HÓA PHÂN TÍCH QUANG PHỔ UV –VIS

Phổ hấp thụ... MỤC TIÊU HỌC TẬP Sau khi học, sinh viên sẽ trình bày được: Phạm vi phổ UV Vis Các yếu tố tham gia vào sự hấp thụ Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp thụ Cấu hình của máy qu

1

QUANG PHỔ UV –VIS

Bộ môn Phân tích – Kiểm nghiệm

Khoa Dược - Đại học Y Dược Tp Hồ chí Minh

10/ 2016

Phổ hấp thụ

MỤC TIÊU HỌC TẬP Sau khi học, sinh viên sẽ trình bày được:

Phạm vi phổ UV Vis Các yếu tố tham gia vào sự hấp thụ Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hấp thụ Cấu hình của máy quang phổ tử ngoại Ứng dụng phép đo quang phổ tử ngoại

7

Bức xạ vùng UV- Vis chia thành 3 vùng nhỏ

-Vùng tử ngoại chân không (UV xa) = 50 – 200 nm ít được

sử dụng vì:

+ có năng lượng khá lớn, khi va chạm gây vỡ liên kết /phân tử

+ bị hấp thụ̣̣̣ mạnh bởi hầu hết dung môi và oxy /không khí + bị hấp thụ̣̣̣ bởi thạch anh (dùng làm cốc đo)

-Vùng tử ngoại gần (UV gần):  = 200 - 375 nm

-Vùng khả kiến (Vis):  = 375 - 800 nm

UV Radiation

9

adjacent thymine bases bond with each other, instead of across the "ladder" This "thymine dimer" makes a bulge, and the distorted DNA molecule does not function properly

2 CHUYỂN MỨC NĂNG LƯỢNG

Sự kích thích điện tử từ orbital phân tử đang chiếm đóng (orbital liên kết) sang orbital phản liên kết.

Chuyển mức năng lượng

11

Điện tử :

+ liên kết đơn trong phân tử

+  →  * cần E lớn (<150 nm: UV chân

không)

+ hidrocarbon no: dùng làm dung môi

n-hexan, nước

- Điện tử :

+ tham gia liên kết đôi, ba

+  →  * cần E nhỏ (  UV-Vis gần)

+ phân tử có nối đôi, nối đôi liên hợp

- Điện tử tự do n (không liên kết):

+ n có ở các dị tố O, S, N, X

+ n * cần E thấp hơn   *

+ các phân tử có cấu trúc liên hợp có nhiều

điện tử và  và n tham gia n*, *

3 CÁC YẾU TỐ THAM GIA VÀO SỰ HẤP THỤ̣̣̣̣̣̣̣̣, CÁC HIỆU ỨNG

3.1 MÀU SẮC

Có tầm quan trọng riêng biệt cho 1 chất

Màu của 1 chất liên quan với sự hấp thụ̣̣̣̣̣ và phản xạ của 1 chất

Mắt người nhìn thấy màu bổ trợ cho màu hấp thụ̣̣̣ htt

p:/ /st ain sfil e.i nf o/ St ain sFi le/ dy es/ dy ec olo r.h

tm

H N O

O indigo

Color Wheel

( R O Y G BI V)

Complementary colors lie across the diameter on the color

compound seen by the eye is the complement of the color of

Compound Absorbed Wavelength of Light

Absorbed

Green

700 nm

Blue-green

400 nm

Approximate Wavelength of Light

Absorbed

Green

500 nm

17

OH N

N

NO2

Para Red

N N

NH 2

H 2 N

Fast Brown

N N

O 3 S

HO

SO 3 Sunset Yellow (Food Yellow 3)

• These materials are some of the more familiar colors of our

“environment”

