Thử nghiệm quy trình sản xuất chế phẩm thuốc trừ sâu sinh học cải tiến và thử nghiệm hiệu lực trên sâu ăn tạp sâu ăn đọt cải

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC CẢI TIẾN VÀ THỬ NGHIỆM HIỆU LỰC TRÊN SÂU ĂN TẠP Spodoptera litura Fabricius, SÂU ĂN Đ

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC CẢI TIẾN VÀ THỬ NGHIỆM HIỆU LỰC TRÊN SÂU ĂN TẠP

(Spodoptera litura Fabricius), SÂU ĂN ĐỌT CẢI (Hellula undalis

Fabricius) TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI VÀ NGOÀI ĐỒNG

TỪ HAI LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

Metarhizium anisopliae và Beauveria bassina

Chủ nhiệm đề tài: LÊ HỮU PHƯỚC

Năm 2011

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

THỬ NGHIỆM QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM THUỐC TRỪ SÂU SINH HỌC CẢI TIẾN VÀ THỬ NGHIỆM HIỆU LỰC TRÊN SÂU ĂN TẠP

(Spodoptera litura Fabricius), SÂU ĂN ĐỌT CẢI (Hellula undalis

Fabricius) TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI VÀ NGOÀI ĐỒNG

TỪ HAI LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN TRÙNG

Metarhizium anisopliae và Beauveria bassina

BAN GIÁM HIỆU KHOA NN- TNTN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

Lê Hữu Phước

THÍ NGHIỆM BỔ SUNG DINH DƯỠNG TRONG QUÁ TRÌNH LÊN MEN CHẾ PHẨM VÀ THỬ NGHIỆM HIỆU LỰC CỦA HAI CHẾ PHẨM TỪ HAI LOÀI NẤM KÝ SINH CÔN

TRÙNG Metarhizium anisopliae, Beauveria bassina ĐỐI VỚI SÂU ĂN TẠP

(Spodoptera litura Fabricius) VÀ SÂU ĂN ĐỌT CẢI

(Hellula undalis Fabricius)

ThS Lê Hữu Phước

TÓM LƯỢC

Nhằm mục đích thử nghiệm môi trường nhân nuôi sinh khối cấp 2 có hiệu quả cao, giá thành thấp

để áp dụng vào quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ nấm Metarhizium anisopliae và nấm Beauveria

bassiana cũng như thí nghiệm về hiệu quả hai loài nấm này trong nhà lưới Thí nghiệm trong phòng

được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, bốn lặp lại để chọn ra môi trường nhân sinh khối cấp 2 (môi trường xốp) từ cơ chất nền là gạo, được bổ sung thêm lần lượt pepton, yeast extract và đường destrose Kết quả nấm Metarhizium anisopliae không cần thêm cơ chất nào cũng cho sinh khối tốt (đạt 26,97 x10 8 bào tử/gam sau khi chủng nấm 12 ngày) Trong khi đó, nấm Beauveria bassina cần bổ sung thêm 0,25 g pepton mới cho được lượng bào tử tối ưu (20,23 x10 8 bào tử/gam) Thí nghiệm trong nhà lưới trên sâu ăn tạp đối với cải tùa xại đã chọn ra nồng độ thích hợp là 15 g.l -1 cho cả hai loại nấm Cụ thể, hai nồng độ phun chế phẩm nấm Metarhizium anisopilae 15 g.l -1 và 20 g.l -1 đều đạt hiệu quả tốt (từ 70%-82%) sau 9 NSKP Nghiệm thức 2 (nồng độ 15 g.l -1 ) có hiệu quả không khác biệt nghiệm thức 3 (nồng độ 20 g.l -1 ) Nghiệm thức phun nấm Beauveria bassiana ở nồng độ 15 g.l -1 (có độ hữu hiệu đạt 70,34 %) cho hiệu quả tốt và kinh tế nhất.

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Phòng trừ sâu hại là một trong những khó khăn lớn nhất trong nghề trồng rau và là mối quan tâm

lo lắng hàng đầu của nông dân Biện pháp phòng trừ của nông dân chủ yếu dựa vào việc phun thuốc hóa học là chính mà rất ít biết đến các biện pháp khác Sự phát triển tính kháng thuốc của sâu hại cũng như ảnh hưởng của thuốc hóa học lên sức khỏe con người và môi trường đã tạo áp lực mạnh mẽ cho sự phát triển của các tác nhân sinh học trong phòng trừ tổng hợp côn trùng gây hại Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như Úc, Brazil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ tổng hợp các loài sâu gây hại một cách hợp

lý đã mang lại hiệu quả khá cao (Butt, T M và Copping, L., 2000) Biện pháp phòng trừ sâu hại bằng biện pháp sinh học đang được khuyến khích nghiên cứu, thử nghiệm để áp dụng, nhất là trên nhóm rau

ăn lá Tuy nhiên, việc sử dụng các dòng nấm này trong quá trình quản lý và phòng trừ còn hạn chế Việc thu thập, phân lập và thử nghiệm các dòng nấm có khả năng diệt sâu cao là yêu cầu thường xuyên và cấp thiết Từ đó, đưa đến yêu cầu cần phải tiến hành nghiên cứu bổ sung thêm các chất khoáng dinh dưỡng trong môi trường nhân sinh khối cấp 2 để tăng cường khả năng tạo mật số bào tử (sống) trên môi trường nhằm tạo nên tính dễ áp dụng ở điều kiện nông hộ cũng như việc thử nghiệm hiệu quả trừ sâu trên rau ở điều kiện nhà lưới nhằm bước đầu nghiên cứu và thử nghiệm hiệu quả sinh học diệt sâu của hai chế phẩm vi sinh

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thí nghiệm bổ sung dinh dưỡng cho môi trường xốp để nhân sinh khối 2 loài nấm

Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Beauveria bassiana (Bals.) Vuill

Chuẩn bị bào tử nấm: Tiến hành cấy và trữ các nguồn nấm vào đĩa Petri chứa các môi trường

dinh dưỡng cho nấm phát triển Khoảng 7-10 ngày sau khi sợi nấm đã hình thành và sinh ra một số lượng bào tử nhất định Tiến hành cạo nấm, lọc lấy dung dịch nấm, đếm mật số bào tử và tạo huyền phù bào tử (HPBT) có mật số có từ 108bào tử/ml

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương đương

với bốn loại môi trường (MT1, MT2, MT3, MT4) có thành phần cơ chất khác nhau và 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại ứng với một bình tam giác chứa 100g gạo và các loại dinh dưỡng bổ sung (pepton, Yeast

extract, Destrose)

Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng bào tử tổng số / 1g chế phẩm và CFU/g

2.2 Khảo sát hiệu quả của 2 chế phẩm đối với sâu ăn tạp (Spodoptera litura) trên cải tùa xại trong

điều kiện nhà lưới

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hình vuông latin (Latin Squares Design), 4

nghiệm thức x 4 lặp lại Mỗi đơn vị thí nghiệm là 1 chậu cải Ngẫu nhiên hóa sơ đồ bố trí thí nghiệm bằng phần mềm IRRITAT 4.0 for Window (hình 3) Thí nghiệm được chia ra thành hai thí nghiệm nhỏ cho từng loại nấm

Bảng 1 Nồng độ các nghiệm thức trong hai thí nghiệm

Nghiệm thức Metarhizium anisopilae (g.l -1 ) Beauveria bassiana (g.l -1 )

Lấy chỉ tiêu: Đếm tổng số sâu còn sống trước khi phun thuốc và 3, 6, 9 ngày sau khi phun thuốc ở mỗi

chậu Mỗi lần lấy chỉ tiêu ghi nhận nhiệt độ và ẩm độ Tính độ hữu hiệu bằng công thức Tilton

Henderson-3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu tìm môi trường sản xuất chế phẩm nấm Metarhizium anisopilae

Kết quả đếm bào tử tổng số và bào tử sống (CFU) được thể hiện bảng 4

Bảng 2: Mật số bào tử của nấm Metarhizium anisopilae trên môi trường xốp sau khi chủng nấm 12 ngày

Ghi chú: ns: khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức ý nghĩa 5% qua phép thử DUNCAN

Mật số bào tử tổng số của nấm Metarhizium anisopilae ở 12 ngày sau khi chủng trên môi trường

xốp cho lượng bào tử rất cao (từ 28,68 x108 bào tử/gamở MT1 đến 32,12 x108 bào tử/gamở MT3); tuy nhiên, cả bốn môi trường này đều không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5% Tương tự, mật số bào tử sống CFU (x108 bào tử/gam)và tỷ lệ sống ở cả 4 môi trường cũng không khác biệt nhau có ý nghĩa, mặc dù MT2, MT3 và MT4 có bổ sung thêm dinh dưỡng pepton, yeast extract và đường destrose

Tỷ lệ sống ở 12 NSKC ở cả 4 loại môi trường là khá cao (từ 80,13 % ở MT1 đến 83,97 % ở MT3), tuy nhiên, giữa chúng không có sự khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê (bảng 2)

Như vậy, ở cả 2 chỉ tiêu mật số bào tử tổng số và CFU, cả 4 môi trường xốp này đều tạo được sinh khối và tỷ lệ sống khá cao mà không khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê Điều này có thể là do trong gạo đã có đủ thành phần dinh dưỡng đáp ứng nhu cầu cho nấm phát triển trong suốt thời gian nhân nuôi sinh khối Do vậy, trong quá trình sản xuất chế phẩm, sử dụng môi trường 1 (chỉ sử dụng gạo thanh trùng không bổ sung thêm dưỡng chất) vừa đơn giản, nhanh vừa giảm được chi phí sản xuất so với các môi trường còn lại

Nghiệm thức Mật số bào tử tổng số

(x108 bào tử/gam) CFU (x10

8 bào tử/gam) Tỷ lệ sống (%)

3.2 Nghiên cứu tìm môi trường xốp để sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana

Kết quả đếm bào tử tổng số và bào tử sống (CFU) được thể hiện ở bảng 2

Bảng 3: Mật số bào tử nấm Beauveria bassiana trên bốn loại môi trường xốp sau khi chủng 12 ngày

Ghi chú: Trong cùng một cột, các số có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở mức ý

nghĩa 5% qua phép thử DUNCAN *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Kết quả thí nghiệm ở bảng 3 cho thấy mật số bào tử tổng số của nấm B bassiana trên bốn loại

môi trường xốp có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%, cao nhất là MT2 (gạo, nước, pepton) và

MT3 (gạo, nước, pepton, yeast extract), đạt lần lượt là 24,16 x 108 bào tử/gam chế phẩm và 25,12 x 108

bào tử/gam chế phẩm, thấp nhất MT1 (chỉ có gạo và nước), đạt 16,14 x 108 bào tử/gam chế phẩm Tuy

nhiên, giữa hai môi trường thử nghiệm MT2 và MT3 lại không khác biệt nhau có ý nghĩa (bảng 3)

Ở chỉ tiêu mật số bào tử sống CFU (colony forming unit, x108 bào tử/gam) cũng cho kết quả

tương tự ở hai môi trường MT2 và MT3, mật số bào tử sống cao hơn hai môi trường còn lại MT1 lại

MT4 nhưng giữa chúng lại không có sự khác biệt nhau qua phép thử Duncan ở mức ý nghĩa 5% Sau 12

ngày sau khi khi chủng, MT2 và MT3 đạt lần lượt là 20,23 x108 bào tử/gam và 22,30 x108 bào tử/gam;

trong khi đó hai MT1 và MT4 chỉ có 11,21 x108 bào tử/gam và 13,26 x108 bào tử/gam Do đó, tỷ lệ sống

được ghi nhận cao hơn ở hai môi trường MT3 và MT2 (88,77 % và 83,73 %) so với hai môi trường

(bảng 3)

Như vậy, môi trường MT2 được chọn khi sản xuất chế phẩm vì mật số bào tử sống CFU và tỷ lệ

sống không khác biệt có ý nghĩa thống kê với MT3 nhưng chi phí thấp hơn do không có Yeast extract

3.3 Hiệu quả của hai chế phẩm sinh học đối với sâu ăn tạp trên cải tùa xại trong điều kiện nhà

lưới

3.3.1 Đối với nấm Metarhizium anisopilae

Kết quả thí nghiệm ở bảng 4 cho thấy, các nghiệm thức đã bắt đầu có hiệu quả vào thời điểm 3

NSKP Nghiệm thức 1 (phun ở nồng độ 10 g.l-1) có hiệu quả thấp hơn hai NT2 (phun ở nồng độ 15 g.l-1)

và NT3 (phun ở nồng độ 20 g.l-1) có ý nghĩa thống kê ở mức 5%, tuy nhiên, hai nghiệm thức 1 và 2 lại

không khác biệt nhau

Ở 6 NSKP, các nồng độ ở các nghiệm thức phun nấm có hiệu quả tăng khá cao, khác biệt so với

đối chứng Hai nghiệm thức phun ở nồng độ 15 g.l-1 và 20 g.l-1 đạt hiệu quả khá cao (lần lượt là 64,61%

và 67,56%), giữa chúng không khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê nhưng cao hơn nghiệm thức phun ở

nồng độ 10 g.l-1 (chỉ đạt 52,48%)

Bảng 4: Hiệu quả của chế phẩm nấm Metarhizium anisopilae đối với sâu ăn tạp trên cải tùa xại trong

điều kiện nhà lưới, bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ, tháng 04-05/2009

Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) vào các ngày sau khi phun

Ghi chú: Trong cùng một cột các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa

5% qua phép thử DUNCAN; *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Đến 9 NSKP, hiệu quả của tất cả các nghiệm thức là rất tốt (đạt từ 70,13% đến 82,54%) Hai

