Khóa luận tốt nghiệp

Khóa luận tốt nghiệp

Mở Đầu Đặt vấn đề

Cà chua là nguồn thực phẩm quan trọng trong đời sống thờng ngày của con

ng-ời Đây là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao, dễ trồng, vốn chi phí ban đầu thấp, có thể mở rộng sản xuất ở hầu khắp các vùng sinh thái khác nhau

Nhu cầu tiêu thụ cà chua ở nớc ta rất lớn và nhu cầu này ngày càng tăng vì cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dỡng cao, trong cà chua có chứa nhiều loại vitamin nh A, B, C, B2, PP, K,…và các chất khoáng nh Ca, Fe, P, S, Na, K, Mg và đ-ờng Mặt khác, cà chua là loại thực phẩm dễ chế biến và sử dụng, có thể dùng ăn tơi, nấu, chế biến thành cà chua khô, cà chua bột, tơng cà chua,…Bên cạnh đó, cà chua còn là mặt hàng xuất khẩu có nhiều triển vọng vì sản phẩm cà chua ở nớc ta được thu hoạch vào đúng thời điểm nhiều nớc không trồng đợc trong mùa đông lạnh [15]

Tuy nhiên, năng suất và chất lợng cà chua phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố Bởi

cà chua là loại cây rất dễ bị sâu bệnh phá hại, đặc biệt là những bệnh do nấm, vi khuẩn, virus Chúng gây hại từ giai đoạn cây con trong vờn ơm, giai đoạn trồng ngoài sản xuất cho đến khi thu hoạch [16] Do đó làm giảm năng suất đồng thời ngời trồng phải sử dụng rất nhiều loại thuốc phòng trừ sâu bệnh với liều lợng cao hơn khuyến cáo rất nhiều lần, vì thế chúng thờng gây độc cho ngời tiêu dùng do d lợng trong sản phẩm Bên cạnh đó, với năng suất trung bình 14 tấn/1 ha, sản lợng hàng năm trên cả nớc là 100 ngàn tấn mới chỉ đảm bảo cho bình quân đầu ngời trên cả nớc hơn 1 kg sản phẩm một năm Mặt khác, do vùng trồng cà chua và thời gian thu hoạch thờng tập trung nên sản phẩm có nơi có lúc thừa, giá bán quá rẻ, dập nát và h hỏng khi vận chuyển và bảo quản, [15] Vì vậy, việc tạo ra những giống cà chua có khả năng kháng sâu bệnh, nâng cao năng suất, chất lợng là rất cần thiết

Trớc đây, muốn tạo ra đợc một giống cây mới, ngời ta đã phải mất rất nhiều năm bằng cách lai tạo, chọn lọc qua nhiều thế hệ, tuy nhiên không phải lúc nào cũng tạo ra đợc giống cây mang đợc các đặc tính nh mong muốn Nhng ngày nay, công nghệ gen đã giúp cho việc chuyển gen u việt vào việc lai tạo giống mới trong nông nghiệp đợc tiến hành một cách nhanh chóng và dễ dàng hơn [13]

Tuy nhiên, một trong những yếu tố quan trọng hàng đầu dẫn tới sự thành công của công tác chọn tạo giống cây trồng nói chung và chuyển gen vào thực vật nói riêng là việc xây dựng hệ thống tái sinh có hiệu quả cao [14] Chính vì vậy chúng tôi quyết định tiến hành"Nghiên cứu hệ thống tái sinh cây cà chua (Lycopersicum

esculentum L.) phục vụ chuyển gen" nhằm khảo sát khả năng tái sinh in vitro cây cà

chua từ thân mầm để phục vụ cho việc chuyển gen sau này

2 Nội dung nghiên cứu.

- Tìm hiểu ảnh hởng cuả một số chất kích thích sinh trởng lên khả năng nảy mầm của hạt

- Tìm hiểu khả năng tái sinh cây từ thân mầm

Đề tài đợc thực hiện tại phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Sinh học - Khoa KHTN &

XH - ĐHTN

Chơng 1 Tổng Quan Tài Liệu

1.1 Giới thiệu chung về cây cà chua

Cà chua thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phân lớp bạc hà (Lamiidae), lớp ngọc lan (Magnoliopsida), có tên khoa học là Lycopersicum

esculentum L., cà chua còn có nhiều tên gọi khác nhau nh Lycopersicum esculentum

Mill, L lycopersicum, S lycopersicon, L kort [15] Từ lâu có nhiều tác giả nghiên cứu về phân loại cà chua và lập thành hệ thống phân loại theo quan điểm riêng của mình Theo H.J.Muller (1940) thì loài cà chua trồng hiện nay thuộc chi phụ

Eulycopersion C.H.Muller Tác giả phân loại chi phụ này thành 7 loài, loài cà chua

trồng hiện nay (Lycopersicon esculentum L.) thuộc loài thứ nhất [2] Theo L.B.Lihner Nonnecke (1989) thì L.esculentum là loài cà chua trồng có 4 biến chủng sau

+ L esculentum var Commune là giống cà chua thông thờng Hầu hết những

giống cà chua trồng đều thuộc biến chủng này Đặc điểm là thân, lá rậm rạp, sum suê, quả có khối lợng trung bình lớn

+ L esculentum var Grandifolium Lá của biến chủng này to, giống lá khoai tây, mặt lá rộng và láng bóng, số lá trên cây ít

