Nghiên cứu quy trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng

Phân lân vi sinh là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống đã được tuyển chọn với mật độ theo tiêu chuẩn hiện hành có khả năng chuyển hoá hợp chất phốt pho khó tan thành dạng

PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết cùa đề tài

Trong sản xuất nông nghiệp ở Việt Nam, phân bón đóng vai trò quan trọng trong việc tăng năng suất cây trồng Tuy nhiên tình hình hiện nay, để đáp ứng nhu cầu về năng suất, một lượng lớn phân hoá học đã được sử dụng, gây ra các tác động tiêu cực đến môi trường đất, không những thế mà còn ảnh hưởng đến môi trường nước, các vi sinh vật cũng như con người

Lân (phốt pho) là yếu tố rất cần thiết đối với sự tăng trưởng và năng suất của cây trồng Đóng vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động sinh lý của cây như phân chia tế bào, quang hợp và phát triển hệ thống rễ tốt (J Microbiol, 2011) Tuy nhiên không phải hợp chất chứa lân nào trong đất cây cũng sử dụng được Điển hình là đất bazan nâu đỏ ở Tây Nguyên có hàm lượng lân tổng số đạt 0,02%, nhưng lượng lân mà cây có thể sử dụng được chỉ 4,12mg/100g đất (Đoàn Triệu Nhạn, 1999) Vì vậy, để nâng cao năng suất cây trồng các nhà nông sử dụng các loại phân lân hoá học để bón cho cây, nhưng khoảng 2/3 phân lân hoá học bón vào đất bị kết tủa ở dạng khó tan cây trồng không hấp thụ được bởi nguyên tố sắt, nhôm hoặc các hợp chất canxi có trong đất (Gyaneshwar và cộng sự, 2002; Turan và cộng sự, 2006) Điều này khiến cho đất trồng ngày càng chai cứng, thiếu màu mỡ Mặt khác lượng phân lân còn lại trong đất có thể bị rửa trôi hoặc thấm vào mạch nước ngầm gây ô nhiễm môi trường nước

Để khắc phục tình trạng trên, hiện nay Việt Nam nói riêng và các nước trên thế giới như Ấn Độ, Nhật Bản… đang tập trung nghiên cứu phân bón theo hướng thân thiện với con người và môi trường, chi phí thấp, đồng thời cải thiện môi trường đất chai cứng do sử dụng phân hoá học trước đó

Một số báo cáo khoa học cho thấy một số loài vi khuẩn khác nhau có khả năng hoà tan các hợp chất phốt pho vô cơ chẳng hạn như tricalcium phosphate, dicalcium phosphate, hydroxyapatite Sự xuất hiện của vi khuẩn hoà tan phốt pho tập trung cao ở vùng rễ, mật độ phụ thuộc vào tính chất của đất (J Microbiol, 2011)

Dựa trên cơ sở đó, phân lân vi sinh được tập trung nghiên cứu làm giải pháp thay thế cho phân lân hoá học Phân lân vi sinh là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật sống đã được tuyển chọn với mật độ theo tiêu chuẩn hiện hành có khả năng chuyển hoá hợp chất phốt pho khó tan thành dạng dễ tan mà cây trồng sử dụng được Phân lân vi sinh là giải pháp bền vững, an toàn cho sự hướng tới nền nông nghiệp sạch hiện nay

Trong thực tế, các doanh nghiệp sản xuất phân bón vi sinh ở hai dạng rắn và lỏng Đối với phân bón vi sinh dạng rắn có những hạn chế nhất định như thời gian bảo quản ngắn, tác dụng chậm, nhiều cơ hội bị tạp nhiễm, khả năng sống của VSV dưới điều kiện khắc nghiệt kém, chi phí vận chuyển cao…(Viveganandan và Jauhri, 2000) Trong bối cảnh đó, phân bón vi sinh dạng lỏng càng có tầm quan trọng và trở nên phổ biến với thời gian sử dụng lâu hơn từ 12 – 24 tháng, dễ tương tác với cây trồng, không gây ô nhiễm, mật độ VSV hữu ích cao, bảo vệ tốt tế bào khỏi các yếu tốt bất lợi từ môi trường… (Sridhar và cộng sự, 2004)

Xuất phát từ những vấn đề trên, đề tài: “Nghiên cứu qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng” được tiến hành nhằm tuyển

chọn các vi sinh vật có khả năng phân giải lân tốt, từ đó nghiên cứu và thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân ở dạng lỏng

Nội dung nghiên cứu

Tuyển chọn chủng vi sinh vật hoặc các chủng vi sinh vật phối hợp có khả năng phân giải lân khó tan tốt nhất, đồng thời có khả năng sinh tổng hợp các chất dinh dưỡng, cũng như chất kích thích tăng trưởng cây trồng để ứng dụng vào sản xuất chế phẩm

Xác định môi trường lên men chính và điều kiện nuôi cấy phù hợp với vi sinh vật

Xác định chất ổn định chế phẩm phù hợp với vi sinh vật và tạo chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng

Thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân

Ý nghĩa khoa học

Thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân lân vi sinh dạng lỏng

Ý nghĩa thực tiễn

Thành công của đề tài sẽ góp phần vào việc sản xuất và ứng dụng chế phẩm

vi sinh vật phân giải lân khó tan trong sản xuất nông – lâm nghiệp, vừa phân giải tốt lân khó tan trong đất vừa có khả năng sinh tổng hợp các chất dinh dưỡng và chất kích thích tăng trưởng cây trồng Cải thiện môi trường đất nông nghiệp đang xuống cấp của Việt Nam Đồng thời đóng góp vào các nghiên cứu về chế phẩm vi sinh dạng lỏng hiện còn ít biết đến ở Việt Nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Các dạng lân trong đất

Lân là chất dinh dưỡng thiết yếu cho sự tăng trưởng của cây trồng, khi không cung cấp đủ lân, cây sẽ sinh trưởng, phát triển chậm, do đó giảm năng suất (Sawyer

và Creswell, 2000) Tuy nhiên, hiệu suất sử dụng lân của cây trồng không quá 25%, phần lớn lân dễ tan trong đất sẽ bị cố định ở dạng cây trồng khó hấp thụ, chiếm tới

95 – 99% tổng lượng lân có trong đất Thành phần lân dễ tan và khó tan trong đất được quyết định bởi tính chất đá mẹ, thành phần cơ giới và hàm lượng chất hữu cơ Hoạt động của các cation kim loại (Ca, Fe, Mg…) và các hợp chất oxide của các kim loại này trong đất cũng làm lân dễ tan bị cố định

Theo Sharpley (2006), thì hàm lượng lân trung bình ở nhiều loại đất thường

từ 0,02 – 0,08 % Do quá trình tích luỹ sinh học, hàm lượng lân ở lớp đất mặt cao hơn lớp dưới

Quá trình phân giải xác bã động thực vật cung cấp cho đất một nguồn lân quan trọng Trong tự nhiên nói chung và trong đất nói riêng, lân tồn tại ở hai hình thức: vô cơ và hữu cơ (Sharpley, 2006)

1.1.1 Lân vô cơ

Lân vô cơ tồn tại ở dạng muối phosphate của những nguyên tố Ca, Fe, Al, Mg… Ở đất trung tính và đất kiềm thì phosphate caxi là chủ yếu, còn ở đất chua thì phosphate sắt và nhôm là chủ yếu Phosphate canxi dễ được huy động để làm thức

ăn cho cây hơn phosphate sắt và phosphate nhôm Sự tồn tại của ion phosphate trong môi trường đất bị chi phối bởi ion phosphate bị chuyển đổi hoá trị (Võ Thị Lài, 2006)

Có thể phân loại lân vô cơ theo tính tan như sau:

- Lân vô cơ khó tan (Ca3(PO4)2, AlPO4, FePO4, …): là các muối phosphate khó tan trong nước, cây không thể hấp thụ được

- Lân vô cơ dễ tan (Na2HPO4, K2HPO4, MgHPO4, …): cây trồng dễ dàng sử dụng các loại muối phosphate này

Trong thực tế H2PO4- là dạng cây trồng dễ hấp thu nhất, các dạng phosphate còn lại thường là các dạng khó hoà tan, muốn cây trồng sử dụng được phải qua quá trình biến đổi thành dạng dễ tan (Võ Thị Lài, 2006) Trong quá trình này vi sinh vật giữ vai trò quan trọng

1.1.2 Lân hữu cơ

Lân hữu cơ trong đất chủ yếu có trong mùn, đất càng giàu mùn càng giàu lân hữu cơ Tuỳ loại đất lân hữu cơ thường chiếm 20 – 80% lân tổng số (Trần Long Tấu, 2009)

Trong lân hữu cơ của đất dạng phổ biến nhất là fytat, có thể chiếm đến 50% tổng số lân hữu cơ Khi có sự tham gia của các vi sinh vật phân giải lân, những hợp chất hữu cơ sẽ được khoáng hoá giải phóng lân vô cơ hay lân hữu cơ, là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho cây trồng Có 70 – 80 tập đoàn vi sinh vật tham gia vào quá trình phân giải lân (Võ Thị Lài, 2006)