NT2 (80,27%) và NT3 (82,54%) vẫn có hiệu quả cao hơn NT1 (70,13%) trên sâu ăn tạp có ý nghĩa

thống kê và giữa chúng vẫn không khác biệt nhau có ý nghĩa (bảng 4)

3.3.2 Đối với nấm Beauveria bassiana

Kết quả thí nghiệm ở bảng 5 cho thấy, tất cả các nghiệm thức đều có hiệu quả cao hơn nghiệm

thức đối chứng vào 3 NSKP, 6 NSKP và 9 NSKP có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5% (bảng 5)

Bảng 5: Hiệu quả của chế phẩm nấm Beauveria bassiana đối với sâu ăn tạp trên cải tùa xại trong điều

kiện nhà lưới, bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ, tháng 04-5/2009

Nghiệm thức Độ hữu hiệu (%) vào các ngày sau khi phun

Ghi chú: Trong cùng một cột các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa

5% qua phép thử DUNCAN *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Ở 3 NSKP, hiệu lực của chế phẩm nấm B bassiana đối với sâu ăn tạp đạt thấp, từ 20,51% (NT1)

đến 35,55% (NT3) Hai nghiệm thức NT2 (15 g.l-1) và NT3 (20 g.l-1) có hiệu quả cao hơn nghiệm thức

NT1 (10 g.l-1), tuy nhiên giữa chúng không khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê Đến 6 NSKP, nghiệm

thức 3 cho kết quả cao nhất (đạt 57,46%), tuy nhiên không khác biệt so với NT2 (47,56%) và thấp nhất

là nghiệm thức NT1 (chỉ đạt 39,46%) Tương tự, ở 9 NSKP, nấm B bassiana có hiệu quả cao hơn ở

nghiệm thức NT3 (đạt 78,04%), và NT2 (70,34%), NT1 (66,35%) cho hiệu quả thấp hơn Như vậy,

nghiệm thức phun B bassiana ở nồng độ 15 g.l-1 cho kết quả không thấp hơn so nồng độ 20 g.l-1 (bảng

5)

4 KẾT LUẬN

4.1 Thí nghiệm trong phòng

Mật số bào tử tổng số, bào tử sống của nấm Metarhizium anisopilae trên môi trường xốp sau khi

chủng nấm 12 ngày không có sự khác nhau giữa 4 loại môi trường dinh dưỡng có bổ sung các khoáng

chất khác nhau Mật số bào tử tổng số ở MT1 từ 22,98 x108 bào tử/gam đến 26,97 x108 bào tử/gam

MT1 (gạo + nước cất, thanh trùng) được chọn làm môi trường nhân sinh khối cấp 2 tốt nhất, vừa đơn

giản cho nông dân vừa giảm chi phí

Mật số bào tử nấm Beauveria bassiana trên bốn loại môi trường xốp sau khi chủng 12 ngày có

mật số bào tử sống CFU / g chế phẩm đạt cao nhất trong 4 nghiệm thức là MT3 (22,30 x108 bào tử/gam)

và MT2 (20,23 x108 bào tử/gam), tuy nhiên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với MT3 MT2

(100g gạo + 120 ml nước + 0,25 g pepton) được chọn làm môi trường xốp nhân khối nấm Beauveria

bassiana

4.2 Thí nghiệm trong nhà lưới

- Cả ba nồng độ phun chế phẩm nấm Metarhizium anisopilae (10 g.l-1, 15 g.l-1 và 20 g.l-1) đều đạt

hiệu quả tốt đối với sâu ăn tạp Spodoptera litura Fabricius trên cải tùa xại trong điều kiện nhà lưới (từ

70%-82%) sau 9 NSKP Nghiệm thức 2 (nồng độ 15 g.l-1) có hiệu quả không khác biệt nghiệm thức 3

(nồng độ 20 g.l-1)

- Nghiệm thức phun nấm Beauveria bassiana ở nồng độ 15 g.l-1 (có độ hữu hiệu đạt 70,34%) cũng

cho hiệu quả cao và kinh tế nhất

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Butt, T M and Copping, L 2000 Fungal biological control agents Pesticide Outlook 11: 186-191

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

Phòng trừ sâu hại là một trong những khó khăn lớn nhất trong nghề trồng rau và là mối quan tâm lo lắng hàng đầu của nông dân Biện pháp phòng trừ của nông dân chủ yếu dựa vào việc phun thuốc hóa học là chính mà rất ít biết đến các biện pháp khác Nông dân

đã sử dụng tới hơn 30 loại thuốc trừ sâu trên rau, trong đó có nhiều loại đã bị cấm sử dụng

(Nguyễn Quí Hùng và ctv., 1999) Sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius), sâu ăn đọt cải (Hellula undalis Fabricius và Crocidolomia binotalis Zeller), sâu tơ (Plutella xylostella), rầy phấn trắng (Bemiscia tabaci), sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) và bọ nhảy (Phyllostreta striolata) là những đối tượng gây hại quan trọng và phổ biến nhất trên nhóm

rau ăn lá tại Đồng bằng sông Cửu Long (Trần Thị Ba, 1999) Sự phát triển tính kháng thuốc của sâu hại cũng như ảnh hưởng của thuốc hóa học lên sức khỏe con người và môi trường đã tạo áp lực mạnh cho sự phát triển của các tác nhân sinh học trong phòng trừ tổng hợp côn trùng gây hại

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới như Úc, Brazil, Mỹ, Pháp, Colombia, Venezuela đã cho thấy việc sử dụng các loại nấm ký sinh côn trùng trong phòng trừ tổng hợp các loài sâu gây hại một cách hợp lý đã mang lại hiệu quả khá cao (Burges, 1998; Butt và Copping, 1999) Ở Châu Á, tại Malaysia, đã nghiên cứu

nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ mối đất đạt hiệu quả 64,57% sau 14 ngày Tại Philippines, đã nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để diệt rầy nâu hại lúa, hiệu lực đạt 60% sau 10 ngày Tại Úc, năm 1991 Milner đã nghiên cứu nấm Metarhizium anisopliae để phòng trừ bọ hung hại mía đạt hiệu quả 68% Tại Nhật Bản, năm 1988 một

số nhà khoa học đã sử dụng nấm Beauveria bassiana để phòng trừ dòi hại rễ củ cải đạt

hiệu quả trên 70% sau 10 ngày Tại Trung Quốc, Am và Wu đã sử dụng dòng nấm

Paecilomyces spp và Beauveria bassiana để phòng trừ sâu róm thông đạt hiệu quả cao

(trích dẫn Phạm Thị Thùy, 2004)

Ở trong nước, đã có một số nghiên cứu của Viện Bảo vệ thực vật phân lập được các dòng nấm ký sinh trên rầy nâu hại lúa, châu chấu hại bắp, sâu đo xanh hại đay, bọ hại dừa, sùng đất hại đậu phộng và sử dụng đạt được hiệu quả rất cao Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long cũng sử dụng các dòng nấm trên rầy nâu đạt hiệu quả rất tốt, hơn 67% sau 10 ngày

Tuy nhiên, việc sử dụng các dòng nấm này trong quá trình quản lý và phòng trừ rau

ăn lá còn hạn chế Ngoài ra, việc thu thập, phân lập và thử nghiệm các dòng nấm có khả năng diệt sâu cao là yêu cầu thường xuyên và cấp thiết Từ đó, đưa đến yêu cầu cần phải tiến hành nghiên cứu bổ sung thêm các chất khoáng dinh dưỡng trong môi trường nhân sinh khối cấp 2 để tăng cường khả năng tạo mật số bào tử (sống) trên môi trường nhằm tạo nên tính dễ áp dụng ở điều kiện nông hộ cũng như việc thử nghiệm hiệu quả trừ sâu trên rau ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng nhằm bước đầu nghiên cứu về hiệu quả sinh học diệt sâu của hai chế phẩm vi sinh này Đề tài: “Thử nghiệm quy trình sản xuất chế phẩm

thuốc trừ sâu sinh học cải tiến và thử nghiệm hiệu lực trên sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius), sâu ăn đọt cải (Hellula undalis Fabricius) trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng từ hai loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae và Beauveria bassina”

được thực hiện đáp ứng các yêu cầu trên

A MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

I MỤC TIÊU

1 Thử nghiệm sản phẩm trừ sâu sinh học cải tiến có hiệu quả đối với hai loài sâu hại quan

trọng trên cải tùa xại là sâu ăn tạp và sâu ăn đọt cải từ hai loài nấm Metarhizium anisopilae

(Metsch.) Sorok và Beauveria bassiana (Bals.) Vuill

2 Đánh giá hiệu quả của hai chế phẩm sinh học này trên cải tùa xại trong điều kiện nhà lưới và ngoài đồng

II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

1 Thí nghiệm bổ sung dinh dưỡng cho môi trường xốp (gạo thanh trùng) để nhân nhanh

sinh khối 2 loài nấm Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Beauveria bassiana (Bals.) Vuill

2 Khảo sát độ hữu hiệu của 2 chế phẩm đối với sâu ăn tạp trên cải tùa xại trong điều kiện nhà lưới

3 Khảo sát độ hữu hiệu của 2 chế phẩm đối với sâu ăn tạp và sâu ăn đọt cải trên cải tùa xại trong điều kiện ngoài đồng

B ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

I ĐỐI TƯỢNG

Hai chế phẩm trừ sâu sinh học từ hai loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Beauveria bassiana (Bals.) Vuill ảnh hưởng lên sâu ăn tạp

và sâu ăn đọt cải ở điều kiện nhà lưới và ngoài đồng

II PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Bổ sung dinh dưỡng cho môi trường xốp nhân nhanh sinh khối để sản xuất chế phẩm

2 loài nấm Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Beauveria bassiana (Bals.) Vuill

cho mật số bào tử cao

Thử nghiệm hiệu lực của 2 chế phẩm lên 2 loài sâu hại trên cây cải tùa xại là sâu ăn tạp và sâu ăn đọt cải

C CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I CƠ SỞ LÝ LUẬN

1 Sơ lược về một số đặc điểm của hai loài nấm ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana

1.1 Phân loại

Theo hệ thống phân loại nấm của Ainsworth, G C (1996), hai loài nấm ký sinh côn

trùng Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana được phân loại như sau:

Nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn, giống Deuteromycetes Một số tác giả khác lại cho rằng nấm Metarhizium anisopliae thuộc ngành phụ lớp nấm túi Asscomycotia, lớp Pletomyces và giống Metarhizium Tuy nhiên,

phân loại theo Ainsworth được nhiều tác giả chấp nhận hơn cả

Nấm Beauveria bassiana thuộc ngành phụ lớp nấm bất toàn Deuteromycetes, giống Beauveria Theo Macleod, H L (1954), loài Beauveria bassiana là loài điển hình trong chi

nấm bạch cương Beauveria

1.2 Sự phân bố

Nấm Metarhizium anisopliae được tìm thấy trên khắp các châu lục với hơn 200 loài

côn trùng khác nhau như rầy lá, rầy mềm, bọ xít đen và rất nhiều loài sâu hại khác Sau khi xâm nhiễm, chúng hình thành trên bề mặt côn trùng một lớp phấn màu xanh vàng đến màu xanh đậm, trên mạng sợi nấm chằng chịt màu trắng (Ferron L K, 1978)

Nấm Metarhizium anisopliae là nấm hại côn trùng, xuất hiện phổ biến trong tự

nhiên, có thể phân lập từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất Ở những nơi

không có côn trùng, người ta cũng phân lập được Metarhizium anisopliae ngay cả trong

điều kiện thời tiết rất khắc nghiệt (như ở Đức), trên những khu đất ở rừng sâu khi bị đốt cháy, cả trong những chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm) hoặc trong trầm tích ở sông chứa đất đầm lầy trồng những loại cây đước, hoặc trong tổ của một số loài chim và cả trong rễ

của cây dâu tây cũng có thể phân lập được nấm Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy,

2004)

Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng rãi trên khắp thế giới, được tìm thấy trên và

trong đất cũng như ký sinh trên rất nhiều loài côn trùng hại bông, khoai tây, lúa mì, đậu và

ngô ở Mỹ (Alaoui Abdelaziz và Elmeziane Abdellatif, 2008) Nấm Beauveria bassiana

(hay còn gọi là nấm bạch cương) là loại nấm hại côn trùng phân bố trên khắp thế giới, xuất hiện phổ biến trong tự nhiên, có thể phân lập dễ dàng từ xác côn trùng chết hay được phân lập từ trong đất (James R Fuxa và Yoshinori Tanada 1991.)