The colors of M&M’s

Bright Blue

Common Food Uses

Beverages, dairy products, powders, jellies, confections,

condiments, icing

Royal Blue

Common Food Uses

Baked goods, cereals, snack foods, ice-cream, confections, cherries

Orange-red

Common Food Uses

Gelatins, puddings, dairy products, confections, beverages,

condiments

Lemon-yellow

Common Food Uses

Custards, beverages, ice-cream, confections, preserves, cereals

Orange

Common Food Uses

Cereals, baked goods, snack foods, ice-cream, beverages,

dessert powders, confections

19

3 2 NHÓM MANG MÀU (CHROMOPHORE):

là nhóm chức chưa no, liên kết đồng hóa trị trong phân tử gây

ra sự hấp thụ̣̣̣ bức xạ trong vùng UV- Vis ( > 200 nm)

- CHROMOPHORE chuyển dịch n  * thường có   300 nm

- CHROMOPHORE chuyển dịch   * thường có   190 nm

3.3 NHÓM TRỢ MÀU (auxochrome)

http://stainsfile.info/StainsFile/dyes/dyecolor.htm

là những nhóm thế no gắn vào nhóm

mang màu làm thay đổi cả bước sóng

lẫn cường độ̣ của dải hấp thụ̣̣̣ cực đại

Thường làm chuyển dịch max về phía

dài hơn

Ví dụ: -OH, -NH2, CH3, NO2, Cl, NHR,

-NR2, -SO3H, (làm tính hấp thụ̣̣̣̣̣ tăng,

làm giảm năng lượng cần hấp thụ̣̣̣̣̣)

23

3.4 CÁC HIỆU ỨNG VÀ SỰ CHUYỂN DỊCH

- Sự chuyển dịch sang đỏ (bathocromic) = red shift

- Sự chuyển dịch sang xanh (hypsocromic) = blue shift

- Hiệu ứng tăng cường độ (hypercromic effect)

- Hiệu ứng giảm cường độ (hypocromic effect)

Schematic describing various transitions (and an image with the corresponding visible spectral lines)

of atomic hydrogen

4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN ĐỘ HẤP THỤ̣̣̣̣̣

4.1 CẤU TRÚC PHÂN TỬ: (xem bài đại cương quang phổ)

PHỔ UV -VIS

4.2.1 DUNG MÔI

- Dm cũng có thể hấp thụ̣̣̣ bức xạ̣ UV-Vis

Khi khảo sát phải chú thích dm được dùng để hòa tan mẫu

- Độ̣ phân cực của dm có thể làm biến đổi môi trường điện tử của nhóm hấp thụ̣̣̣ mang màu Thông thường, độ̣ lớn của sự̣ chuyển dịch có thể liên quan với độ̣ phân cực của dm

Ví dụ: độ̣ hấp thụ̣̣̣ của aceton có thể thay đổi từ 259 nm – 279

nm tuỳ vào dm được sử dụng

- Để phân tích so sánh, nên sử dụng một dm duy nhất cho tất cả các lần đo

27

Độ dài sóng Các dung môi hấp thụ

180-195 nm Acid sulphuric (96%), nước, acetonitril, cyclohexan, isooctan 200-210 nm cyclopentan, n-hexan, glycerol, methanol, ethanol

210-220 nm n-butyl alcohol, isopropyl alcohol, cyclohexan, ethyl ether,

1,4-dioxan 245-260 nm chloroform, ethyl acetat, methyl format

265-275 nm carbon tetrachlorid, dimethyl sulphoxid/formamid, acetic acid 280-290 nm benzen, toluen, m-xylen

300-400 nm pyridine, aceton, carbon disulfit Dung kém phân cực càng môi càng

tốt (nhưng thường ít sử dụng)

Phổ của Phenol / octane và / Ethanol

29

4.2.3 pH

Ở các gía trị pH khác nhau thì cấu trúc của vật chất (như là các chỉ thị pH) có thể thay đổi theo pH nên sẽ hấp thụ̣̣̣ cực đại ở bước sóng khác nhau

Nếu đang khảo sát một hoạt chất mà pH ảnh hưởng đến phổ của một mẫu đo thì nên dùng hệ đệm để làm ổn định pH môi trường rồi mới khảo sát độ hấp thụ̣̣̣ của hoạt chất này

