THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT

2 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư BÀI 1, 2 TẾ BÀO SINH DỤC CỦA ĐỘNG VẬT HỮU NHŨ Túi tinh: nơi chứa tinh trùng và tiết dịch trộn với tinh trùng tạo tinh dịch.. 1.4 Sự thụ tinh ở động vậ

1 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Trường ĐH Công nghiệp Tp.HCM Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm

THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỘNG VẬT

GV biên soạn: Lê Trầm Nghĩa Thư

2 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

BÀI 1, 2 TẾ BÀO SINH DỤC CỦA ĐỘNG VẬT HỮU NHŨ

Túi tinh: nơi chứa tinh trùng và tiết dịch trộn với tinh trùng tạo tinh dịch Túi tinh còn là nơi tập kết tạm thời của tinh trùng trước khi ra ngoài

Tuyến tiền liệt: sản xuất dịch (có trong thành phần của tinh dịch) được tiết vào túi tinh

Niệu đạo: nằm trong dương vật, tinh trùng phóng ra ngoài qua niệu đạo

Dương vật: xuất tinh và bài xuất nước tiểu

1.1.2 Sinh lý tinh trùng

Cấu tạo tinh trùng gồm 3 phần: đầu, thân và đuôi

Phần đầu: chứa thể đỉnh acrosome, đây là nơi giải phóng các enzyme giúp cho tinh trùng xâm nhập trứng

Phần thân: chứa ty thể, có liên quan đến các hoạt động chuyển hóa chất và năng lượng

Phần đuôi: có vai trò vận động, không tham gia vào quá trình thụ tinh

3 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Hình Cấu tạo tế bào tinh trùng

Số lượng tinh trùng: chiếm trung bình 5% thể tích tinh dịch (95% dịch tiết) Ở người, trung bình có 3 ml tinh dịch cho một lần xuất tinh, số lượng tinh trùng trung bình từ 60 – 120 triệu tế bào/ml Số lượng tinh dịch ở bò là 4-5 ml và lợn là 150-200 ml

Tinh trùng vận động bằng cách của tự quẫy đuôi

Sự sinh tinh xảy ra gần như suốt đời sống của cá thể đực, tuy nhiên số lượng và chất lượng tế bào có thể thay đổi

Điều kiện để quá trình thụ tinh xảy ra bình thường là:

- Tinh trùng gặp trứng sau 12 giờ phóng vào ống dẫn trứng

- Số lượng tinh trùng phải đảm bảo trong 1 ml tinh dịch

- Tỷ lệ % tinh trùng dị dạng không vượt quá 2 – 5%

- Phần đầu tinh trùng có chứa đủ lượng enzyme hyaluronidase

4 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Hình Cấu tạo tinh hoàn và sự sinh tinh 1.2 Hệ sinh dục cái

1.2.1 Cấu tạo

- Buồng trứng: nơi chứa các nang trứng

- Vòi tử cung (ống dẫn trứng): nơi trứng gặp tinh trùng và thụ tinh (ở 1/3 ống dẫn trứng)

- Tử cung: cơ quan để thai làm tổ và phát triển

- Âm đạo: cơ quan giao hợp

5 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Hình Buồng trứng và sự phát triển các giai đoạn của trứng

Ở người, khi sơ sinh có khoảng 3.104 - 3.105 nang trứng nguyên thủy Khi trưởng thành còn 400 – 500 nang

Hình Thời điểm kích hoạt hormone cho tới khi rụng trứng

6 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

1.3 Đặc điểm cơ bản của các tế bào sinh dục

Một trong các đặc điểm của tế bào sinh dục trưởng thành ở sinh vật nói chung là bộ nhiễm sắc thể đơn bội (n) Đây là kết quả của hai lần phân chia giảm nhiễm trước khi thụ tinh

Các tế bào sinh dục trưởng thành không thể hiện đầy đủ các cơ quan nội bào như các tế bào soma Kích thước các tế bào sinh dục trưởng thành thường lớn hơn các tế bào khác Trong một giai đoạn phát triển nhất định, chúng có thể không cần giá thể bám dính

Điều này trong nuôi cấy in vitro thuận lợi hơn tế bào soma

Trong quá trình phát triển luôn xuất hiện các cấu trúc đặc thù dành cho chức năng thụ tinh (thể cực, màng thụ tinh…)