1.1.3 Vòng tuần hoàn

Ion PO4-3 trong dung dịch đất Ion PO4-3 bị hấp thụ

Quá trình khoáng Hoà tan Quá trình cố định

Phốt pho vô cơ

Cố định tạm thời

Chất hữu cơ tươi và tế bào sinh vật

Chất hữu cơ mùn hoá

Hình 1.1 Vòng tuần hoàn lân trong tự nhiên

Lân trong tự nhiên luôn tuần hoàn chuyển hoá (Hình 1.1), nhờ vi sinh vật lân hữu cơ được vô cơ hoá thành dạng muối của acid phosphoric Các dạng này một phần được cây trồng sử dụng biến thành lân hữu cơ, một phần bị cố định ở dạng khó tan Trong quá trình này vi sinh vật giữ vai trò quan trọng

Trong tự nhiên, lân tham gia vào các quá trình chuyển đổi vật chất bằng cả con đường hóa học và sinh học Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của lân trong tự nhiên diễn ra theo 3 quá trình sau:

Khoáng hóa: Là quá trình chuyển hóa lân dạng hữu cơ thành lân dạng vô cơ

Cố định sinh học (Immobilization): Là quá trình tái sử dụng lân vô cơ nhờ

VSV và qua đó chuyển đổi lân vô cơ thành lân hữu cơ trong protoplasm của VSV

Cố định hóa học (Fixation): Là quá trình chuyển đổi lân dạng tan sang dạng

khó tan dưới tác dụng của các phản ứng hóa học giữa ion PO43- và cation kim loại

1.1.4 Vai trò của lân đối với cây trồng

Phốt pho là một trong những yếu tố quan trọng trong nông nghiệp hiện nay, nằm trong nhóm ba nguyên tố đa lượng chính của cây trồng (N, P, K) Tầm quan trọng của phốt pho đối với sản lượng mùa vụ được minh hoạ bằng tổng lượng phân lân được sử dụng trong suốt 35 năm gần đây, ổn định ở khoảng dưới 20 triệu tấn/năm trong 10 năm gần đây

Phốt pho có nhiều chức năng quan trọng đối với thực vật, chức năng cơ bản

là lưu trữ và vận chuyển năng lượng trong thực vật Adenosine diphosphate (ADP)

và adenosine triphosphate (ATP) là những hợp chất phốt pho năng lượng cao, điều khiển hầu hết những tiến trình trong thực vật bao gồm quang hợp, hô hấp, tổng hợp acid nucleic và protein và vận chuyển dinh dưỡng thông qua những tế bào thực vật Ngoài ra còn đẩy mạnh sự phát triển của rễ, tăng khả năng hấp thu nước và khoáng chất Thúc đẩy quá trình sinh nhánh, nảy chồi cho ra hoa tạo quả sớm (Lê Văn Căn, 1968)

1.2 Tổng quan về vi sinh vật phân giải lân

VSV phân giải lân - VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing

mobilizing Microorganisms) là các VSV có khả năng chuyển hoá hợp chất phốt pho khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng Các VSV phân giải hợp chất phốt pho khó tan được biết đến nay gồm cả vi khuẩn, nấm mốc và nấm men VSV phân giải lân không chỉ là các VSV chuyển hoá photphate vô cơ, mà bao gồm cả các VSV có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo nguồn lân dễ tiêu cung cấp cho đất và cây trồng (Vũ Thuý Nga, 2003)

VSV phân giải lân được chia làm 2 nhóm: nhóm VSV phân giải lân vô cơ và nhóm VSV phân giải lân hữu cơ

1.2.1 VSV phân giải lân hữu cơ

Như ta đã biết, lân hữu cơ cũng là nguồn dự trữ lân trong đất đáng kể cho sự phát triển của thực vật Tuy nhiên, để thực vật sử dụng được thì nguồn lân hữu cơ này cần phải được vô cơ hóa (khoáng hóa) dưới dạng dễ tan Quá trình khoáng hóa của hầu hết các hợp chất lân hữu cơ được thực hiện nhờ hệ enzyme phosphatase của các vi sinh vật đất Càng gần vùng rễ cây thì hoạt động của các vi sinh vật phân giải lân hữu cơ càng mạnh mẽ (Tarafdar và Junk, 1987) Rõ ràng, sự tồn tại hệ vi sinh vật vùng rễ này đã góp phần đáng kể tăng lượng lân khả dụng cho cây trồng (Garcia

và cộng sự, 1992; Xu và Johnson, 1995)

VSV phân giải lân hữu cơ chủ yếu gồm các chủng Bacillus (Skrary và Cameron, 1998) và Pseudomonas (Gügi và cộng sự, 1991), ngoài ra còn một số xạ khuẩn và nấm khác Đáng chú ý là B.megaterium var phosphatsum có khả năng phân giải lân hữu cơ cao Đồng thời B megaterium còn có khả năng hình thành bào

tử nên sức sống rất mạnh (Nguyễn Hữu Hiệp, 2009)

Qua nghiên cứu hoạt động phân giải lân hữu cơ của các enzyme phosphatase khác nhau ở vùng rễ ngô, lúa mạch, lúa mì, Burn (1983) đã nhận thấy hoạt tính của các phosphatase mạnh nhất ở đất chua đến trung tính

Tất cả những nghiên cứu trên đã khẳng định vi khuẩn đất có vai trò quan trọng trong việc cung cấp lân khả dụng cho cây trồng từ các nguồn lân vô cơ và hữu

cơ sẵn có trong đất mà cây trồng không sử dụng được

1.2.2 VSV phân giải lân vô cơ

Nhiều vi khuẩn như B.megaterium, B.mycoides, B.butyricus, Pseudomonas fluorescens, vi khuẩn nitrat hóa, một số vi khuẩn hệ rễ, xạ khuẩn có khả năng phân

giải Ca3(PO4)2 và bột apatit Khả năng phân giải lân vô cơ có liên quan mật thiết tới

sự sản sinh acid của vi sinh vật Quá trình lên men tạo ra acid carbonic, là acid chủ yếu thúc đẩy quá trình hòa tan lân vô cơ

Ca3(PO4)2 + H2CO3 + H2O  Ca(PO4)2H2O + Ca(HCO3)2

Trong đất vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác dụng trong việc phân giải Ca3(PO4)2 Vì trong quá trình sống các vi khuẩn này tích lũy HNO3 và H2SO4 trong đất

1.2.3 Khả năng kích thích sự phát triển cây trồng của VSV phân giải lân

Trong tự nhiên tồn tại một số lượng lớn các vi khuẩn mà đa phần là các vi khuẩn liên quan đến rễ cây, có tác dụng kích thích tăng trưởng cây trồng Nhóm vi khuẩn này gọi là PGPB (plant growth promoting bacteria) Theo Ahmed và Shahab (2011), PGPB sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp một hoặc nhiều cơ chế để cải thiện mức độ tăng trưởng và sức khoẻ cây trồng Những cơ chế này có thể hoạt động đồng thời hoặc hoạt động tuần tự ở các giai đoạn khác nhau của sự phát triển thực vật Chúng bao gồm:

- Hoà tan lân

- Cố định đạm

- Kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng

- Tăng cường sự hấp thu các chất dinh dưỡng cần thiết khác

- Sản xuất phytohormone như acid indole-3-acetic và acid butyric indol Trong số đó vi khuẩn phân giải lân khó tan (PSB) đã được sử dụng như phân bón sinh học thương mại để cải thiện tình trạng nông nghiệp (Subba-Rao, 1993; Rodríguez và Fraga, 1999) Nhóm vi khuẩn phân giải lân được coi là phân bón sinh học có triển vọng nhất vì rất nhiều loại đất giàu lân tổng số nhưng lại thiếu hụt trầm trọng lân dễ tan cung cấp cho cây trồng

Tác động có lợi của vi khuẩn phân giải lân đã được nhiều tác giả mô tả (Antoun và cộng sự, 1998; Chabot và cộng sự, 1998; Pal, 1998; Peix và cộng sự,

2001; Sarawgi và cộng sự, 1999; Tomar và cộng sự, 1996) Hơn nữa, các vi khuẩn phân giải lân lại rất có tiềm năng để sản xuất phân vi sinh đa chức năng vì có thể

tương tác kết hợp tốt với các vi khuẩn có lợi khác như Azospirillum (Gaur và Alagawadi, 1992; Belimov và cộng sự, 1995) và Azotobacter (Kundu và Gaur,

1984)

Ngoài vai trò cung cấp lân dễ tan cho cây trồng, các vi khuẩn hòa tan lân còn

có khả năng sinh các yếu tố có vai trò nâng cao hiệu suất tăng trưởng như cố định đạm, sinh tổng hợp các phytohormone, kháng sinh, hay các enzyme chitinase, cellulase, pectinnase, giúp cây trồng phát triển tốt hơn, chống chịu tốt hơn đối với điều kiện bất lợi từ bên ngoài

1.2.4 Cơ chế hòa tan lân của VSV

1.2.4.1 Cơ chế hòa tan lân vô cơ

Một số lý thuyết giải thích các cơ chế hoà tan lân của VSV như lý thuyết acid hữu cơ và lý thuyết acid hóa bằng cách giải phóng H+ (Ahmed và Shahab, 2011)