+ L esculentum var Validum Cà chua anh đào, cây đứng, mập

+ L esculentum var Pyriforme Cà chua hình quả lê

Tất cả các loài cà chua đều có số nhiễm sắc thể 2n = 24

1.1.2 Đặc điểm sinh học

Cà chua là loại thân thảo, sống theo mùa, a khí hậu ấm áp và ánh sáng đầy đủ

Có ánh sáng cây mới sinh trởng và phát triển tốt Cà chua sinh trởng và phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ trung bình từ 22oC -26oC Nếu nhiệt độ trên 35oC cây cà chua ngừng sinh trởng, khi nhiệt độ xuống dới 10oC cà chua không ra hoa Mặc dù đợc xếp vào nhóm cây tơng đối chịu hạn song cà chua cũng là cây a nớc, cà chua cần một lợng nớc lớn cho suốt quá trình sinh trởng, phát triển nên cà chua cần phải đợc tới nhiều nớc, nếu để ruộng trồng cà chua lúc thừa lúc thiếu nớc sẽ làm cho quả dễ bị nứt Vào thời gian ra hoa nếu thiếu nớc sẽ làm cho hoa đợc hình thành ít, dễ

bị rụng quả [12]

Cà chua có thân tròn, phân nhánh nhiều, cao 0.6 - 1m, toàn thân có lông mềm

và lông tuyến, đặc tính của cây cà chua là bò lan ra xung quanh hoặc mọc thành bụi Lá kép lông chim phân thuỳ, số lợng thuỳ không cố định Lá chét hình trứng thuôn dài 7-12cm, rộng 2-5 cm, đầu nhọn hoặc tù, gốc lệch, mép khía, răng thô, cuống dài 2-3cm [6]

Hoa màu vàng, mọc thành chùm ở kẽ lá, mỗi chùm 5-8 hoa hoặc nhiều hơn Khi gặp những điều kiện bất lợi nh quá lạnh, quá nóng, quá khô hạn, quá ẩm ớt hoặc thiếu dinh dỡng, sâu bệnh gây hại, thì sẽ làm cho hoa và quả dễ bị rụng Thờng ngời

ta sử dụng chất kích thích sinh trởng 2,4D để ngăn cản hiện tợng này [3]

Quả cà chua có hình tròn hoặc hơi dẹt, cũng có giống quả hình trứng, hình quả lê, Khi quả chín, tuỳ thuộc vào đặc điểm của giống mà có màu sắc khác nhau nh màu đỏ, màu vàng, màu vàng hồng, Chất màu chủ yếu của cà chua là carotinoit, chlorophyll, theo mức độ chín, lợng chlorophyll giảm, lợng carotinoit tăng Trong quả

cà chua có chứa thịt quả, chất dịch chua ngọt và nhiều hạt dẹt hình thận [6] Lớp thịt càng dày, buồng đựng hạt càng bé, chất lợng quả càng cao ở độ chín hoàn toàn, lợng vitamin C và carotinoit đạt tỷ lệ cao nhất, lợng acid giảm, lợng đờng tăng, thịt quả có

vị ngọt hơn lúc còn xanh Lợng protopectin giảm làm cho vỏ dễ tách ra và quả bị mềm

Dựa vào đặc điểm hình thái của quả mà ngời ta phân loại cà chua thành các nhóm khác nhau ở nớc ta, các giống cà chua đang đợc trồng chủ yếu thuộc ba nhóm

chính là nhóm cà chua múi, nhóm cà chua hồng và nhóm cà chua bi (hay còn gọi là

cà chua ta hoặc cà chua kiu) [15]

- Cà chua múi: Quả to, nhiều ngăn tạo thành múi Quả có vị chua, nhiều hạt, ăn không ngon, nhng cây mọc khoẻ, sai quả, chống chịu sâu bệnh tốt Giống điển hình

là cà chua múi Hải Phòng

- Cà chua hồng: Là loại cà chua đợc trồng phổ biến hiện nay Quả có hình dạng

nh quả hồng, không có múi hoặc múi không rõ Chất lợng ăn tơi cũng nh lúc chế biến

và nấu ăn cao do thịt quả đặc, nhiều bột, lợng đờng cao Phần lớn trong nhóm này là các giống đợc lai tạo, chọn lọc trong nớc và một số giống nhập nội Một số giống th-ờng đợc trồng là PT18, HT7, HT14, VT3, HP1, MV1,

- Cà chua bi: Là giống địa phong, gặp rải rác ở các vùng núi cao và ven biển miền trung, chúng có lợng acid cao, hạt nhiều, năng suất thấp do quả bé nhng khả năng chống chịu tốt nên đợc sử dụng làm vật liệu tạo giống Gần đây, nhiều vùng trong nớc đã trồng các giống cà chua quả nhỏ nhập nội Những giống này cho năng suất và chất lợng tốt, đợc sử dụng chủ yếu nh một loại quả sau bữa ăn Các giống có màu sắc và hình dáng rất đa dạng [23]

1.1.3 Giá trị kinh tế và giá trị sử dụng

Cà chua là cây rau có giá trị kinh tế cao, đợc trồng rộng rãi trên thế giới Cà chua có thể cho năng suất cao, sinh trởng nhanh, bảo quản đợc tơng đối dài hơn so với các loại rau khác, quả có khả năng vận chuyển đợc thuận lợi và đi xa [3] Vì vậy trồng cà chua đã thực sự mang lai hiệu quả kinh tế cao