1.3 Đặc điểm hình thái, sinh học và khả năng gây hại

1.3.1 Nấm Metarhizium anisopliae

Nấm Metarhizium anisopliae có dạng sợi phân nhánh, có vách ngăn ngang, đường

kính 3 – 4 µm (Trần Thị Thanh, 2000) Sợi nấm phát triển trên bề mặt côn trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn mọc tỏa tròn trên đám sợi nấm dày đặc Bào tử trần hình que có kích thước 3,5 x 6,4 x 7,2 µm, màu từ lục xám đến ôliu - lục, bào tử xếp thành chuỗi khá chặt chẽ và nhìn bằng mắt thường có thể thấy bào tử được tạo ra trên bề mặt cơ thể côn trùng một lớp phấn khá rõ màu xanh lục Sợi nấm khi phát triển bên trong côn trùng có chiều rộng khoảng 3 - 4 µm, dài khoảng 20 µm, chia thành nhiều tế bào ngắn, trong tế bào có thể thấy rõ nhiều giọt mỡ (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nấm Metarhizium anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, khuẩn lạc có màu xanh, thỉnh thoảng có màu tối hoặc màu hồng vỏ quế Loài Metarhizium anisopliae có

2 dạng bào tử nhỏ và lớn, dạng bào tử nhỏ Metarhizium anisopliae var có kích thước bào

tử 3,5 - 5,0 x 2,5 - 4,5 µm, dạng bào tử lớn là Metarhizium anisopliae var major có kích

nhiễm bệnh bởi nấm Metarhizium anisopliae (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nấm Metarhizium anisopliae là loài nấm ký sinh rất rộng trên các đối tượng gây hại

nông lâm nghiệp trên khắp thế giới như bộ cánh cứng, cánh đều, cánh nửa cứng, cánh vẩy,… Cho đến nay các nhà khoa học trên thế giới vẫn chưa xác định được một loại vi

nấm nào có hiệu lực cao và phổ tác dụng rộng rãi như chủng M anisopliae Tại Úc năm

1995, Richard Miller đã tách được vài trăm dòng nấm Metarhizium anisopliae từ một

nhóm côn trùng sống trong đất dưới gốc mía Trong số 95 chủng thử nghiệm trực tiếp, tác

giả chỉ chọn được hai chủng có khả năng diệt sâu là Lepidota frenchi và L consobrina hại

rễ mía và một chủng diệt sâu Antitrogus parvulus với LD50 là 1 - 5 x 104 bào tử.g-1 Henel

đã chọn từ 22 chủng vi nấm, chỉ có 1 chủng Metarhizium anisopliae là phù hợp cho phương pháp phòng trừ sinh học đối với loài mối Masutiesrmes exitiosus (Hill K L, 1999,

trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy, 2004)

Nhiều loài nấm trong chi Metarhizium có khả năng diệt côn trùng thuộc họ Elalerdae

và Curculionidae thuộc bộ cánh cứng Coleoptera, ấu trùng muỗi Aedes aegypti, Anopheles setphensi, Clexpipiens thuộc bộ hai cánh Diptera, bọ xít đen hại lúa mì Scotiphora coarctata thuộc bộ cánh nửa cứng Hemiptera, châu chấu sống lưng vàng Patanga sucincta, châu chấu mía Heiroglyphus tonkinensis thuộc bộ cánh thẳng Orthopterra, mối hại đất Masutitermes extiosus thuộc bộ cánh bằng Isoptera

1.3.2 Nấm Beauveria bassiana

Nấm có sợi từ màu trắng đến màu kem có pha một ít màu đỏ, da cam, đôi khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trường sắc tố màu vàng, màu đỏ nhạt hoặc màu xanh da trời Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn ngang, có chiều dài khoảng 3 - 5μm phát triển dày đặc trên môi trường, về sau xuất hiện chi chít các cuống sinh bào tử

Đặc điểm của loại nấm này là có sợi xốp, cuống bào tử trần đứng riêng rẽ hay tụ lại thành từng đám, không phân nhánh hoặc phân nhánh, hình ống hoặc hình bình với chiều dài không đều nhau Trên cuống có những nhánh nhỏ mang bào tử trần (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nấm Beauveria bassiana sinh ra những bào tử trần đơn bào (chỉ gồm một tế bào)

không màu, trong suốt, không vách ngăn từ hình cầu (đường kính 1 – 4 µm) đến hình trứng (kích thước 1,5 - 5,5 µm) Bào tử trần mọc trong vòng xoắn, phát sinh từ sợi sinh dưỡng mọc thành từng đám, có cuống phình ra Tế bào sinh bào tử trần có cuống dạng hình cầu hoặc elip, hình thoi trụ, hình cổ chai Cuống tế bào sinh bào tử trần có hình ziczag nhưng là mấu dạng răng nhỏ phát sinh bởi sự kéo dài của gốc ghép (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nấm Beauveria bassiana xâm nhiễm nhiều loài côn trùng gây hại cho nông nghiệp

thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh màng Hymenoptera, và

cả bộ cánh nửa cứng Hemiptera, bộ hai cánh Diptera (Lewis và Bing, 1991) Clark G H và

ctv., (1986) cho biết có thể sử dụng nấm Beauveria bassiana để diệt muỗi

1.4 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa

1.4.1 Nấm Metarhizium anisopliae

Nấm Metarhizium anisopliae không thể sinh trưởng tốt trên nền cơ chất không có

kitin, chúng sống được ở nhiệt độ thấp 80C, có biên độ về độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều

CO2 và thiếu O2 chúng có thể sống tới 445 ngày

Ở nhiệt độ dưới 100C và trên 450C thì nấm thường không hình thành bào tử Nhiệt

độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là từ 25 - 300C và sẽ bị chết ở 49 - 550C, nhiệt độ cho nấm phát triển tốt nhất là 250C pH thích hợp là 6,0 và có thể dao động trong khoảng

3,3 - 8,5 Nấm Metarhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, xenlulose và kitin

(lông và da côn trùng)

Nấm Metarhizium anisopliae có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon khác

nhau Chúng phát triển tốt trên môi trường có chứa glucose hay lipid Muốn tạo thành bào

tử, nấm Metarhizium anisopliae đòi hỏi phải có ẩm độ không khí khá cao

Sản phẩm trao đổi chất có thể làm tê liệt ấu trùng của sâu loài Galleria, Mellonela và Bombyx mori Trong dịch nuôi cấy người ta đã tách được dung dịch toxin và xác định bản

chất hóa học của chúng là peptid vòng destruxin A, B, C và D (Phạm Thị Thùy, 2004)

Ở nhiệt độ dưới 10 0C và trên 45 0C thì nấm thường không hình thành bào tử Nhiệt

độ thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là từ 25 – 30 0C và bị chết ở 49 – 55 0C, nhiệt độ cho nấm phát triển tốt nhất là 22 - 250C pH thích hợp là 6 và có thể dao động trong

khoảng 3 - 8,5 Nấm Beauveria bassiana có khả năng phân giải tinh bột, xeluloza và kitin (lông và da côn trùng) Chase A R và ctv., sử dụng môi trường chứa nguồn tinh bột tự nhiên (bột yến mạch) để phân lập nấm Beauveria bassiana

Nấm Beauveria bassiana có thể đồng hóa nhiều nguồn thức ăn carbon khác nhau

Chúng phát triển tốt trên môi trường có thể chứa glucose hay lipid Muốn tạo thành bào tử,

nấm Beauveria bassiana đòi hỏi phải có ẩm độ không khí cao, tuy nhiên ẩm độ dưới 50%

vẫn kích thích nấm sinh bào tử (Gottwald G L, H L Tedders, 1982)

1.5 Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng và các sản phẩm trao đổi chất

1.5.1 Nấm Metarhizium anisopliae

Độc tố của nấm M anisopliae gồm một số ngoại độc tố có tên là Destruxin A, B, C

hay D Các ngoại độc tố đó là các sản phẩm thứ cấp vòng peptit, L-prolyu, L-leucine, anhydride và Desmethyl Destruxin B Cấu trúc cơ bản của chúng gồm 5 aminoacid và α-hytroxy acid Destruxin gây chán ăn và gây độc cho côn trùng khi chúng hấp thu vào da,

một số Destruxin gây tê liệt côn trùng (Amiri, B L và ctv., 1999; Dumas, C K và ctv., 1996) Một số Destruxin khác ức chế miễn dịch rất mạnh mẽ (Cerenius, L và ctv., 1998)

Các sản phẩm thứ cấp đó thường được tích lũy vào cuối giai đoạn sinh trưởng của nấm, khi các nguồn thức ăn và năng lượng cạn kiệt (Phạm Thị Thùy, 2004)

Theo Suziki, K Kawakami và ctv., (1971):

Destruxin A có công thức nguyên là: C29H47 N5O7, có điểm sôi là 188 0C

Destruxin B có công thức nguyên là: C30H51O7N5, có điểm sôi là 234 0C

Gần đây, Alexandr Jegorov, Petr Sedmera, Vladimr Havlek and Vladimr Mat'ha (1998) đã ly trích thành công được độc tố có tên là Destruxin Ed1, một Cyclopeptide từ nấm này

Năm 1969, Hamill, R L đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm bạch

cương Beauveria bassiana và đặt tên cho độc tố này là Beauvericin Dombrink Kurtzman

M.A (2003) đã xác định bản chất của độc tố sinh ra trong quá trình trao đổi chất là vòng peptit có sắc tố màu vàng là tenelin và basianin, những sắc tố này có thể là do hydroxylat progesteron và những phần nhỏ tách ra từ testosteron (C19H28O2) sinh ra

Destrxin A Destrxin B

Nguồn: Pedras

Hình 1: Cấu trúc độc tố thực vật (phytotoxin) của nấm Metarhizium anisopliae

1.5.2 Nấm Beauveria bassiana

Độc tố của nấm Beauveria bassiana là Beuvericin Về mặt hoá học, Beuvericin có

danh pháp là xyclo (N-metyl L-phenylalanin-D-α-hydroxy- izovaleryl) 3 Đó là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93 -94 0C Từ 1 lít môi trường nuôi cấy nấm bạch

cương Beauveria bassiana các nhà khoa học Trung Quốc ở trường Đại học tổng hợp Nam

Khai (Thiên Tân) đã tách ra được 1,5 g độc tố Beauvericin và từ 1 kg môi trường đặc các tác giả đã chiết tách ra được 3,8 g Beauvericin (Phạm Thị Thùy, 2004)

Nguồn: Cha-Gyun Shin

Hình 2: Cấu trúc độc tố thực vật (phytotoxin) của nấm Beauveria bassiana

Thành phần của môi trường sẽ gây ảnh hưởng đến sự sản sinh độc tố của nấm

Beauveria bassiana Theo Fang W, Bidochka MJ (2006), sự hiện diện của đường fructose trong môi trường nuôi cấy sẽ làm gia tăng đáng kể độc tố Beauvericin của nấm Beauveria bassiana

Theo Bidochka M J và J J Khachatourians (2001) thì sản phẩm của nấm Beauveria bassiana là 2 axit hữu cơ, đó là axit oxalic và axit citric, khi nuôi cấy trên môi trường có

chứa kitin Các tác giả đã chứng minh được chính hai axit trên đã tham gia vào trong quá trình hòa tan protein biểu bì của côn trùng (Phạm Thị Thùy, 2004)

1.6 Cơ chế tác động của nấm lên côn trùng

1.6.1 Metarhizium anisopliae

Khi bào tử nấm Metarhizium anisopliae bám trên bề mặt côn trùng sẽ nảy mầm tạo

thành ống mầm xuyên qua biểu bì bên ngoài Bào tử bám chặt vào da và tấn công theo cơ chế bám dính không chuyên biệt thông qua tính kỵ nước của vách tế bào (Bocias, H I; Bandan, A R., 1988; 1991) Khi tiếp xúc với da côn trùng và với điều kiện thích hợp bào

tử sẽ mọc mầm có thể tạo ra các cấu trúc xâm nhiễm như tạo ra các ống mầm, túi ngoại bào hoặc túi áp suất, từ đó xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp chitin Sự xâm nhập của nấm vào trong biểu bì thường là do sự phối hợp của enzyme và cơ chế cơ học Nấm tiết ra các loại men làm mềm lớp vỏ chitin và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào

tử mọc mầm, qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng Các enzyme đó là exoproteases, endoproteases, esterases, lipases, chitinases và

chitobiases (Leger St và ctv., 1996; Butt và ctv., 1998)

1.6.2 Beauveria bassiana

Những bào tử nấm Beauveria bassiana thường bay trong không khí khi dính vào côn

trùng, gặp điều kiện thích hợp sẽ nảy mầm và mọc thành sợi nấm đâm xuyên qua vỏ kitin Chúng phát triển ngay trong cơ thể côn trùng cho đến khi xuất hiện các tế bào nấm đầu tiên (có dạng chuỗi ngắn như nấm men), côn trùng đã phải huy động hết các tế bào bạch huyết (lympho-cyte) để chống đỡ nhưng nấm bạch cương đã sử dụng những vũ khí hóa học rất lợi hại là độc tố Beauvericin, proteaza và một số chất khác làm cho tế bào bạch huyết của tằm không chống đỡ nổi nên lần lượt bị huỷ diệt Khi độc tố nấm đã tiêu diệt hết các tế bào bạch huyết cũng là lúc côn trùng bị chết, cơ thể côn trùng bị cứng lại là do các sợi nấm đan xen lại với nhau; bào tử của nấm bạch cương đã được sử dụng một cách có hiệu quả để phòng trừ nhiều loại côn trùng hại cây trồng (Phạm Thị Thùy, 2004)

1.7 Ảnh hưởng của điều kiện bên ngoài đối với sự sinh trưởng và phát triển của hai

loài nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana

1.7.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu môi trường không tốt nấm mọc yếu hoặc không mọc Trong quá trình nảy mầm để hình thành

bào tử M anisopliae cần các nguồn C, N Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau Môi trường thích hợp nhất cho nấm M anisopliae là môi trường có chứa

chitin làm nguồn cacbon, nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi

cấy nấm M anisopliae sẽ thu được số lượng bào tử cao, bởi vì thành phần chitin trong môi

trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loại nấm, nó giúp cho sự phát triển và hình thành bào tử đính (conidiospore) và bào tử trần (Blastoospore)

Các tác giả như Rombach (1888), Hegedus và ctv (1993), Jenkins và Prior (1994) đã

sử dụng phương pháp nuôi cấy chìm để sản xuất nấm sẽ thu được kết quả tốt, vì trong nuôi

cấy chìm người ta đã xác định được khả năng sinh bào tử chồi và lượng sinh khối M anisopliae rất cao Li và ctv bằng phương pháp nuôi cấy chìm đã thí nghiệm tách chiết theo phương pháp bản mỏng và các tác giả đã xác định được độc tố của M anisopliae là

Destruxin A, B, C, D (trích dẫn từ Phạm Thị Thùy, 2004)