Lý thuyết acid hữu cơ

Lý thuyết acid hữu cơ được chấp nhận bởi nhiều nhà nghiên cứu Trong lý thuyết này, các nguồn lân vô cơ không hòa tan trong môi trường được hòa tan bởi VSV phân giải lân, đi kèm với sản xuất các acid hữu cơ, làm giảm pH và làm tăng

sự tạo phức của các ion dương liên kết với nhóm phosphate (Puente và cộng sự, 2004).Việc giảm độ pH của dịch nuôi cấy VSV từ giá trị ban đầu của môi trường là 7.0 đến giá trị cuối cùng 2.0 được ghi lại bởi nhiều nghiên cứu (Gaur và Gaind 1999; Illmer và Schinner, 1992) Việc sản xuất các acid hữu cơ dẫn đến hiện tượng acid hóa các tế bào VSV và môi trường xung quanh Do đó, việc giải phóng các ion

P trong các khoáng P-Ca là do sự thay thế H+ bằng Ca2+

Phân tích dịch nuôi cấy của các VSV có khả năng hòa tan lân đã cho thấy sự hiện diện của số lượng các acid hữu cơ như malic, glyoxalic, succinic, fumaric, tartaric, alpha keto butyric, oxalic, citric, acid 2-ketogluconic và gluconic (Lapeyrie

và cộng sự, 1991; Cuningham và Kuaick, 1992; Illmer và cộng sự, 1995; Fasim và

cộng sự, 2002; Kim và cộng sự, 1997) Trong số đó, acid gluconic có vẻ là tác nhân thường gặp nhất của quá trình hòa tan lân vô cơ Các vi khuẩn sinh acid gluconic đã

được báo cáo là Pseudomonas sp (Illmer và Schinner, 1992), Erwinia herbicola (Liu và cộng sự, 1992), Pseudomonas cepacia (Goldstein và cộng sự, 1993) Chủng

vi khuẩn Bacillus liqueniformis và Bacillus amyloliquefaciens đã được xác định là

có khả năng sản xuất hỗn hợp các acid lactic, isovaleric, isobutyric, và acit acetic có vai trò tham gia vào quá trình hòa tan lân vô cơ khó tan (Rodríguez và Fraga, 1999)

Goldstein (1995) đã chứng minh rằng kết quả của sự oxy hóa glucose sản sinh ra acid gluconic và acid 2-ketogluconic là cơ sở của quá trình hòa tan lân vô cơ khó tan của một số vi khuẩn Gram âm

Bên cạnh các acid hữu cơ, acid vô cơ như acid nitric và acid sulfuric cũng

được sản xuất bởi các vi khuẩn nitrat và các Thiobacillus trong quá trình oxy hóa

của các hợp chất vô cơ có chứa nitơ hoặc lưu huỳnh Các acid vô cơ này phản ứng với canxi phosphat và chuyển đổi chúng thành các dạng hòa tan (Gaur và Gaind, 1999)

Hàm lượng và loại acid hữu cơ được các VSV tiết vào dịch nuôi cấy rất đa dạng Lượng lân được VSV hòa tan phụ thuộc vào cường độ và loại acid Acid béo được đánh giá là có hiệu quả hơn acid phenolic và acid citric khi hòa tan lân Acid fumaric có khả năng hòa tan lân tốt nhất Tribasic acid và dibasic acid cũng có hiệu quả hơn acid monobasic (Gaur và Gaind, 1999)

Goldstein (1994) đề xuất rằng quá trình oxy hóa trực tiếp periplasmic glucose thành acid gluconic, thường là acid 2-ketogluconic, hình thành cơ sở trao đổi chất của chất khoáng trong một số vi khuẩn gram âm phân giải lân

Mặc dù nhiều nhà nghiên cứu ủng hộ giả thuyết acid hữu cơ, nhưng rất khó khăn trong việc định lượng lân hòa tan tương ứng với từng loại acid hữu cơ xuất hiện trong môi trường chất lỏng

Lý thuyết acid hóa

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng vi sinh vật vẫn có khả năng hòa tan lân mà không hề sản sinh bất cứ loại acid hữu cơ nào trong quá trình sinh trưởng Việc hòa

tan lân mà không sản xuất acid được giải thích là do việc phát hành các proton kèm theo quá trình hô hấp hoặc đồng hóa amoni (Taha và cộng sự, 1969; Kucey, 1983; Dighton và Boddy, 1989; Parks và cộng sự, 1990) Illmer và Schinner (1995) đã giải thích sự hòa tan lân nhờ giải phóng H+ làm giảm pH của môi trường Họ đã sử

dụng Pseudomonas aurantiogriseum và Pseudomonas sp phân lập từ đất rừng để

phân giải 2 hợp chất Ca-P là hydroxyapatite và brushite Tác giả quan sát thấy rằng nồng độ lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy lỏng tăng lên tương ứng với mức tiêu thụ apatit (Ca5(PO4)3(OH, F, Cl)) và brushite (CaHPO4.2H2O) Nồng độ lân hòa tan cũng đạt mức cao nhất ở một số thời điểm nhất định trong suốt quá trình nuôi cấy Họ cho rằng các hợp chất hữu cơ đã được đồng hóa như các chất dinh dưỡng bởi hai chủng sinh vật này khi môi trường chất lỏng chứa ít chất vô cơ Việc giải phóng H+ được cho là liên kết với đồng hóa cation, như ion amoni (NH4+) Giải phóng H+ đi kèm đồng hoá NH4+ chịu trách nhiệm hòa tan lân Họ đã chứng minh

rằng Pseudomonas aurantiogriseum và Pseudomonas sp Đã tạo H+ để hòa tan hydroxyapatite một cách hiệu quả mà không cần sự liên kết với brushite giữa các tế bào và các chất nền, đồng thời giảm độ pH Vi khuẩn huy động lân để giải phóng

H+ tại bề mặt tế bào Hoạt động giải phóng H+ đi kèm với giảm pH tạo thành một điều kiện thích hợp cho sự hòa tan lân

Bên cạnh đó, các chất dễ tạo phức, CO2, H2S cũng tăng cường quá trình phân giải lân vô cơ khó tan (Luo và cộng sự, 1993; Kapoor và cộng sự, 1989)

1.2.4.2 Cơ chế hòa tan lân hữu cơ

Tương tác emzyme – cơ chất là cơ sở của quá trình hòa tan lân hữu cơ Các enzyme phosphatase đóng vai trò phân giải hầu hết các dạng lân hữu cơ trong đất

Một số loại enzyme có hoạt tính phosphatase có thể kể đến như acid phosphatase, phytase, lecithinase, D-α-Glycerophosphatase, phosphonoacetate hydrolase …

1.3 Phân bón vi sinh phân giải lân

1.3.1 Định nghĩa

Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất phốt pho khó tan (tên thường gọi là phân lân vi sinh) là sản phẩm chứa một hay nhiều chủng vi sinh vật đã được tuyển chọn với mật độ đạt tiêu chuẩn hiện hành, có khả năng chuyển hoá hợp chất phốt pho khó tan thành dạng dễ tiêu cung cấp cho đất và cây trồng, tạo điều kiện nâng cao năng xuất và (hoặc) chất lượng nông sản Phân lân vi sinh và các chủng vi sinh vật không gây ảnh hưởng xấu đến người, động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản

1.3.2 Quy trình sản xuất

Qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh tổng quát bao gồm 2 phần: từ giống gốc ban đầu tiến hành nhân giống thu sinh khối và tạo chế phẩm

1.3.2.1 Phân lập tuyển chọn chủng VSV phân giải lân (PSM)

Trong quy trình sản xuất chế phẩm PSM, công tác đầu tiên là phân lập và tuyển chọn những chủng VSV tốt

Chủng VSV phân giải lân được phân lập từ đất hoặc từ vùng rễ cây trồng

Phối trộn

Chế phẩm dạng rắn

Chế phẩm dạng lỏng

Hình 1.2 Qui trình sản xuất tổng quát phân bón vi sinh

trên các loại đất hay cơ chất giàu hữu cơ theo phương pháp nuôi cấy pha loãng trên môi trường đặc Pikovskaya (Pikovskaya, 1948) Trong quá trình nuôi cấy các chủng VSV phân giải lân sẽ tạo vòng phân giải, tức là vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc Vòng phân giải được hình thành nhờ khả năng hoà tan phosphate khó tan được bổ sung vào môi trường nuôi cấy Căn cứ vào đường kính vòng phân giải, thời gian hình thành và độ trong của vòng phân giải người ta có thể đánh giá định tính khả năng phân giải mạnh hay yếu của các các chủng VSV phân lập Để đánh giá chính xác mức độ phân giải các hợp chất lân khó tan của VSV, người ta phải định lượng hoạt tính phân giải của chúng bằng cách phân tích hàm lượng lân dễ tan trong môi trường nuôi cấy VSV có chứa loại phosphate không tan

Để sản xuất phân lân VSV người ta cố gắng tuyển chọn các chủng VSV có khả năng phân hu nhiều loại hợp chất lân hữu cơ và vô cơ khác nhau và có ảnh hưởng tốt đến cây trồng Vì ngoài hoạt tính phân giải lân, nhiều chủng VSV còn có các hoạt tính sinh học khác gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng, phát triển và năng suất cây trồng Do vậy cần chọn những nguồn phân lập an toàn sinh học hoặc sau khi phân lập cần được đánh giá ảnh hưởng đến đối tượng cây trồng sử dụng Chỉ sử dụng chủng VSV vừa có hoạt tính phân giải lân cao, sức cạnh tranh lớn, thích ứng ở

pH rộng, phát huy được ở nhiều vùng sinh thái khác nhau và đặc biệt không gây ảnh hưởng xấu đến cây trồng và môi trường sinh thái, tốt hơn nếu chủng VSV đó sinh tổng hợp các hợp chất có lợi cho cây trồng

