Báo cáo Vi sinh ứng dụng

mẫu nước trong môi trường tự nhiên.Ngoài ra từ môi trường này có thể tạo ra các môi trường phân lập khác bằng cách : +Pha trộn tỉ lệ môi trường của CPC khác nhau+Giảm nông độ Colistin tr

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA NUÔI TRỒNG

Chủ đề 4:

trên môi trường CPC agar từ mẫu

nước biển tự nhiên

1.Mở đầu

Như đã biết thì vi khuẩn (chẳng hạn như

Vibrio spp) là một trong những nguyên nhân gây bệnh nguy hiểm cho các đối tượng nuôi trồng

thủy sản cũng như những tác hại của chúng với sức khỏe con người Song những hiểu biết và

những nghiên cứu về chúng đến thời điểm hiện tại cũng đang còn nhiều hạn chế

Do đó việc nghiên cứu, phân lập, nhận dạng chúng để có những hiểu biết sâu sắc từ đó làm cơ sở cho việc chẩn đoán và phòng trị bệnh

có vai trò to lớn trong nuôi trồng thủy sản cũng như trong việc bảo vệ sức khỏe con người!

mẫu nước trong môi trường tự nhiên.

Ngoài ra từ môi trường này có thể tạo ra các môi trường phân lập khác bằng cách :

+Pha trộn tỉ lệ môi trường của CPC khác nhau+Giảm nông độ Colistin trong môi trường nuôi cấy +Loại bỏ một thành phần nào đó của CPC agar

Mẫu nước tự nhiên/mẫu ĐVTS ước lượng mật độ của Vibrio vulnificus

CPC agar Phương pháp cấy vạch

Những cuộc điều tra gần đây về V vulnificus như của Arias và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu mẫu nước biển và mẫu động vật thủy sản tại khu vực ven bờ biển Tây Ban Nha thuộc biển Địa Trung Hải:

Mẫu nước tự nhiên/mẫu ĐVTS các khuẩn lạc CPC agar

TCBS agar

Đặc điểm hình thái

Kiểm tra PCR (các đoạn mồi đặc biệt)

Kết luận ? (nhanh, chính xác)

Các khuẩn lạc của Vibrio vulnificus

trên các môi trường TCBS và CPC

V vulnificus

Trong quá trình nghiên cứu đó, V vulnificus đã được phát hiện đầu tiên ở vùng biển Tây Ban Nha thuộc biển Địa Trung Hải Nhưng chỉ có 7.6% khuẩn lạc phát triển và nhận dạng được thông qua những đặc điểm về hình thái của V vulnificus (đã kiểm chứng bằng PCR) Những khuẩn lạc không thể kiểm chứng được bằng PCR thì sẽ không được nhận dạng.

Người ta đã tiến hành việc xác định một số dòng tiêu biểu thu được trên môi trường CPC agar Trong những nghiên cứu đó đã thấy

sự xuất hiện của các loài tương tự như V vulnificus nhưng chưa được kiểm chứng một cách chắc chắn

Kết quả thu được nếu sai lệch thì do :

+Sự thiếu chính xác của phương pháp PCR+sự có mặt của vi khuẩn cạnh tranh khác (chúng có đặc điểm hình thái tương tự như V vulnificus)

Đặc điểm sinh hóa V parahaemolyticus V harveyi V alginolyticus V anguillarum V vulnificus

+ + + Xanh - + + - + +

+ + + Vàng - + + - + +

+ + + Vàng - - + - + -

+ + + Xanh - + + - + -

-Bảng : đặc điểm sinh hóa một số loài Vibrio

Để nhận diện những loài không phải Vibrio các nhà nghiên cứu

đã chọn ra 284 chủng mà đã xác định không phải là V vulnificus để phân lập trên CPC agar

Trong 284 chủng được phân lập thì có 57 thể phân lập là những loài thuộc Vibrio không được nhận dạng Những chủng này có kết quả dương tính với Arginine dehidrolase và chỉ một số chúng âm tính với

Decacboxylase Thêm vào đó khi tỉ lệ của Enterobacteriaceae thấp được xác định bởi API 20E Và một vài dòng không thể phát triển

được trên môi trường lên men thì không phải là Vibrio và không xác định

Những loài phong phú nhất như V harveyi (chiếm 24%) thể phân lập cùng với V splendidus, V navarrensis, V alginolyticus, V

parahaemolyticus Những loài còn lại chiếm tỉ lệ thấp hơn 1% V

harveyi, V splendidus là những loài phong phú nhất trong quá trình nghiên cứu suốt cả mùa nóng lẫn mùa lạnh và chúng có khả năng cạnh tranh với những loài khác có nhu cầu về độ mặn thấp như: V

vulnificus, V parahaemolyticus.