Theo FAO (1999), hiện có tới 158 nớc trồng cà chua Diện tích cà chua trên thế giới là 3 254 000 ha, năng suất là 27.77 tấn/ha, sản lợng 90.36 triệu tấn Một số n-

ớc có năng suất cà chua cao trên 100 tấn/ha nh Hà Lan (425 tấn/ha), Thụy Sĩ (383 tấn/ha), Thụy Điển (327 tấn/ha), Na Uy (291 tấn/ha), Ailen (201 tấn/ha), [2]

Cà chua là loại rau cho hiệu quả kinh tế cao và là mặt hàng xuất khẩu quan trọng của nhiều nớc ở Mỹ (1997) tổng giá trị xuất khẩu một hecta cà chua cao hơn

4 lần so với lúa nớc, 20 lần so với lúa mỳ [2]

ở Việt Nam, lịch sử trồng cà chua mới chỉ hơn 100 năm nay Trong những năm gần đây ở nớc ta diện tích trồng cà chua đang ngày một tăng Điều kiện thiên nhiên, khí hậu và đất đai nớc ta rất thích hợp cho cà chua sinh trởng và phát triển Vì vậy trên khắp nớc ta từ bắc tới nam hầu hết đâu cũng trồng đuợc cà chua [3] Diện tích trồng cà chua hàng năm khoảng 10 000 ha [15] Cà chua là cây rau quan trọng của nhiều vùng chuyên canh, là cây trồng sau lúa mùa sớm cho hiệu quả kinh tế cao.

Cà chua đợc trồng chủ yếu ở vùng đồng bằng sông hồng và trung du bắc bộ ở Miền Nam có Đà Lạt (Lâm Đồng) là nơi sản xuất cà chua cho năng suất cao Song trong cả nớc cha có vùng sản xuất lớn, cà chua đang đợc trồng rải rác ở nhiều nơi

Đây cũng là khó khăn trong việc quy hoặch vùng sản xuất cà chua cho mục đích xuất khẩu và chế biến

Quả cà chua có giá trị dinh dỡng rất cao, thành phần dinh dỡng gồm glucid, protein, P, Ca, caroten, Fe, các vitamin B1, B2, PP, C [6] Vitamin C trong quả cà chua khi nấu chín vẫn giữ đợc phần lớn khối lợng, chỉ bị bay hơi tơng đối ít vì trong quả cà chua có các acid xitric và acid táo là những loại acid vừa có tác dụng bảo vệ vitamin C vừa có tác dụng tiêu đợc các chất béo [3] Cà chua chín cây có chất lợng tốt hơn so với cà chua chín trong thời gian bảo quản Đặc biệt, quả cà chua cú chứa hàm lượng lycopen khỏ cao Lycopen hoạt động như chất chống oxy húa cực mạnh trong cơ thể, chống lại tỏc hại của cỏc gốc tự do, khụi phục những tế bào bị tổn hại, tiờu diệt những phõn tử thoỏi húa, kiềm chế quỏ trỡnh oxy húa của DNA do đú cà chua cú tỏc dụng tốt đối với nhiều bệnh như: ung thư, tim mạch, chống lóo húa,…

Do có thành phần dinh dỡng phong phú nên cà chua đã trở thành món ăn thông dụng của nhiều nớc trên 150 năm nay và là cây rau ăn quả đợc trồng rộng rãi khắp các châu lục [2] Cà chua cũng là loại rau có nhiều cách sử dụng Có thể dùng quả tơi, trộn salat, nớc giải khát, xào nấu, hoặc đợc chế biến thành nhiều loại sản phẩm khác nhau nh: cà chua cô đặc, nớc quả, nớc sốt, tơng, cà chua đóng hộp, [19]

Cà chua là loại rau ăn quả có giá trị dinh dỡng và kinh tế cao nhng ở một số vùng ở nớc ta nó còn giữ giá trị thấp trong cơ cấu cây trồng Hiện nay, các nghiên cứu trên đối tợng này chỉ dừng lại ở việc sử dụng hệ thống cây trồng hoàn chỉnh [13] Sử dụng những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào đã thiết lập một công cụ hữu

ích cho việc nghiên cứu và tạo thành công cây cà chua chuyển gen nhằm nâng cao năng suất, chất lợng của cà chua.

1.2 Công nghệ tế bào thực vật trong cải tạo giống cây trồng

1.2.1 Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật

Hệ thống nuôi cấy mô tế bào thực vật đợc hoàn thiện và phát triển mạnh từ những năm 60 của thế kỷ XX khi tìm ra môi trờng nuôi cấy chuẩn và đặc biệt sử dụng các chất hormone sinh trởng nh auxin, gibberillin, cytokinin, để kích thích sự phân bào và tăng trởng tế bào cũng nh tạo thành các mô và tái sinh cây toàn vẹn từ tế bào đợc nuôi cấy[1]

Ngày nay ngời ta có thể nuôi cấy bất kỳ cơ quan nào của cây (chồi, lá, thân, rễ, hoa, ) để tạo thành mô sẹo và từ đó điều khiển cho tế bào biệt hoá thành các mô khác nhau (rễ, thân, lá, ) và tái sinh thành cây trởng thành

Trong kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thì môi trờng dinh dỡng để duy trì sự sống cho tế bào là rất quan trọng Môi trờng bao gồm các thành phần đa lợng nh: NH4,