1.7.2 Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự phát triển của bào tử nấm

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trưởng và phát triển, nếu môi trường không tốt nấm mọc yếu hoặc không mọc

1.7.2.1 Metarhizium anisopliae

Trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử, nấm M anisopliae cần các nguồn C,

N Sự phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau Môi trường thích hợp

nhất cho nấm M anisopliae là môi trường có chứa chitin làm nguồn cacbon, nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi cấy nấm M anisopliae sẽ thu được số

lượng bào tử cao, bởi vì thành phần chitin trong môi trường nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loại nấm, nó giúp cho sự phát triển và hình thành bào tử đính (Conidiospore) và bào tử

trần (Blastospore) Ngoài nguồn nitơ vô cơ ra, nấm M anisopliae còn sử dụng tốt nguồn

hữu cơ như protein, pepton, các axit amin trong đó có axit glutamic là axit thích hợp cho nấm phát triển Các nguyên tố vi lượng như C++, Zn++ có tác dụng kích thích cho sự phát

triển của nấm (Leger St, et al., 1996)

1.7.2.2 Beauveria bassiana

Nấm Beauveria bassiana khi nảy mầm cần rất nhiều chất dinh dưỡng, nếu để trong

nước cất thì chúng nảy mầm rất ít hoặc nảy mầm rất chậm Nấm bạch cương nảy mầm tốt trong môi trường có đường mía và peptone (Trần Văn Mão, 2002)

Cũng như nấm Metarhizium anisopliae, nấm Beauveria bassiana cần các nguồn C,

chitin và glucoza

Trong các loại đường nói chung, đường glucoza luôn là nguồn carbon khá tốt cho

các loài nấm Nấm Beauveria bassiana sử dụng glucoza trong đường đơn khá tốt, nhưng

xyloza lại rất kém; trong đường đôi chúng sử dụng đường mía và đường maltoza khá tốt nhưng đường lactoza lại rất kém; trong đường đa chúng sử dụng tinh bột rất tốt, đường đơn lại rất kém; đối với xenluloza hầu như chúng không sử dụng Trong axit chúng sử dụng axit hữu cơ (lactic) rất kém, nhưng glycerin (3 cacbon và 6 cacbon) lại rất tốt (Trần Văn Mão, 2002)

Không những yêu cầu về nguồn cacbon, nấm Beauveria bassiana còn yêu cầu nitơ hữu cơ và vô cơ, trong nitơ vô cơ nấm Beauveria bassiana sử dụng tốt NO3- tốt hơn là

NH4+ P là nhân tố quan trọng làm tăng sản lượng nấm bạch cương, trong giai đoạn sinh

trưởng hàng loạt sợi nấm, Beauveria bassiana rất cần C, N, nhưng đến khi sợi nấm đứt ra

thì nhu cầu C, N giảm dần, nhu cầu đối với P tăng lên (Trần Văn Mão, 2002)

1.7.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và ẩm độ lên nấm

Nhiệt độ và ẩm độ là những nhân tố quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của

nấm Metarhizium anisopliae và nấm Beauveria bassiana Nói chung, phạm vi nhiệt độ của nấm Metarhizium anisopliae là khoảng 5 - 350C Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị

Thùy và ctv., (1999) thì nhiệt độ tối ưu cho nấm M anisopliae phát triển là 25-300C, nhiệt

độ từ 300C trở lên nấm sinh trưởng giảm dần và trên 350C nấm ngừng sinh trưởng

Gần đây Stathers và ctv đã công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm gây bệnh côn trùng Theo tác giả thì nấm M anisopliae

thích hợp ở nhiệt độ là 280C (trích dẫn Phạm Thị Thùy, 2004)

1.7.4 Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự hình thành bào tử

Ánh sáng có tác dụng xúc tiến bào tử nảy mầm và hình thành bào tử, mặt khác ánh sáng cũng có tác dụng ức chế và diệt nấm Qua nhiều năm sản xuất nấm côn trùng, viện

Bảo vệ thực vật xác định nấm M anisopliae và nấm B bassiana phát triển tốt trong điều

kiện ánh sáng yếu, chỉ cần một lượng ánh sáng nhỏ trong ngày với thời gian chiếu sáng 6 –

8 giờ cũng đủ cho nấm phát triển tốt Nếu dưới ánh sáng trực xạ nấm M anisopliae rất khó

nẩy mầm

1.7.5 Ảnh hưởng của độ thoáng khí

Nấm M anisopliae thuộc loại hiếu khí, khi nấm phát triển chúng đòi hỏi có hàm

lượng oxy thích hợp trong cả biên độ rộng cũng như trong dụng cụ nuôi cấy, phạm vi thích hợp cho các loại nấm côn trùng phát triển là 0,3 - 0,7m3 môi trường/m3 không khí Nếu sản xuất lớn cần để độ dầy bề mặt (xốp) của nấm trên khay hay nia khoảng 10 – 15cm trong phòng sản xuất có không gian thích hợp và điều kiện ôn ẩm độ phù hợp (Phạm Thị Thùy, 2004)

1.7.6 Ảnh hưởng của hàm lượng nước

Nấm M anisopliae đòi hỏi lượng nước thích hợp, nếu quá khô hoặc quá ẩm thì nấm

phát triển đều không tốt, tỷ lệ thích hợp nhất là 30 - 50% (Phạm Thị Thùy, 2004)

1.7.7 Ảnh hưởng của độ pH

Phạm vi các loài nấm M anisopliae sống ở pH từ 3,5 - 8,0, song các loại nấm trên

ưa môi trường axit và phát triển thích hợp nhất ở dộ pH từ 5,5 - 6

Theo Trần Vũ Mão (2002) thì nấm M anisopliae có phạm vi pH là 6,9 - 7,2 Nói

chung, lợi dụng hợp chất cacbon làm giảm pH nhưng lợi dụng protein lại làm tăng pH, đã

bổ sung vào môi trường một lượng nhỏ KH2PO4 và MgSO4.7H2O mục đích là để duy trì tính ổn định của pH trong môi trường nuôi cấy

2 Công nghệ sản xuất nấm côn trùng và tình hình nghiên cứu ứng dụng trong và ngoài nước

2.1 Một số nguyên liệu dùng để sản xuất nấm côn trùng

2.1.1 Nước

Nước là nguồn nguyên liệu quan trọng vì các môi trường nuôi cấy cần một lượng rất lớn Tuy nhiên, nước dùng cho công nghệ sản xuất vi sinh vật phải là nước sạch và mềm Các chỉ số quan trọng của nước là: độ cứng, độ oxy hoá và vi sinh vật

Độ cứng của nước thể hiện bằng sự có mặt của ion Ca2+ và Mg2+ trong nước Muối cacbonat của hai ion này biểu hiện độ cứng tạm thời Còn các ion khác như Cl-, SO42-,

NO3-, là biểu hiện của độ cứng vĩnh cửu

Độ oxy hoá của nước cho biết mức độ nhiễm bẩn của nước bởi các chất hữu cơ, chỉ

số này được thể hiện bằng mg O2/lít

Chỉ số vi sinh vật cho biết mức độ nhiễm bẩn của nước (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

2.1.2 Gạo

Gạo là một sản phẩm lương thực Hạt gạo màu trắng, nâu hoặc đỏ thẫm, chứa nhiều dinh dưỡng Hạt gạo chính là nhân của thóc sau khi tách bỏ vỏ trấu và cám Gạo được gần một nửa dân số thế giới dùng phổ biến

Lớp ngoài cùng của hạt và mầm hạt gạo đều chứa các chất dinh dưỡng quý như đạm, mỡ, canxi và vitamin nhóm B Không nên xay xát gạo trắng quá làm mất chất dinh

dưỡng

Bảng 1: Thành phần dinh dưỡng trong 100g gạo (Năng lượng1461 kJ (344 kcal))

Nước: 12,9 g F:150 µg Leu: 660 mg

Protein: 6,8 g Iod: 2µg Lys: 290 mg

Lipit: 0,6 g Se: 10-70 µg Met: 170 mg

Cacbohydrate: 77,8 g Vitamins Phe: 390 mg

Xơ:1,4 g Vitamin E: 70 µg Thr: 280 mg

Khoáng chất: 0,5 g Vitamin B1: 60 µg Trp: 90 mg

Khoáng chất Vitamin B2: 30 µg Tyr: 260 mg

Na: 6 mg Nicotinamide:1300 µg Carbohydrates

K : 105 mg Pantothenic acid: 630 µg Sucrose: 150 mg

Mg: 65 mg Vitamin B6: 150 µg Lipit

Ca : 6 mg Biotin: 3 µg Palmitic acid: 110 mg Mn: 2 mg Folic acid: 30 µg Stearic acid: 12 mg

Fe : 600 µg Amino Acids Oleic acid: 220 mg

Cu : 130 µg Arg: 570 mg Linolic acid: 220 mg Zn: 500 µg His:170 mg Linoleic acid: 12 mg P:120 mg Ile: 340 mg

(Nguồn: http://www.food-allergens.de/symposium-vol1(4)/data/rice/rice-composition.htm)

2.2 Phương pháp lên men xốp

Xác định được môi trường nuôi cấy là yếu tố rất quan trọng cho nấm côn trùng sinh trưởng và phát triển Đồng thời biết được nếu môi trường không tốt, nấm mọc yếu hoặc không mọc vì trong quá trình nảy mầm để hình thành bào tử, nấm côn trùng cần các nguồn

C, N Theo kết quả nghiên cứu của Phạm Thị Thuỳ và ctv., (1992) thì môi trường nhân

giống cấp 1 là môi trường Sabouraud bổ sung thêm khoáng chất là môi trường tốt nhất để

nấm Metarhizium anisopliae phát triển Môi trường gồm có agar, pepton, glucoza,

MgSO4.7H2O

Để sản xuất nấm ký sinh côn trùng người ta thường dùng những hạt cơ chất rắn, những loại hạt này có hoặc không có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trên bề mặt Các hạt cơ chất rắn này có thể đóng vai trò làm nguồn chất dinh dưỡng, ví dụ như cám lúa

mỳ, bột ngô, tấm, bánh hạt bông các loại dầu…hoặc nó có thể chỉ đơn giản đóng vai trò như chất mang vô cơ (Dulmage và Rhodes, 1971, được trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy, 2004)

2.3 Tình hình sản xuất và ứng dụng chế phẩm nấm ký sinh côn trùng ở Việt Nam và trên thế giới

Với phương pháp lên men xốp có thể dễ dàng tạo được một lượng lớn chế phẩm diệt sâu ở dạng dính bào tử bền vững để thử nghiệm ngoài đồng ruộng Quy trình kỹ thuật cũng tương đối đơn giản

Khi nuôi nấm diệt sâu trên môi trường xốp, đã đạt hiệu suất bào tử cao, cho phép rút ngắn thời gian thu được một lượng vật liệu bào tử so với các phướng pháp lên men khác,

để chống sâu bệnh Tuy nhiên, khả năng sống của bào tử trong chế phẩm phụ thuộc không chỉ vào điều kiện bảo quản mà còn phụ thuộc vào sấy khô và cơ chất dinh dưỡng

Chuẩn bị các loại môi trường cấp 1 và cấp 2 Cấy giống cấp 1 vào môi trường nhân giống và môi trường sản xuất theo quy trình sau:

Ống giống thuần môi trường nhân giống cấp 1 môi trường nhân giống cấp 2 Rải ra khay để hình thành bào tử thu sinh khối, sấy khô 400C có

độ thông gió trong 6-8 giờ hỗn hợp phụ gia để tạo chế phẩm nấm kiểm tra chất lượng bào tử nấm Thử hoạt lực trên sâu đóng gói để bảo quản và sử dụng

Nguồn: Phạm Thị Thùy (2004)

2.3.2 Trên thế giới

Theo tài liệu của Phạm Thị Thùy (2004), Metschnhikov đã phát hiện và phân lập

được nấm xanh Metarhizium anisopliae trên sâu non bộ cánh cứng hại lúa mì (Anisophiae austrinia) từ năm 1878 Tác giả đã tìm ra con sâu mang bệnh nấm và nghiên cứu để nhân

nuôi chúng rồi thử lại bằng cách sử dụng bào tử nấm thuần khiết gây bệnh trên ấu trùng và

dạng trưởng thành của sâu non bọ đầu dài hại củ cải đường (Bothinaderes punctiventris),

ông nhận thấy có hiệu quả Sau đó, Metschnhikov vẫn miệt mài với những nghiên cứu ứng dụng nấm trên đồng ruộng và xác định khả năng sử dụng nấm gây bệnh trên côn trùng vào thực tiễn sản xuất Cùng với học trò của mình là nhà côn trùng học Isac Craxinstic, ông đã

tiến hành sản xuất bào tử nấm Metarhizium anisopliae dạng thuần khiết rồi trộn với chất

bột nền và đưa ra đồng ruộng để diệt sâu non và trưởng thành bọ đầu dài hại củ cải đường

(Bothinaders punctiventris), hiệu quả đạt được 55 - 80% sau 10 - 15 ngày thử nghiệm