Chú ý : hầu hết các hệ đệm hấp thụ̣̣̣ có ý nghĩa và có thể ảnh hưởng đến độ dài sóng cực đại đối với các phép đo Do vậy, phải làm song song mẫu trắng

N N

O 3 S N

CH 3

CH 3 Yellow, pH > 4.4 Red, pH < 3.2

Methyl Orange

4.2.4 NHIỆT ĐỘ

- sự trương nở đơn giản của dm có thể làm thay đổi độ hấp thụ̣̣̣ biểu kiến và do đó cũng có thể làm ảnh hưởng đến độ đúng của kết quả

- sự cân bằng vật lý hay hoá học: khi nhiệt độ tăng sẽ phá huỷ cấu trúc của acid nucleic

-nhiệt độ thay đổi: chỉ số khúc xạ của dm thay đổi một cách có ý nghĩa

Như vậy:

nếu khi đo phổ, nhiệt độ có ảnh hưởng đến mẫu thì phải sử dụng cốc đo ổn nhiệt đễ không làm thay đổi độ hấp thụ̣̣̣ biểu kiến

PHỔ UV –VIS –

4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN ĐỘ HẤP THỤ̣̣̣

Spectrophotometric

31

Sơ đồ máy UV -Vis

3: cốc chứa dung dịch đo 4: Bộ phận phát hiện (tế bào quang điện) ; 5+ 6: bộ phận khuếch đại va máy ghi tín hiệu

QUANG PHỔ KẾ UV -VIS

5.2 Phân loại

5.2.4 Máy đo quang phổ 2 chùm tia – các kiểu khác nhau

PHỔ UV –VIS : cường độ phổ với đèn vùng UV và Vis

Đèn Tungsten sử dụng cho vùng Vis vì có cường độ cao / vùng này

Half – life 10.000 giờ

Đèn Deuterium sử dụng cho vùng UV

vì vùng Vis bị nhiễu nhiều

Half – life 1.000 giờ



h H

H H

E

H     '  '' 

2 0

2

http://www.spe

5.1.1 ĐÈN NGUỒN

Cốc đo có thể làm bằng thạch anh, plastic hay thuỷ tinh Thạch anh: có thể sử dụng đo trong vùng 200-700 nm Thuỷ tinh và plastic: thích hợp cho vùng khả kiến

5.1 3 CỐC ĐO

Detector ống nhân quang

Ánh sáng đa sắc từ nguồn được hội tụ trên khe vào của bộ phận tạo đơn sắc

Nguồn này tách ánh sáng đa sắc thành ánh sáng đơn sắc có độ dài sóng xác định  và rồi ánh sáng này đi qua khe ra để tới mẫu đo

Để tính độ hấp thụ của môi trường có chất cần định lượng thì ánh sáng phải đi qua mẫu trắng trước khi qua mẫu đo và chọn lựa một vùng để đo mà ở vùng này mẫu trắng hấp thụ̣̣̣̣̣ kém nhất

5.2 Phân loại

45

Detector dải diode quang

Photodiode Array Detectors (PDA)

5.1 4 DETECTOR

http://news.thomasnet.com/images/large/542/542148.jpg http://www.ant7.com/forum/forum_

posts.asp?TID=8066&PN=1

Độ hấp thụ thu được bằng cách tính hiệu số giữa các phép

đo có và không có mẫu phân tích

http://boomeria.org/physicslectures/secondsemester/electricity/electronics/diodes.jpg

chất bán dẫn theo một tiếp

giáp P - N ta được một Diode,

tiếp giáp P -N có đặc điểm:

tại bề mặt tiếp xúc, các điện

tử dư thừa trong bán dẫn N

sang vùng bán dẫn P để lấp

vào các lỗ trống

trung hoà về điện

Đọc thêm

49

Phổ Uv – vis có vai trò rất quan trọng trong công tác KN

Phép đo phổ Uv- vis phổ biến ở các phòng thí nghiệm

- Chất rắn: ít được đo

- Chất lỏng: chứa trong một cốc đo bằng silica, thủy tinh hay plastic

- Chất khí: chứa trong các cốc đo tương tự như cốc đo chứa chất lỏng nhưng được dán lại hay nút kín lại, không để thoát khí ra ngoài