NO3, SO4, Ca, Cl, K, Na, Các chất vi lợng nh: Fe, Mg, Mn, Zn, I, Bo, Mo, Cu, Ngoài ra còn phải bổ sung đờng vào môi trờng nuôi cấy vì cây nuôi cấy không hoàn toàn tự dỡng [27] Đờng đợc sử dụng làm nguồn cacbon chủ yếu cung cấp năng lợng trong nuôi cấy, đồng thời đóng vai trò duy trì áp suất thẩm thấu cho môi trờng nuôi cấy [25] Các đờng thờng dùng trong nuôi cấy là đờng glucose, hoặc sucrose Cho

đến nay, có rất nhiều môi trờng dinh dỡng khoáng đợc tìm ra nh môi trờng MS (1962), môi trờng Knop (1974), môi trờng Linsmainer và Skoog (1963), môi trờng Gamborg (1968), môi trờng VW (Vacine Went), Trong đó môi trờng MS là phù hợp nhất đối với đa số các loài thực vật [24] Tuy nhiên, không phải loài nào cũng phù hợp với môi trờng MS nh cẩm chớng (Dianthus spp), hơng nhu (Ocmum

gratissmum) chỉ sinh trởng đợc khi lợng khoáng giảm một nửa [26] Ngoài chất dinh

dỡng thì các hormone sinh trởng cũng đóng vai trò hết sức quan trọng trong định ớng cho quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy [4]

h-Bên cạnh đó phải kể đến vai trò của các yếu tố ngoại cảnh nh thời gian, độ chiếu sáng, nhiệt độ, độ pH, Chúng gây ảnh hởng lên sự sinh trởng và tái sinh của

tế bào, mô sẹo và cây con [1]

1.2.1.1 Cơ sở của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên cơ sở khoa học là tính toàn năng của tế bào do Haberlandt đề xuất năm 1902: “Mỗi một tế bào bất kỳ lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh” Khả năng

đó gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật [4]

Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hoá đều mang toàn bộ thông tin di truyền của cơ thể Chính vì vậy, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi một tế bào đều có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Để thực hiện

đợc điều này tế bào thực vật phải trải qua hai quá trình là phản biệt hoá và tái biệt hoá [11]

- Phản biệt hoá là giai đoạn đa tế bào từ trạng thái đã biệt hoá trở lại trạng thái cha biệt hoá Quá trình này biến tế bào đã biệt hoá thành những tế bào có hình thức giống nh những tế bào ở đỉnh sinh trởng (tế bào mầm phôi) Chúng có đặc điểm là tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ li ti hoặc không có, nhân to, kích thớc tế bào lớn Những tế bào nh vậy coi nh đã được phản biệt hoá xong và trong những điều kiện nuôi cấy nhất định chúng sẽ phát triển thành cơ thể mới

- Tái biệt hoá là giai đoạn đa tế bào đã phản biệt hoá phát triển thành cây hoàn chỉnh Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào đã biệt hoá tham gia hình thành nên các tế bào phôi và hai loại tế bào khác là tế bào trung gian và tế bào khổng lồ có không bào rất lớn Trong đó, chỉ có tế bào phôi và tế bào trung gian là phân chia còn các tế bào khổng lồ thì chết dần Khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh chỉ có ở trong các tế bào phôi, nhng nếu trong quần thể không có các tế bào khổng lồ thì các tế bào phôi không thể phát sinh thành cơ thể mới đợc mà chỉ những quần thể nuôi cấy có đủ các loại tế bào khác nhau mới có khả năng tái sinh [11]

Sự tái biệt hoá và phản biệt hoá là quá trình hoạt hoá và ức chế hoạt động của các gen Trong một giai đoạn nhất định của cây, một số gen nào đó đang ở trong trạng thái ức chế không hoạt động đợc hoạt hoá để cho ra một tính trạng biểu hiện mới Ngợc lại, một số gen lại bị ức chế đình chỉ hoạt động Quá trình hoạt hoá, ức chế diễn ra theo một chơng trình đã đợc lập sẵn trong cấu trúc hệ gen của tế bào, giúp cho

sự sinh trởng, phát triển của cơ thể thực vật đợc hài hoà Sự hoạt động hài hoà của của

các tế bào và mô cơ quan còn phụ thuộc vào tế bào nằm trong khối mô, cơ quan của cơ thể Khi tách riêng từng tế bào hoặc làm giảm kích thớc khối mô sẽ tạo điều kiện cho việc hoạt hoá các gen của tế bào [4].

1.2.1.2 Một số yếu tố ảnh hởng lên quá trình nuôi cấy mô tế bào

+ ảnh hởng của các chất điều hoà sinh trởng

Các chất điều hoà sinh trởng là thành phần không thể thiếu trong môi trờng nuôi cấy Chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát sinh hình thái thực vật in

vitro Hiệu quả tác động của các chất điều hoà sinh trởng phụ thuộc vào: Nồng độ sử

dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hoà sinh trởng, loại mẫu nuôi cấy, [20]

Các chất điều hoà sinh trởng bao gồm hai nhóm chính là auxin và cytokinin Tỉ

lệ, hàm lợng hai nhóm chất điều hoà sinh trởng này trong môi trờng nuôi cấy khác nhau sẽ định hớng cho sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy khác nhau[5]