Vấn đề được nghiên cứu nhiều nhất là thành phần dinh dưỡng cũng như phương

pháp nuôi cấy nấm côn trùng Để nhận được lượng sinh khối và bào tử nấm, Dangar và ctv (1991) đã nuôi cấy nấm M anisopliae trên môi trường Czapek-Dox là phù hợp nhất Các

tác giả cũng đã nhận thấy trong số các loại ngũ cốc sử dụng làm nguồn cacbon thì gạo là

phù hợp hơn cả, và khi nuôi cấy nấm M anisopliae để sản xuất chế phẩm trên môi trường

gạo đã cho số lượng bào tử hình thành nhiều gấp 3 lần và thời gian hình thành bào tử cũng nhanh hơn so với môi trường đậu tương ngâm Các tác giả đó còn sử dụng các loại cám,

trấu, nước dừa và cùi dừa để sản xuất ra sinh khối nấm M anisopliae

Nuôi cấy nấm để sản xuất thuốc trừ sâu sinh học còn phụ thuộc rất nhiều vào nguồn gốc chủng mới phân lập và nguyên liệu làm môi trường, mặc dù thuốc vi nấm được sản xuất từ các nước khác nhau nhưng đều cho hiệu quả diệt côn trùng cao Hiện nay các nhà khoa học trên thế giới đã phát hiện được hơn 750 loài nấm có khả năng gây bệnh trên côn trùng Trên cơ sở công nghệ sinh học, nhiều phòng thí nghiệm sinh học trên thế giới đã nghiên cứu và chế tạo ra các loại thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ nấm

Tại Cuba, những năm 1970 - 2002, viện công nghệ sinh học Lahabana đã nghiên cứu

công nghệ sản xuất chế phẩm M anisopliae và B bassiana trên môi trường tấm gạo với

dung dịch cacbonat canxi 0,5%, bằng phương pháp luộc tấm gạo rồi sấy khô sau đó nhân

giống thuần Phương pháp này đã đạt được kết quả bước đầu trong việc sử dụng nấm trừ một số sâu hại cây trồng Hiện nay nền công nghệ sinh học ở Cuba phát triển rất nhanh, phương pháp nhân giống nấm trên tấm hoặc gạo đã được phát triển quy mô lớn Phương pháp này đã được thử nghiệm ở viện Bảo Vệ Thực Vật năm 2002 song kết quả thu được không ổn định, mất nhiều thời gian, tốn công cho luộc và sấy tấm khi sản xuất trong túi nilon dễ bị tạp nhiễm, chất lượng thấp và không ổn định, vì sản xuất rất phức tạp, năng suất không cao 107-108 bào tử/gam So với lên men xốp của viện Bảo Vệ Thực Vật (1996) thì phương pháp của Cuba cho hiệu suất thấp hơn và thời gian nuôi cấy lâu hơn, giá thành đắt hơn mặc dù có cải tiến nhân giống bằng môi trường dịch thể sau đó nuôi cấy nấm trong túi

PP, nhưng điều quan trọng nhất vẫn phải đảm bảo là phân loại và xác định đúng chủng giống, nếu sai nấm sẽ không có hiệu quả (Phạm Thị Thùy, 2004)

Đến nay nhiều nước trên thế giới đã sản xuất ra các thuốc nấm diệt côn trùng có khả năng thương mại hoá trên thị trường như:

Biotrol FMA do hãng Nutrilite (Mỹ) sản xuất để diệt trừ muỗi

Metaquino do hãng Dodecap (Brazil) sản xuất để trị bọ hung

Năm 1988 tại Nhật Bản một số nhà khoa học đã phòng trừ dòi hại rễ củ cải đường

bằng nấm Beauveria bassiana, ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng

các chế phẩm từ nấm Beauveria bassiana Tusher, V G., R Tibshirani và G Chu (2001)

đã tiến hành thử nghiệm sinh học của nấm Beauveria bassiana phòng trừ dạng trưởng thành của bọ hà khoai tây (Cylas puncticollis) Ở Trung Quốc, các tác giả Am và Wu đã sử dụng chủng nấm Beauveria bassiana để phòng trừ sâu róm thông (Dendrrolinmmus tabulaformis) đạt hiệu quả cao

Thuốc vi nấm Beauveria bassiana được rất nhiều nước trên thế giới như Mỹ,

Canada, Anh, Úc, Philippin và Trung Quốc… ứng dụng trên nhiều loại cây trồng để phòng trừ nhiều đối tượng sâu hại cây trồng thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera, bộ cánh cứng Coleoptera, bộ cánh thẳng Orthopterra, bộ cánh bằng Isoptera… đạt kết quả tốt, đặc biệt là những loại sâu hại cây rừng như sâu róm thông, bọ hại dừa, châu chấu… (Rombach và Agudu, 1988, Milner, 1991 được trích dẫn bởi Phạm Thị Thùy, 2004)

3 Giới thiệu về Cải tùa xại

Trong tiếng Hoa ở Bạc Liêu "xại" có nghĩa là cải, "tùa xại" là cải lớn Cây cải Xại trồng trên đất rẫy, mọc thành từng bụi giống như cây cải xanh, nhưng cọng cải Xại tròn, to

và cứng hơn nhiều Cây cải Xại tốt có thể có chiều dài 60-70 cm, cọng cải tròn (tức cuống mỗi lá cải) lớn bằng ngón tay cái Cải nhổ lên còn nguyên gốc, không cần rửa, đem để trong nhà chổ thoáng mát có thể được vài ngày mà không hư, không cần cất vào tủ lạnh Khi nào ăn mới đem ra cắt, rửa, ngâm nước cải tươi tốt lại như mới nhổ Người Hoa thường dùng cải này nấu món canh hầm chân giò heo hoặc với đầu, cẳng, cánh, vịt hay gà Món này có thể để dành ăn dài ngày, ăn với cơm hoặc cháo trắng đều rất ngon Ngoài ra, cải tùa xại còn có thể làm dưa để ăn lâu dài Tập quán tốt đẹp này lan rộng trong cộng đồng dân cư ở Bạc Liêu, hiện nay không chỉ người Hoa, mà người Kinh, người Khmer đều thích

ăn và trồng cải Xại Cải tùa xại thuộc nhóm rau ăn lá, thời gian sinh trưởng 60-70 ngày, năng suất cao, lợi nhuận cao hơn trồng lúa, có thể trồng được quanh năm

Cây cải tùa xại thuộc họ Thập tự (Cruciferae), thân thảo mọc thành từng bụi Cây cao

khoảng 30-40 cm, chu kỳ sinh trưởng khoảng 45-50 ngày sau khi trồng, cây cuộn bắp sau

30 ngày, độ che phủ mặt đất khá tốt Cây cải tùa xại ngoài ủ chua để làm dưa còn có thể chế biến được thành nhiều món ăn khác

Theo Trần Thị Ba (2001), cải tùa xại thường xuyên bị nhiều loại sâu hại tấn công đặc

biệt là sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius), sâu ăn đọt cải (Hellula undalis Fabricius và Crocidolomia binotalis Zeller) Sâu ăn tạp tấn công tất cả các giai đoạn sinh trưởng của

cây nhưng sâu ăn đọt thường xuyên chỉ ăn phá khi cây có đọt non và hậu quả là cây không còn khả năng tạo lá mới và cuộn bắp lại được Sâu ăn đọt cải mới nổi lên là một đối tượng đáng sợ trên cải hơn các loài khác

4 Hai loài sâu ăn tạp Spodoptera litura Fabricius và sâu ăn đọt cải Hellula undalis

Fabricius

4.1 Sâu ăn đọt cải Hellula undalis

Sâu ăn đọt cải Hellula undalis Fabricius là một loài côn trùng thuộc họ Pyralidae

(Ngài Sáng), bộ Lepidoptera (Cánh Vảy)

Đặc điểm hình thái và sinh học

Bướm nhỏ, màu nâu xám đậm, trên cánh có nhiều sọc ngang gãy khúc màu xám nhạt Rải rác trên cánh có những đốm hình dạng không đồng nhất màu đậm, cuối bìa cánh

có một hàng điểm đen Một bướm cái đẻ từ 160 - 180 trứng, trung bình 25 - 30 trứng trong một ngày, đẻ cao điểm vào ngày thứ hai sau khi vũ hoá Trứng được đẻ thành từng cái hay

2 - 3 cái trên lá non, cuống lá hay đọt non Đời sống của bướm khoảng 5 - 10 ngày

Trứng hình bầu dục, màu trắng ngà Thời gian ủ trứng từ 4 - 7 ngày

Ấu trùng màu hồng, đầu đen và có những sọc đen chạy dọc thân mình Ấu trùng có 4 tuổi, phát triển trong thời gian khoảng 10 ngày

Nhộng màu đỏ nâu, phát triển từ 6 - 8 ngày

Tập quán sinh sống và cách gây hại

Sâu hoạt động chậm chạp, ăn lá cải và thường sinh sống trong đọt non làm hư khối

sơ khởi của cây cải và chui xuống đất làm nhộng bên gốc cây cải Sâu tấn công cây cải bắp suốt giai đoạn tăng trưởng của cây và gây hại cao điểm vào khoảng 40 ngày sau khi trồng

Biện pháp phòng trị

Nên phòng trị khi sâu còn ở bên ngoài lá cải, chưa chui vào trong đọt bằng các loại thuốc trừ sâu ăn lá thông thường (Lê Thị Sen, 1999)

4.2 Sân ăn tạp Spodoptera litura Fabricius

Tên khoa học: Spodoptera litura Fab

Đặc điểm hình thái sinh học

Theo Lê Thị Sen (1999) bướm có chiều dài thân khoảng 20 – 25 mm, sãi cánh rộng từ

35 – 45 mm Cánh trước có màu nâu vàng, giữa cánh có vân trắng, cánh sau màu trắng ống ánh Bướm có đời sống trung bình từ 1 – 2 tuần tùy điều kiện thức ăn Trung bình một bướm cái có thể đẻ 300 trứng nếu điều kiện thích hợp có thể đẻ từ 900 – 2000 trứng Ở đồng bằng sông Cửu Long, khả năng đẻ trứng của một bướm cái khoảng 510 trứng trên cặp nhưng có trường hợp đặc biệt lên đến 1440 trứng phát triển (Phạm Huỳnh Thanh Vân

và Lê Thị Thùy Minh, 2001)

Theo Phạm Thị Nhất (2000) trứng có hình bán cầu, đường kính 0,5 mm, trứng mới đẻ

có màu vàng trắng, sau đó chuyển sang màu vàng tro, lúc sắp nở có màu vàng tối nhưng theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001) thì trứng có màu vàng trắng, sau đó chuyển thành màu vàng tro, lúc sắp nở có màu nâu đậm, trứng sâu nở sau khi đẻ 2 –

3 ngày

Theo Lê Thị Sen (1999) thời gian phát triển của ấu trùng kéo dài từ 20 –25 ngày, sâu

có 5 tuổi hoặc 6 tuổi tùy điều kiện môi trường Nếu điều kiện thuận lợi ấu trùng có thể dài

từ 35 –53 mm hình ống tròn, tuổi nhỏ sâu có màu lục, càng lớn sâu càng chuyển về màu nâu đậm Trên cơ thể có hai sọc vàng chạy ở hai bên hông từ đốt thứ nhất đến đốt cuối của bụng, mỗi đốt có một chấm đen nhỏ nhưng hai chấm đen ở đốt thứ nhất là rõ nhất Sâu càng lớn hai chấm đen ở đốt thứ nhất càng to dần và gần như giao nhau tạo thành một khoang đen chính gì vậy sâu ăn tạp còn được gọi là “Sâu Khoang”

Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001) khi mới được hình thành, nhộng sâu ăn tạp có màu xanh đọt chuối rất mềm, sau đó chuyển sang màu vàng xanh cuối cùng có màu nâu đen, các đốt cuối của bụng có thể cử động được, thời gian nhộng kéo dài khoảng 7 – 10 ngày

Vòng đời của sâu ăn tạp tương đối ngắn trung bình 30,2 ngày bao gồm bốn giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng, thành trùng, trong đó giai đoạn ấu trùng chiếm trung bình khoảng 21,7 ngày, đây là giai đoạn gây hại quan trọng của sâu ăn tạp Khả năng sinh sản mạnh và thời gian phá hại kéo dài, vì thế sâu ăn tạp là đối tượng gây hại quan trọng trên rau màu

Tập quán sinh sống và cách gây hại

Theo Lê Thị Sen (1999) bướm thường vũ hóa vào buổi chiều và bay ra hoạt động vào lúc vừa tối, ban ngày bướm đậu ở mặt sau lá hoặc trong những bụi cỏ Bướm hoạt động từ tối đến nửa đêm, có thể bay xa vài chục mét và cao đến 6 – 7m Sau khi vũ hóa được vài giờ bướm có thể bắt cặp và một ngày sau đó có thể đẻ trứng

Ấu trùng tuổi nhỏ có thể ăn biểu bì trên mặt lá, ấu trùng tuổi 3 cắn phá rất mạnh ăn thủng lá và gân lá, ở tuổi lớn khi thiếu thức ăn sâu còn có tập quán ăn thịt lẫn nhau, sâu non ăn lá còn lại biểu bì và gân lá, ăn cả nụ bông, đậu, bắp cải mới ra lá, sâu ăn thủng lá có khi ăn cả ngọn làm cây còi cọc Bắp cải mới vừa cuộn, sâu đục chui vào bắp cải ăn đọt Sâu khoang ăn rau muống chỉ còn trơ đọt Nhưng theo Phạm Thị Nhất (2000) sâu non phát triển thích hợp vào lúc có nhiệt độ và ẩm độ cao, sâu cắn phá mạnh vào lúc ban đêm nhưng khi có ánh nắng sâu chui xuống đất hoặc dưới tán lá khô và cỏ dại để ẩn nấp

Biện pháp phòng trị

Biện pháp canh tác: Đất trước khi trồng cần phải được cày, xới và xử lý thuốc trừ sâu

và cho ruộng ngập nước 2 – 3 ngày để diệt nhộng, sâu non có trong đất, phải thường xuyên

đi thăm ruộng để kịp thời phát hiện sâu, ngắt bỏ ổ trứng hoặc tiêu diệt sâu non mới nở khi chưa phân tán xa (Lê Thị Sen, 1999)

