kì nảy mầm mía cần nhiệt độ trên 15⁰C tốt nhất là từ 26-33⁰C Giống mía nhiệt đới sinh trưởng chậm khi nhiệt độ dưới 21⁰C và ngừng sinh trưởng khi nhiệt độ 13⁰C và dưới 5⁰C thì cây sẽ chết

- Đất trồng

Mía là loại cây công nghiệp khoẻ, dễ tính, không kén đất, vậy có thể trồng mía trên nhiều loại đất khác nhau Đất thích hợp nhất cho mía là những loại đất xốp, tầng canh tác sâu, có độ phì cao, giữ ẩm tốt và dễ thoát nước Có thể trồng mía có kết quả trên cả những nơi đất sét rất nặng cũng như trên đất than bùn, đất hoàn toàn cát, đất

chua mặn, đất đồi, khô hạn ít màu mỡ Yêu cầu tối thiểu với đất trồng là có độ sâu, độ thoáng nhất định, độ pH không vượt quá giới hạn từ 4-9, độ pH thích hợp là 5,5-7,5

2.1.4 Tình hình sản xuất và phân bố

- Diện tích trồng mía nước ta từ năm 1995 đến năm 2010 có nhiều biến động

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng mía giai đoạn 1995 – 2010 Năm Diện tích (nghìn ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lượng (nghìn tấn)

Nguồn: Niên giám thống kê Việt Nam năm 2000, 2011[11]

- Phân bố: Cây mía được trồng ở cả 7 vùng sinh thái nông nghiệp và có mặt tại 58/63 tỉnh thành phố, nhưng tập trung nhiều nhất ở 4 vùng: Đồng bằng sông Cửu Long, Bắc Trung Bộ, Duyên hải Nam Trung Bộ và Đông Nam Bộ

Bảng 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng mía phân theo vùng năm 2010

Các vùng Diện tích

(nghìn ha)

Năng suất (tạ/ha)

Sản lượng (nghìn tấn)

Nguồn: Niên giám thống kê Việt Nam năm 2011[11]

2.1.5 Tình hình nghiên cứu nhân giống mía bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro trên thế giới và ở Việt Nam

2.1.5.1 Trên thế giới

Phương pháp nuôi cấy in vitro đã được áp dụng ở nhiều quốc gia như Ấn Độ,

Cu Ba, Trung Quốc, Đài Loan, Tại Cu Ba hệ thống sản xuất và cung cấp mía giống được hình thành nhằm mục tiêu hình thành dịch vụ giống và hom giống có độ thuần và chất lượng cao, sạch sâu bệnh để bảo quản tốt tính di truyền và tăng cường thời gian khai thác giống thương phẩm Trong đó phương pháp nuôi cấy mô đóng

vai trò then chốt trong việc nhân nhanh giống cơ bản đạt tiêu chuẩn [4]

Tại Trung Quốc nhân giống mía bằng phương pháp này đã được triển khai ở một số vùng trồng mía Chỉ trong vòng 4 năm, giống Quế Đường 11 đã phủ kín hơn

32.000 ha, trong khi đó bằng phương pháp nhân truyền thống phải mất hơn 10 năm

mới có được diện tích tương tự [4]

Heinz, 1977 ở Hawaii và sau đó các nhà khoa học Đài Loan, Pháp, Cuba, Argenetina, đã thành công trong việc tái sinh mía từ callus, từ nuôi cấy túi phấn đã tạo được cây đơn bội có năng suất cao hơn trong điều kiện tự nhiên so với cây bố mẹ, hoặc phương pháp chọn dòng soma cho phép phân lập được các dòng kháng bệnh [7]

2.1.5.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, các ngành khoa học nói chung và công nghệ nuôi cấy mô tế bào

nói riêng đang tiến triển chậm hơn so với thế giới rất nhiều Việc ứng dụng những thành tựu của phương pháp nhân giống in vitro còn là một lĩnh vực khá mới mẻ, nhưng giàu tiềm năng phát triển

Phương pháp nuôi cấy in vitro trên cây mía đã được thử nghiệm ở nhiều nơi như Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam, Viện Di Truyền Nông Nghiệp Việt Nam,… Tại Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã thí nghiệm và nhân giống vô tính nhiều giống cây trồng như: mía, ngô, dứa, lúa,…có khả năng chống chịu để phục vụ cho việc trồng trọt ở địa bàn miền Bắc [7]

Tuy việc nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy mô đối với cây mía đã được tiến hành từ những năm 1970 nhưng cho đến nay thì nuôi cấy mô cây mía vẫn còn là một vấn đề mới mà các nhà chọn tạo giống đang rất quan tâm nghiên cứu [5]

Trong những năm qua nước ta đã nhập nội một số giống mía, chủ yếu là các giống mía ROC của Đài Loan Tuy nhiên do giá thành cao, hệ số nhân của các

phương pháp nhân giống truyền thống lại thấp không đủ đáp ứng đủ nhu cầu về

giống mía Gần đây một số Viện nghiên cứu đã tiến hành nhân giống mía in vitro(Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam

và Viện Nghiên cứu Mía đường)

2.2 Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng

2.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.1.1 Tính toàn năng của tế bào

Haberlandt (1902) là người đầu tiên đưa ra quan điểm về cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật chính là tình toàn năng của tế bào Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp

điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh

2.2.1.2 Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào

Sự phân hóa tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau

Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên, chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổi của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phân hóa tế bào

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào Như vậy kĩ thuật nuôi cấy

mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của

tế bào thực vật một cách định hướng dựa vào sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào trên cơ sở tính toàn năng của tế bào thực vật

2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.2.2.1 Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát triển hình thái của tế bào và mô thực vật, nó quyết định cho sự thành công của việc nuôi cấy mô tế bào thực vật tách rời Thành phần chính bao gồm:

Thành phần vật lý:

- Ánh sáng:

Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, với đa số các loài cây thời gian chiếu sáng thích hợp là từ 12- 18h/ngày Cường độ ánh sáng cũng là yếu tố quan trọng tác động đến quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, cường độ ánh sáng cao kích thích sự tạo chồi trong khi cường độ ánh sáng thấp sẽ hình thành mô sẹo Nhìn chung cường độ ánh sáng thích hợp cho nuôi cấy mô là 1000-2500 lux (Vũ Văn Vụ, 1999) [14] Chất lượng

ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát sinh hình thái của mô thực vật in vitro Ánh

sáng đỏ làm tăng chiều cao thân chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanh thì sẽ ức chế sự vươn cao của mô nhưng lại ảnh hưởng tốt tới

sự sinh trưởng của mô sẹo

đích nuôi cấy

- Nguyên tố khoáng đa lượng: bao gồm các nguyên tố N, P, K, Mg, S, Ca,…

với hàm lượng của mỗi nguyên tố thường lớn hơn 30mg/l, các chất đóng vai trò quan trọng trong việc cấu thành nên các cơ quan bộ phận của cây (Đỗ Năng Vịnh, 2005) [16]

Nitơ (N): được đưa vào môi trường ở 2 dạng: Nitrat (NO3-) và nguồn amôn (NH4+) dùng riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau

Phospho (P): là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực vật Nó tham gia vào quá trình vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, acid nucleic và tham gia vào cấu trúc màng Phospho thường được cung cấp dưới dạng đường phospho

Lưu huỳnh (S): Được sử dụng ở dạng muối SO4-2- nồng độ thấp còn dạng

SO32-và SO22- kém tác dụng thậm chí còn gây độc cho môi trường nuôi cấy

Kali (K): K+ là các cation chủ yếu trong cây Ion K+ được chuyển qua màng tế bào dễ dàng và có vai trò chính là điều hoà pH và áp suất thẩm thấu của môi trường nội bào Sự thiếu hụt K+ trong môi trường nuôi cấy mô thực vật sẽ dẫn đến tình trạng thiếu nước

Na+ và Cl-: Cần ở nồng độ thấp và được đưa vào môi trường cùng với muối khoáng khi diều chỉnh pH môi trường

- Các nguyên tố khoáng vi lượng: là các nguyên tố như: Fe, Mn, Mo, B, I, Cu, Zn,

Co… với hàm lượng mỗi nguyên tố nhỏ hơn 30g/l Chúng là thành phần của coenzim để xúc tác phản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào sống (O.L Gamborg, 1995) [20]

Sắt (Fe): Hầu hết thực vật chỉ hấp thu Fe 2+, còn Fe3+ cần được khử thành

Fe 2+ ở bề mặt rễ trước khi nó được chuyển vào trong tế bào chất Nếu thiếu Fe thì quá trình tổng hợp protein bị ngưng lại, số lượng ribosom cũng giảm mạnh Thiếu sắt ở rễ kéo theo những thay đổi hình thái, sự dài rễ giảm nhưng diện tích và số lượng long rễ tăng

Bo: Bo cần thiết cho sự hoạt động của đỉnh sinh trưởng Thiếu Bo sẽ làm giảm sự tổng hợp cytokinine, sự phân chia tế bào bị kìm hãm do có sự giảm sinh tổng hợp ARN trong nhân

Đồng (Cu): trong thực vật, đồng tồn tại dưới dạng ion hoá trị 1 và 2 Hàm

Cây in vitro chủ yếu phát triển theo phương thức dị dưỡng (hoàn toàn sử

dụng các chất dinh dưỡng của môi trường) Trong nuôi cấy nhân tạo, đường cung cấp nguồn cacbon để mô tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ, giúp tế bào

phân chia, tăng sinh khối khi tế bào chưa có khả năng quang hợp hoặc chưa đảm nhận hoàn toàn chức năng quang hợp Dạng đường hay được sử dụng gồm: Saccarose, glucose, Mantose, Fructose (Đỗ Năng Vịnh, 2005) [16] Thông dụng nhất đã được kiểm chứng là saccarose, nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%

- Vitamin:

Tế bào và mô thực vật trong điều kiện in vitro vẫn có khả năng tổng hợp

vitamin nhưng lượng tổng hợp được không đủ nên phải bổ sung thêm vitamin vào môi trường nuôi cấy Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamin (B1), acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol (Đỗ Năng Vịnh, 2005) [16]

- Các chất bổ sung

Trong môi trường nuôi cấy mô, tuỳ từng loại cây ta có thể bổ sung thêm một

số chất thích hợp để đảm bảo sự sinh trưởng của cây là tối ưu nhất

Nước dừa: được xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993; George,1996) Nước dừa được sử dụng

để kích thích phân hoá và nhân nhanh chồi ở nhiều loại cây, trong đó có mía

Dịch chiết nấm men (YE): chủ yếu chứa đường, nucleic acid, amino acid, vitamin, auxin, muối khoáng YE có tác dụng rất tốt với rễ

Dịch thuỷ phân casein (CH): được bổ sung rộng rãi trong kỹ thuật vi sinh vật, ở nuôi cấy mô và tế bào thực vật chủ yếu được sử dụng làm nguồn bổ sung amino acid

Chất làm đông đặc môi trường (agar): đây là polysaccharide của tảo biển, hoà tan với nước khi ở nhiệt độ lớn hơn 800 C thì ở dạng lỏng còn khi nhiệt độ nhỏ hơn 400C lại ở dạng rắn (gel)

- Chất điều khiển sinh trưởng:

Là thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy, giúp điều khiển

được quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào, thể hiện được tính toàn năng của

tế bào trong nuôi cấy tế bào và mô thực vật tách rời Bằng cách cung cấp các chất ở một mức độ hợp lý chúng ta có thể điều chỉnh được chiều hướng phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1999) [14] Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật

được chia thành các nhóm chính sau:

Auxin: kích thích quá trình tăng trưởng của tế bào, gây ức chế sinh trưởng của chồi bên, kích thích sự hình thành mô sẹo và rễ bất định Các loại thường dùng

là IAA, NAA, IBA, 2,4 – D

Cytokinin: kích thích sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hoá chồi, tạo chồi bất định trong nuôi cấy mô Các loại thường dùng là kinetine, BAP…

Người ta sử dụng phối hợp auxin và cytokinin với tỷ lệ và hàm lượng phù hợp để đạt mục đích mong muốn Quy luật tương đối: auxin/ cytokinin lớn thì các mẫu cấy tạo rễ bất định, tỷ lệ trung bình thì mẫu cấy tạo mô sẹo, còn tỷ lệ thấp thì tạo chồi

Gibberillin: có vai trò quan trọng trong sinh lý ngủ nghỉ của hạt, chồi, phát triển của hoa, tăng trưởng chiều dài thực vật, sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô phân sinh

- pH môi trường:

pH môi trường có ảnh hưởng tới khả năng trao đổi chất với môi trường dinh dưỡng của tế bào, mô nuôi cấy pH thích hợp cho nuôi cấy là 5,6 – 6 Nếu pH thấp môi trường không thể đông kết còn pH cao làm cho môi trường đông cứng lại ức chế trao đổi chất của mô, tế bào nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1999) [14]

2.2.2.2 Vật liệu nuôi cấy

Tùy theo đặc điểm của từng đối tượng cũng như mục đích nghiên cứu mà lựa

chọn mô nuôi cấy cho phù hợp Trong vi nhân giống in vitro người ta thường sử

dụng đỉnh chồi, mắt ngủ, vẩy củ Để tạo cây đơn bội thì ta nuôi cấy bao phấn, hạt phấn, túi noãn; mô sẹo thường được tạo từ lát cắt lá non hoặc chóp rễ…(Vũ Văn

Vụ, 1999) [14]

Nguyên tắc chung là: cây cho mẫu phải là cây khoẻ mạnh, sạch bệnh, sinh trưởng tốt Nên thu mẫu vào đầu mùa sinh trưởng và vào buổi sáng sớm (S.Narayanaswamy, 1994) [23] Cơ quan nuôi cấy được lựa chọn theo mục đích nghiên cứu, mẫu cấy càng non (chưa biệt hóa sâu) cho hiệu quả càng cao( O.L Gamborg và cs, 1995) [20]

2.2.2.3 Điều kiện vô trùng

Đây là điều kiện đầu tiên quyết định đến sự thành bại của nuôi cấy mô tế

bào Môi trường và các thiết bị sử dụng cấy phải được vô trùng tuyệt đối Nếu điều kiện, thiết bị không đảm bảo thì môi trường sẽ bị nhiễm, mô cấy sẽ bị chết

2.2.3 Các bước trong nhân giống in vitro

Ngày nay, hầu hết các nhà nghiên cứu khoa học đều thống nhất rằng thành công của nuôi cấy mô tế bào chỉ đạt được khi nó trải qua 4 bước cơ bản sau:

Bước 1: Giai đoạn vào mẫu

Đây là giai đoạn khó khăn nhất có ý nghĩa quyết định tới toàn bộ quy trình

nhân giống Giai đoạn này phải đảm bảo được các yêu cầu sau:

- Tỷ lệ chết thấp

- Tỷ lệ sống cao

- Mô cấy sinh trưởng và phát triển tốt

Một số hoá chất thường dùng HgCl2, CaOCl2, NaOCl, H2O2 Tuỳ thuộc vào từng mô thực vật mà lựa chọn nồng độ, thời gian xử lý và hoá chất thích hợp [14]

Bước 2: Nhân nhanh mẫu

Toàn bộ quá trình nuôi cấy mô tế bào xét cho cùng chỉ nhằm mục đích chính

là tạo ra hệ số nhân chồi cao nhất Ở giai đoạn này, môi trường dinh dưỡng nhân tạo

để nuôi cấy thường được đưa thêm vào chất kích thích sinh trưởng, các chất bổ sung

khác như nước dừa, nước chiết nấm men, kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sang nhằm đạt được hệ số nhân chồi cao nhất mà vẫn đảm bảo sức sống, bản chất di truyền, có thể tạo thành cây hoàn chỉnh, đạt tiêu chuẩn cây giống ở giai đoạn sau

Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Khi đạt được một kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường nhân nhanh vào môi trường tạo rễ Thường sau 2 – 3 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ Ở giai đoạn này, người ta bổ sung vào môi trường tỷ lệ auxin nhỏ vì auxin là nhóm hormone thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy

Bước 4: Thích ứng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quy trình nuôi cấy mô tế bào Cây lấy ra ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề mặt rễ để tránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc Để cây đưa ra ngoài vườn ươm được phát triển tốt cần đảm bảo một số yêu cầu sau:

+ Cây phải đảm bảo về chiều dài của rễ, lá, thân…

+ Giá thể dùng để trồng cây phải tơi, xốp, thoát nước tốt

+ Phải điều chỉnh độ ẩm, cường độ chiếu sáng, chế độ dinh dưỡng phù hợp

Quy trình nhân nhanh của các giống mía được thể hiện trong sơ đồ dưới đây:

Chọn và xử lý

mẫu

Chọn và xử lý mẫu

Tạo callus từ lát cắt lá non

Nuôi cấy chồi

đỉnh

Chọn cây ưu việt

từ giống

ưu việt

Tái sinh chồi

Kéo dài chồi Tạo cụm chồi

Ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

Đưa cây ra vườn ươm

Đưa cây ra ngoài

đồng ruộng

PHẦN 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, phạm vi nghiên cứu

Đối tượng sử dụng trong các thí nghiệm là 3 giống mía YT006, Br3280 và

TQ2 nhập nội có năng suất và trữ lượng đường cao

Mẫu dùng để nuôi cấy được trồng tại vườn ươm mía Trạm thực nghiệm Sinh học Công nghệ cao Văn Giang – Hưng Yên, thuộc Viện di truyền Nông nghiệp –

Từ Liêm – Hà Nội

Vật liệu đưa vào là chồi đỉnh, chồi nách gần ngọn và lá non của các cây mía

đang giữa thời kỳ sinh trưởng mạnh

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành

Địa điểm: Trạm thực ngiệm Sinh học Công nghệ cao, Văn Giang – Hưng

Yên; trực thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp, Đường Phạm Văn Đồng – Từ Liêm –

Hà Nội

Thời gian tiến hành: Từ 12/2013 đến 5/2014

3.3 Nội dung nghiên cứu và các chỉ tiêu theo dõi

3.3.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất điều tiết sinh

trưởng đến khả năng tạo chồi và hình thành mô sẹo của 3 giống mía YT006, Br3280

và TQ2

Nội dung 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng và

hàm lượng nước dừa đến khả năng tái sinh chồi của 3 giống mía

Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng agar và một số chất điều

tiết sinh trưởng (BAP) đến quá trình nhân nhanh chồi

Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến khả năng ra rễ

tạo cây hoàn chỉnh của 3 giống YT006, Br3280 và TQ2

Nội dung 5: Nghiên cứu giá thể thích hợp để đưa cây in vitro ra vườn ươm

trước khi đưa cây ra ngoài đồng ruộng

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.3.2.1 Phương pháp nghiên cứu nội dung 1

- Phương pháp tạo vật liệu vô trùng:

+ Chọn những cây mía còn non có sức nảy mầm và tái sinh cao

+ Ngọn mía được cắt bỏ phiến lá, bóc tất cả phần bẹ già và các lá vàng, héo rồi mang mẫu vào phòng cấy

+ Xử lý mẫu: Mẫu được lau sạch bằng cồn 70 0 trong box cấy vô trùng, bóc

bỏ lần lượt các bẹ và lá non bên ngoài đến khi sát chồi đỉnh

+ Dùng dao cắt chồi nách, chồi đỉnh và lá non theo kích thước: chồi nách: đường kính 1,0 cm x 1,0 cm; chồi đỉnh: 1,5 cm x 1,5 cm; lát cắt lá non: 1,0 cm x 1,0 cm

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu khả năng tạo chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2

- Mục đích của thí nghiệm: Nghiên cứu khả năng tạo chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2 trong môi trường MS

- Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện:

+ Nhiệt độ từ: 25-27 0C

+ pH = 5,7

+ Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/24 giờ

+ Mẫu nuôi trong môi trường: MS + đường saccharose 30g/l + agar 6g/l + nước dừa 15%

+ Mẫu cấy được làm sạch, cắt đúng kích thước quy định

+ Mẫu được cấy trong bình tam giác 250ml với số lượng: 2 chồi nách/1 bình

và 1 chồi ngọn/1 bình, mẫu cấy thẳng đứng phần mắt chồi hướng lên trên

+ Chỉ tiêu quan sát: Số chồi tạo thành sau 3 tuần, số mẫu nhiễm và số mẫu chết

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp với IBA 0,1mg/l lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2

- Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ của 2,4-D cần thiết để bổ

sung vào môi trường sao cho tỉ lệ tạo callus là lớn nhất

- Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng

- Môi trường nuôi cấy gồm: MS + đường saccharose 30g/l + agar 6g/l + nước dừa 15%, bổ sung thêm chất kích thích sinh trưởng 2,4-D với nồng độ tăng dần từ 0mg/l tới 1mg/l kết hợp với IBA 0,1mg/l

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 7

công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần cấy 3 đĩa, mỗi đĩa cấy 10 lát Thí nghiệm được bố trí như sau:

MT nền: MS + đường saccharose 30g/l + agar 6g/l + nước dừa 15% + IBA 0,1mg/l

- Chỉ tiêu quan sát: Số callus tạo thành sau 4 tuần và sau 8 tuần sau đó tính

được tỉ lệ phần trăm

3.3.2.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2

- Phương pháp tái sinh chồi của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2

Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin 0,2mg/l lên quá trình tái sinh chồi từ callus của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2

- Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ thích hợp của BAP cần

để bổ sung vào môi trường sao cho khả năng tạo chồi là lớn nhất

- Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiên tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng

- Môi trường nền gồm: MS + đường saccharose 30 g/l + agar 6 g/l + Kinetin 0,2 m/l

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với

6 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 3 bình x 10 mẫu Thí nghiệm được bố trí như sau:

6 MT nền + 2,5

- Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được sau ba tuần nuôi cấy, chất lượng chồi và

tính được hệ số nhân chồi

Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình tái sinh chồi từ callus của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2

- Mục đích của thí nghiệm: Xác định được phần trăm thể tích của nước dừa cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy sao cho môi trường là tối ưu nhất

- Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, độ ẩm, ánh sáng

- Công thức môi trường nền gồm: MS + đường saccharose 30g/l + agar 6 g/l

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

Với 5 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại cấy 3 bình x

10 mẫu Thí nghiệm được bố trí như sau:

3.3.2.3 Phương pháp nghiên cứu nội dung 3

- Phương pháp nhân nhanh in vitro

Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng agar đến quá trình hình thành chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2

- Mục đích của thí nghiệm: Xác định được hàm lượng agar cần bổ sung vào

môi trường nuôi cấy sao cho tạo được môi trường tối ưu nhất

- Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu nhất về nhiệt độ, pH, độ

ẩm, ánh sáng

- Công thức môi trường nền gồm: MS + đường saccharose 30g/l + nước dừa 15%

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn

toàn Với 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại Thí nghiệm được bố trí như sau:

Công thức Hàm lượng agar (g/l)

- Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được, chiều cao của chồi sau 4 tuần nuôi cấy

và tính được hệ số nhân chồi, số lá/số chồi

Thí nghiệm 6: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình nhân chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2

- Mục đích của thí nghiệm: Tìm được nồng độ thích hợp nhất của BAP bổ sung vào môi trường sao cho sự nhân chồi là tối ưu

- Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu nhất về nhiệt độ, pH, độ

ẩm, ánh sáng

- Công thức môi trường gồm: MS + đường saccharose 30 g/l + agar 6 g/l + nước dừa 15%

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn

Với 7 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại Thí nghiệm được bố trí như sau:

- Chỉ tiêu quan sát: Số chồi thu được sau 4 tuần nuôi cấy, chất lượng, màu sắc chồi sau đó tính được hệ số chồi

- Công thức môi trường thích hợp sẽ được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo

Nội dung 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng auxin đến khả năng ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của 3 giống YT006, Br3280 và TQ2

Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA ở các nồng độ khác nhau lên quá trình ra rễ của Giống mía YT006, TQ2 và Br3280

- Mục đích của thí nghiệm: Xác định được nồng độ thích hợp nhất của NAA

để bổ sung vào môi trường hình thành rễ sao cho số rễ và chiều dài rễ là tốt nhất

- Thí nghiệm được tiến hành trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, độ ẩm, pH, ánh sáng

- Công thức môi trường gồm: MS + đường saccharose 60 g/l + nước dừa 15%

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5

công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại Thí nghiệm được bố trí như sau:

- Mẫu cấy trong bình tam giác 250ml với số lượng 20 cây x 3 bình

- Chỉ tiêu quan sát: Số rễ/ cây, độ dài rễ, số lá/số cây sau đó tính được tỷ lệ rễ tạo thành

- Công thức môi trường thích hợp sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Nội dung 5: Nghiên cứu giá thể thích hợp để đưa cây in vitro ra vườn ươm trước khi đưa cây ra ngoài đồng ruộng

Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất nền đến tỷ lệ sống của cây trên vườn ươm

- Mục đích của thí nghiệm: Tìm ra môi trường chứa các chất nền thích hợp

để đưa cây ra vườn ươm với tỷ lệ sống là cao nhất

- Cây được tiến hành làm thí nghiệm trong điều kiện tối ưu về ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, nồng độ oxi

- Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí theo kiểu ngẫu nhiên hoàn toàn Với 5

công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại, cấy 3 cây/ khóm Thí nghiệm được bố trí như sau:

- Chỉ tiêu quan sát: Số cây/khóm, chiều cao cây, số lá/cây sau 10, 20, 30 ngày

- Công thức thích hợp cây sẽ được chọn để đưa ra trồng hàng loạt trên đồng ruộng

3.3.3 Các chỉ tiêu theo dõi

3.3.3.1 Đánh giá khả năng tạo chồi:

- Tỷ lệ mẫu chết (%) = ( ∑Số mẫu chết/∑Số mẫu đưa vào) × 100

- Tỷ lệ mẫu sống (%) = ( ∑Số mẫu sống/∑Số mẫu đưa vào) × 100

- Hệ số tạo chồi (lần) = ∑Số chồi tạo thành/∑Số mẫu đưa vào

3.3.3.2 Đánh giá khả năng tạo mô sẹo:

- Tỷ lệ tạo mô sẹo( %) =( ∑Số mô sẹo tạo thành/∑Số mẫu ban đầu) × 100

3.3.3.3 Đánh giá khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo

- Hệ số tạo chồi (lần) = ∑Số chồi thu được/∑Số mẫu đưa vào

3.3.3.4 Đánh giá hệ số nhân

- Hệ số nhân chồi (lần) = ∑Số chồi thu được/∑Số chồi cấy vào

- Chiều cao trung bình chồi (cm) = ∑Chiều cao/∑Số chồi

- Số lá trung bình/chồi (lá) = ∑Số lá/∑Số chồi

- Hình thái, chất lượng cây

3.3.3.5 Đánh giá khả năng tạo rễ

- Tỷ lệ ra rễ (%) = ( ∑Số cây ra rễ/∑Số cây cấy vào) × 100

- Số rễ trung bình/cây = ∑Số rễ tạo thành/∑Số chồi ra rễ

- Độ dài rễ trung bình (cm) = ∑Chiều dài rễ/∑Số rễ

- Số lá trung bình/cây (lá) = ∑Số lá/∑Số cây

3.3.3.6 Đánh giá khả năng sống sót khi ra vườn ươm

- Tỷ lệ sống sót (%) = ( ∑Số cây sống/∑Số cây cấy vào) × 100

- Số cây/khóm (cây)

- Chiều cao cây trung bình (cm) = ∑Chiều cao cây/∑Số cây

- Số lá trung bình/cây (lá) = ∑Số lá/∑Số cây

3.3.4 Phương pháp xử lý số liệu

- Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm thường xuyên (10 ngày/1 lần)

