T-nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình gắn sản phẩm PCR bằng cách ngăn chặn việc tự gắn vòng của vector và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR đã được tạ[r]
Trang 1Tổng quan về vector tách dòng
1.A Các đặc điểm của vector.
Đầu thừa Thymidine 3’ để tách dòng sản phẩm PCR: Các pGEM-T và pGEM-T Easy
Vectors được thiết kế với một 3’- thymidine ở cả hai đầu T-nhô ra ở vị trí gắn tăng hiệu quả của quá trình gắn sản phẩm PCR bằng cách ngăn chặn việc tự gắn vòng của vector và cung cấp một đầu T tương thích với đầu A của sản phẩm PCR đã được tạo ra bởi các enzyme tổng hợp
Lựa chọn các thể biến nạp Xanh / Trắng: Các vector Các pGEM-T và pGEM-T Easy là
vector có số lượng bản copy cao, chứa các promoter T7 và SPS6 RNA polymerase nằm cạnh vùng MCR, bên trong đoạn mã cho α-peptite và đoạn mã cho enzyme β-galactosidase Sự bất hoạt do hoạt động chèn vào của đoạn α-peptite cho phép xác định các thể chuyển nạp hay không chuyển nạp bằng cách sàng lọc màu sắc xanh/trắng trên đĩa thạch
Vị trí enzyme giới hạn cho việc cắt đoạn sản phẩm gắn: Vector đều chứa một số lớn vị trí
cắt của enzyme giới hạn trong vùng đa chọn lọc (MCR = Multiple Cloning Region) Vị trí
MCR của Vector pGEM-T Easy nằm dọc theo các vị trí nhận biết của enzyme EcoRI, BstZI
và NotI, cho phép 3 enzyme riêng rẽ cắt đoạn chèn Vùng lựa chọn của Vector pGEM-T nằm dọc theo các vị trí nhận biết của BstZI Cuối cùng, một vị trí cắt đôi có thể được sử dụng để
giải phóng đoạn chèn từ vector này hay vector khác
Gắn nhanh chóng: Vector đều được cung cấp với đệm 2x rapid ligation buffer Phản ứng gắn
có thể được ủ trong vòng 1 giờ ở nhiệt độ phòng Khoảng thời gian ủ có thể tăng them để tăng
số lượng khuẩn lạc được biến nạp Thông thường, một quá trình ủ qua đêm ở 4oC cho số lượng thể được biến nạp cao nhất
Hình 2 Promoter và trình tự đa nối của vector pGEM-T Easy Sợi phía trên chịu trách nhiệm tổng hợp ARN nhờ enzym T7 ARN polymerase Sợi phía dưới chịu trách nhiệm tổng hợp ARN nhờ SP6 ARN polymerase
2 Bản đồ vector pGEM-T Easy và các điểm trình tự tham khảo
Trang 2Các điểm trình tự tham khảo của vector pGEM-T Easy
Vị trí khởi đầu phiên mã nhờ T7 ARN polymerase 1
Promoter SP6 ARN polymerase (-17 đến +3) 139-158
Vị trí khởi đầu phiên mã bằng SP6 ARN polymerase 141
Vị trí liên kết mồi có trình tự đảo ngược pUC/M13 176-197
Vị trí liên kết với mồi có trình tự xuôi pUC/M13 2949-2972
Promoter của T7 ARN polymerase (-17 đến +3) 2999-3