Công nghệ sinh học ứng dụng trong Thú Y và Y học potx

Khi kháng nguyên xâm nhập, lập thức sản sinh tín hiệu báo động, kích thích hệ thống tế bào sinh kháng thể sản xuất một protein đặc hiệu, kết dính, trung hoà kháng nguyên.. Vào năm 19

Công nghệ sinh học ứng dụng

trong Thú Y và Y học

PGS.TS Dương thanh Liêm

Bộ môn Dinh dưỡng Khoa Chăn nuôi – Thú y Trường Đại học Nông Lâm

CÔNG NGHỆ SINH HỌC TRONG MIỄN DỊCH HỌC:

1 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG PHỤC VỤ CHO XÉT NGHIỆM VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH

2 SẢN XUẤT VACCINE TÁI TỔ HỢP PHỤC VỤ CHO CÔNG TÁC PHÒNG CHỐNG BỆNH TẬT

Khái niệm miễn dịch

1 Miễn dịch chủ động

Miễn dịch chủ động là phản ứng bảo vệ của cơ thể khi có sự xâm nhập của protein kháng nguyên lạ:

- Một cách tự nhiên do sự xâm nhập của vi khuẩn

hoặc virus vào cơ thể.

- Một cách không tự nhiên thông qua chủng ngừa

vaccin từ vi khuẩn hay virus đã nhược độc.

Khi kháng nguyên xâm nhập,

lập thức sản sinh tín hiệu báo động,

kích thích hệ thống tế bào sinh kháng

thể sản xuất một protein đặc hiệu, kết

dính, trung hoà kháng nguyên Protein

thực hiện việc này gọi là kháng thể.

Bảo vệ cơ thể bằng cách đưa trực tiếp kháng thể

hay tế bào miễn dịch (tế bào kháng thể) vào cơ thể

Có hai phương cách đưa kháng thể vào cơ thể:

2 Miễn dịch bị động

Thai nhi nhận

kháng thể từ mẹ qua sữa đầu.

 Thông qua việc

tiêm huyết thanh có chứa kháng thể để điều trị bệnh.

Thời gia tồn tại kháng thể ngắn

Các giai đoạn phát triển chính của miễn dịch ứng dụng trong phòng chống bệnh.

Thời kỳ sơ khai:

người bất tử bởi dịch đó.

mùa Pasteur là người có công lớn khai phá.

Những bước đi đầu tiên trong thực nghiệm:

tế bào là bước tiến lớn trong quan sát.

Một thế kỷ trước, Paul Ehrlich (1854 – 1915) ,

Một nhà hóa học người Phần Lan đã tạo một bước đột phá trong nghiên cứu kháng thể Ông cho rằng phân tử kháng thể được xem như là một “viên đạn phù thủy - magic bullet” , có thể định hướng và tiêu diệt các mầm bệnh ở người Với phát minh quan trọng này, ông đã được tặng giãi Nobel Y học

vào năm 1908.

Vào năm 1975, Kohler và Milstein là những người đầu tiên dung hợp tế bào lympho để sản sinh một dòng tế bào có khả năng “bất tử” và sản sinh kháng thể đặc hiệu Hai nhà khoa học nói trên

được tặng giải Nobel Y học vào năm 1984 cho phát

Gía trị của Hybridoma chỉ được khẵn định vào năm 1987 khi kháng thể đơn dòng được sản xuất thành công dùng trong chẩn đoán lâm sàng rất chính xác.

César Milstein

Nobel Y học (1984): Niels Jerne &

Georges Kohler

1 Sản xuất kháng thể đa dòng

Phân tử kháng nguyên tinh chế

có thể có nhiều protein kháng nguyên

Gây miễn dịch

1

1

2 3

Lượng Ig

trong serum

Tuần lễ ->

0 Gây nhiểm

(Hiệu giá HI)

HI chứa kháng thể

Đa dòng

Một kháng nguyên thường chứa nhiều yếu tố

quyết định kháng nguyên (epitope)

Để đáp ứng với kháng nguyên, các lymphocyte cũng sản sinh và tiết nhiều phân tử kháng thể tương ứng có thể kết dính kháng nguyên

Mặt lợi của kháng thể đa dòng là sẽ có nhiều kháng thể tấn công kháng nguyên cùng một lúc

Ag

Mặt bất lợi của kháng thể

đa dòng là sự kém đặc hiệu, một vài kháng nguyên khác nhau có thể có cùng epitope,

từ đó có thể gây sai lệch khi kết luận các serotyp trong chẩn đoán huyết thanh học.