- Nhóm auxin: Đợc đa vào môi trờng nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trởng và giãn nở của tế bào, tăng cờng các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích

sự hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính

Một số loại auxin thờng dùng trong nuôi cấy: IAA ( Indole acetic acid); IBA (Indole butyric acid); 2.4-D (2.4 - Dichlorophenoxy acetic acid) ; α-NAA (α-Naphthalene acetic acid)

Các auxin đều có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp, phạm vi sử dụng từ 0.1

- 1mg tuỳ theo mục đích và vật liệu nuôi cấy Auxin đợc thêm vào sẽ kết hợp với các auxin nội sinh để điều khiển chiều hớng và cờng độ các quá trình sinh trởng [18] Tuỳ theo loại auxin, hàm lợng sử dụng và đối tợng nuôi cấy mà tác động sinh lý của auxin là kích thích sinh trởng của mô, hoạt hoá sự hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo [20]

- Nhóm cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trởng của chồi in vitro Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sinh trởng của mô sẹo nhng có ảnh hởng dơng tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy Vì thế, trong giai đoạn đầu của phát sinh phôi soma, sự có mặt auxin là cần thiết nh-

ng trong giai đoạn sau của phôi phải đợc nuôi cấy trên môi trờng có cytokinin để biệt hoá chồi [21].

Một số loại cytokinin thờng dùng trong nuôi cấy: zeatin; kinetin; BAP,…Hàm lợng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0.1-2.0mg/l ở những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy Ngợc lại, ở nồng độ thấp hơn, cytokinin biểu hiện hiệu quả kích thích kém, dẫn đến sự tạo chồi và sinh trởng của chồi giảm

Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần cả hai Còn đa số các trờng hợp phải sử dụng phối hợp cả auxin và cytokinin ở những tổ hợp tỉ lệ khác nhau [20] Theo Bhojwani(1980) ở một số loài, môi trờng nuôi cấy chỉ

có một loại cytokinin cũng cho hệ số tạo chồi cực đại Với các cây ngũ cốc sự phối hợp của hai hay nhiều loại cytokinin cho kết quả tốt hơn khi sử dụng cytokinin riêng

rẽ Tuy nhiên, muốn có tơng quan sinh trởng tối u thì phải có cân bằng hormone thích hợp Sự biệt hoá cơ quan thực vật in vitro là kết quả tác động qua lại giữa hai nhóm auxin và cytokinin Tỷ lệ auxin/cytokinin cao sẽ kích thích sự tạo thành rễ, ngợc lại

sẽ đẩy mạnh sự biệt hoá chồi, còn nếu tỷ lệ đó là trung bình thì mô sẹo đợc hình thành Đó là nguyên tắc chung, còn phản ứng của các loại mô là không giống nhau [25] Vì thế mỗi loại mô ở từng giai đoạn sinh trởng khác nhau thì tổ hợp nồng độ giữa auxin và cytokinin là rất quan trọng

Ngoài hai nhóm chính là auxin và cytokinin, trong nuôi cấy ngời ta còn sử dụng thêm các chất điều hoà sinh trởng khác nh GA (thông dụng nhất là GA3), ABA, etylen,…Sự có mặt của GA3 trong môi trờng nuôi cấy sẽ tăng cờng quá trình vơn thân của chồi và tạo cây hoàn chỉnh ở một số loài thực vật Tuy nhiên đối với một số

đối tợng thì việc bổ sung GA3 là không cần thiết vì nó ảnh hởng xấu đến sự hình thành chồi bất định, sự tạo rễ và phát sinh phôi ABA chỉ đợc sử dụng trong nuôi cấy nhằm kìm hãm sự sinh trởng của chồi, tham gia bảo quản lơng thực và quỹ gen in

vitro ở một số trờng hợp ABA có tác dụng thúc đẩy sự tạo rễ nh trong nuôi cấy

khoai lang, cà chua, đậu tơng,…Trong nuôi cấy phôi, việc bổ sung ABA vào môi ờng nuôi cấy là cần thiết vì ABA giúp phôi chống lại sự khô hoá [25]

tr-+ ảnh hởng của mẫu nuôi cấy lên khả năng tái sinh cây

Mẫu dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể là hầu hết các cơ quan bộ phận của cây: Chồi ngọn, chồi bên, phiến lá, cuống lá,…Các cấu trúc của phôi (lá mầm, trụ lá mầm,…); Các cơ quan dự trữ (củ, căn hành,…) Tuỳ theo sự tiếp xúc với môi trờng mà các mẫu thực vật có chứa ít hay nhiều mầm bệnh (vi khuẩn, nấm) Các cấu trúc thực vật đợc bao kín (lá mầm, phôi, mô thịt trong quả,…) thờng không chứa hoặc có ít vi sinh vật Ngợc lại các mô và cơ quan thực vật tiếp xúc trực tiếp với đất, nớc nh rễ, thân ngầm, củ thờng có lợng vi sinh vật rất cao và rất khó loại bỏ hoàn toàn chúng khỏi nguồn mẫu.