Biện pháp hóa học: Sâu ăn tạp có khả năng kháng thuốc rất cao do đó khi sử dụng

thuốc hóa học trong phòng trị cần thay đổi thuốc thường xuyên và nên phun vào giai đoạn trứng sắp nở có hiệu quả hơn Các loại thuốc thường dùng như Cyperan 10EC, Karate 2,5EC, Regent 80WG, (Trần Thị Ba,1999) Nên phun lúc chiều mát và phun lúc chúng còn nhỏ (tuổi 1 – 3) để chúng ít kháng thuốc (Dương Minh, 1999)

Biện pháp sinh học: Theo Phạm Huỳnh Thanh Vân và Lê Thị Thùy Minh (2001) ghi

nhận trong điều kiện tự nhiên tại ĐBSCL, sâu ăn tạp bị 4 nhóm ký sinh sau: côn trùng ký sinh, nấm ký sinh, siêu vi khuẩn gây bệnh NPV (Võ Thanh Tùng, 2005)

5 Thuốc Proclaim 1.9EC

Proclaim 1.9EC là loại thuốc trừ sâu sinh học thế hệ mới, độc tính trung bình, đặc trị sâu tơ hại bắp cải, sâu cuốn lá hại lúa

Hoạt chất: Là hai loại hoạt chất của Emamectin benzoate (Avermectin B1a 90% + Avermectin B1b 10%), và các chất phụ gia khác

Đặc tính và lợi ích: Proclaim 1.9EC là sản phẩm của Syngenta, luôn đảm bảo về độ tinh khiết cao của hoạt chất và phụ gia Là loại thuốc trừ sâu sinh học với cơ chế tác động chuyên biệt nhờ tác động vị độc, tiếp xúc Chuyển vị nhanh nên bảo vệ hữu hiệu cây trồng ngay lần phun đầu tiên, sau 2 giờ sâu hại lập tức ngừng ăn, biến hoạt

Cách dùng: Lắc kĩ trước khi pha Trên bắp cải: Pha 10 ml thuốc/bình 8 lít Phun 7 – 8 bình/1000m2 (công) hoặc phun 2 – 3 bình/sào Bắc bộ Phun khi sâu mới xuất hiện Phun 2 – 3 lần/vụ cách nhau 7 – 10 ngày

Thời gian cách ly ngắn, 3 ngày, độc nhẹ với ong

II PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Thí nghiệm bổ sung dinh dưỡng cho môi trường xốp để nhân sinh khối 2 loài nấm

Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Beauveria bassiana (Bals.) Vuill

Nguồn nấm:

Hai dòng nấm Metarhizium anisopilae Ma1-ST (dòng nấm số 1, phân lập được từ

Sóc Trăng) và Beauveria bassiana Bb1-VL(dòng nấm số 1, phân lập được từ Vĩnh Long)

Chuẩn bị bào tử nấm:

Tiến hành cấy và trữ các nguồn nấm vào đĩa Petri chứa các môi trường dinh dưỡng

cho nấm phát triển Khoảng 7 - 10 ngày sau khi sợi nấm đã hình thành và sinh ra một số

lượng bào tử nhất định Tiến hành cạo nấm, lọc lấy dung dịch nấm, đếm mật số bào tử và

tạo huyền phù bào tử (HPBT) có mật số có từ 108bào tử/ml

Bảng 2: Tỷ lệ nguyên liệu các loại môi trường

Nguyên liệu

MT Gạo (g)

Nước cất (ml) Pepton (g)

Yeast Extract (g)

Destrose (g)

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức tương đương với

bốn loại môi trường (MT1, MT2, MT3, MT4 như trong bảng 2) có thành phần cơ chất

khác nhau và 4 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại ứng với một bình tam giác chứa 100 g gạo và các

loại dinh dưỡng bổ sung Các bình tam giác chứa môi trường này đã được thanh trùng bằng

autoclave ở 1210C trong 30 phút Mỗi bình tam giác cho 5ml dung dịch huyền phù bào tử

nấm có mật số 108 bào tử/ml, sau đó ủ các bình tam giác trong điều kiện phòng thí nghiệm

27 – 30 0C Sau 10 - 14 ngày, khi quan sát thấy sợi nấm và bào tử đã mọc đều khắp môi

trường thì đưa môi trường ra khay nhựa cho vào tủ thông gió (nhiệt độ 37 0C) đến khi ẩm

độ còn khoảng 10 – 12% thì tiến hành nghiền mịn, đóng gói và bảo quản trong điều kiện

lạnh

Bảng 3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Nấm Metarhizium anisopilae

A4 C3 B3 A3 C4 A1 D4 B4 D1 C2 D3 C1 B2 D2 B1 A2

Ghi chú: A, B, C, D: MT1, MT2, MT3, MT4

1, 2, 3, 4: bốn lần lặp lại

Nấm Beauveria bassiana

A1 B4 B1 A4 D3 D4 C3 C1 B2 D2 A2 D1 A3 C2 C4 B3

Ghi chú: A, B, C, D: MT1, MT2, MT3, MT4

1, 2, 3, 4: bốn lần lặp lại

Các chỉ tiêu đánh giá

Xác định chất lượng chế phẩm

- Số lượng bào tử tổng số có trong 1g chế phẩm

- CFU (colony forming unit) trên 1g chế phẩm

Cách lấy chỉ tiêu

- Số lượng bào tử tổng số trên 1g chế phẩm

Hòa tan 1g chế phẩm đã nghiền mịn vào 9ml nước cất đã thanh trùng, lọc lấy dung

dịch bào tử nấm Pha loãng và đếm mật số bào tử bằng lame đếm Thoma của Nhật

Cho 50µl dung dịch huyền phù bào tử nấm có HSPL khoảng 10-5 chà đều trên môi

trường thạch agar có trong đĩa Petri, sau 5 ngày đếm số khuẩn lạc trong đĩa, từ đó xác định

CFU trong gam chế phẩm

Các số liệu thí nghiệm được phân tích thống kê với phần mềm MSTATC

2 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ hai loại nấm ký sinh côn trùng

Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Beauveria bassiana (Bals.) Vuill

Nhân sinh khối và sản xuất thành hai nguồn nấm là M1-ST và B1-VL được mang làm

chế phẩm tại phòng thí nghiệm Bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ

Kiểm tra sản phẩm

Xác định bào tử sống (CFU/gam) chế phẩm: sử dụng 50μl dung dịch huyền phù bào

tử nấm có HSPL ≥ 104 chà đều trên môi trường trong đĩa petri, sau 2 ngày đếm số khuẩn

lạc hình thành trong đĩa, từ đó suy ra CFU trong 50μl dung dịch huyền phù bào tử nấm và CFU/gam chế phẩm

CFU/gam = A 20 hệ số pha loãng với A là số khuẩn lạc hình thành trong đĩa petri (Quy trình trong phần kết quả và thảo luận)

3 Khảo sát hiệu quả của 2 chế phẩm đối với sâu ăn tạp (Spodoptera litura) trên cải

tùa xại trong điều kiện nhà lưới

Chuẩn bị sâu ăn tạp

Sâu ăn tạp (SAT) được thu thập ngoài đồng về nuôi trong phòng thí nghiệm bằng

thức ăn nhân tạo (đã thanh trùng) Ở thế hệ sau, lựa chọn những cá thể đồng đều cùng kích

cỡ (tuổi 2) để làm thí nghiệm

Chuẩn bị huyền phù dung dịch nấm

Hòa tan chế phẩm nấm đã nghiền mịn với nước cất thanh trùng, lọc lấy dung dịch bào tử nấm, đếm mật số bào tử và tạo huyền phù có mật số 108 bào tử/ml

Chuẩn bị thí nghiệm

Cải được trồng trong chậu sau 20 ngày tuổi đã lớn và phát triển tốt, sau đó thả sâu ăn tạp lên để làm thí nghiệm, có khung lưới bao từng chậu và bao xung quanh khu vực thí nghiệm

Thí nghiệm được chia ra thành hai thí nghiệm nhỏ cho từng loại nấm Đặt riêng hai nơi, cách nhau 2m và được ngăn giữa bằng vách tôn cao 1,5m Các chậu cải trong từng thí nghiệm cũng đặt cách nhau 1m Khi phun nấm, dùng bạt nilon quay vòng quanh từng chậu

để hạn chế nấm phát tán sang chậu xung quanh Hai loại nấm dùng riêng 2 tấm bạt nilon

* Đối với nấm Metarhizium anisopilae

Nghiệm thức 1 (A): Nấm Metarhizium anisopilae 10 g.l -1

Nghiệm thức 2 (B): Nấm Metarhizium anisopilae 15 g.l -1

Nghiệm thức 3 (C): Nấm Metarhizium anisopilae 20 g.l -1

Nghiệm thức 4 (D): Đối chứng phun nước

* Đối với Beauveria bassiana

Nghiệm thức 1 (A): Nấm Beauveria bassiana 10 g.l -1

Nghiệm thức 2 (B): Nấm Beauveria bassiana 15 g.l -1

Nghiệm thức 3 (C): Nấm Beauveria bassiana 20 g.l -1

Nghiệm thức 5 (D): Đối chứng phun nước

Mỗi chậu thả 40 sâu ăn tạp (tuổi 2, thế hệ 2) Mỗi chậu có khung lưới bao riêng,

không cho sâu di chuyển sang nghiệm thức khác

Lọc dung dịch bào tử nấm từ hai chế phẩm với khối lượng theo từng nghiệm thức,

sau đó phun ướt đều lên cây bằng bình xịt 4 lít

Tất cả các nghiệm thức đều được thêm chất bám dính (tên thương mại là TP) với

Hình 3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm hai loại nấm Metarhizium anisopilae và Beauveria

bassiana trên sâu ăn tạp trong điều kiện nhà lưới

Lấy chỉ tiêu

Đếm tổng số sâu còn sống trước khi phun thuốc và 3, 6, 9 ngày sau khi phun thuốc

ở mỗi chậu Mỗi lần lấy chỉ tiêu ghi nhận nhiệt độ và ẩm độ Tính độ hữu hiệu bằng công thức Henderson-Tilton

Độ hữu hiệu (%) = ).100

.1(

Ca Tb

Cb Ta

−

Với Ta: số sâu còn sống ở nghiệm thức có xử lý thuốc sau khi phun

Tb: số sâu còn sống ở nghiệm thức có xử lý thuốc trước khi phun

Ca: số sâu còn sống ở nghiệm thức đối chứng sau khi phun

Cb: số sâu còn sống ở nghiệm thức đối chứng trước khi phun

Tổng hợp số liệu bằng Excel và thống kê số liệu bằng chương trình MSTATC

4 Khảo nghiệm hiệu lực của 2 chế phẩm Metarhizium anisopliae (Ma), Beauveria bassiana (Bb) trên cải tùa xại trong điều kiện ngoài đồng

Phương tiện

Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại phường Long Tuyền, quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ Nền đất ruộng thí nghiệm trên đất chuyên rau màu, kích thước líp 1m, mương 0,3m

Phân bón: N-P-K

Thuốc sinh học: các chế phẩm nấm ký sinh: Metarhizium anisopliae (Ma),

Beauveria bassiana (Bb) được chuẩn bị sẵn trong phòng thí nghiệm

Các vật dụng khác: cây con giống (vô bầu), bình xịt, dây nilon, nhiệt kế, thùng tưới, bìa sơmi, thước, viết,…

Thời gian thí nghiệm: tháng 5/2009 – tháng 7/2009, vụ Hè Thu 2009

+ Lần 3: 20-22 ngày sau khi trồng Tùy theo tình hình của cây, có thể bón 15-20kg

NPK (16-16-8) hoặc tưới 5-10 kg Urea /1.000 m2

+ Lần 4: dùng phân Urea và Kali để tưới (đối với 1.000m2 thì cần 10-15kg Urea và 10kg Kali) Liều lượng khi pha loãng tưới: 50g Urea/20 lít nước và 100g Kali/20 lít nước

-Thu hoạch: Sau khoảng 45 – 50 ngày

Phương pháp thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức x

4 lặp lại cho từng loại nấm Mỗi lô có diện tích 20 m2 (2 m x 10 m) Liếp cách li rộng 1m, giữa các lô thí nghiệm cách nhau 1 mương líp để hạn chế tác động qua lại giữa các nghiệm thức

Cắm cột đánh dấu 20 cây cố định trên từng lô để lấy chỉ tiêu Cắm bảng, kéo dây ngăn giữa các lô

Các nghiệm thức cũng giống như thí nghiệm trong nhà lưới

* Đối với nấm Metarhizium anisopilae

Nghiệm thức 1 (A): Nấm Metarhizium anisopilae 10 g.l -1

Nghiệm thức 2 (B): Nấm Metarhizium anisopilae 15 g.l -1

Nghiệm thức 3 (C): Nấm Metarhizium anisopilae 20 g.l -1

Nghiệm thức 4 (D): Thuốc hóa học Prolaim 1.8 EC

Nghiệm thức 5 (E): Đối chứng phun nước

* Đối với Beauveria bassiana

Nghiệm thức 1 (A): Nấm Beauveria bassiana 10 g.l -1

Nghiệm thức 2 (B): Nấm Beauveria bassiana 15 g.l -1

Nghiệm thức 3 (C): Nấm Beauveria bassiana 20 g.l -1

Nghiệm thức 4 (D): Thuốc hóa học Prolaim 1.8 EC

Nghiệm thức 5 (E): Đối chứng phun nước

Tất cả các nghiệm thức cũng thêm chất bám dính hiệu TP với nồng độ theo khuyến cáo 2 ml.l-1