Hình 1.3 VK phân giải lân trên

MT P

Hình 1.4 VK phân giải lân trên

MT P bổ sung Bromophenol blue

1.3.2.2 Nhân sinh khối VSV

Từ các chủng VSV tuyển chọn, sinh khối VSV được nhân giống cấp 1, nhân giống cấp 2 và lên men chính để thu sinh khối (Hình 1.2), trong đó các yếu tố ảnh hưởng như môi trường nhân sinh khối, nồng độ ô xy, nhiệt độ và pH cần được đặc biệt chú ý

Môi trường nhân sinh khối VSV cần đáp ứng đầy đủ nhu cầu dinh dưỡng cho VSV sinh trưởng phát triển, đồng thời phải rẻ và luôn sẵn có

Theo Wang JinLing và cộng sự (2013), để xác định môi trường nuôi cấy tốt nhất cần tiến hành thí nghiệm bề mặt phản ứng tối ưu hoá Thí nghiệm được tiến

hành đối với chủng vi khuẩn hoà tan phosphate Bacillus megaterium, OD600 được xem như tiêu chuẩn để đánh giá số lượng tế bào Các yếu tố trong môi trường được tiến hành tối ưu như nguồn carbon, nguồn nitơ, nồng độ muối vô cơ và đạt được các giá trị tốt nhất của từng yếu tố Từ đó thiết kế đồ thị bề mặt phản ứng nhằm xác định môi trường tối ưu hoá Kết quả cho thấy các thành phần môi trường tối ưu bao gồm: Lactose 6g/L, Pepton 7,45g/L, NaCl 5g/L, MgSO4.7H2O 2,46g/L, CaCl21,22g/L, K2SO4 0,087g/L Với môi trường nuôi cấy tối ưu này, số lượng tế bào sống

của vi khuẩn Bacillus megaterium trong dịch lên men có thể đạt 2,0 109 cfu/ml Có thể cung cấp mật độ cao vi khuẩn hoà tan phosphate cho sản xuất công nghiệp

Hầu hết các VSV sử dụng trong sản xuất phân bón được nhân sinh khối bằng phương pháp lên men chìm trong các nồi lên men (J F Walter và A S Paau, 1996)

1.3.2.3 Tạo chế phẩm

Phân bón VSV được sản xuất bằng cách phối trộn sinh khối VSV ở một mật

độ nhất định vào chất mang vô trùng hoặc không vô trùng

* Chất mang và xử lý chất mang

Chất mang là cơ chất để VSV trú ngụ và duy trì mật độ trong thời gian từ khi sản xuất đến khi sử dụng Ngoài các yêu cầu về đặc tính vật lý, cảm quan, chất mang phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến VSV, thực vật và môi trường

Chất lượng phân VSV trên nền chất mang khử trùng phụ thuộc rất lớn vào mật độ VSV hữu ích và khả năng tồn tại của chúng trong sản phẩm Nhằm hạn chế tối đa sự cạnh tranh của các VSV tạp trong phân bón, chất mang được khử trùng bằng các phương pháp khác nhau Phương pháp thông dụng đang được sử dụng rộng rãi hiện nay là khử trùng bằng hơi nước bão hòa

Nhằm giảm giá thành, tạo điều kiện thuận lợi cho người sử dụng sản phẩm phân bón VSV trên nền chất mang không khử trùng cũng đã được nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất Phân VSV trên nền chất mang không khử trùng là sản phẩm phân VSV, trong đó chất mang sau xử lý được phối trộn trực tiếp với sinh khối VSV không thông qua khử trùng

Ưu và nhược điểm của 2 loại phân bón VSV trên nền chất mang khử trùng

và không vô trùng được tổng kết trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Ưu điểm và hạn chế của phân bón VSV trên nền chất mang khử trùng và

- Dễ đánh giá và kiểm tra chất lượng

- Thuận lợi cho việc sử dụng

- Cần đầu tư lớn ban đầu và đòi hỏi đặc biệt cho điều kiện khử trùng chất mang

- Đầu tư ít, không cần kỹ thuật đặc biệt

- Cần lượng sinh khối VSV lớn

- Chất lượng không ổn định, khó đánh giá và kiểm tra chất lượng, không bảo quản được lâu

(Phạm Văn Toản, 2002)

* Chủng sinh khối VSV vào chất mang, tạo sản phẩm

Sinh khối VSV sau lên men được ly tâm hay vi lọc, rửa tế bào để thu sinh khối Chủng sinh khối vào chất mang vô trùng theo mật độ nhất định tạo ra phân VSV trên nền chất mang vô trùng, trong đó sinh khối VSV được chủng trong điều kiện vô trùng bằng bơm tiêm hoặc hệ thống tiêm dịch tự động, bán tự động, sau đó đưa vào buồng sinh trưởng ở nhiệt độ phù hợp với từng giống VSV Sau thời gian sinh trưởng 1 tuần sản phẩm có thể mang đi sử dụng

Đối với phân VSV trên nền chất mang không khử trùng, ngoài công đoạn khử trùng chất mang, các công đoạn sản xuất phân bón hoàn toàn đồng nhất với qui trình sản xuất phân VSV trên nền chất mang khử trùng

Trong thực tế, nhiều doanh nghiệp sản xuất phân bón VSV dạng lỏng và dạng bột sinh khối VSV đông khô Để sản xuất phân bón VSV dạng lỏng, trong quá trình chuẩn bị môi trường người ta bổ sung vào môi trường chất bảo quản, đó là hợp chất polyme (PB 40, Gum arabic v.v ) với liều lượng 0,5% so với thể tích môi trường nuôi cấy Sau khi kết thúc lên men, dịch lên men được bảo quản lạnh, ly tâm thu sinh khối và tiến hành phối trộn vào chất mang Cuối cùng đóng gói tạo sản phẩm phân bón vi sinh vật dạng lỏng

Phân VSV dạng bột đông khô là sản phẩm trong đó sinh khối VSV sau lên men được ly tâm loại bỏ nước tự do và đông khô trong thiết bị đông khô Sản phẩm tạo ra được đóng gói với chất mang hoặc không có chất mang

1.3.2.4 Yêu cầu chất lượng và công tác kiểm tra chất lượng

Để đảm bảo chất lượng phân bón trong quá trình sản xuất cần thiết phải kiểm tra chất lượng ở các công đoạn sản xuất sau:

- Giống gốc và chất lượng giống lên men cấp 1

- Chất mang

- Sinh khối VSV sau khi kết thúc lên men

- Sản phẩm sau phối trộn sinh khối, sau thời gian sinh trưởng và bảo quản Phân VSV phân giải lân phải có hiệu quả đối với đất và cây trồng, ngh a là

có ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng phát triển của cây trồng, đến năng suất, chất

lượng nông phẩm hoặc độ phì nhiêu của đất Mật độ VSV trong sản phẩm phải bảo đảm các tiêu chuẩn ban hành Phân lân vi sinh được coi là có chất lượng tốt khi có chứa một hay nhiều loại VSV có hoạt tính phân giải lân cao, có ảnh hưởng tốt đến cây trồng Mật độ vi sinh vật trong sản phẩm phải bảo đảm các tiêu chuẩn ban hành

Bảng 1.2 Chỉ tiêu mật độ VSV trong phân bón vi sinh

Từ những hạn chế của phân bón vi sinh dạng rắn, năm 1998 tiến s Krishan Chandra giám đốc trung tâm RCOF, đã xây dựng công nghệ phân bón sinh học dạng lỏng tại trụ sở Bangalore Công nghệ này là giải pháp thay thế các chế phâm phân bón sinh học trước đây Chế phẩm phân bón vi sinh vật dạng lỏng là một chế phẩm đặc biệt không những bao gồm các vi sinh vật có lợi mà còn chứa các chất có thúc đẩy VSV phát triển và bảo vệ chúng dưới các điều kiện bất lợi giúp cho thời hạn sử dụng chế phẩm lâu hơn

Nhiều nghiên cứu cho thấy, các loại polyme được sử dụng để sản xuất chế phẩm bởi khả năng hạn chế sự truyền nhiệt, giúp chế phẩm phân bố đều không bị kết

(Nguồn: TCVN 6169:1996)

cặn, bảo vệ tế bào VSV khỏi những yếu tố bất lợi từ môi trường Chẳng hạn như Sodium alginate, Carboxyl methyl cellulose (CMC), Polyvinyl pyrrolidone (PVP), Xanthan gum…

Theo Mahdi (2010), polysorbate 20 thương mại được gọi là Tween 20 ở nồng độ 0,025% được tìm thấy là chất hoạt động bề mặt cho quần thể tế bào tốt hơn Polysorbate là một chất bề mặt không ion có tính ổn định và không độc tính cho phép nó được sử dụng như một chất tẩy rửa và chất nhũ hóa trong một số ứng dụng trong nước, khoa học, và dược lý

Được biết Glycerol có khả năng bảo vệ các tế bào chống lại điều kiện bất lợi

từ môi trường, chống sự mất nước của chế phẩm lỏng trong thời gian bảo quản dài (Somasegaran và Hoben, 1985) Ngoài ra còn hoạt động như một nguồn carbon thay thế (Lorda và Balatti, 1996)