1.4 Sự thụ tinh ở động vật hữu nhũ

Tinh trùng được phóng vào âm đạo đi theo ống dẫn trứng Lúc này trứng đã di chuyển được khoảng 1/3 chiều dài ống dẫn trứng Tinh trùng gặp trứng, sự thụ tinh diễn ra và tạo hợp tử (2n)

Mỗi lần phóng tinh, số tinh trùng đi vào vòi trứng tới hàng trăm triệu, tuy nhiên chỉ còn chừng vài ngàn tế bào vào được tới vị trí thụ tinh Thế nhưng khi gặp trứng thì chỉ còn vài trăm tinh trùng Tiến hành thụ tinh thì chỉ có 1 tinh trùng

Tinh trùng tiết enzyme hyaluronidase phá màng trong suốt của trứng, nhờ vậy phần đầu tinh trùng chui được vào trứng Lúc này, tinh trùng loại bỏ phần đuôi

Trong lĩnh vực thụ tinh nhân tạo trên người và động vật, việc thu nhận được số lượng lớn các tế bào sinh dục gồm tế bào trứng và tinh trùng là một yêu cầu thiết yếu Các tế bào sinh dục thu nhận được phải đảm bảo các yêu cầu về chất lượng nhằm đạt kết quả

tốt cho thụ tinh in vitro

7 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Trứng có thể thu nhận từ động vật được kích hoạt bằng kích dục tố gây sự rụng trứng gồm có PMSG (Pregnant-Mare’s-Serum-Gonadotrophin) và hCG (Human Chorionic Gonadotrophin) hoặc từ buồng trứng động vật giết mổ

Trứng thu nhận từ các động vật được kích hoạt bằng kích dục tố là những trứng đã thành thục (trứng chín), tức sẵn sàng cho sự thụ tinh nếu gặp tinh trùng Người ta thu trứng bằng phương pháp nội soi đối với những động vật lớn Trong trường hợp thí nghiệm ở chuột, không thể tiến hành nội soi, người ta có thể giết chuột để thu nhận trứng chín và rụng từ các ống dẫn trứng

Trứng thu nhận từ buồng trứng động vật giết mổ (heo, bò…) là các trứng chưa chín, do

đó cần đưa trứng vào môi trường nuôi chín Trong môi trường này người ta cần bổ sung các yếu tố dinh dưỡng và các loại hormone… để kích thích sự chín của trứng

Sự chín của trứng có nghĩa là có sự thay đổi hình thái học, sinh hóa ở tế bào chất, nhân

tế bào và các bộ phận khác, sao cho các trứng này có khả năng thụ tinh và phát triển thành phôi Thời gian thành thục và chín của trứng non trong môi trường nhân tạo thường từ 24-44 giờ, tùy theo loài

Như vậy, thụ tinh nhân tạo có thể thực hiện được cần hai yếu tố quan trọng là thu nhận được những tế bào trứng tốt có khả năng thụ tinh và những tinh trùng tốt, khỏe

8 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

1.5.2 Đánh giá phân loại trứng

Theo sự hiện diện hoặc độ dày, mỏng của tế bào hạt cumulus bao xung quanh trứng (tế bào cumulus là các tế bào có nhiều hạt được hình thành sau khi trứng rụng vào ống dẫn) Trong môi trường nuôi cấy, lớp tế bào này cũng được hình thành Các tế bào cumulus có nhiệm vụ chính là cung cấp chất dinh dưỡng cho trứng trong khi chưa được

thụ tinh Khi gặp tinh trùng, lớp tế bào này bị bong ra Trong thụ tinh in vitro, người ta

phải tìm cách gỡ bỏ lớp tế bào này nhưng không được gây tổn thương trứng)

Loại A: trứng có lớp tế bào cumulus bao kín xung quanh

Loại B: trứng có lớp tế bào cumulus bao vây một phần

Loại C: trứng không có lớp tế bào cumulus bao quanh

Thường chỉ dùng trứng loại A để nuôi cấy và thụ tinh nhân tạo

9 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Hình Trứng loại A Hình Trứng loại B Hình Trứng loại C Việc đánh giá, phân loại các trạng thái của trứng chỉ có tính ước lệ tương đối, tuy nhiên

trong thụ tinh in vitro, đây là tiêu chuẩn quan trọng nhất, đồng thời cũng dễ nhận biết

nhất

Thu nhận và đánh giá chất lượng tinh dịch

Nội dung chủ yếu để đánh giá tinh dịch là:

Lấy tinh: ngày, tháng, năm, giờ lấy tinh; phương pháp lấy tinh; nhiệt độ không khí, quá trình vận chuyển, bảo quản

Đánh giá đại thể: lượng xuất tinh, màu sắc, mùi, độ keo dính, pH, tỷ lệ dị dạng … Thông thường, người ta có chế độ dinh dưỡng đặc biệt cho con vật được chọn lấy tinh trước

đó vài ngày

Đánh giá vi thể: nồng độ tinh trùng, tinh trùng dị hình, sức đề kháng của tinh trùng, tỷ

lệ tinh trùng sống, sức hoạt động của tinh trùng

Những đánh giá khác dùng trong nghiên cứu: tình trạng acrosome, áp suất thẩm thấu, năng lực đệm, độ nhớt tỷ trọng, hệ số hô hấp, sức sống bền, sự chuyển động…

Giống di truyền, thể trạng con vật (thường có các bộ phận chuyên môn hóa việc đánh giá tinh trùng cho công nghệ tạo giống vật nuôi)

Việc đánh giá tinh trùng cần tiến hành thật nhanh, chính xác và cẩn thận

10 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Thuốc nhuộm Eosin 1%, Nigrosine 10%

Rửa buồng trứng nhiều lần bằng nước muối ấm đến khi sạch máu, sau đó để buồng trứng vào nước muối sạch và giữ ở 380C trong điều kiện vô trùng đến khi sử dụng

Sử dụng một buồng trứng, giữ buồng trứng phía trên becher có chứa dung dịch nước muối sinh lý (khoảng 50 ml) và dùng dao mổ tạo những vết cắt dọc theo những nang trứng cho đến khi thấy được dung dịch trong buồng trứng chảy vào becher

11 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Nhúng buồng trứng vào becher và khuấy mạnh nhiều lần cho trứng có thể rơi vào dung dịch Lấy buồng trứng ra khỏi becher

Để trứng lắng trong 5 phút, dùng pipet hút bỏ dung dịch phía trên, chừa lại khoảng 20

ml Cẩn thận ở bước này, nếu không sẽ mất nhiều trứng Nếu khi hút dung dịch bị xáo trộn, phải ngưng lại và đợi vài phút cho trứng lắng trở lại

Lặp lại bước rửa 2 lần nữa, chừa lại khoảng 20 ml dung dịch ở đáy Chuyển dung dịch nước muối sinh lý có trứng vào đĩa petri

Quan sát trứng dưới kính hiển vi, đánh giá phân loại trứng Căn cứ vào vùng tế bào cumulus để đánh giá chất lượng trứng

(Chú ý: làm nhanh, chính xác và tránh để trứng quá lâu ngoài không khí)

Hình Các bước thu nhận trứng từ buồng trứng

3.2 Đánh giá tinh dịch

Trong phần thực tập này, sinh viên đánh giá các chỉ tiêu về tinh dịch động vật như: pH, xác định mật độ tinh trùng bằng phòng đếm hồng cầu và xác định tỷ lệ tinh trùng sống bằng nhuộm màu tinh trùng

12 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

3.2.1 Mật độ tinh trùng (C) là số tinh trùng hiện diện trong 1 ml tinh dịch

Thực hiện việc đếm tinh trùng heo bằng phương pháp đếm hồng cầu

Pha loãng tinh trùng trong ống trộn bạch cầu bằng dung dịch pha loãng tinh trùng Đếm số lượng tinh trùng trong 400 ô nhỏ (của 25 ô lớn) của phòng đếm Trong phần này, tinh dịch được pha loãng 20 lần bằng ống trộn bạch cầu Công thức tính như sau:

C = 104 x D x N (tế bào/ml) C: Mật độ tinh trùng trong tinh dịch D: Độ pha loãng tinh dịch

N: Số tinh trùng đếm được 3.2.2 Xác định tỷ lệ tinh trùng sống

Có thể đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng bằng cách nhuộm tinh trùng (đang còn sống) trong thuốc nhuộm Khi nhuộm, nếu tinh trùng còn sống thì đầu tinh trùng không bắt màu, ngược lại, nếu tinh trùng chết thì đầu tinh trùng bắt màu hồng

Phương pháp nhuộm bằng thuốc nhuộm Eosin 0,5%: trộn một giọt tinh trùng tươi với một giọt dung dịch Eosin 1% lên một phiến kính, phủ lamell lên, tiến hành kiểm tra sau