Các loài cây khác nhau có hiệu quả nuôi cấy khác nhau Thông thờng thực vật hai lá mầm có khả năng tái sinh cao hơn thực vật một lá mầm Thậm chí tuy mang cùng một lợng thông tin di truyền nh nhau nhng các cấu trúc mô khác nhau trên một cây có thể cho các kết quả phát sinh hình thái khác nhau, với khả năng tạo chồi, rễ hay mô sẹo,…[24] Vì vậy, để chọn mẫu cấy cho phù hợp, phải căn cứ vào trạng thái sinh lý hay tuổi của mẫu Mẫu non trẻ có sự phản ứng với các điều kiện và môi trờng nuôi cấy nhanh, dễ tái sinh, đặc biệt là trong nuôi cấy mô sẹo, phôi Ngoài ra mô non trẻ mới đợc hình thành, sinh trởng mạnh, mức độ nhiễm mầm bệnh ít hơn [20]

Để đạt đợc hiệu quả tái sinh cao, khi lấy mẫu phải chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển cần thiết Thông thờng ngời ta lấy mẫu mô ở đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách rồi đến đỉnh chồi hoa và có thể là đoạn thân non, hoặc mảnh lá non Đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách dùng để nhân nhanh nhiều loại cây trồng nh: dứa, khoai tây, thuốc lá, cà chua, hoa cúc, hoa hồng,…Đỉnh chồi hoa để nhân nhanh suplơ Mảnh lá mầm để nhanh họ bầu bí,…Sử dụng chồi non của hạt nảy mầm cũng dễ dàng nhân nhanh nhiều loại cây trồng [5]

Bên cạnh đó, chất lợng của mẫu cấy phụ thuộc vào chất lợng của cây cho mẫu, thờng ngời ta lấy mẫu từ những cây có những đặc điểm u việt cần quan tâm: Sinh tr-ởng, phát triển mạnh, chống chịu tốt với các điều kiện bất lợi (hạn, lạnh, mặn,…) hoặc sâu bệnh, cho sản lợng và chất lợng ngon của quả, hạt,…

Tuỳ thuộc vào mục đích và khả năng nuôi cấy mà ngời ta chọn mẫu cho phù hợp: Để phục vụ cho nhân giống vô tính thờng chọn chồi ngọn, chồi bên (chồi muộn) Nuôi cấy mô sẹo, nuôi cấy phôi có thể sử dụng lá mầm, trụ mầm, thân, lá, phôi,…Để

thu cây đơn bội phục vụ cho lai tạo giống: Dùng bao phấn và hạt phấn cho nuôi cấy Bên cạnh đó, nguồn gốc, tuổi sinh lý của mẫu cấy cũng ảnh hởng đến khả năng tái sinh của mô Các mảnh nuôi cấy càng nhỏ thì tỉ lệ sống càng thấp và các mô có nguồn gốc từ chồi đỉnh có khả năng sinh trởng tốt hơn các mô có nguồn gốc từ chồi nách [25]

Tuy vậy, nguyên tắc căn bản là mẫu cấy phải chứa các tế bào sống từ các mô non có các tế bào đang phân chia mạnh chiếm tỷ lệ lớn, nhất là dễ tạo mô sẹo Mẫu cấy phải đợc khử trùng trớc khi đa vào môi trờng nuôi cấy Nếu mẫu lấy từ hạt, cần phải khử trùng bề mặt và gieo hạt vào điều kiện vô trùng để mọc thành cây và lấy mẫu Nếu mẫu lấy trực tiếp từ cây tơi, cần phải đợc xử lý để thu đợc mẫu sạch bệnh Nồng độ và thời gian xử lý tuỳ theo loại mẫu

1.2.1.3 ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành sinh học Nhờ áp dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh, mô sẹo,… con ngời đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần tốc độ vốn có trong tự nhiên Do đó sẽ tạo ra hàng loạt các cá thể đồng nhất về mặt di truyền từ một cá thể ban đầu với hệ số nhân giống cao ở quy mô công nghiệp, chính vì vậy nó đợc ứng dụng để nhân nhanh các giống cây trồng có giá trị kinh tế cao hoặc khó nhân giống bằng các phơng pháp thông thuờng khác Hơn nữa dựa vào kỹ thuật nuôi cấy để duy trì và bảo quản đợc nhiều giống cây trồng quý hiếm hoặc có thể loại

bỏ các mầm bệnh (phục chế giống) [21]

Hiện nay hàng loạt cây giống nh cây lơng thực, cây thực phẩm, cây dợc liệu, cây hoa, cây ăn trái, cây rừng,… đang đợc sản xuất trên quy mô công nghiệp bằng công nghệ vi nhân giống Công nghệ vi nhân giống có ý nghĩa kinh tế cao, nhất là đối với các cây sinh sản chậm (cây rừng, cây gỗ, cây ăn trái, cây dợc liệu) hoặc đối với cây cần cung cấp số lợng cây giống nhiều trong thời gian ngắn nh các cây hoa (hoa hồng, phong lan,…) Hơn nữa, chỉ thông qua kỹ thuật vi nhân giống mới có thể tạo đ-

ợc các giống cây thuần, cây lai, cây chuyển gen đồng đều về chất lợng, về tính chịu bệnh,…hoặc mang các đặc tính đáp ứng nhu cầu của ngời tiêu dùng [8]

Mặt khác, sử dụng các kỹ thuật nuôi cấy và dung hợp tế bào trần (protoplast)