Việc sản xuất phân bón VSV dạng lỏng tạo ra một bước ngoặc lớn trong việc sản xuất phân bón vi sinh vật vì nó được thiết lập dựa vào bốn đặc điểm yêu cầu sau:

- Ổn định sinh vật trong quá trình sản xuất phân bón và lưu trữ

a) Nhiệt độ

Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong sản xuất, vì ảnh hưởng của nhiệt độ là khác nhau đối với các giống vi sinh vật khác nhau Thông thường chủng VSV phối vào trong chế phẩm lỏng tăng trưởng bình thường ở 370C và có khả năng chịu đựng nhiệt độ lên tới 450C trong 2 năm hoặc nhiều hơn

b) Môi trường

Chế phẩm phân bón vi sinh vật có hiệu quả gần như là giống nhau trong tất

cả môi trường, nhưng hiệu quả có thể giảm 20 – 25% trong điều kiện môi trường khí hậu khác nhau Thông thường, VSV vẫn sẽ hoạt động trong suốt thời gian bảo quản và khi bón xuống đất vẫn sẽ duy trì hoạt động trong suốt mùa vụ hoặc trong suốt chu kỳ cây trồng Tuy nhiên, VSV có thể bị bất hoạt do một số yếu tố môi trường như nhiệt độ cao, thậm chí là các VSV cạnh tranh Không những thế nó còn

bị mất đi do quá trình rửa trôi, mưa, gió Tầm quan trọng tương đối của yếu tố này

là cần phải lựa chọn việc sử dụng phân bón ở đâu, điều đó làm hạn chế việc sử dụng phân bón VSV Vì vậy, việc tạo chế phẩm phân bón VSV dạng lỏng có thể chứa các chất phụ gia để bảo vệ VSV chống lại điều kiện bất lợi từ môi trường

c) Ảnh hưởng pH

Độ pH đóng vai trò quan trọng trong quá trình nuôi cấy, nó phải đảm bảo ổn định trong phạm vi nhất định Ngoài ra, các chất hóa học có trong đất như magie, mangan, canxi,… làm tăng giá trị pH, khi bị ướt sương hoặc phun nước, có thể ức chế, vô hiệu hóa môt số sinh vật Điều kiện pH rất cao hoặc rất thấp sẽ làm bất hoạt VSV Vì vậy, cần phải duy trì pH bằng một chất đệm phụ gia làm cho thời gian sử dụng tốt hơn Duy trì pH tối ưu nâng cao tuổi thọ của một số các vi sinh vật như

Azospirillum, Azotobacter, vi khuẩn phospho hòa tan (PSM),

d) Ổn định VSV trong chế phẩm chất lỏng

Đây là giai đoạn bảo quản chế phẩm sau sản xuất Giai đoạn này có thể kéo dài vài tuần đến nhiều năm Vi sinh vật có lợi được lưu trữ trong chất lỏng chế phẩm thích hợp cho sự ổn định và tăng trưởng của chúng Ngoài ra, người ta còn nghiên cứu sử dụng chất mang để cải thiện sự ổn định của VSV trong suốt thời gian bảo quản

nm những tia này có thể gây hại đến VSV có trong chế phẩm Người ta có thể khắc phục bằng cách có thể bổ sung các chất phản xạ ánh sáng, tán xạ hay sử sử dung các chất hấp thụ bức xạ, chuyển đổi thành những bước sóng ngắn để gây vô hại đến VSV Tuy nhiên, việc tìm ra những vật liệu hay những chất như thế rất khó khăn và chưa có cơ sở vững chắc cho việc tránh ảnh hưởng của mặt trời đến chế phẩm tạo ra

f) Xử lý và sử dụng chế phẩm phân bón dạng lỏng

Chế phẩm phân bón sinh học dạng lỏng đảm bảo dễ dàng xử lý và sử dụng Điển hình, chế phẩm phân bón lỏng có thể giúp việc duy trì phân bố VSV tránh hiện tượng vón cục nên có thể sử dụng ngay sau thời gian bảo quản Còn các chế phẩm dạng bột hay viên không thể duy trì tính đồng nhất VSV Ví dụ như trong tường hợp

của Azospirillum mật độ tế bào đi xuống 105 cfu/ml sau 6 tháng bảo quản ở nhiệt độ phòng trong khi bảo quản bằng chế phẩm lỏng trong suốt 2 năm mà vẫn duy trì mật

độ tế bào 108cfu/ml Tương tự như vậy, trong khi Azotobacter, Rhizobium ở dạng

chế phẩm rắn duy trì hạn sử dụng là 6 tháng, PSM đến 8 tháng, nhưng trong trường

hợp bảo quản trong chế phẩm lỏng Azotobacter, PSM và KMB sử dụng đến 2 năm sau, Rhizobium lên đến 14 tháng Điều này cho thấy sự vượt trội của chế phẩm lỏng

so với chế phẩm dạng rắn

1.3.4 Ưu điểm của phân bón sinh học dạng lỏng

Theo Dr Krishan Chandra và cộng sự (1999), chế phẩm phân bón dạng lỏng

có các ưu điểm sau:

- Thời gian sử dụng kéo dài hơn từ 12 – 24 tháng

- Không gây ô nhiễm môi trường

- Dễ tương tác với cây trồng

- Có khả năng chịu được nhiệt độ lên đến 450C trong 2 năm

- Kiểm soát chất lượng dễ dàng

- Hiệu quả kinh tế cao

- Dễ dàng xử lý và lưu trữ

Hơn nữa, vì là phân bón dạng lỏng nên VSV được bảo quản trong chế phẩm, môi trường là chất dinh dưỡng cho VSV sinh trưởng, phát triển và bảo vệ khỏi những vi khuẩn bất lợi Có thể giải quyết vấn đề phân bón vsv trước đây đem lại

1.4 Nghiên cứu trong nước

Nhằm mục tiêu phát triển nông nghiệp sinh thái bền vững, Việt Nam từ lâu

đã có nhiều nghiên cứu phát triển phân lân vi sinh

Từ thập kỉ 90 của thế kỉ XX, các vi sinh vật phân giải lân sau khi nhân sinh khối được tẩm nhiễm vào chất mang tạo thành chế phẩm vi sinh vật phân giải lân hoặc phối trộn với chất hữu cơ tạo thành phân lân hữu cơ vi sinh vật

Nhiều thực nghiệm trong khuôn khổ đề tài Khoa học Công nghệ 02 – 06 (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam giai đoạn 1992 – 1995) ở nhiều địa phương trong cả nước đã xác định việc sử dụng phân VSV phân giải lân thay thế 30 – 50% lượng phân lân cần bón bằng quặng phosphoric mà năng suất cây trồng không thay đổi Sử dụng phân VSV phân giải lân có thể làm tăng 15% năng suất cây trồng hoặc tiết kiệm 1/3 lượng phân lân hóa học cần bón (Phạm Văn Toản

và cộng sự, 2000)

Một số chế phẩm phân bón vi sinh dạng lỏng có tác dụng phân giải lân khó tiêu đã được nghiên cứu và bán trên thị trường hiện nay như: chế phẩm Nobala của Công ty TNHH Công nghệ nông lâm, chế phẩm lỏng Dasvila của Công ty TNHH Dasco, phân bón vi sinh BioGro của Trung tâm nghiên cứu và ứng dụng phân bón

vi sinh thuộc Trường ĐH Khoa học tự nhiên Hà Nội

Tuy nhiên nhìn chung cho thấy, các chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng hiện nay vẫn còn ít được biết đến, giá thành còn khá đắt đối với nhà nông Việt Nam

1.5 Nghiên cứu ngoài nước

Phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng với những ưu điểm nổi trội, ngày càng được nhiều nước trên thế giới quan tâm nghiên cứu Nhiều công trình nghiên cứu ở châu Âu, châu Mỹ, Ấn Độ đã cho thấy những cải tiến tốt hơn so với phân bón

vi sinh phân giải lân dạng rắn nhờ bổ sung các chất bảo vệ tế bào, chất ổn định chế

phẩm, chất bảo quản…

Một nghiên cứu sơ bộ đã được tiến hành để xác định sự tồn tại của vi khuẩn

Bacillus megaterium trong chế phẩm lỏng có bổ sung chất bảo vệ tế bào PVP,

glycerol 12ml/L và nguồn đường, dưới ảnh hưởng của nhiệt độ trên cây đậu đũa Trong 4 tuần ở 480C cho mật độ tế bào 4 1010 cfu/ml, tăng cường lượng phosphate hấp thu, thời gian lưu trữ lên đến 6 tháng

Các chế phẩm trên nền chất mang rắn vốn có những hạn chế nhất định như thời gian sử dụng thấp, khả năng sống trong điều kiện nghèo nàn thấp, ô nhiễm cao

Đã có nhiều nghiên cứu nhằm thay thế, Calcium alginate đã được tìm thấy cho hiệu

quả tốt hơn than chì đối với Bacillus polymyxa và Pseudomonas striata

(Viveganandan và Jauhri, 2000)

Chế phẩm phân bón sinh học trên nền chất mang rắn có khả năng chịu nhiệt kém, trong khi các công thức chất lỏng có thể chịu được nhiệt độ cao đến 550C Độ

pH trong việc xây dựng chất lỏng của PSB dao động khoảng 7,0 – 6,46,

Azospirillum 7,01 – 6,71 và Azotobacter 7,1 – 6,6 (Leo Daniel và cộng sự, 2013)