30 giây ở kính hiển vi (vật kính 40) Quan sát kết quả: Tinh trùng sống không nhuộm màu Tinh trùng chết nhuộm màu đỏ hồng

Phương pháp nhuộm bằng hỗn hợp Eosin- Nigrosin: trộn 1 giọt tinh trùng với hai giọt Eosin 1% Sau 30 giây, thêm ba giọt Nigrosin 10% và trộn (30 giây) Đặt một giọt mẫu lên một phiến kính và trải ra lớp mỏng Để mẫu khô, kiểm tra dưới vật kính 10, 40 Quan sát kết quả: tinh trùng sống có màu trắng, tinh trùng chết nhuộm màu đỏ

Đặt mẫu lên kính hiển vi dưới vật kính 10, kiểm tra tổng số 100 tinh trùng trong đó tính

số lượng tinh trùng sống (không bắt màu) và suy ra tỷ lệ phần trăm Nếu tinh trùng sống đạt 80% trở lên, chứng tỏ tỏ tinh dịch tốt, sử dụng đạt hiệu quả cao

13 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

14 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

BÀI 3 TẠO PHÔI ĐỘNG VẬT HỮU NHŨ IN VITRO

I MỤC ĐÍCH

Thực hiện các phương pháp nhằm tạo phôi động vật hữu nhũ: bò, heo trong điều

kiện in vitro

II CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Ở động vật hữu nhũ, sự thụ tinh là quá trình kết hợp giữa tinh trùng

(spermatozoa) ở con đực và tế bào trứng (oocyte) ở con cái trong cơ thể con cái (1/3

ống dẫn trứng) để tạo nên hợp tử (zygote), hợp tử phát triển thành phôi (embryo) và phôi

phát triển thành cá thể mới Quá trình này bao gồm hàng loạt biến đổi sinh lý, sinh hóa phức tạp ở tinh trùng và trứng trước và sau khi chúng kết hợp với nhau

Thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization – IVF) là quá trình kết hợp giữa

tinh trùng và trứng để tạo thành hợp tử được thực hiện bên ngoài cơ thể mẹ, tại phòng thí nghiệm Tuy xảy ra ở ngoài cơ thể nhưng các điều kiện cho quá trình IVF như môi

15 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

trường, nhiệt độ, độ ẩm, độ nhớt…cùng các chỉ số sinh học khác phải giống như trong

cơ thể mẹ

Các bước tạo phôi động vật hữu nhũ

Chuẩn bị giao tử cái

Thu nhận buồng trứng và có thể tiến hành các phương pháp sau

+ Phương pháp chọc hút: dùng kim 18 G và syringe 5 ml chọc vào nang trứng và hút

ra

+ Phương pháp rạch múc: dùng dao phẫu thuật rạch nang trứng rồi múc trứng ra

+ Phương pháp nghiền nát: buồng trứng được cắt nhỏ và lọc lấy tế bào trứng

Sau khi thu nhận, phân loại và chọn những trứng A, B đem nuôi trưởng thành

Các phương pháp tạo phôi in vitro

-Phương pháp IVF: thụ tinh trong ống nghiệm, theo đó trứng và tinh trùng sẽ được đặt chung với nhau trong vi giọt môi trường, và tinh trùng sẽ tự xâm nhập vào trứng -Phương pháp vi tiêm: tinh trùng được tiêm trực tiếp vào trong bào tương của trứng III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

1 Vật liệu

1.1 Mẫu vật

- Buồng trứng heo

16 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

- Mẫu tinh heo tươi

1.2 Dụng cụ

- Kéo, kẹp

- Kim tiêm 18G và syringe

- Đĩa petri nhựa 60 mm

- Pipette Pasteur

- Dây chuyền nước biển

- Đầu tip xanh, đầu tip vàng

17 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

2.2 Phương pháp kéo pipette Pasteur

Pipette Pasteur được dùng để chuyển trứng, chuyển phôi, phá cumulus Kéo pipette Pasteur trên ngọn lửa đèn cồn sao cho đầu pipette bằng và đường kính đầu kim phù hợp với mục đích sử dụng theo các bước:

Bước 1: Đưa pipette lên ngọn đèn cồn

Bước 2: Đưa pipette ra ngoài đèn cồn và kéo

Bước 3: Bẻ đầu pipette bằng kẹp

2.3 Phương pháp chọc hút buồng trứng

Sử dụng syringe 5 ml với đầu kim 18 G hút khoảng 1 ml dung dịch thu trứng Sau đó, chọc kim tiêm vào các nang trứng có đường kính từ 2 đến 10 mm và hút lấy dịch nang trứng Khi thu được khoảng 3 ml dịch nang trứng, chuyển dịch nang vào đĩa Tiếp tục thực hiện cho đến khi thu hết dịch nang trứng của buồng trứng