Vấn đề đặt ra từ trước năm 1970:

1 Việc phân biệt giữa các dòng tế bào B, T khác nhau hầu như

không thể thực hiện vì chúng có hơn 95% phân tử bề mặt tế bào giống nhau Kháng thể đa dòng không đặc hiệu, không thể phát hiện được.

2 Không thể chọn lọc được các phân tử kháng thể đặc hiệu cho

một serotyp.

Giải pháp ngày nay:

1 Làm “bất tử” các tế bào sản xuất kháng thể bằng phương pháp

dung hợp tế bào lympho.

2 Chọn lọc dòng tế bào chuyên sản xuất kháng thể đơn dòng

mong muốn.

Kết quả:

Kết quả là giải Nobel Y học dành cho hai nhà khoa học: George

Kohler và Cesar Milstein.

2 Sản xuất kháng thể đơn dòng

để chẩn đoán các serotyp của vi trùng

Kháng nguyên tinh chế

Gây miễn dịch

Cô lập lách chứa các tế bào tạo kháng thể

Mỗi tế bào có khả năng sinh sản một loại kháng thể khác nhau Lách

Lựa chọn một trong

số những tế bào này để nuôi cấy thứ cấp nhân lên, tạo sự đồng nhất TB

… và tạo quần thể tế bào đơn dòng cùng nguồn gốc

Tất cả các tế bào đều tạo một loại kháng thể duy nhất để chống lại một epitope duy nhất

KN

Tính đặc hiệu cao

…nhưng độ nhạy trong nhận biết

và tiêu diệt kháng nguyên kém,

đặc biệt là với một lượng nhỏ

kháng nguyên.

Hybridoma

TẾ BÀO HYBRIDOMA

Sơ đồ qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng

“Monoclonal

Antibodies”

Figure 18.2

http://tigger.uic.edu/depts/mcmi/courses/mim326/ppt/11-3-06MIM326.ppt

Dòng tế bào ung thư Myeloma thương mại hóa

không có khả năng sử dụng chất: Hypoxanthine,

làm nguồn nguyên liệu để tổng hợp nucleic acid

và sẽ bị chết khi nuôi cấy trong môi trường HAT.

Chỉ có các tế bào B đã được dung hợp với dòng tế bào Myeloma mới có khả năng sống sót trong

môi trường HAT

Chọn lọc các dòng tế bào lai

Phương pháp dùng môi trường HAT

Ứng dụng của kháng thể đơn dòng

1 Sản xuất các bộ kit để chẩn đoán bệnh, có

thể phát hiện được ở hàm lượng rất thấp,

nhanh chóng, có thể áp dụng để kiểm tra sàn lọc rất tốt Tuy nhiên để cho chính xác hơn cần kết hợp với phương pháp hóa học khác,

ví dụ như sắc ký khối phổ MS

2 Sản xuất các kháng thể đặc hiệu để tiêu diệt

chính xác tế bào ung thư mà không nhầm

lẫn với tế bào bình thường của cơ thể.

1 Phủ phiến với kháng thể đơn

5 Thêm kháng nguyên tương

ứng Kháng nguyên này sẽ liên kết với Mab.

6 Rửa để loại các liên kết kháng

nguyên – kháng thể không đặc hiệu.

Phương pháp ELISA1 (Phủ phiến)

ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay

7 Thêm cộng hợp kháng Mab gắn chất

phát hiện (1 đầu kết hợp với kháng nguyên, một đầu gắn chất phát hiện

Phương pháp ELISA2 (Phủ phiến)

ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay 2

8 Rửa

9 Thêm cơ chất

Đo mật độ quang và kết luận

EIA – ELISA-kit

Những giếng có màu vàng dương tính (màu lợt hàm lượng

tồn dư thấp, màu đậm hàm lượng tồn dư cao)

Những giếng không màu, âm tính (không có tồn dư -agonist)

Kết quả kiểm tra EIA

Xác định Clenbuterol bằng kháng thể miễn dịch

enzyme EIA - enzyme immunoassay)

1 Ủ các hạt nam

châm với kháng thể

2 Rửa để loại các

liên kết không đặc hiệu

3 Kháng thể và các tế bào bám vào sẽ được giữ lại dưới tác dụng của từ trường.

4.Sau khi loại bỏ tác dụng của từ trường, các tế bào

sẽ được giải phóng.