Chế phẩm lỏng được xây dựng với 0,5% Sodium alginate, sau 10 ngày nuôi

ủ cho mật độ tế bào trong chế phẩm 3,2 108 cfu/ml Chế phẩm lỏng với 0,5% CMC, sau 10 ngày ủ cho mật độ tế bào trong chế phẩm 0,7 108 cfu/ml (Leo Daniel và cộng sự, 2013)

Theo Leo Daniel và cộng sự (2013), môi trường cải tiến cho chế phẩm phân

lân vi sinh dạng lỏng đã nghiên cứu trên vi khuẩn Bacillus megaterium là môi

trường Pikovskaya (g/L) gồm: chiết xuất từ nấm men 5, dextrose 10, Ca3(PO4)2 5, KCl 0.5, MgSO4 0.2, MNSO4 0.1, FeSO4 dấu vết, (NH4)SO4 dấu vết, glycerol 10ml

Theo Wang RinLing và cộng sự (2013), thì thành phần nuôi cấy tối ưu hoá bao gồm: lactose 6g/L, peptone 7,45g/L, NaCl 5g/L, MgSO4.7H2O 2,46g/L, CaCl21,22 g/L, và K2SO4 0,087 g/L Dưới môi trường nuôi cấy tối ưu này, số lượng các tế

bào sống của vi khuẩn Bacillus megaterium trong dịch lên men có thể đạt trên

2,0×109 cfu/ml

Hiện nay, hai nước Trung Quốc và Ấn Độ đang đẩy mạnh nghiên cứu và ứng

dụng công nghệ sinh học trong sản xuất phân lân vi sinh với quy mô công nghiệp, ứng dụng trên hàng chục triệu ha (Bạch Phương Lan, 2004)

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, thiết bị, hoá chất

2.1.1 Vật liệu

Bộ sưu tập 4 chủng VSV có khả năng phân giải phosphate khó tan tốt nhất

đã phân lập được từ mẫu đất ao Đồng Nai, mẫu vỏ cà phê ở Lâm Đồng, mẫu đất trồng đậu ở Đắk Nông của Nguyễn Thuý Hằng (2013)

2.1.2 Thiết bị

Nồi tiệt trùng Autoclave, cân kỹ thuật, cân phân tích, máy lắc, máy ly tâm, máy đo độ hấp thụ quang học, bộ chưng cất Kjeldahl, tủ lạnh thường, tủ cấy vô trùng, tủ ấm, kính hiển vi…

Cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức, pipet, micropipet, ống nghiệm,

đ a petri, Eppendorf, đũa thủy tinh, que cấy…

2.1.3 Hoá chất các môi trường sử dụng

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Từ 4 chủng VSV có hoạt tính phân giải phosphate canxi khó tan tốt nhất

trong bộ sưu tập 19 chủng VSV của Nguyển Thuý Hằng (2013) đã phân lập được từ mẫu đất ao Đồng Nai, mẫu vỏ cà phê ở Lâm Đồng, mẫu đất trồng đậu ở Đắk Nông Tiến hành kiểm tra độ thuần khiết của ống giống, đánh giá hoạt tính phân giải phosphate canxi khó tan, khả năng sinh tổng hợp IAA, khả năng cố định đạm sau thời gian bảo quản Từ đó tuyển chọn ra chủng VSV hoặc các chủng VSV phối hợp tốt nhất để sản xuất chế phẩm

- Nghiên cứu thời gian và phương pháp lên men phù hợp với các chủng VSV được tuyển chọn để sản xuất chế phẩm

- Nghiên cứu môi trường lên men chính và điều kiện nuôi cấy

- Nghiên cứu chất ổn định chế phẩm thích hợp

- Thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân dạng lỏng

Chọn môi trường lên men chính

Xác định hàm lượng thành phần môi trường lên men

chính và điều kiện nuôi cấy

Môi trường NB Môi trường NB1 Môi trường NB2

Chọn chất ổn định chế phẩm

4 chủng VSV có khả năng phân giải Ca3(PO4)2 khó tan

tốt nhất

Khảo sát độ thuần khiết

Khả năng hoà tan

Ca3(PO4), AlPO4

Khả năng sinh IAA

Khả năng

cố định đạm

Tuyển chọn chủng VSV tạo chế phẩm

Xác định thời gian lên men

Lên men chung

Lên men từng chủng riêng rẽ

Xác định phương pháp lên men

Pepton

2.4 Phương pháp luận

Để đạt mục tiêu thiết lập qui trình sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh vật phân giải lân khó tan dạng lỏng từ bộ sưu tập 4 chủng vi khuẩn phân giải lân khó tan của Nguyễn Thuý Hằng (2013) Người thực hiện đề tài tiến hành kiểm tra độ thuần khiết của các ống giống và khả năng phân giải Ca3(PO4)2 khó tan, khả năng sinh IAA, khả năng cố định đạm của các chủng VSV sau thời gian bảo quản Từ các kết quả kiểm tra và kết quả khả năng phân giải AlPO4 khó tan của Nguyễn Thuý Hằng (2013), tuyển chọn ra chủng VSV hoặc các chủng VSV phối hợp tốt nhất để sản xuất chế phẩm Sau đó xác định thời gian lên men, phương pháp lên men và chọn môi trường lên men chính để thu sinh khối VSV Từ môi trường lên men đã chọn, tiếp tục xác định hàm lượng các thành phần có trong môi trường và điều kiện nuôi cấy VSV Cuối cùng chọn chất ổn định thích hợp để sản xuất chế phẩm

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Khảo sát độ thuần khiết của giống

Quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 4 chủng VSV trên môi trường Pikovskaya đặc ở đ a petri:

- Tăng sinh 4 chủng VSV trong môi trường Pikovskaya lỏng điều chỉnh về

pH = 7, hấp khử trùng, ủ trong tủ ủ 370C

- Sau 24h, tiến hành pha loãng bằng cách dùng micropipette có đầu tip vô trùng hút 1ml dịch tăng sinh vào 9ml nước muối sinh lý vô trùng, được nồng độ pha loãng 10-1 Tương tự pha loãng đến nồng độ 10-7

- Dùng micropipette có đầu tip vô trùng hút 0,1ml dịch tăng sinh nồng độ pha loãng 10-7 cấy trải trên các đ a petri chứa sẵn môi trường thạch Pikovskaya Ủ trong tủ ủ 370C

- Sau 24h, tiến hành quan sát khuẩn lạc và so sánh đặc điểm hình thái so với kết quả của Nguyễn Thuý Hằng (2013) Những đ a petri xuất hiện khuẩn lạc khác với chủng được cấy có ngh a đã bị nhiễm trong thời gian bảo quản, cấy ria nhiều lần đến khi thuần khiết và giữ giống lại Các chủng VSV thuần khiết tiếp tục sử dụng

để nghiên cứu

Tiến hành nhuộm Gram, nhuộm bào tử (Theo Trần Linh Thước, 2007) và so sánh với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thuý Hằng (2013)

2.5.2 Tuyển chọn chủng VSV hoặc các chủng VSV phối hợp để sản xuất chế phẩm

2.5.2.1 Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate canxi khó tan của các chủng VSV

Thực hiện nuôi cấy 4 chủng VSV trên môi trường NB đã được hấp khử trùng, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 v/p Sau 24h, kiểm soát dịch tăng sinh VSV ở OD600nm = 0.8 bằng chính môi trường NB đã hấp khử trùng để đảm bảo mật độ tế bào bằng nhau giữa các VSV Hút 1ml dịch nuôi cấy NB cấy chuyển vào 20ml môi trường P đã hấp khử trùng, pH = 7, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng

Sau 3, 5 ngày, kiểm tra khả năng phân giải phosphate khó tan của từng VSV bằng phương pháp Stannous Chloride Mẫu đối chứng là mẫu chỉ chứa môi trường

P đã hấp khử trùng Lặp lại 3 lần với mỗi mẫu

2.5.2.2 Xác định khả năng sinh IAA của các chủng VSV

Thực hiện nuôi cấy 4 chủng VSV trên môi trường NB đã được hấp khử trùng, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 v/p Sau 24h, kiểm soát dịch tăng sinh VSV ở OD600nm = 0.8 bằng chính môi trường NB đã hấp khử trùng để đảm bảo mật độ VSV bằng nhau Sau đó hút 1ml dịch nuôi cấy NB cấy chuyển vào 20ml môi trường P, pH = 7 Nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng sau 5 ngày, thu dịch nuôi cấy đo lượng IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết ra môi trường bằng phương pháp Salkowski (Glickmann và Dessaux, 1995) Lặp lại 3 lần với mỗi mẫu Mẫu đối chứng chỉ chứa môi trường P đã hấp khử trùng

2.5.2.3 Xác định khả năng cố định đạm N-NH 4 + của các chủng VSV

Thực hiện nuôi cấy 4 chủng VSV trên môi trường NB đã được hấp khử trùng, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc 150 v/p Sau 24h, kiểm soát dịch tăng sinh VSV ở OD600nm = 0.8 bằng chính môi trường NB đã hấp khử trùng để đảm bảo mật độ VSV bằng nhau Hút 1ml dịch nuôi cấy NB cấy chuyển vào 20ml môi trường Ashby, điều chỉnh về pH = 7 Nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng sau 5 ngày, thu

dịch nuôi cấy và định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl (Johan Kjeldahl, 1883) Lặp lại 3 lần với mỗi mẫu Mẫu đối chứng chỉ chứa môi trường Ashby đã hấp khử trùng