Phun chế phẩm 4 lần trong toàn thời gian sinh trưởng của cây: phun vào 10, 20, 30

và 40 ngày sau khi trồng

Cách phun: Lọc chế phẩm với 2 lớp vải lưới Pha khoảng 4 lít dung dịch chế phẩm theo khối lượng tương ứng rồi phun ướt đều lên lá Mỗi bình phun 4 lặp lại của từng nghiệm thức Sử dụng 2 bình phun riêng cho mỗi loại nấm Nghiệm thức đối chứng phun trước để nghiệm thức này không bị nấm lẫn vào bình phun

Vùng đệm

Ghi chú: A, B, C, D, E: năm nghiệm thức trong thí nghiệm

1, 2, 3 và 4: bốn lần lặp lại

Hình 4b: Sơ đồ bố trí thí nghiệm nấm Beauveria bassiana trong điều kiện ngoài đồng

Sâu ăn đọt trong thí nghiệm này được xác định là loài Helulla undalis (xem đặc

điểm sinh học và sinh thái trong phần Cở sở lý luận)

Thu thập số liệu

- Đếm mật số sâu hại hiện diện trên từng lô, mỗi lô đếm tổng cộng số sâu sống trên

20 cây đã được đánh dấu cố định Đếm số sâu còn sống trên cây ở các thời điểm trước khi phun và 3, 6, 9 ngày sau khi phun

- Mỗi lần lấy chỉ tiêu ghi nhận nhiệt độ và ẩm độ trên từng lô

Tính độ hữu hiệu của chế phẩm cũng theo công thức Henderson-Tilton như ở trên

Chỉ tiêu năng suất:

- Năng suất thực tế: Cân tất cả các cây cải trên từng lô, quy ra t.ha-1

- Tính tỷ lệ thương phẩm và phế phẩm ở từng nghiệm thức Cải thương phẩm được quy ước là thương lái thu mua được với giá trị của thị trường

- Tính hiệu quả kinh tế: lãi, hiệu quả đồng vốn, thu nhập biên (MRR = Lợi nhuận tăng thêm/Chi phí tăng thêm)

Các số liệu thu thập được xử lý bằng chương trình Excel và thống kê bằng MSTATC

CHƯƠNG 2 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Thí nghiệm bổ sung dinh dưỡng cho môi trường xốp để nhân sinh khối 2 loài nấm

Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Beauveria bassiana (Bals.) Vuill

Lên men xốp là phương pháp nhân sinh khối nấm trong môi trường dinh dưỡng nấm

cấp 2 rất tốt, vừa có thể sản xuất được với số lượng lớn, cho mật số cao và ổn định vừa là

một phương pháp rẻ tiền, có thể sử dụng nguồn gạo phế phẩm, thích hợp với điều kiện

nông hộ

Gạo là môi trường nhân sinh khối được áp dụng rộng rãi để nhân sinh khối các loài

nấm để sản xuất với số lượng lớn, ví dụ như các loài nấm Tricoderma spp làm nấm đối

kháng trong phòng trừ sinh học, làm tác nhân phân hủy rơm rạ,… Năm 2004, tác giả

Dương Minh sử dụng gạo để nhân sinh khối nấm Tricoderma spp để làm nấm đối kháng

Ba nhà khoa học Trần Văn Mão, Trần Văn Hai và Phạm Thị Thùy cũng sử dụng gạo

(ngâm và thanh trùng) làm môi trường nhân giống các loài nấm ký sinh côn trùng để phòng

và trị rầy nâu, sùng hại rễ đậu phộng, sâu róm hại thông, sâu đo, châu chấu,… Butt, T M

and L Copping 2000 và Clark et al., 2002 cũng đã chọn gạo là môi trường nhân nuôi nấm

ký sinh Metarhizium anisopilae và Beauveria bassiana

Thí nghiệm được tiến hành với mục đích sản xuất chế phẩm nấm bằng phương pháp

lên men xốp, để có thể thu được một lượng lớn dạng đính bào tử conidiospore (bào tử có

cấu trúc bền vững, có thời gian sống lâu, giữ hoạt tính bền lâu hơn)

1.1 Nghiên cứu tìm môi trường sản xuất chế phẩm nấm Metarhizium anisopilae (theo

công nghệ nuôi cấy xốp)

Chủng vào 16 bình tam giác (tương ứng với 4 nghiệm thức), mỗi bình 5ml dung dịch

huyền phù bào tử nấm Metarhizium anisopilae (nồng độ 108 bào tử/ml) (được chuẩn bị sẵn

môi trường xốp và qua thanh trùng) Ủ các bình tam giác trong điều kiện phòng thí nghiệm

ở nhiệt độ 25-300C, đối với nấm Metarhizium anisopilae có thời gian phát triển rất nhanh

nên chỉ sau 10 ngày thì có thể cho ra khay để sấy khô, rồi đem nghiền mịn và tiến hành

đếm bào tử Kết quả đếm bào tử tổng số và bào tử sống (CFU) được thể hiện bảng 4

Bảng 4: Mật số bào tử của nấm Metarhizium anisopilae trên môi trường xốp sau khi chủng

Hình 5: Ngâm gạo chuẩn bị thanh trùng Hình 6: Nấm sau khi cấy nấm nguồn 10 ngày

Hình 7: Chuẩn bị mẫu và đếm mật số bào tử trên kính hiển vi

Kết quả thí nghiệm ở bảng 4 cho thấy, mật số bào tử tổng số của nấm Metarhizium

anisopilae ở 12 ngày sau khi chủng trên môi trường xốp cho lượng bào tử rất cao (từ 28,68

x108 bào tử/gamở MT1 đến 32,12 x108 bào tử/gamở MT3); tuy nhiên, cả bốn môi trường này đều không khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức độ 5% Tương tự, mật số bào tử sống CFU (x108 bào tử/gam)và tỷ lệ sống ở cả 4 môi trường cũng không khác biệt nhau có ý nghĩa, mặc dù MT2, MT3 và MT4 có bổ sung thêm dinh dưỡng pepton, yeast extract và đường destrose

Tỷ lệ sống ở 12 NSKC ở cả 4 loại môi trường là khá cao (từ 80,13% ở MT1 đến 83,97% ở MT3), tuy nhiên, giữa chúng không có sự khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê (bảng 4)

Như vậy, ở cả 2 chỉ tiêu mật số bào tử tổng số và CFU, cả 4 môi trường xốp này đều tạo được sinh khối và tỷ lệ sống khá cao mà không khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê Điều này có thể là do trong gạo đã có đủ thành phần dinh dưỡng đáp ứng nhu cầu cho nấm phát triển trong suốt thời gian nhân nuôi sinh khối Do vậy, trong quá trình sản xuất chế

phẩm, sử dụng môi trường 1 (chỉ sử dụng gạo thanh trùng không bổ sung thêm dưỡng chất)

vừa đơn giản, nhanh vừa giảm được chi phí sản xuất so với các môi trường còn lại

Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Tanada, Y., và H K Kaya (1993) khi

họ kết luận rằng nấm Metarhizium anisopilae rất dễ nuôi cấy, đạt được hiệu quả gây bệnh

và làm giảm mật số côn trùng đáng kể Theo Trần Văn Mão (2002), nấm Metarhizium

anisopilae có yêu cầu dinh dưỡng không quá nghiêm khắc, có thể chọn các nông sản phụ

có giá thành rẻ để sản xuất và nấm nảy mầm tốt trong môi trường có hoặc không có

pepton

Thực tế, trong quá trình nhân sinh khối, nấm Metarhizium anisopilae đã tạo mật số

khá cao sau 10 ngày sau khi chủng nấm vào túi nilon chịu nhiệt (cho màu xanh lục đều

khắp túi, hình 6) Đặc điểm này khi sản xuất chế phẩm có thể rút ngắn thời gian ủ Nấm

Metarhizium anisopilae rất dễ nuôi cấy trên môi trường xốp, cho mật số cao và nhanh,

thậm chí trên môi trường gạo chất lượng kém (Trần Văn Mão, 2002) Nuôi nhân sinh khối

trên môi trường xốp là một sự cải tiến quan trọng trong việc nhân nuôi các dòng nấm

(Yasuhisa Kunimi, 2001)

1.2 Nghiên cứu tìm môi trường xốp để sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana

(theo công nghệ nuôi cấy xốp)

Các bước đối với nấm Beauveria bassiana cũng tương tự như nấm Metarhizium

anisopilae: chủng vào 16 bình tam giác (mỗi bình 5ml dung dịch huyền phù bào tử nấm

Beauveria bassiana, nồng độ 108 bào tử/ml) đã được chuẩn bị sẵn môi trường xốp và qua

thanh trùng Kết quả đếm bào tử tổng số và bào tử sống (CFU) được thể hiện ở bảng 5

Bảng 5: Mật số bào tử nấm Beauveria bassiana trên bốn loại môi trường xốp sau khi

Ghi chú: Trong cùng một cột, các số có cùng chữ cái theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở

mức ý nghĩa 5% qua phép thử DUNCAN

*: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Kết quả thí nghiệm ở bảng 5cho thấy mật số bào tử tổng số của nấm B bassiana

trên bốn loại môi trường xốp có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%, cao nhất là MT2

(gạo, nước, pepton) và MT3 (gạo, nước, pepton, yeast extract), đạt lần lượt là 24,16 x 108

bào tử/gam chế phẩm và 25,12 x 108 bào tử/gam chế phẩm, thấp nhất MT1 (chỉ có gạo và

nước), đạt 16,14 x 108 bào tử/gam chế phẩm Tuy nhiên, giữa hai môi trường thử nghiệm

MT2 và MT3 lại không khác biệt nhau có ý nghĩa (bảng 5)

Ở chỉ tiêu mật số bào tử sống CFU (colony forming unit, x108 bào tử/gam) cũng cho

kết quả tương tự ở hai môi trường MT2 và MT3, mật số bào tử sống cao hơn hai môi

trường còn lại MT1 lại MT4 nhưng giữa chúng lại không có sự khác biệt nhau qua phép thử Duncan ở mức ý nghĩa 5% Sau 12 ngày sau khi khi chủng, MT2 và MT3 đạt lần lượt

là 20,23 x108 bào tử/gam và 22,30 x108 bào tử/gam; trong khi đó hai MT1 và MT4 chỉ có 11,21 x108 bào tử/gam và 13,26 x108 bào tử/gam Do đó, tỷ lệ sống được ghi nhận cao hơn

ở hai môi trường MT3 và MT2 (88,77% và 83,73%) so với hai môi trường (bảng 5)

Thí nghiệm này cũng phù hợp với nghiên cứu của Chase, A R, L S Orborne và V

M, Ferguson (1996) khi họ chọn lọc một số môi trường dinh dưỡng tốt nhất để nhân sinh

khối cho nấm Beauveria bassiana Việc bổ sung pepton và yeast extract cho nấm

Beauveria bassiana (phân lập trên rầy nâu Nilaparvata lugens) sau 12 ngày sau khi chủng

cho mật số bào tử cao hơn một cách có ý nghĩa

Như vậy, môi trường MT2 được chọn khi sản xuất chế phẩm vì mật số bào tử sống CFU và tỷ lệ sống không khác biệt có ý nghĩa thống kê với MT3 nhưng chi phí thấp hơn

do không có Yeast extract

2 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học từ hai loại nấm ký sinh côn trùng

Metarhizium anisopilae (Metsch.) Sorok và Beauveria bassiana (Bals.) Vuill

Theo quy trình công nghệ của Bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ (xem quy

trình phần Phương pháp nghiên cứu)

Quy trình được thực hiện với 3 bước chính (theo tài liệu Poster của Trần Văn Hai, 2008)

Bước 1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm

Ngâm gạo từ 1giờ – 1giờ 30 phút (gạo thường)

Chia gạo vào từng bọc nylon (500g/bọc, bọc chịu nhiệt tốt)

Buộc kín miệng bằng dây thun

Bước 2 Hấp khử trùng (có thể dùng nồi hấp bánh tét tại địa phương)

Cho nước ngập đến vỉ ngăn nước để khử trùng môi trường

Sau khi nước sôi đun tiếp tục trong 2 giờ

Vớt bịch gạo ra và để nguội

Bước 3 Chủng nấm vào môi trường gạo

Chia dĩa nấm nguồn thành 6 phần

Dùng kẹp (dao) rạch thành từng miếng nhỏ

Chủng 1/6 mãnh agar có nấm vào 1 bọc nylon

Đậy nắp gòn và bịt đầu môi trường (trong tủ cấy)

Ủ chế phẩm nơi cao ráo, thoáng mát, sau 10 - 14 ngày có thể đem sử dụng

Hòa chế phẩm trong nước qua vải lược và phun xịt lúc trời mát

Sản phẩm được nghiền thành dạng bột mịn và được đóng gói 100gr bằng bao bì chứa thuốc trừ sâu trên thị trường

Những đặc điểm của chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana:

- Dạng chế phẩm: dạng bột khô, hòa nước khi sử dụng Cây nhỏ có thể dùng thùng vòi

sen để tưới, khi cây lớn có thể tưới hoặc phun bằng bình phun thuốc bảo vệ thực vật thông thường (lọc trước bằng vải lọc, chống nghẹt vòi phun)

- Số lượng bào tử đăng ký: 109 bào tử / ml

- Đối tượng phòng trừ: sâu ăn lá, rầy nâu, bọ cánh cứng hại dừa, bù lạch.

- Thời gian bảo quản: 12 tháng, trong điều kiện mát.

- Cảnh báo an toàn: rất an toàn cho môi trường và nông sản.

- Sử dụng: hòa loãng với nước phun (phải lọc bằng vải) hoặc tưới.