T T

T B

T

ừ tr ư ờ n g

T ừt r ư ờ n g

Gắn kháng thể lên hạt nam châm siêu nhỏ, ly trích bởi từ trường

Tế bào lai Hybridoma đầu tiên

Milestone: Köhler, G and Milstein,

- Một trong số những tế bào

được nuôi cấy có khả năng ly giải SRBC.

- Các khuẩn lạc tế bào lai mọc

được trên môi trường agar mềm Một vài dạng có khả năng

ly giải SRBC.

- Các khuẩn lạc được thu nhận

và cấy chuyền Cuối cùng thu nhận được dòng tế bào lai Một

số chúng có khả năng tạo kháng thể đơn dòng kháng SRBC.

3 Các ứng dụng của kháng thể đơn dòng:

Đo hàm lượng protein và dư lượng thuốc trong huyết tương

Phân loại mô và định nhóm máu.

Xác định CD để phát hiện và chữa trị bệnh bạch cầu.

Chẩn đoán ung thư.

Định danh các tế bào có chức năng đặt biệt tham gia vào hệ thống miễn dịch.

Định tính và định lượng hormone.

Đặc hiệu cho nhiều epitop Đặc hiệu với 1 epitop

Cĩ thể thay đổi ở những lần sản xuất khác nhau.

Hầu như khơng biến đổi nhiều

Hỗn hợp của nhiều kháng thể đơn dòng =

Oligoclonal antibody

So sánh giữa sản xuất kháng thể đơn dịng và kháng thể đ dịng

4 Một số thành tựu mới trong

Cấu trúc cơ bản của kháng thể.

Light chain: Chuổi nhẹ

Heavy chain: Chuổi nặng Variable region: Vùng có thể biến đổi

Constant region: Vùng không biến đổi.

Hinge: Bản lề; Disulphide bond: Cầu lưu huỳnh

Cấu trúc cơ bản

Cấu trúc từng phần

Nghiên cứu cấu trúc kháng thể và nhân hóa kháng thể

Carboxyl đọan cuối

Chuổi nặng Cầu disulfide

Chuổi nhẹ Vùng bản lề

Amino acid đọan cuối (Fab hoặc paratope)

Trong phân tử Immuno Globulin (Ig) có Chứa đoạn họat động (Fab) có khả năng kết nối với kháng nguyên (antigen) để

Vô hiệu hóa kháng nguyên.

Sử dụng enzyme

Papain và Pepsin

cắt kháng thể ra từng đoạn rồi để

nghiên cứu đặc tính cấu trúc của chúng

Cấu trúc phân tử kháng thể IgG

Fab: Fragment Antigen-Binding Fc: Fragment Crystallizable

Fv: Fragment Variable scFv: Single-chain Fragment variable

Cấu trúc và chức năng bắt giữ kháng nguyên của các “Fab” IgG kháng thể

VHH: Variable heavy chain antibody fragment ARP: A ramosus peroxidase

Mô hình cấu trúc của đoạn kháng thể Fab

Mô hình bắt giữ kháng nguyên của Fab

http://www.biology.arizona.edu/immunology/tutorials/antibody/prob_set/02t.htm

Trong hình gồm có:

Kháng nguyên màu xanh lá cây ; Kháng thể màu đỏ Xám:

Hình 1 thiếu đọan kháng thể Fab nên không gắn được với antigen.

Hình 2 có đoạn Kháng thể Fab nên gắn được với antigen (màu

đỏ tía)

Kháng thể tái tổ hợp

Tế bào lai bất tử

Sản xuất kháng thể từ đối tượng

không phải là động vật

5 Sản xuất kháng thể đơn dòng Một số Mab trên thị trường

Monoclonal antibody (Mab)

5.1 Sử dụng Mab để tạo kit chẩn đóan

Chẩn đóan nhanh bằng kit Elisa

(Prion protein EIA kit)

Kháng thể đơn dòng̉

PrP

Gắn PrP lên kháng thể đơn dòng

FAb mang màu vàng

Tinh chế với PrP mang màu vàng

Gắn chất mang màu vào PrP.

Rữa sạch những Chất mang màu tự do.