2.5.3 Xác định thời gian và phương pháp lên men thu sinh khối

2.5.3.1 Xác định thời gian lên men

Thực hiện nuôi cấy 2 chủng VSV trên môi trường NB đã được hấp khử trùng, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 v/p Sau 24 giờ, kiểm soát dịch tăng sinh VSV ở OD600nm = 0.8 bằng chính môi trường NB đã hấp khử trùng để đảm bảo mật độ tế bào bằng nhau giữa các VSV Hút 1ml dịch nuôi cấy NB cấy chuyển vào 10ml môi trường NB mới đã hấp khử trùng, pH = 7, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng

Ở các mốc thời gian 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 giờ tiến hành kiểm tra tốc độ tăng trưởng của VSV bằng cách đo OD600nm Mỗi mốc thời gian lặp lại 3 lần, mẫu đối chứng là môi trường NB đã hấp khử trùng

Dựng đường cong tăng trưởng của VSV với trục tung là log(OD hiệu chỉnh), trục hoành là thời gian nuôi cấy

ODhiệu chỉnh = OD hệ số pha loãng (OD 0.4)

2.5.3.2 Xác định phương pháp lên men chung hoặc lên men từng chủng riêng rẽ

Thực hiện nuôi cấy từng chủng VSV trên môi trường NB đã được hấp khử trùng, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 v/p Sau 24h, kiểm soát dịch tăng sinh VSV ở OD600nm = 0.8 bằng chính môi trường NB đã hấp khử trùng để đảm bảo mật độ tế bào bằng nhau giữa các VSV

Lên men từng chủng riêng rẽ

Hút 1ml dịch nuôi cấy mỗi chủng, cấy chuyển riêng từng chủng vào 10ml môi trường NB mới đã hấp khử trùng, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng Mỗi mẫu lặp lại 3 lần

Sau 6h lên men, tiến hành đo mật độ tế bào bằng phương pháp đo quang phổ

ở bước sóng 600nm Mật độ tế bào khi lên men riêng bằng tổng mật độ tế bào của 2

Các môi trường kiểm tra khả năng phân giải lân, sinh IAA và khả năng cố định đạm, cấy chuyển vào 1ml dịch nuôi cấy VSV Trong 1ml chứa 0.5ml dịch nuôi cấy mỗi chủng OD600nm = 0.8 Tiến hành khảo sát các hoạt tính như các mục 2.5.2.1, 2.5.2.2, 2.5.2.3

Lên men chung

Hút 1ml dịch nuôi cấy mỗi chủng, cấy chuyển vào 20ml môi trường NB đã hấp khử trùng, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng Mỗi mẫu lặp lại 3 lần

Sau 6h lên men, tiến hành đo mật độ tế bào bằng phương pháp đo quang phổ

ở bước sóng 600nm

Khả năng phân giải lân, sinh IAA và khả năng cố định đạm tiến hành khảo sát như các mục 2.5.2.1, 2.5.2.2, 2.5.2.3

2.5.4 Khảo sát môi trường lên men và điều kiện nuôi cấy

Thực hiện nuôi cấy 2 chủng VSV đã tuyển chọn trên môi trường NB đã được hấp khử trùng, nuôi ủ trong 24h ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 v/p Sau 24h, kiểm soát dịch tăng sinh VSV ở OD600nm = 0.8 bằng chính môi trường NB đã hấp

khử trùng để đảm bảo mật độ tế bào bằng nhau giữa các VSV

2.5.4.1 Chọn môi trường lên men cơ bản

Từ môi trường lên men NB ban đầu, tiến hành khảo sát lên men trên môi trường NB có bổ sung nguồn đường Glucose (NB1) xem ở mục 2.1.3 và môi trường

NB bổ sung Glucose và khoáng (NB2) xem ở mục 2.1.3 Đo mật độ tế bào sau khi lên men bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 600nm

Hút 1ml dịch nuôi cấy NB cấy chuyển vào 10ml môi trường cần khảo sát

NB, NB1, NB2 đã hấp khử trùng, pH = 7, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng Sau 6, 12, 18, 24 giờ tiến hành đo OD600nm để kiểm tra mật độ tế bào Mỗi mẫu lặp lại 3 lần Mẫu đối chứng là VSV lên men trong môi trường NB

2.5.4.2 Xác định hàm lượng đường Glucose bổ sung

Sau khi chọn môi trường lên men cơ bản, tiếp tục khảo sát hàm lượng đường Glucose bổ sung bằng cách cố định các thành phần khác trong môi trường chỉ thay đổi hàm lượng Glucose có trong môi trường ở các mức 3g/L, 5g/L, 10g/L, 15g/L,

20g/L Đo mật độ tế bào sau khi lên men bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 600nm

Hút 1ml dịch nuôi cấy NB cấy chuyển vào 10ml môi trường bổ sung Glucose đã hấp khử trùng, pH = 7, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng Sau 18h tiến hành đo OD600nm để kiểm tra mật độ tế bào Mỗi mẫu lặp lại 3 lần Mẫu đối chứng là VSV lên men trong môi trường được chọn ở thí nghiệm trên

2.5.4.3 Xác định hàm lượng pepton bổ sung

Tương tự để xác định hàm lượng pepton bổ sung vào môi trường lên men, cố định các thành phần khác chỉ thay đổi hàm lượng pepton có trong môi trường ở các mức 3g/L, 5g/L, 10g/L, 15g/L, 20g/L Đo mật độ tế bào sau khi lên men bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 600nm

Hút 1ml dịch nuôi cấy NB cấy chuyển vào 10ml môi trường bổ sung Pepton

đã hấp khử trùng, pH = 7, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng Sau 18h tiến hành

đo OD600nm để kiểm tra mật độ tế bào Mỗi mẫu lặp lại 3 lần Mẫu đối chứng là VSV lên men trong môi trường được chọn ở thí nghiệm trên

2.5.4.4 Xác định hàm lượng khoáng bổ sung

Tương tự để khảo sát hàm lượng khoáng tối ưu trong môi trường lên men chính, cố định các thành phần khác chỉ thay đổi hàm lượng khoáng có trong môi trường

Gọi tỉ lệ nồng độ khoáng có trong môi trường lên men ban đầu là X (NaCl 5g/L, MgSO4.7H2O 2,46g/L, CaCl2 1,22g/L, K2SO4 0,087g/L) Người thực hiện đề tài tiến hành khảo sát hàm lượng khoáng ở các mức 0,5X, X, 1,5X, 2X Đo mật độ

tế bào sau khi lên men bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 600nm

Pha dung dịch khoáng với tỉ lệ nồng độ 2X, sau đó pha loãng thành dãy nồng

độ 0,5X, X, 1,5X, cố định các thành phần khác trong môi trường

Hút 1ml dịch nuôi cấy NB cấy chuyển vào 10ml môi trường bổ sung khoáng

đã hấp khử trùng, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng Sau 18h tiến hành đo

OD600nm để kiểm tra mật độ tế bào Mỗi mẫu lặp lại 3 lần Mẫu đối chứng là VSV lên men với môi trường được chọn ở thí nghiệm trên

2.5.4.5 Xác định điều kiện nuôi cấy

Sau khi xác định hàm lượng các thành phần trong môi trường lên men chính, tiến hành xác định mật độ oxy hoà tan thích hợp thông qua tốc độ lắc 120, 150, 180 v/p Đo mật độ tế bào sau khi lên men bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 600nm

Hút 1ml dịch nuôi cấy NB cấy chuyển vào 10ml môi trường lên men chính

đã hấp khử trùng, pH = 7, nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng với 3 tốc độ 120 v/p, 150 v/p, 180 v/p Sau 18h tiến hành đo OD600nm để kiểm tra mật độ tế bào Mỗi mẫu lặp lại 3 lần Mẫu đối chứng là VSV lên men ở chế độ lắc 150 v/p

2.5.5 Chọn chất ổn định thích hợp để tạo chế phẩm

2.5.5.1 Tạo chế phẩm phân bón vi sinh phân giải lân khó tan dạng lỏng

Thực hiện nuôi cấy 2 chủng VSV trên môi trường NB đã được hấp khử trùng, ở nhiệt độ phòng, trên máy lắc 150 v/p Sau 24h, kiểm soát dịch tăng sinh VSV ở OD600nm = 0.8 bằng chính môi trường NB đã hấp khử trùng để đảm bảo mật

độ tế bào bằng nhau giữa các VSV Hút 1ml dịch nuôi cấy NB cấy chuyển vào 10ml môi trường lên men NB đã hấp khử trùng, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng

Sau 6h lên men, bảo quản lạnh (4 – 80C) dịch lên men 4 – 5 giờ, sau đó tiến hành ly tâm 4000 v/p trong 15 phút để thu sinh khối và loại bỏ dịch nuôi cấy Dùng micropipette với đầu tip vô trùng chủng sinh khối VSV vào 20ml môi trường chế phẩm đã hấp khử trùng, pH = 7 Thể tích cấy 2 chủng VSV vào chế phẩm bằng nhau Mật độ tế bào trong chế phẩm bằng tổng mật độ tế bào của 2 chủng VSV và không nhỏ hơn 108 cfu/ml (TCVN 6169:1996) Mỗi mẫu lặp lại 3 lần Mẫu đối chứng là chế phẩm không có chất ổn định