- Các số liệu được tính toán bằng phần mềm Excel

- Các số liệu phân tích là trung bình của các lần theo dõi

- Số liệu được xử lý bằng phân tích thống kê toán học kết hợp với phần mềm

xử lý số liệu sinh học IRRISTAT

- Các công thức so sánh được tiến hành theo phương pháp kiểm tra sự sai khác giữa các giá trị trung bình bằng phép ước lượng và sử dụng tiêu chuẩn LSD ( Least Significant Different) ở độ tin cậy 95%

- Kiểm tra độ biến động của các thí nghiệm được biểu hiện qua chỉ số tiêu chuẩn CV%

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất điều tiết sinh

trưởng đến khả năng tạo chồi và hình thành mô sẹo của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2

Nhằm xác định công thức thích hợp cho giai đoạn vào mẫu tạo nguồn vật liệu khởi đầu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu khả năng tạo chồi từ các nguồn vật liệu khác nhau của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2

4.1.1 Nghiên cứu khả năng bật chồi của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2

Đỉnh sinh trưởng và chồi nách của mía được bao bọc rất kỹ bởi nhiều lớp lá

non nên khá sạch, nếu được lấy trong điều kiện thời tiết nắng ráo thì không cần khử trùng cũng có thể nuôi cấy được với tỷ lệ nhiễm khá thấp Do vậy chúng tôi thí nghiệm với 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 trên môi trường khởi tạo để kích thích sự bật chồi mới Kết quả được trình bày trên bảng dưới:

Bảng 4.1 Khả năng bật chồi của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 sau 3

tuần nuôi cấy

Loại chồi

Số mẫu

đưa

vào (mẫu)

Số chồi tạo thành (chồi)

Tỷ lệ bật chồi

%

Số chồi tạo thành (chồi)

Tỷ lệ bật chồi

%

Số chồi tạo thành (chồi)

Tỷ lệ bật chồi

%

Hình 4.1: Phát sinh chồi mới từ chồi đỉnh giống Br3280 và TQ2 trên môi trường MS

Từ kết quả thí nghiệm trên ta thấy với cùng một số lượng mẫu, môi trường

và điều kiện nuôi cấy như nhau nhưng mỗi giống khác nhau cho khả năng tạo chồi khác nhau Trung bình từ 1 chồi đỉnh hoặc một chồi nách ta được 1 chồi mới

Giống Br3280 với CT1 (chồi đỉnh) tỷ lệ mẫu tạo chồi cao hơn ở chồi nách

đạt 133%, chồi thu được là chồi tốt (chồi khỏe và xanh) Ở CT2 (chồi nách) chất

lượng chồi không có sự thay đổi tuy nhiên tỷ lệ mẫu bật chồi đã giảm xuống còn 116%

Giống YT006 cho tỷ lệ nảy mầm của chồi nách (CT2) đạt 133% cao hơn của chồi đỉnh (CT1)

Có một vài mẫu bị nhiễm và chết nguyên nhân có thể do bình nuôi cấy, nút

đậy chưa đảm bảo sạch hoặc do thao tác làm việc Mẫu chết có thể do mẫu bị cắt

quá sâu, mẫu chưa đảm bảo

Nhìn chung khả năng tạo chồi của cả 3 giống mía là tương đối cao, tỷ lệ thành công là 98% Ta thấy cùng là mía nhưng tuỳ từng giống khác nhau ta chọn vật liệu khởi đầu khác nhau sẽ cho kết quả khác nhau sao cho tỷ lệ tạo chồi là cao nhất

4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA0,1mg/l kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau kết hợp lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2

Cùng với việc đưa mẫu vào bằng chồi đỉnh, chồi ngọn thì chúng tôi còn thí nghiệm đưa mẫu vào bằng lá non nằm sát đỉnh sinh trưởng

Môi trường MS (1962) có chứa các hàm lượng 2,4 - D khác nhau đã được sử dụng để tạo mô sẹo từ mẩu lá non Tuy nhiên, Eklof và cộng sự (1997) đã nghiên cứu và chứng minh khi bổ sung kết hợp giữa IBA và 2,4 - D thì khả năng tạo callus cao hơn hẳn Ở thí nghiệm của ông cho thấy với nồng độ của IBA vượt quá 0,2 mg/l

MT thì gây ức chế tạo callus Vì vậy chúng tôi chọn làm thí nghiệm với nồng độ IBA là 0.1 mg/l MT kết hợp với nồng độ 2,4 – D thay đổi để tìm nồng độ thích hợp cho tỷ lệ tạo callus là lớn nhất

Để tạo mô sẹo, chúng tôi lấy lá mía non cắt thành từng mẩu kích thước (0,5

cm x 0,5 cm) cấy vào môi trường cơ bản MS + đường 30g/l + nước dừa 15% + agar 6g/l + IBA 0,1mg/l + 2,4D với nồng độ thay đổi từ 0 – 1 mg/l Mẩu lá đặt trên mặt thạch và nuôi trong bóng tối Sau 12-14 ngày thấy xuất hiện những sẹo nhỏ ở mép

lá sau đó mô sẹo lan toả khắp bề mặt lá Tiếp tục theo dõi sau 4 tuần và 8 tuần nuôi cấy ta được kết quả được biểu thị ở bảng 4.1.2 và biểu đồ kèm theo dưới đây:

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của IBA 0,1mg/l kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau lên quá trình phát sinh mô sẹo ở lát cắt lá non của 3 giống mía YT006,

Sau 4 tuần nuôi cấy Sau 8 tuần nuôi cấy

Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với IBA 0,1mg/l lên quá trình phát

sinh mô sẹo ở lát cắt lá non sau 4 tuần nuôi cấy (theo tỷ lệ %)

Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với IBA 0,1mg/l lên quá trình phát

sinh mô sẹo ở lát cắt lá non sau 8 tuần nuôi cấy (theo tỷ lệ %)