Các chất liệu cần dùng

Trong phản ứng EIA

Các bước thực hiện phản ứng ELISA

chẩn đoán bệnh bò điên

Một số Kit Elisa dùng kiểm tra PrP có bán trên thị trường

Prion Protein EIA Kit <5897 5 1 >

· Prion Protein Monoclonal Antibody (3O8) <1897 5 0 >

· Prion Protein Monoclonal Antibody (8G8) <1897 6 0 >

· Prion Protein Monoclonal Antibody (SAF-32) <1897 2 0 >

· Prion Protein Monoclonal Antibody (SAF-53) <1897 3 0 >

· Prion Protein Monoclonal Antibody (SAF-54) <1897 4 0 >

· Prion Protein Monoclonal Antibody (SAF-61) <1897 5 5 >

· Prion Protein Monoclonal Antibody (SAF-70) <1897 7 0 >

· Prion Protein Monoclonal Antibody (SAF-83) <1897 6 5 >

· Prion Protein Monoclonal Antibody (SAF-84) <1897 7 5 >

<sales@caymanchem.com> for a quote

This product is also available in bulk quantities Please contact our

Mab dùng trong điều trị các tế bào ung thư ác tính

Cetuximab (Erbitux®)

II Tăng cường sức đề kháng cho cơ thể động vật Sản xuất kháng thể từ lòng đỏ trứng gà

• Cải tạo thụ quan (cơ quan cảm thụ).

• Sản xuất kháng thể chống bệnh do E.coli

(Bệnh tiêu chảy trên heo do E Coli)

• Nghiên cứu sản xuất kháng thể chống

bệnh đường ruột do virus (rotavirus) trên heo.

Sản xuất trứng gà thực phẩm chức năng, ăn để

phòng bệnh, ăn để chữa bệnh ở Nhật Bản

Phản ứng giữa kháng nguyên và kháng thể

Sản xuất trứng gà giàu kháng thể để phòng chống

bệnh tật cho người và động vật

Trứng gà giàu kháng thể để phòng và chống bệnh do vi khuẩn và virus gây bệnh

Vi khuẩn gây bệnh tấn công tế bào niêm mạc ruột

và gây mất nhiều nước, tiêu chảy, giảm hấp thu.

Vi khuẩn bệnh bị kháng thể đặc hiệu trong

lòng đỏ kết dính và làm vô hoạt chúng

Virus gây bệnh tấn công niêm mạc ruột

là cho tế bào niêm mạc vỡ tung, gây tiêu chảy

Ăn lòng đỏ trứng có kháng thể đặc hiệu sẽ làm

vô hoạt các virus gây bệnh đường ruột

Qui trình sản xuất trứng gà giàu kháng thể

SPF

Trứng gà giàu kháng thể chống bệnh được sản xuất ở Nhật Bản bởi Công ty GHEN

http://www.ghen.co.jp/en/ingredients/index.html

QUY TRÌNH SẢN XUA ÁT PROTIMAX ®

1 Gà mái đẻ SPF (Special Pathogenic

Free) được chủng nhiều loại vaccine

the quy trình nghiêm ngặt

2 Trứng được thu hoạch và

kiểm tra lượng kháng thể bằng phương pháp ELISA

3 Trứng được kiểm tra và phân loại

theo các tiêu chuẩn chế biến Sau khi đập vỡ , trứng được xử lý

bằng phương pháp Pasteur, và sấy khô đểû cho ra một dạng bột mịn, và được trộn với các thành phần khác để tạo ra sản phẩm PROTIMAX

Protimax ®

Bổ sung vào khẩu phần

Cung cấp cho heo con

khả năng chống lại các

vi khuẩn gây bệnh và

đồng thời phát triễn hệ

miễn dịch thụ động

trong thời gian dài

C ác loại kháng thể đặc hiệu được

E Coli) E.coli 263 E.coli J5

Cơ chế tác động của Protimax

• PROTIMAX còn có khả năng kết dính các vi khuẩn gây bệnh

và virus, không cho chúng bám vào thành ruột và nhân lên

trong đường tiêu hóa của heo con, nhờ vậy giúp cho heo con tránh được các bệnh nhiểm

trùng gây tiêu chảy

IgG

IgG

Những kết quả thử nghiệm Protimax ở Mỹ

1.44 1.39

Chỉ số tiêu tốn thức ăn, F/G

13.64% 1.35

1.19

Lượng thức ăn bình quân,

/heo/ngày (lb.)

55 48.4

Tổng lượng thức ăn./heo (lb.)

9.46% 0.94

0.86

Bình quân tăng trọng/ ngày/ heo,

(lb.)

40.7 40.7

Số ngày nuôi

38.2 34.9

Tổng tăng trọng/ heo, (lb.).