để chuyển các gen mong muốn vào cây trồng tạo ra những tế bào lai khác loài mang

đặc tính di truyền của cả bố và mẹ, đây là phơng pháp hiệu quả nhất để tạo ra cây lai xoma, cho phép thu đợc tổ hợp lai mong muốn, phơng pháp này đã khắc phục đợc những hạn chế cố hữu mà phơng pháp lai hữu tính không thực hiện đợc Bên cạnh đó các nhà nghiên cứu còn thu nhận các chất trao đổi thứ cấp từ tế bào nuôi cấy dẫn đến một sự ổn định và độc lập hơn, ít lệ thuộc vào sản xuất của thực vật ngoài tự nhiên [21]

Đồng thời nuôi cấy mô tế bào thực vật là một phơng pháp nghiên cứu hiệu quả nhất quá trình phát sinh hình thái ở nhiều loài thực vật Phơng pháp này giúp mở ra những hớng mới trong nghiên cứu sinh lý và di truyền thực vật nh: Cơ chế sinh tổng hợp các chất, sinh lý phân tử - đột biến, sinh lý dinh dỡng ở tế bào thực vật,…[21]

Đặc biệt nuôi cây mô tế bào thực vật còn đợc xem là bớc không thể thiếu trong

kỹ thuật tạo cây trồng chuyển gen Một hệ thống tái sinh tối u sẽ cho phép tạo ra các cây chuyển gen có khả năng sinh sản bình thờng và duy trì tính trạng đợc chuyển nạp cho thế hệ sau một cách hiệu quả

1.2.2 Tạo giống cây trồng mới bằng phơng pháp chuyển gen

So với các phơng pháp lai tạo và chọn giống cổ điển, kỹ thuật chuyển gen có một số u thế: Nó cho phép đa vào thực vật một gen lạ thậm chí không hề có nguồn gốc thực vật, nó còn cho phép sản xuất với hàm lợng cao một protein chủ yếu của tế bào có cấu trúc và đặc tính hoàn toàn thay đổi, điều không bao giờ xảy ra trong tự nhiên [4] u điểm của hệ thống chuyển gen thực vật là không những toàn bộ các tế bào của cây tái sinh đều mang gen tái tổ hợp mà kể cả những hạt sinh ra từ cây này Hơn nữa, việc bổ sung các tính trạng quan trọng bằng kỹ thuật gen không làm ảnh h-ởng tới kiểu hình của cây, trong khi lai tạo truyền thống thờng phải chuyển toàn bộ genome của cây cho vào cây nhận nên rất khó tách riêng các gen có lợi khỏi các gen không cần thiết, nhất là khi chúng liên kết với nhau dẫn đến việc tạo ra kiểu hình không mong đợi [14]

Chuyển gen đợc hiểu là quá trình gắn một hay nhiều đoạn DNA mã hoá cho một thông tin di truyền nhất định vào một cơ thể sinh vật mới Đoạn DNA lạ này có

thể đợc tách từ thực vật, vi khuẩn, động vật hoặc đợc tổng hợp bằng các kỹ thuật sinh học phân tử Trong tế bào chủ, gen lạ hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trng, từ

đó xuất hiện đặc tính mới của cơ thể mang gen chuyển Muốn chuyển gen lạ vào tế bào chủ phải gắn gen mong muốn chuyển vào vector Các vector chuyển gen càng nhỏ càng tốt vì chúng dễ xâm nhập vào tế bào Vector phải có khả năng tự sao chép nhờ đó gen lạ cũng đợc sao chép cùng với DNA vector Đồng thời, vector phải đợc gắn gen chỉ thị chọn lọc Ví dụ: Gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu, và phải có

vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Các vector thờng dùng để chuyển gen ở thực vật gồm có các plasmid của vi khuẩn hoặc một số loại virus thực vật Quá trình này phải trải qua một số giai đoạn nhất định đó là lồng ghép, kết gắn, tạo biểu hiện và di truyền đoạn gen mới đó cho các thế hệ sau [18]

Hiện nay, có nhiều phơng pháp đợc sử dụng để chuyển gen vào cây trồng Căn

cứ vào cách thức đa gen vào tế bào thực vật mà ngời ta chia ra hai phơng pháp là: chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián tiếp Chuyển gen trực tiếp là việc sử dụng các biện pháp cơ học, vật lý hoặc hoá học để chuyển trực tiếp các gen vào tế bào thực vật Đó là phơng pháp vi tiêm, phơng pháp chuyển gen bằng súng bắn gen, bằng xung

điện, qua ống phấn, chuyển gen bằng siêu âm, chuyển gen bằng phơng pháp hoá học Chuyển gen gián tiếp là phơng pháp chuyển gen thông qua các vi sinh vật trung gian

nh virus, vi khuẩn (tiêu biểu là vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens) Đây là phơng pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định [5]

Cho dù lựa chọn phơng pháp nào thì để chuyển gen vào thực vật cũng cần phải trải qua các bớc cơ bản là: Chọn lọc và phân lập gen; chuyển gen vào tế bào thực vật; nuôi tế bào thực vật để tạo cây hoàn chỉnh

Nh vậy, nuôi cấy mô tế bào thực vật là khâu quan trọng không thể thiếu trong quy trình tạo thực vật chuyển gen Vì thế một hệ thống tái sinh cây in vitro hoàn chỉnh với tần số tái sinh cao giữ vai trò quan trọng trong nghiên cứu chuyển nạp gen

và hệ thống tái sinh này cần thực hiện trớc khi tiến hành quá trình chuyển gen

Kể từ khi những thí nghệm chuyển gen đầu tiên đợc tiến hành đến nay đã có hơn 50 loại gen đợc chuyển vào cây trồng và ít nhất khoảng 400 loài đã đợc kiểm tra

ngoài đồng ruộng [1] Trong đó có một số cây quan trọng nh ngô, cà chua, đậu tơng, khoai tây, bông, lúa, thuốc lá, và một số loài hoa.