Bước 1

Bước 3

Bước 2

18 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

2.4 Phương pháp swim-up tinh trùng

Chuyển 1 ml tinh dịch vào ống ly tâm Nhẹ nhàng bổ sung 3 ml môi trường vào bên trên ống Để nghiêng 45oC ở nhiệt độ 37OC trong 30 phút, thu nhận nhẹ nhàng 1 ml dịch bên trên

Hình Thu nhận tinh trùng bằng phương pháp swim up

2.5 Phương pháp chuyển tinh trùng vào trứng (phương pháp thụ tinh)

Dùng pipette mouth có gắng pipette pastuer hút cụm trứng đã trưởng thành, nhanh chóng chuyển sang vi giọt tinh trùng đã chuẩn bị sẵn Các thao tác được thực hiện dưới kính hiển vi đảo ngược

Chọc nang trứng

Chuyển dịch nang vào

đĩa

19 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

IV YÊU CẦU

1 Kéo pipette Pasteur với kích thước phù hợp và tạo được vi giọt

2 Thu nhận và nhận diện, phân loại được trứng

3 Thu nhận và nhận diện được tinh trùng

4 Trình bày được quy trình thụ tinh trong ống nghiệm

5 Thực hiện được thao tác chuyển trứng, tinh trùng vào vi giọt

6 Thực hiện được thao tác chuyển trứng từ vi giọt chứa trứng vào vi giọt chứa tinh trùng

BÀI 4 TÁCH TẾ BÀO TỪ MÔ ĐỘNG VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRYPSIN

20 Biên soạn: ThS Lê Trầm Nghĩa Thư

Để thực hiện quá trình nuôi cấy sơ cấp tế bào động vật, bước đầu là tách chúng thành các tế bào riêng rẽ từ những mảnh mô và cho chúng bám vào giá thể phù hợp

Việc tách tế bào có thể thực hiện bằng biện pháp cơ học hay bằng enzyme để tạo thành một dịch huyền phù tế bào Hầu hết các loại tế bào động vật bình thường (trừ tế bào máu) đều cần bám vào một giá thể để sống và phát triển với hiệu quả cao nhất, tuy nhiên, những tế bào ung thư có thể phát triển ở trạng thái lơ lửng trong môi trường

Có nhiều loại enzyme được sử dụng để tách tế bào như collagenase, elastase, hyaluronidase, pronase… nhưng trypsin được dùng phổ biến nhất vì hiệu quả tách tế bào cao và giá rẻ

Trypsin có thể tách hoàn toàn tế bào từ mô bằng cách thủy phân các protein liên kết các

tế bào với nhau Tuy nhiên trypsin cũng có thể làm tổn thương màng tế bào trong quá trình tách, do đó cần phải xác điịnh nồng độ enzyme và thời gian tách tối ưu

Các nhà khoa học thường mong muốn có thể tiến hành nghiên cứu một chức năng nhất định của một mô hay một tế bào trong một hệ thống đơn giản Để thực hiện điều này, người ta tìm cách tách tế bào ra khỏi mô nội quan của cơ thể và tiến hành nuôi cấy chúng trong điều kiện nhân tạo Đây là kỹ thuật cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật Bằng kỹ thuật tách tế bào động vật, chúng ta có thể làm chủ được những dòng tế bào tạm thời hay liên tục, từ đó có những ứng dụng quan trọng về sau

Tế bào sơ cấp là các tế bào được tách ra lần đâu tiên và chưa hề qua nuôi cấy Các tế bào này có thể tạo lớp đơn Người ta có thể dùng các tế bào lớp đơn để thực hiện các test vi sinh vật và miễn dịch Mỗi lớp đơn của các tế bào sơ cấp thường rất nhiều chủng loại, có thể tìm kiếm được các tế bào mầm trong lớp đơn khi phân lập và đem cấy chuyền nhiều lần

Việc tách tế bào theo phương pháp sử dụng enzyme cho phép có thể thu được một lượng lớn tế bào đơn trong một thời gian ngắn Nhờ đó, việc nuôi cấy sơ cấp có nhiều thuận