Môi trường sử dụng làm chế phẩm là môi trường Pikovskaya lỏng, bổ sung 1% glycerol, 0,025% Tween 20 và 0,5% chất ổn định Sử dụng 3 loại chất ổn định khác nhau là Sodium Alginate, Tinh bột, CMC Pikovskaya là môi trường chứa dạng phosphate khó tan, thuận lợi cho sự phát triển của VSV phân giải lân Cũng là môi trường giữ giống và môi trường phân lập ban đầu

2.5.5.2 Kiểm tra chất lượng chế phẩm lỏng sau thời gian bảo quản

Chế phẩm sau khi bảo quản 4 tuần, tiến hành kiểm tra lại mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trực tiếp xem ở mục 2.6.5.1, khả năng phân giải

Ca3(PO4)2 khó tan được xác định bằng phương pháp Stannous Chloride xem ở mục 2.5.2.1, khả năng sinh tổng hợp IAA kiểm tra bằng phương pháp Salkowski xem ở mục 2.5.2.2, khả năng cố định đạm kiểm tra bằng phương pháp Kjeldahl xem ở mục 2.5.2.3 Từ đó chọn ra chất ổn định thích hợp, là chất ổn định của chế phẩm sau thời gian bảo quản có mật độ tế bào và các hoạt tính cao nhất

Kiểm tra mật độ tế bào

Hút 10ml chế phẩm đã lắc đều vào 90ml nước muối sinh lý 0,85% vô trùng, được nồng độ pha loãng 10-1 Tiếp tục hút 1ml dịch 10-1 vào 9ml nước muối sinh lý được nồng độ pha loãng 10-2 Pha loãng đến dãy nồng độ 10-5

, 10-6, 10-7 Dùng micropipette có đầu tip vô trùng hút 0,1ml dịch pha loãng 10-5, 10-6,

10-7 cấy trải trên các đ a petri chứa sẵn môi trường thạch Pikovskaya Mỗi độ pha loãng lặp lại 3 lần Ủ trong tủ ủ ở 370C

Sau 42 giờ, tiến hành đếm thô những khuẩn lạc đặc trưng của 2 chủng VSV trong chế phẩm

Kiểm tra khả năng phân giải Ca 3 (PO 4 ) 2 khó tan

Hút 1ml chế phẩm đã lắc đều, cấy chuyển vào 20ml môi trường Pikovskaya

đã hấp khử trùng, pH = 7, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng

Sau 5 ngày, kiểm tra khả năng phân giải phosphate khó tan của từng VSV bằng phương pháp Stannous Chloride xem ở mục 2.5.2.1 Lặp lại 3 lần với mỗi chai chế phẩm Mẫu đối chứng là mẫu chế phẩm không có chất mang

Kiểm tra khả năng sinh IAA

Hút 1ml chế phẩm đã lắc đều, cấy chuyển vào 20ml môi trường P đã hấp khử trùng, pH = 7, nuôi cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng

Sau 5 ngày, thu dịch nuôi cấy đo lượng IAA được vi khuẩn tổng hợp và tiết

ra môi trường bằng phương pháp Salkowski xem ở mục 2.5.2.2 Lặp lại 3 lần với mỗi chai chế phẩm Mẫu đối chứng là môi trường P cấy 1ml chế phẩm và đo IAA ngay

Kiểm tra khả năng cố định đạm

Hút 1ml chế phẩm đã lắc đều, cấy chuyển vào 20ml môi trường Ashby đã hấp khử trùng, pH = 7, nuối cấy lắc 150 v/p ở nhiệt độ phòng

Sau 5 ngày, thu dịch nuôi cấy và định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl xem ở mục 2.5.2.3 Lặp lại 3 lần với mỗi chai chế phẩm Mẫu đối chứng là môi trường Ashby cấy 1ml chế phẩm và phân tích Kjeldahl ngay

Chuẩn bị

Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet): Cân 2g tím kết tinh hoà tan trong 20ml ethanol 95%; Cân 0,8g ammon oxalat hoà tan trong 80 (ml) nước cất Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng

Dung dịch Lugol: Hoà tan 1g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml Bảo quản trong lọ tối

Dung dịch tẩy màu: Ethanol 95%

Dung dịch nhuộm bổ sung Fuchsin Ziehl: Fuchsin kiềm (C19H18N3Cl = 323,82 đvC) 1g, phenol 5g, ethanol 90% 10 ml, nước cất 200ml Hòa tan fuchsin với ethanol, hòa tan phenol với nước cất sau đó trộn lại

Tiến hành

Cố định mẫu: Nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống

Thực hiện nuôi cấy các chủng VSV phân lập được trên môi trường NB đã được hấp khử trùng, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 v/p Sau 24 giờ dùng que cấy ria lấy một ít dịch sinh khối cho lên giữa phiến kính (nếu thấy hơi đậm đặc

có thể pha loãng trước khi quan sát)

Làm khô trong không khí, sau đó hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 –

3 lần

Tiến hành nhuộm Gram:

- Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô

- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô

- Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fucshin Ziehl trong 2-3 phút, rửa nước,

để khô trong không khí

Tiến hành

Thực hiện nuôi cấy các chủng VSV phân lập được trên môi trường NB đã được hấp khử trùng, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 150 vòng/phút Sau 8 ngày, dùng que cấy ria lấy một ít dịch sinh khối cho lên giữa phiến kính (nếu thấy

hơi đậm đặc có thể pha loãng trước khi quan sát) Làm khô trong không khí, sau đó

hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2 – 3 lần

Nhỏ 1 – 2 giọt malachite 5% lên vết bôi và tiến hành hơ nước nóng trong 10 – 12 phút Rửa bằng nước cất trong 30 giây

Nhỏ 1 – 2 giọt Fuchsin trong 30 giây Rửa nước, để khô trong không khí Soi kính: dùng vật kính dầu 100x

2.6.2 Phương pháp Stannous Chloride xác định nồng độ orthophosphate

Nguyên tắc

Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate của các chủng VSV dựa trên nồng độ Orthophosphate (PO43-) có trong dịch nuôi cấy Nồng độ orthophosphate càng cao chứng tỏ lượng phosphate khó tan bị phân giải càng nhiều

Nồng độ orthophosphate được xác định bằng phương pháp Stannous Chloride (Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater) Trong môi trường acid, orthophosphate trong mẫu sẽ phản ứng với ammonium molypdate (AM) tạo thành molypdophosphoric acid (NH4)3PO4.12MoO3 màu vàng

Để tính tương quan giữa chỉ số mật độ quang (OD) và nồng độ orthophosphate cần thiết lập phương trình tương quan giữa hai chỉ số đó bằng

KH2PO4

*Xác định lượng phosphate dễ tan có trong dịch nuôi cấy VSV

Lấy dịch nuôi cấy VSV, đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch trong, bổ sung thêm 4ml AM, 10 giọt dung dịch SnCl2 Định mức tới vạch 50ml bằng nước cất, đảo đều bình, đợi 10-12 phút, đo OD600nm

*Tính toán lượng phosphate do VSV hòa tan vào dịch nuôi cấy:

[orthophosphate]VSV = [orthophosphate]TN – [orthophosphate]ĐC

2.6.3 Phương pháp Salkowski xác định nồng độ IAA

2.6.4 Phương pháp Kjeldahl định lượng đạm tổng số

Nguyên tắc

Vô cơ hóa mẫu

- Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:

2H2SO4 2H2O + 2SO2 + O2

- Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O; còn nitơ được giải phóng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch

2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4

Các nguyên tố P, K, Ca, Mg,…chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO,…

Chưng cất đạm

- Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH

Dung dịch B: hoà tan 0,5g methylene trong 100ml ethanol 50%

Khi dùng pha dung dịch A với dung dịch B theo tỉ lệ 1:1

Tiến hành

Vô cơ hoá mẫu

Hút 2ml dịch nuôi cấy cho vào bình phá mẫu, cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc

sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hoá) Cho thêm vào 2,5g chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để yên khoảng 3 phút Đặt bình phá mẫu lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thu tinh

Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte, đặt bình hơi nghiêng trên bếp, tránh trường hợp khi sôi mạnh hóa chất bắn ra ngoài, khi đã sôi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hóa chất trào ra ngoài và không bị bay mất ammoniac

Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình còn chưa bị oxi hoá vào trong dung dịch Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn Để nguội bình rồi chuyển toàn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nước cất vô đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch

Cất đạm

Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm có sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình có màu tím hồng Tiếp tục cho vào bình cất 20ml NaOH 40% cho đến khi toàn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ)

Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0,1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch có màu tím hồng) Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn Bật công tắc cất đạm Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn có làm xanh giấy quỳ không, nếu không thêm NaOH 40%

Sau khi cất đạm 20 – 25 phút để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn Nếu giấy qùy không đổi sang màu xanh là được Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa

Chuẩn độ

Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng

*Định lượng đạm tổng số có trong dịch nuôi cấy VSV

Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo công thức:

N (mg%) = ( )

Trong đó:

V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng

V2: số ml NaOH 0,1N đã chuẩn độ