Theo thống kê của ISAAA năm 2006, diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu đã lên tới 102 triệu ha mà đứng đầu là hoa kỳ với 54,6 triệu ha (chiếm 53%) Trong số các cây trồng chuyển gen đợc thơng mại hoá thì đậu tơng chuyển gen là loại cây trồng có diện tích gieo trồng lớn nhất 58,6 triệu ha (chiếm 57% diện tích trồng cây chuyển gen trên toàn cầu), tiếp theo là ngô với 25,2 triệu ha (chiếm 25%), bông 13,4 triệu ha (chiếm 13%) và cải dầu canola 4,8 triệu ha (chiếm 5%) [10]

1.2.3 Một số thành tựu chuyển gen ở cà chua

Ngày nay nhờ thành quả của phơng pháp nuôi cấy mô, kết hợp với nhiều

ph-ơng pháp chuyển gen tiên tiến có hiệu quả, chúng ta đã tạo ra đợc trên 45 loài cây tái

tổ hợp khác nhau nh lúa mì, lúa, ngô, khoai tây, bông, cà chua, cải dầu, đậu tơng,…[18] Với nhiều tính trạng đợc chuyển gen ở thực vật Đa phần các thực vật chuyển gen nhận đợc các gen đề kháng thuốc diệt cỏ (56%), kháng virus (15%), kháng côn trùng (10%),…[11]

Riêng đối với cà chua, kể từ năm 1994 khi cà chua trở thành sản phẩm chuyển gen đầu tiên đợc thơng mại hoá [5] cho đến nay ngời ta đã tạo ra đợc nhiều giống cà chua mới mang các đặc tính mong muốn nh kháng sâu, kháng virus, cho quả chín chậm, chống chịu điều kiện bất lợi,…

Cà chua là loại cây dễ trồng, không yêu cầu cao về kỹ thuật chăm sóc Tuy nhiên năng suất cà chua thờng bị giảm đáng kể do cà chua là loại cây dễ bị sâu bệnh phá hại Để khắc phục điều này, ngời ta đã tạo ra đợc giống cà chua có khả năng kháng sâu đục quả rất hiệu quả bằng cách chuyển gen Cry vào cà chua Gen Cry là gen tổng hợp protein nội độc tố của vi khuẩn Bacillus (Bt) đã cắt ngắn phần phụ (gen Cry) Gen Cry đã cắt ngắn này đợc chuyển vào cà chua tạo ra giống cà chua có khả năng kháng sâu đục quả rất hiệu quả

Để kháng lại virus khảm thuốc lá, ngời ta đã chuyển gen CP-TMV vào cà chua tạo ra cây cà chua chuyển gen có khả năng kháng lại virus khảm thuốc lá

Cà chua sau thu hoạch thờng chín nhanh và dễ bị thối hỏng do đó làm ảnh

h-chuyển một gen vào cây cà chua, gen này làm cho cà chua sản xuất ra một loại enzyme làm thoái hoá thành phần tiền chất hình thành ethylen và nh vậy sẽ làm cho

cà chua chậm chín và ít bị h hại Ngày nay, để bảo quản cho cà chua khỏi bị thối hỏng, ngời ta đã chuyển vào cà chua một gen của vi khuẩn, gen này sản sinh ra một chất gọi là chitinase tiêu diệt các tế bào nấm Do đó có thể bảo quản đợc cà chua lâu hơn sau khi thu hoạch [16]

Từ năm 1994, giống cà chua chín chậm chuyển gen đã đợc thơng mại hoá rộng rãi trên thị trờng ở Mỹ Giống này có u điểm là quả không bị dập khi vận chuyển[9]

Nh vậy, từ khi cà chua chính thức đợc trồng làm rau màu cho đến nay Quá trình cải tiến giống đợc các nhà chọn tạo giống cà chua thực hiện liên tục Do đó, năng suất và chất lợng cà chua không ngừng đợc cải thiện nhằm đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của ngời tiêu dùng Bên cạnh các hớng nghiên cứu nâng cao năng suất

và chất lợng cà chua bằng việc chuyển các gen kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, chín chậm,…Ngày nay, một hớng nghiên cứu mới đợc ứng dụng đối với cà chua là tạo cây cà chua với mục đích làm thực phẩm chức năng Tuy cha đợc thơng mại hoá nhng đây là hớng nghiên cứu có nhiều triển vọng và bớc đầu thu đợc thành công ở một số nớc ở ấn độ các nhà khoa học thuộc viện nghiên cứu thực vật quốc gia đã phát triển dòng cà chua chuyển gen có chức năng antitrypsin của ngời Cà chua chuyển gen có khả năng sản xuất ra loại protein chức năng “ human alpha - 1- antitrypsin” (AAT) Protein AAT là chất ức chế phổ biến nhất với enzyme “ serine protease” trong huyết tơng ngời Thiếu AAT sẽ dẫn tới bệnh ung th gan, viêm khí quản, viêm khớp và viêm da Ngời ta nhận thấy protein AAT của cà chua chuyển gen thể hiện hoạt tính rất cao Trung bình 1kg lá cà chua có thể cho 195mg AAT [28]