Hình 4.4: Callus phát sinh trên môi trường MS bổ sung IBA 0,1mg/l kết hợp với 2,4 – D 0,4mg/l sau 4 tuần (bên trái) và 2,4 – D 0,5 mg/l sau 8 tuần (bên phải)

Từ kết quả thí nghiệm trên ta thấy sau 4 tuần nuôi cấy tỷ lệ tạo mô sẹo ở lát cắt lá non đạt cao nhất ở nồng độ 2,4 – D 0,5 mg/l của cả 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 Ở công thức đối chứng tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo rất thấp, gần như không có, ở giống YT006 là 3,3%, giống Br3280 là 6,6%, TQ2 là 6,6% Tăng dần nồng độ 2,4 – D kết hợp với IBA 0,1 mg/l thì tỷ lệ tạo callus tăng lên đáng kể so với

CT đối chứng và đạt cao nhất ở nồng độ 2,4 – D 0,5mg/l Giống YT006 cho tỷ lệ tạo callus là 60%, Br3280 là 73,3%, TQ2 là 66,7%

Tăng thời gian nuôi cấy và quan sát sau 8 tuần ta thấy có sự thay đổi rõ rệt,

số mô sẹo tăng và tỷ lệ phát sinh mô sẹo của 3 giống đạt cao nhất ở nồng độ 2,4 – D 0,4mg/l, giống YT006 đạt 60%, giống Br3280 đạt 80%, giống TQ2 đạt 73,3% Vậy khi nồng độ IBA 0,1mg/l kết hợp với 2,4 – D 0,4mg/l cho tỷ lệ tạo mô sẹo ở lát cắt lá non là cao nhất sau 8 tuần nuôi cấy

4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng một số chất điều tiết sinh trưởng và nồng độ nước dừa đến quá trình tái sinh chồi từ callus của 3 giống mía

4.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin 0,2mg/l kết hợp với BAP ở các nồng độ khác nhau lên quá trình tái sinh chồi từ callus của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2

Davenpoort và cộng sự đã chứng minh Kinetine được thí nghiệm trên các thực vật khác nhau thì đều cho kết quả chồi tái sinh tốt ở nồng độ 0,2 mg/l MT Trong thí nghiệm của chúng tôi, mô sẹo phôi hoá sau 2 lần cấy chuyển trên môi trường nhân mô sẹo đã được lựa chọn và cấy chuyển sang môi trường tái sinh: MS + đường 30g/l + 15% nước dừa + agar 6 g/l + kinetine 0,2 mg/l + nồng độ BAP thay

đổi từ 0,1 - 2,5 mg/l

Bảng 4.3: Ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin 0,2mg/l lên quá trình tái sinh chồi từ callus của Giống mía YT006, Br3280 và

TQ2 sau 3 tuần nuôi cấy

Chất lượng chồi

Số chồi thu

được

Hệ

số nhân (lần)

Số chồi thu

được

Hệ số nhân (lần)

Số chồi thu

được

Hệ

số nhân (lần)

Hình 4.5: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP ở các nồng độ khác nhau kết hợp với Kinetin

0,2mg/l lên quá trình tái sinh chồi từ callus sau 3 tuần nuôi cấy

Quan sát trong thời gian thí nghiệm thấy rằng sau 5 - 6 ngày nuôi cấy, trên các mẩu mô sẹo có các chấm xanh, sau 10 - 12 ngày xuất hiện các chồi con màu xanh nhỏ li ti Sau 3 tuần nuôi cấy tỷ lệ mô sẹo tái sinh thành các chồi hữu hiệu tăng đáng kể

Từ bảng kết quả thí nghiệm và biểu đồ ta thấy ở công thức đối chứng BAP 0mg/l thì quá trình phát sinh chồi có xảy ra nhưng với hệ số nhân thấp, chồi ngắn, màu xanh nhạt Khi tăng dần nồng độ BAP lên 0,5 – 1 mg/l thì thấy hệ số nhân chồi tăng rõ rệt ở cả 3 giống Ở nồng độ BAP 0,5mg/l hệ số nhân trung bình của giống YT006 là 3,6, Br3280 là 4,9 và TQ2 là 4,6 Ta quan sát thấy rằng ở nồng độ BAP 1mg/l cho chất lượng chồi tốt nhất, chồi mập, khoẻ, lá xanh

Tăng nồng độ BAP lên 1,5 mg/l hệ số nhân đạt cao nhất ở cả 3 giống, tuy nhiên chất lượng chồi bình thường, lá nhỏ, màu xanh nhạt Hệ số nhân của giống YT006 là 5,0, Br3280 là 6,1 và TQ2 là 5,6

Tiếp tục tăng nồng độ BAP lên 2 – 2,5 mg/l MT thì gây phản ứng ức chế ngược lại làm số chồi thu được giảm, chồi thấp, sùi to Quan sát thấy rằng khi tăng nồng độ BAP lên thì tỷ lệ tái sinh vẫn cao nhưng đồng thời lại xuất hiện cây bạch tạng và mầm nhỏ li ty tăng

Vậy công thức thích hợp nhất trong giai đoạn tái sinh chồi là nồng độ BAP 1,5 mg/l kết hợp với Kinetine 0,2 mg/l MT để đạt hệ số nhân cao nhất ở cả 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 Nếu mục đích không phải để nhân chồi mà quan tâm

đến chất lượng chồi cũng như sự phát triển của cây sau này thì ta sử dụng nồng độ

BAP 1 mg/l kết hợp với Kinetine 0,2 mg/l cho chồi đẹp và khoẻ nhất

4.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nước dừa lên quá trình tái sinh chồi của 3 Giống mía YT006, Br3280 và TQ2

Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc về Van Overbeek và cộng sự (Van Overbeek et al, 1941,1942) [27] Sau đó, tác dụng tích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được nhiều tác giả ghi nhận Nước dừa đã được nhiều tác giả xác định là rất giàu các hợp chất hữu cơ, chất khoáng và các chất kích thích sinh trưởng có tác dụng kích thích hình thành chồi Tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa từ 0 – 20% lên quá trình hình thành chồi từ callus của 3 giống mía YT006, Br3280 và TQ2 Sau

3 tuần nuôi cấy với các công thức môi trường khác nhau ta được kết quả ở bảng bên dưới

Hình 4.6: Ảnh hưởng của môi trường MS và hàm lượng nước dừa đến sự hình thành

chồi của giống mía YT006 sau 3 tuần nuôi cấy Bảng 4.4 Ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi từ callus của 3

giống mía YT006, Br3280 và TQ2 sau 3 tuần nuôi cấy

Chất lượng chồi

Số chồi thu

được

(chồi)

Hệ số nhân (lần)

Số chồi thu

được

(chồi)

Hệ số nhân (lần)

Số chồi thu

được

(chồi)

Hệ số nhân (lần)

Hình 4.7: Biểu đồ ảnh hưởng của nước dừa đến sự hình thành chồi của 3 giống mía

YT006, Br3280 và TQ2 sau 3 tuần nuôi cấy

Kết quả cho thấy khi CT 1 (Đ/C) môi trường chưa bổ sung nước dừa thì cây vẫn phát triển nhưng hệ số nhân rất thấp, cây yếu, lá hơi vàng Tăng dần nồng độ nước dừa lên 5% thì tỷ lệ tạo chồi tăng rõ rệt, giống YT006 hệ số nhân đạt 1,8, giống Br3280 là 2,3 và TQ2 đạt 2,0

Ở CT3 với nồng độ nước dừa là 10% ta thấy hệ số nhân chồi của 3 giống đều

tăng, nhưng giống TQ2 đạt hệ số nhân cao nhất là 4,0, tăng 2,5 lần so với CT đối chứng, chất lượng chồi tốt, chồi mập

Khi thí nghiệm ở nồng độ nước dừa 15% cho hệ số nhân chồi và chiều cao của chồi tốt nhất, chồi mập và khoẻ, lá dày xanh đậm ở 2 giống YT006 và Br3280 Hệ số nhân của giống YT006 là 3,9 tăng 2,4 lần so với công thức đối chứng, giống Br3280 là 4,5 tăng 2,6 lần so với CT (Đ/C) Trong khi đó hệ số nhân của TQ2 giảm nhẹ so với CT3

Tuy nhiên khi lượng nước dừa bổ sung tăng lên 20% nhưng chúng tôi thấy rằng hệ số nhân chồi không tăng nữa mà lại giảm Vì cây đã hấp thụ đủ và đạt hệ số nhân cao nhất ở hàm lượng thích hợp nên khi tăng lượng nước dừa thì cây cũng không sử dụng, vừa dư thừa, vừa tốn kém hơn về kinh tế Vậy hàm lượng thích hợp

bổ sung vào môi trường nuôi cấy để hệ số nhân chồi đạt cao nhất là nước dừa 10%

đối với giống TQ2 và 15% đối với giống YT006 và Br3280 Điều này chứng tỏ

nước dừa đã cải thiện thành phần dinh dưỡng của môi trường và đẩy mạnh quá trình

sinh trưởng và nhân nhanh chồi ở mía Đây cũng là công thức tối ưu sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của trạng thái môi trường và chất điều tiết sinh trưởng (BAP) lên quá trình nhân nhanh chồi

4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng agar đến quá trình hình thành chồi của Giống mía YT006, Br3280 và TQ2

Năm 1882 nhà vi sinh vật học nổi tiếng người Đức Robert Koch đã có ý tưởng với việc nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường đặc Một năm sau Walther Hess

là một cộng sự của Robert Koch đã thành công trong việc sử dụng agar làm đông môi trường nuôi cấy Đặc điểm nổi bật là agar không những đông đặc môi trường ở nhiệt độ <400C mà còn không bị vi sinh vật phân huỷ làm biến tính

Tiếp tục hoàn thiện xây dựng quy trình nhân nhanh 3 giống mía YT006, Br3280, TQ2 chúng tôi làm thí nghiệm xác định hàm lượng agar cần bổ sung vào môi trường nuôi cấy là tối ưu nhất Kết quả thu được ở bảng dưới đây:

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của hàm lượng agar đến quá trình hình thành chồi của

giống mía YT006, Br3280 sau 4 tuần nuôi cấy

MT Trạng thái

môi trường

Hàm lượng agar (g/l)

Số mẫu cấy (mẫu)

Số chồi thu

được

(chồi)

Hệ số nhân (lần)

Chiều cao chồi

TB (cm)

Số chồi thu

được

(chồi)

Hệ số nhân (lần)

Chiều cao chồi

TB (cm)

Chất lượng chồi

1 Môi trường

Nhỏ, xanh

2 Môi trường

bán lỏng 3 90 224 2,5 7,27 278 3,1 7,46

Nhỏ, vàng

3 Môi trường

Mập, xanh

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của hàm lượng agar đến quá trình hình thành chồi của

giống mía TQ2 sau 4 tuần nuôi cấy

MT Trạng thái

môi trường

Hàm lượng agar (g/l)

Số mẫu cấy (mẫu)

TQ2

Số chồi thu được (chồi)

Hệ số nhân (lần)

Chiều cao chồi TB (cm)

Chất lượng chồi

Hình 4.8.: Biểu đồ ảnh hưởng của hàm lượng agar đến quá trình hình thành chồi sau

4 tuần nuôi cấy