Mẫu đo

kiểm tra sulfur carbon trong carbon tetraclorid

kiểm tra ethynodiol diacetate với sự có mặt của 17

ethinylestra -3,5, diene

6.2 Xác định cấu trúc bằng

phổ UV -Vis

- Qui luật Woodward có

thể dẫn đến nhiều chỉ dẫn

hữu ích trong việc xác định

cấu trúc Cho kết quả tốt nếu

hợp chất khảo sát cho phổ

hẹp hay khi sử dụng bộ phận

phát hiện đa kênh

53

Phổ hấp thụ̣̣̣ của một chất là đường biểu diễn độ hấp thụ̣̣̣̣̣ của chất đó theo bước sóng của ánh sáng chiếu tới

A = f ()

CỰC ĐẠI HẤP THỤ̣̣̣̣̣: bước sóng mà ở

đó chất đo có độ hấp thụ lớn nhất

Phổ UV -Vis thường thường chỉ thể

hiện một số ít dải rộng nên cung

cấp thông tin ít hơn quang phổ IR

(phổ này có nhiều dải hẹp)

Sự hấp thụ nhiều nhất của các chất

hữu cơ là do sự có mặt của các nối

 (không bão hoà)

http://www.specialchem4adhesives.com/documents/ind exables/contents/12/images/Benzotriazole_spectre.gif

PHỔ UV -VIS

6.3.1 Định tính trong trường hợp có chất chuẩn

So sánh phổ của mẫu đo với phổ của chất chuẩn:

-Cùng nồng độ, hai phổ phải cho  max và  max giống hệt nhau

-Tiến hành: ghi phổ của mẫu khảo sát và mẫu chuẩn trong cùng dung môi, máy, nhiệt độ … rồi so sánh 2 đường cong

Nếu đúng 1 hợp chất thì 2 đường cong phải chồng khít lên nhau

55

6.3.2 Định tính trong trường hợp

không có chất chuẩn

- So sánh max, max của phổ điện

tử của chất khảo sát với phổ điện

tử có trong tài liệu về phổ

11

A

Thí dụ:

Vitamin B 12 có 3 cực đại hấp thụ̣̣ ở 278  1 nm; 361  1 nm; 548  2 nm

Vitamin B12 có = 207 ở 361 nm

Cực đại hấp thụ ma x và hệ số hấp thụ max là hai hằng số phổ

UV - Vis đặc trưng riêng cho mỗi chất

+ phải thực hiện đúng theo các điều kiện đã ghi / tài liệu về dung môi, nồng độ, loại máy

phổ UV của B 12

1 1 A

6.4.1 Định lượng trực tiếp

6.4.1.1.Định lượng chất khảo sát có mợt thành phần

a Phương pháp đo tuyệt đới

(khơng sử dụng trực tiếp chất chuẩn - máy phải được chuẩn

) (

cm

E

hoặcD A

6.4 Định lượng

57

Cân chính xác 0,002g chế phẩm, cho vào

mợt bình định mức 50ml, thêm nước tới

vạch, lắc đều cho tan (nờng đợ pha xấp

xỉ 40 microgam/ml)

Đợ hấp thu A = 0,787 ở max = 361 nm

(cớc đo l =1 cm) Hãy xác định nờng đợ

của B12 Biết = 207 tại 361 nm 1 %

cm

E

%95

10040

38  

ml 100 / gam 0038

,

0 207

787 ,

a 207

50

A )

cân được

lượng (

E

loãng) pha

%

1 002 , 0 207

50 787

, 0

b Phương pháp sử dụng hệ số hấp thụ̣̣̣̣̣ mol  của một chất

- Pha mẫu chuẩn có nồng độ chính xác Cc rồi đo độ hấp thụ Ac trên máy tại bước sóng của đỉnh có độ hấp thụ̣̣̣̣̣ cao nhất trong các đỉnh cực đại với cốc đo dày 1 cm