51.7 47.4

Trọng lượng bình quân đầu ra(,lb.)

13.5 12.5

Trọng lượng bình quân đầu

vào,( lb.)

-29.92% 1.46

2.09

%Tỷ lệ tử vong

45 63

Số heo chết

3031 2955

Số heo đầu ra

3076 3018

Số heo đầu vào

% Khác biệt Protimax

Đối chứng

10.39% 1.38

1.54 Chỉ số tiêu tốn T Ă , F/G

-9.40% 1.06

1.17

Lượng thức ăn bình

quân,./heo/ngày (lb.)

46.9 53.1

Tổng thức ăn,/heo (lb.)

1.31% 0.77

0.76 Tăng trọng/ ngày/con,lb.

44.3 45.4

Số ngày nuôi

34.1 34.6

Tổng tăng trọng/ heo,(lb.)

45.1 45.6

P bình quân đầu ra, (lb.)

11 11

P bình quân đầu vào, (lb.)

-45.50% 4.72

8.66

%Tỷ lệ tử vong

72 131

Số heo chết

1455 1382

Số heo đầu ra

1527 1513

Số heo đầu vào

% Khác biệt Protimax

Đối chứng Hiệu quả sử dụng Protimax trên heo ở miền Nam Carolina.

Công nghệ sinh học trong sản xuất

vaccine phòng chống bệnh tật

1 Sản xuất vaccin truyền thống

- Vaccin sống

- Vaccine chết

2 Sản xuất vaccin tái tổ hợp (còn rất mới)

- Vaccin đơn dòng phòng một loại virus 1 serotype

- Vaccin đa dòng phòng virus nhiều serotype

Các kiểu vaccin đã sản xuất,

sử dụng hiện tại và tương lai

1 Toàn bộ mầm bệnh được giết chết rồi đem chủng ngừa bệnh

do mầm bệnh đó gây ra (vaccin chết).

2 Mầm bệnh sống đã bị làm suy yếu hoặc nhược độc không có

khả năng gây bệnh làm vaccin để chủng ngừa bệnh do mầm bệnh đó gây ra.

3 Vaccin á đơn vị protein (Protein Subunit vaccines):

→ Protein của tổ chức tự nhiên được tinh chế làm vaccin

→ Antigen protein tái tổ hợp làm vaccin

(Recombinant protein antigens).

→ Peptide có kích cở hóa học nhỏ làm vaccin.

4 Vaccin là acid nucleic (Nucleic acid vaccines).

Hệ thống thùng lên men sản xuất vaccin

Swedish company SBL Vaccin AB brought on-line

http://www.pharmaceutical-technology.com/projects/sbl_vaccin/

Vaccin á đơn vị tái tổ hợp

so với vaccin tự nhiên.

Những lợi thế của vaccin tái tổ hợp:

 Sản xuất với giá rẻ và ổn định hơn vaccin từ mầm bệnh được làm suy yếu như vi khuẩn, virus…

 Qui trình thực hiện vaccin tự nhiên là sự phân lập

protein antigen tự nhiên bằng phương pháp siêu lọc

chiết xuất ra, có thể có nhiều dạng antigen trong đó

 Antigen protein tự nhiên thường không tinh khiết hơn antigen là một protein tái tổ hợp

Vaccin á đơn vị tái tổ hợp

so với vaccin tự nhiên (tt).

Sự bất lợi của vaccin tái tổ hợp:

 Phân bố ký sinh gây bệnh có thể có nhiều hình thái Vaccin tái tổ hợp chỉ chống lại một số dòng

 Vaccin tái tổ hợp thường đơn dòng nên không thể kích thích sinh ra nhiều loại kháng thể để tập trung tiêu diệt mầm bệnh đa type kháng thể

ví dụ như carbohydrate kích thích sinh kháng thể không thực hiện được trong qui trình sản xuất vaccin tái tổ hợp chỉ cho ra protein kháng nguyên

Vaccin Peptide tổng hợp.

 Là sản phẩm tổng hợp hóa học

 Ổn định với những biến động nhiệt độ

 Không gây bệnh truyền nhiểm khi chủng ngừa so

với sử dụng vaccin nhược độc đôi khi xảy ra

 Chủ tâm sử dụng những peptide có khả năng kích

thích trực tiếp sự đáp ứng miễn dịch nên chỉ cần lượng nhỏ vaccin, nhưng hoạt tính mạnh