3 Hiệu quả của hai chế phẩm sinh học đối với sâu ăn tạp trên cải tùa xại trong điều

kiện nhà lưới

Sâu ăn tạp Spodoptera litura là đối tượng gây hại quan trọng trên các lại rau cải ở

các thời kỳ sinh trưởng của cây và gây hại quanh năm ở Đồng Bằng Sông Cửu Long

(Nguyễn Thị Thu Cúc, 2003) Sâu ăn tạp là loại sâu kháng thuốc rất mạnh nên việc tìm ra

các dòng vi nấm có khả năng gây bệnh cao là một triển vọng lớn để quản lý loài sâu này

(Trần Văn Hai, 2008)

3.1 Đối với nấm Metarhizium anisopilae

Thí nghiệm được thực hiện tại nhà lưới Bộ môn Bảo vệ thực vật, nhiệt độ trung bình

28,6 - 31,9 0C, ẩm độ trung bình 56,5 - 79,7% Nhìn chung, các nghiệm thức đều có hiệu

quả nhất định, khác biệt so với đối chứng ở tất cả các ngày sau khi phun (NSKP) ở mức ý

nghĩa 5% (bảng 6)

Bảng 6: Hiệu quả của chế phẩm nấm Metarhizium anisopilae đối với sâu ăn tạp trên cải

tùa xại trong điều kiện nhà lưới, bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ,

Ghi chú: Trong cùng một cột các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở mức ý

nghĩa 5% qua phép thử DUNCAN

*: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Kết quả thí nghiệm ở bảng 6 cho thấy, các nghiệm thức đã bắt đầu có hiệu quả vào

thời điểm 3 NSKP Nghiệm thức 1 (phun ở nồng độ 10 g.l-1) có hiệu quả thấp hơn hai NT2

(phun ở nồng độ 15 g.l-1) và NT3 (phun ở nồng độ 20 g.l-1) có ý nghĩa thống kê ở mức 5%,

Ở 6 NSKP, các nồng độ ở các nghiệm thức phun nấm có hiệu quả tăng khá cao, khác

biệt so với đối chứng Hai nghiệm thức phun ở nồng độ 15 g.l-1 và 20 g.l-1 đạt hiệu quả khá

cao (lần lượt là 64,61% và 67,56%), giữa chúng không khác biệt nhau có ý nghĩa thống kê

nhưng cao hơn nghiệm thức phun ở nồng độ 10 g.l-1 (chỉ đạt 52,48%)

Trong quá trình quan sát, chúng tôi nhận thấy rằng một số sâu đã xuất hiện tơ nấm ra

ngoài cơ thể côn trùng mặc dù ban đầu các sợi tơ nấm có màu trắng nhạt, mọc xốp, một số

đã biểu hiện lờ đờ, chậm lớn, giảm sức ăn phá Đây cũng là đặc tính ưu việt của thuốc trừ

sâu nguồn gốc vi sinh, côn trùng tuy không chết ngay nhưng giảm sự ăn phá cây trồng

Đến 9 NSKP, hiệu quả của tất cả các nghiệm thức là rất tốt (đạt từ 70,13% đến

82,54%) Hai NT2 (80,27%) và NT3 (82,54%) vẫn có hiệu quả cao hơn NT1 (70,13%) trên

sâu ăn tạp có ý nghĩa thống kê và giữa chúng vẫn không khác biệt nhau có ý nghĩa (bảng 6)

Milner et al., (1991) đã làm thí nghiệm với các chế phẩm nấm xanh trong nhà lưới ở Úc

có độ hữu hiệu từ 60,5%-71,7% sau 10 ngày phun trong mùa hè và cho rằng nếu ẩm độ

cao, kéo dài sẽ cho kết quả tốt hơn Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Phạm Thị

Thùy (1999) khi phun nấm Metarhizium anisopliae lên sâu róm, cho hiệu quả 72,56% sau

10 ngày Milner et al., (1991) cũng đã phun chế phẩm nấm xanh và nấm trắng lên ớt ngọt

(sweet pepper) lên sâu đục trái trong nhà lưới ở Úc cũng cho hiệu quả 60,5-70,2% sau 12

NSKP

Như vậy, cả ba nồng độ phun chế phẩm nấm Metarhizium anisopilae đều đạt hiệu

quả tốt đối với sâu ăn tạp trên cải tùa xại trong điều kiện nhà lưới (từ 70%-82%) sau 9

NSKP Nghiệm thức 2 (nồng độ 15 g.l-1) có hiệu quả không khác biệt nghiệm thức 3 (nồng

độ 20 g.l-1) là nồng độ tối ưu để sử dụng trừ sâu ăn tạp trong điều kiện nhà lưới trên cây cải

tùa xại trong thí nghiệm này

3.2 Đối với nấm Beauveria bassiana

Kết quả thí nghiệm ở bảng 7 cho thấy, tất cả các nghiệm thức đều có hiệu quả cao

hơn nghiệm thức đối chứng vào 3 NSKP, 6 NSKP và 9 NSKP có ý nghĩa thống kê ở mức

độ 5%

Bảng 7: Hiệu quả của chế phẩm nấm Beauveria bassiana đối với sâu ăn tạp trên cải tùa xại

trong điều kiện nhà lưới, bộ môn Bảo vệ thực vật, Đại học Cần Thơ, tháng

Ghi chú: Trong cùng một cột các số có cùng chữ theo sau giống nhau thì không khác biệt thống kê ở mức ý

nghĩa 5% qua phép thử DUNCAN

*: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Ở 3 NSKP, hiệu lực của chế phẩm nấm B bassiana đối với sâu ăn tạp đạt thấp, từ

Tương tự, ở 9 NSKP, nấm B bassiana có hiệu quả cao hơn ở nghiệm thức 2 và 3

(70,34% và 78,04%), tuy nhiên giữa chúng cũng không khác biệt nhau có ý nghĩa

Như vậy, nghiệm thức phun B bassiana ở nồng độ 15 g.l-1 cho kết quả tốt và giá

thành thấp nhất trong các nghiệm thức thử nghiệm(bảng 7)

Hình 8: a/ Đặt chậu cải trong lồng lưới riêng để đảm bảo mật số sâu

b/ Thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên

a/ nấm Metarhizium anisopliae b/ nấm Beauveria bassiana

Hình 9: Sâu ăn tạp bị nhiễm nấm trong nhà lưới ĐHCT, tháng 02-03/2009

b

a

4 Khảo nghiệm hiệu lực của 2 chế phẩm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana trên cải tùa xại trong điều kiện ngoài đồng tại Phường Long Tuyền, Thành

Phố Cần Thơ, từ 05/2009 đến 07/2009

4.1 Mô tả địa điểm thí nghiệm

Phường Long Tuyền thuộc Quận Bình Thủy, nằm cách trung tâm thành phố Cần Thơ chỉ 10 km, là địa bàn chuyên canh rau màu các loại với diện tích có hơn 4.400 ha (theo niên giám thống kê thành phố Cần Thơ, 2010)

Thí nghiệm về hiệu lực của 2 chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria

bassiana đối với sâu ăn tạp và sâu ăn đọt (loài Hellula undalisFabricius) trên cải tùa xại được thực hiện tại ruộng chuyên canh rau của anh Nguyễn Văn Đỉnh, thời gian từ giữa tháng 5 đến cuối tháng 7 năm 2009 trên nền đất thịt, vụ trước có canh tác dưa hấu Trong thời gian bố trí thí nghiệm, xung quanh khu vực có trồng dưa hấu, đậu nành, bắp, dưa leo

và vườn cây lâu năm ở cách khoảng 200 m

Hình 10: Bản đồ hành chánh Phường Long Tuyền, Quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ

Hình 11:Vị trí bố trí thí nghiệm tại hộ ông Nguyễn Văn Đĩnh, Phường Long Tuyền, Quận

Bình Thủy, thành phố Cần Thơ

4.2 Tình hình thời tiết Thành phố Cần Thơ, từ tháng 05/2009 đến tháng 07/2009

110.6

120.3 169.7

Nhiệt độ TB(0C)

Số giờ nắng(giờ)

Tháng 5Tháng 6Tháng 7

Nguồn: Cục thống kê thành phố Cần Thành phố Cần Thơ, 2009

Hình 12: Lượng mưa, ẩm độ, nhiệt độ và lượng nắng trung bình tại quận Bình Thủy, thành

phố Cần Thơ tháng 5, 6 và 7 năm 2009

- Mưa và ẩm độ: Mưa bắt đầu xuất hiện khá nhiều vào đầu tháng 5 đến cuối tháng 7

có nhiều cơn mưa nặng hạt và kéo dài, số giờ nắng trong ngày giảm (trung bình 170,9 giờ / tháng) (Hình 12)

- Nhiệt độ: nhiệt độ dao động ngày và đêm không lớn, trung bình từ 29,4 0C giờ vào tháng 5/2009 đến 28,9 0C vào tháng 7/2009 (Hình 12)

- Nắng: Số giờ nắng trung bình tháng không quá nhiều vào các tháng này, từ 210,4

vào tháng 5/2009 giờ giảm xuống còn 170,9 giờ vào tháng 7/2009 (Hình 12)

4.3 Tình hình sâu bệnh

Trong quá trình canh tác trong thí nghiệm, sâu ăn tạp (Spodoptera litura Fabricius)

và sâu ăn đọt cải (Helulla undalis) là hai đối tượng gây hại chính Bên cạnh đó, vẫn có xuất hiện rải rác sâu xanh da láng (Spodoptera exigua Fabricius), ruồi đục lá (Lyriomyza sp.),

Trong quá trình canh tác, xuất hiện nhiều loài thiên địch (nhóm bắt mồi) tự nhiên

trên ruộng như bọ rùa đỏ (Micraspis spp.), kiến ba khoang (Ophionea nigrofassciata), nhện Lycosa (Lycosa pseudoannulata), bọ đuôi kìm (Euborellia stali) do chỉ sử dụng thuốc

sinh học trong ruộng và các ruộng lân cận phun thuốc hóa học nên chúng di trú sang Không ghi nhận được nhóm thiên địch ký sinh trong thí nghiệm do không quan sát và theo dõi nhưng có lẽ đã có thiên địch ký sinh côn trùng (parasitism) xuất hiện Trong điều kiện

ít sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, hệ sinh thái ngoài đồng sẽ ở trạng thái cân bằng, dịch hại

không quá lớn (Nguyễn Công Thuật, 2002) Tuy nhiên, các loài thiên địch bắt mồi này

không có hiệu quả cao đối với bọ nhảy (Phyllotetra striolata) Ngoài ra, bệnh hại có xuất

hiện rải rác nhưng với mức độ nhẹ, không làm giảm năng suất

4.4 Kết quả thí nghiệm độ hữu hiệu của hai loại nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana

Nói chung, thí nghiệm thành công vì mật số sâu xuất hiện ở nghiệm thức đối chứng nhiều hơn so với 3 nghiệm thức có phun chế phẩm nấm và nghiệm thức phun thuốc trừ sâu Proclaim 1.9 EC, dẫn đến kết quả độ hữu hiệu của nghiệm thức đối chứng thấp hơn một cách rất có ý nghĩa và năng suất lý thuyết và thực tế của nghiệm thức đối chứng thấp hơn rất nhiều (hình 15 và hình 16) Chế phẩm đã có hiệu quả nhất định trên sâu ăn tạp

(Spodoptera litura Fabricius) và sâu ăn đọt cải từ 55% đến 65%

4.4.1 Thí nghiệm nấm Metarhizium anisopliae trên trên sâu ăn tạp Spodoptera litura Fabricius và sâu ăn đọt Hellula undalisFabricius

4.4.1.1 Đối với sâu ăn tạp Spodoptera litura Fabricius

Từ số liệu về độ hữu hiệu của chế phẩm nấm Metarhizium anisopliaeđối với sâu ăn tạp trên cải tùa xại được thể hiện ở bảng 8, nhận thấy rằng cả ba nghiệm thức đều thể hiện hiệu quả nhất định sau 6 đến 9 NSKP ở cả 4 lần xử lý chế phẩm

Nghiệm thức phun nấm Metarhizium anisopliae ở nồng độ 10 g.l-1 cho độ hữu hiệu khá thấp, thấp nhất từ 18,6% ở lần phun thuốc thứ 3 (3 NSKP) đến cao nhất là 60,2% vào 9 NSKT (cũng ở lần phun thuốc thứ 3)

Nghiệm thức phun nấm Metarhizium anisopliae ở nồng độ 15 g.l-1 có hiệu quả cao hơn ở nồng độ 10 g.l-1, đạt cao nhất đến 61,6% (vào thời điểm 9 NSKP) và thấp nhất là 25,8% ở 3 NSKP (vào thời điểm 20 NSKT) Nghiệm thức phun ở nồng độ 15 g.l-1 có hiệu quả cao hơn một cách có ý nghĩa so với nghiệm thức phun ở nồng độ 10 g.l-1, trừ ở lần phun thứ 3 và thứ 4 (6 và 9 NSKP) (bảng 8) Tuy nhiên, hiệu quả đối với sâu ăn tạp so với thuốc sâu hóa học Proclaim 1.9 EC vẫn thấp và chậm hơn (bảng 8)

Nghiệm thức phun nấm Metarhizium anisopliae ở nồng độ 20 g.l-1 cho hiệu quả không khác biệt thống kê có ý nghĩa đối với nồng độ 15 g.l-1 ở phần lớn các thời điểm lấy chỉ tiêu, chỉ trừ ở 9 NSKP (lần phun 1) và 6 NSKP (lần phun 4) Hiệu quả cao nhất đối với nghiệm thức này là 65,4% (ở 9 NSKP thuốc lần 3) và thấp nhất chỉ đạt 19,5% (3 NSKP thuốc lần 2) Điều này cho thấy, chế phẩm sinh học này trên rau đối với sâu ăn tạp vẫn có hiệu quả chậm, đến 9 NSKP đạt hiệu quả cao hơn