Dựa theo định luật Lambert-Beer, tính  rồi suy ra nồng độ mẫu thử Ct (mol/lit)  của cùng chất trong cùng dung môi và tại cùng bước sóng thì giống nhau

A = .C l   = Ac Ac

6.4.1.Định lượng trực tiếp

6.4.1.1 Định lượng chất khảo sát có một thành phần

59

c Phương pháp so sánh độ hấp thụ̣̣̣ (có chất chuẩn)

- Pha mẫu chuẩn có nồng độ chính xác Cc trong dung môi thích hợp

- Pha dung dịch mẫu thử có nồng độ Ct, trong cùng dung

môi

So sánh độ hấp thụ̣̣̣̣̣ (At) của dung dịch thử nghiệm có nồng

độ (Ct) với độ hấp thụ Ac của dung dịch chuẩn có nồng độ

biết trước (Cc)

Cc A

A C

C

C A

A

c

t t

c

t c

Chú ý: Trong thực nghiệm, Ct và Cc càng gần nhau kết quả càng chính xác

PHỔ UV -VIS

d.Phương pháp sử dụng đường tuyến tính

(xây dựng đường cong chuẩn độ).

- Pha các dd mẫu chuẩn C1, C2, C3,C4,… Cn chính xác / dm thích hợp

- Lần lượt xác định A1, A2, A3, A4 An ở max

- Vẽ đồ thị với trục tung là (A), trục hoành là (C)

- Xác định y = ax + b với R2 = 0,99

- Đo Ax của dd cần khảo sát rồi căn cứ vào đồ thị tìm Cx

(Cx phải nằm trong khoảng C1 – Cn khảo sát)

61

6.4.1.2 Định lượng hổn hợp có nhiều thành phần

a: Sự chồng phổ

Nguyên tắc: ở một bước sóng xác định thì độ hấp thụ của nhiều hợp chất có mặt trong một hỗn hợp bằng tổng độ hấp thụ của mỗi thành phần

PHỔ UV -VIS 6.4.1.2 Định lượng hổn hợp có nhiều thành phần

b Phương pháp sử dụng luật cộng tính mật độ quang

Điều kiện: max của chúng cách nhau một khoảng  10 nm

63

6.4.1.2.Định lượng hổn hợp có nhiều thành phần

Tiến hành:

- Quét phổ UV-vis riêng rẽ của 2 chất chuẩn X và Y

- Chọn 2 cực đại  max1 và  max2 đặc trưng của 2 chất chuẩn X và Y

- Đo riêng A từng chất chuẩn để xác định

- Đo A của dd hỗn hợp ở các  max1 và  max2 của các thành phần với cốc đo dày 1 cm

l Y l

X và Y là 2 ẩn số Giải 2 phương trình 2 ẩn số

1 y

1

x ,ε ε

1 y

1

x ,ε ε

2

x ,ε ε

2 y

2

x ,ε ε

PHỔ UV -VIS 6.4.2 Chiết đo quang = Tạo dẫn chất hấp thụ̣̣ mạnh, đo trong vùng UV – vis

Nguyên tắc: Thêm một thuốc thử hữu cơ vào chất khảo sát không có tính hấp thụ (hoặc hấp thụ yếu) để tạo thành phức chất có tính hấp thụ mạnh hơn chất ban đầu rồi sau đó chiết sang môi trường khác và đo trực tiếp

Kỹ thuật này làm tăng độ nhạy và tăng tính chọn lọc một cách có ý nghĩa

Ứng dụng: phân tích nước và tạp chất /nước

Thí dụ 1:

Sử dụng Dimethylglyoxime để

tạo dẫn chất với Ni +++ có màu

-dd Chì (Pb++) /nước không hấp thụ /UV –vis tạo phản ứng với Dithizon thành dẫn chất Pb – Dithizonat có màu đỏ tan /CHCl3và hấp thụ / vùng UV –vis

http://www.sciencestuff.com/pro d/Chem-Rgnts/C1693