Điều này liên quan đến phạm vi tác động hẹp của V vulnificus,

V parahaemolyticus

Vì vậy, với điều kiện độ mặn cao ở Địa Trung Hải lại thuận lợi cho các loài Vibrio khác Do đó nhận thấy rằng số lượng V vulnificus gần như được giữ trong ngưỡng giới hạn nhất định

Một vài

Serratia sp, Citrobacter sp và Proteus sp chiếm ưu thế lớn Những thể phân lập phát triển này phát triển trên môi trường CPC agar lấy được

từ mẫu nước với mật độ cao, không ổn định của trực khuẩn đường

ruột Coliform

Có một chú ý rằng 2 loài V alginolyticus, V parahaemolyticus

được xác định rằng không có khả năng sử dụng Cellulose như nguồn Cacbon tạo năng lượng duy nhất của chúng

Sự phát triển quá mức của các loài Vibrio cạnh tranh khác bao gồm những dòng có khả năng sử dụng Cellulose sẽ làm giảm hoạt tính của môi trường CPC agar

Từ đó sẽ dẫn đến sự sai lệch của việc xác định những mẫu

có trong môi trường nơi mà chúng sinh sống chiếm số it

Bảng 1 Các loài (khác với V vulnificus) thu được trên môi trường CPC agar từ mẫu nước biển tự nhiên

4 20

284

(%) total

24 19 13 8 5 0.7 0.7 0.7 0.3 0.3 20

1.5 7

100

Massad và Oliver cho rằng môi trường CPC agar là sự lựa chọn tốt nhất cho V cholerae và V vulnificus Đồng thời họ đã kiểm tra

cùng với 19 loài Vibrio và một số loài khác và nhận ra rằng khi ủ ấm

ở 400C chỉ có 1 trong 9 chủng V parahaemolyticus là có thể phát

triển được

Trong những nghiên cứu sau đó, một vài tác giả đã dùng môi trường CPC agar hoặc làm giảm hoạt tính môi trường bằng cách giảm nồng độ Colistin (mCPC) cho sự phân lập V vulnificus từ những mẫu nước biển hay mẫu động vật thủy sản có vỏ từ những vùng biển khác nhau

Moriss và cộng sự kiểm tra và nhận thấy rằng V fluvialis, V harveyi cũng có khả năng sử dụng Cellulose trên môi trường CPC

Mô hình nghiên cứu của Moriss và cộng sự

CPC agar mCPC

Kiểm tra PCR (các đoạn mồi đặc biệt)

Mẫu nước tự nhiên/mẫu ĐVTS

Høi và cộng sự đã sử dụng môi trường CC agar

(Cellobiose-Colistin agar) vì nhận thấy Polymyxin B không thật sự cần thiết (chất kháng sinh và Colistin được xem như chất kháng khuẩn)

Họ nhận thấy rằng: môi trường mới này đã cải thiện một cách đáng kể tốc độ phân lập của V vulnificus từ mẫu nước hoặc mẫu lắng cặn so với môi trường mCPC agar Tuy vậy việc làm giảm nồng độ của chất kháng sinh không ngăn chặn được hoàn toàn khả năng cạnh tranh và ức chế của các loài Vibrio khác Họ nhận thấy rằng những

chủng V vulnificus được phân lập từ những mẫu cá Chình bị bệnh

không phát triển trên môi trường CPC agar Điều này có liên quan đến việc đánh giá thấp sự có mặt của những loài này khi sử dụng môi

trường CPC agar

Ngoài ra họ đã kiểm tra 125 chủng đã xác nhận

trên môi trường chọn lọc Tất cả thể phân lập của V

broth) ở 280C trong 14 giờ và nuôi cấy trên môi

trường CPC agar trong 14 giờ ở 400C Chỉ có một số phát triển được và cho dương tính với Cellulose

Việc kiểm tra được tiến hành trên 2 lô của môi

trường CPC agar hoàn toàn độc lập 91% mẫu cá

Chình bị bệnh dòng E (serovar E) cùng với 25% thể phân lập của những mẫu trong môi trường và 33% thể phân lập của những dòng có liên quan (không

phải dòng E) không thể phát triển

125 dòng V vulnificus

và các chủng liên quan

Môi trường MB

Bảng 2 Sự phát triển của các dòng V vulnificus trên CPC agar

Sự kém phát triển của V vulnificus từ những

mẫu cá Chình bị bệnh có thể được giải thích là do

nhiệt độ ủ quá cao (400C) vượt qua giới hạn nhiệt

độ của những chủng này

Phát hiện này chỉ ra rằng khả năng phát triển

trên môt trường CPC agar là không được chia sẻ ở tất cả chủng V vulnificus đã được trình bày bởi

Høi và cộng sự (đã tìm thấy rằng một vài chủng gây bệnh và chủng có liên quan phát triển ở trong MICs (là một chế phẩm vi sinh)

3 Kết luận

Từ kết quả thu được ở trong những nghiên cứu hiện tại và trước đó ở vùng biển Địa Trung Hải có thể kết luận rằng:

mẫu thí nghiệm chứa một số lượng lớn các loài Vibrio có

sử dụng Cellulose như là nguồn Cacbon và nguồn năng

chính xác và khả năng phán đoán của môi trường.

 Không phải tất cả những chủng V vulnificus được kiểm tra thì đều phát triển được trên môi trường CPC agar.

 Phương pháp PCR có độ tin cậy cao khi nhận dạng

 Tính chọn lọc thấp của môi trường CPC agar đối với thể phân lập

do sự hiện diện với số lượng cao của các loài Vibrio cạnh tranh

khác phù hợp hơn với môi trường đặc biệt này mà không thể ức chế chúng một cách hoàn toàn

 Ngoài sự kết hợp của môi trường CPC agar và phương pháp PCR

để phát hiện được sự có mặt của những loài gây bệnh này người ta còn sử dụng các phương pháp khác

Vấn đề đang còn tranh cãi hiện nay là để mang lại sự xác minh chính xác và có cơ sở cho các khuẩn lạc của V vulnificus trên CPC agar khi mà trong những mẫu nghiên cứu có một số lượng lớn các loài cạnh tranh khác