NGHIÊN cứu đa DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN GEN BÔNG cỏ (gossypium arboreum l ) PHỤC vụ lập bản đồ GEN KHÁNG BỆNH XANH lùn Khóa luận tốt nghiệp

1.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BÔNG VẢI (Gossypium L.)1.1.1. Vị trí phân loại và nguồn gốc phân bốTheo cơ sở dữ liệu ITIS (Integrated Taxonomic Information System), cây bông được phân loại như sau:Giới thực vật – Plantae Ngành hạt kín – Magnoliophyta Lớp hai lá mầm – Magnoliopsida Bộ bông – MalvalesHọ bông – MalvaceaeChi bông – GossypiumCây có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Các loài bông có thể cao đến tận 3 mét. Lá có cuống dài, phiến non có lông về sau không lông, có 35 thùy sâu đến một nửa. Hoa to 58 cm, vàng vàng, tâm đỏ bầm; lá đài phụ rời nhau hay dính nhau ít, có khía rất sâu; đài hình chén; ống nhị dài 1,5 cm. Quả nang xoan (quả bông), 34 mảnh; hạt nhiều, có lông trắng dễ tróc phủ quanh hạt gọi là sợi bông. Hình 1.1. Loài bông cỏ châu Á (Gossypium arboreum L.)Theo Jiang (2004), Brubaker và cs. (2002), chi Gossypium có khoảng 50 loài và chỉ có bốn loài có giá trị thương phẩm cao là: Gossypium arboreum L. Bông cỏ châu Á, có nguồn gốc ở miền nam châu Á. Gossypium barbadense L. Bông hải đảo, có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ. Gossypium herbaceum L. Bông cỏ châu Phi, có nguồn gốc ở miền nam châu Phi. Gossypium hirsutum L. Bông luồi, có nguồn gốc ở khu vực Trung Mỹ, Caribe và miền nam Florida, Hoa Kỳ.Các loài bông còn lại không được trồng do sợi bông ngắn và có màu nâu hung đỏ, không phù hợp cho việc xe sợi hay xoắn sợi thành các sợi chỉ:+ Gossypium sturtianum J.H. Willis – Bông Úc hay hồng sa mạc Sturt (Sturt’s Desert Rose), có nguồn gốc ở Australia.+ Gossypium thurberi Tod. – Bông dại Arizona, có nguồn gốc ở Arizona, New Mexico và miền bắc Mexico.+ Gossypium tomentosum Nutt. – Bông Hawaii, là loài đặc hữu của khu vực quần đảo Hawaii….Cũng theo Brubaker và cs. (2002), chi Gossypium phân bố ở phía Tây và Nam Mexico khoảng 18 loài, ở Đông Bắc châu Phi và Arập khoảng 14 loài, và ở Australia khoảng 17 loài. Trong bốn loài bông có giá trị thương phẩm trên, ở Việt Nam, canh tác phổ biến nhất là ba loài bông là: G. hirsutum L., G. arboreum L. và G. barbadense L.a) Gossypium hirsutum L.Loài G. hirsutum thường được gọi là bông luồi, là loài bông tứ bội (song lưỡng bội) khác nguồn A, D có bộ nhiễm sắc thể 2n = 2x = 52 (Jiang, 2004). Bông luồi có nguồn gốc từ Trung Mỹ, nay được trồng lan rộng ra khắp nơi trên thế giới, sản lượng xơ bông Luồi chiếm trên 90% sản lượng toàn thế giới. Bông luồi được trồng nhiều nhất là ở Mỹ, trên 95% (Jiang, 2004), sau đó là Nga, Ấn Độ, Trung Quốc, Braxin, Achentina, Nam Phi và châu Úc.Ở Việt Nam, bông luồi du nhập vào nước ta khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế Kỷ XX. Phần lớn các giống thuộc loài này do người Pháp đưa vào nhằm mục đích khai thác và sản xuất bông hàng hóa. Về sau, loài này được du nhập vào bằng nhiều con đường khác nhau, chủ yếu thông qua các chương trình viện trợ của các tổ chức quốc tế. Qua quá trình thực nghiệm cho thấy loài này có khả năng thích ứng rộng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU……… 1

1 Tính cấp thiết của đề tài……… 1

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài……… 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… 4

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BÔNG VẢI Gossyipum L 4

1.1.1 Vị trí phân loại và nguồn gốc phân bố……… 4

1.1.2 Xuất xứ và sự đa dạng genome cây bông……… 7

1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT BÔNG TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC…… 9

1.2.1 Tình hình sản xuất bông trên thế giới……… 9

1.2.2 Hiện trạng ngành sản xuất bông ở Việt Nam………. 11

1.3 MỘT SỐ CHỈ THỊ ADN TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN……… ……… 15

1.3.1 Sự đa dạng ADN……… 15

1.3.2 Chỉ thị ADN……… 16

1.4 THÀNH TỰU TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY BÔNG VẢI BẰNG CHỈ THỊ ADN……… 20

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới……… 20

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam……… 22

1.5 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TÍNH KHÁNG BỆNH XANH LÙN…… 23

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP……… 25

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU……… 25

2.1.1 Vật liệu thực vật……… 25

2.1.2 Các cặp mồi SSR……… 26

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ KỸ THUẬT SỬ DỤNG… 26 2.2.1 Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn các giống bông cỏ… 26 2.2.2 Phương pháp đánh giá đặc tính nông sinh học, tiềm nămg năng suất của các giống bông……… ……… 27

2.2.3 Phương pháp phân tích đa hình di truyền bằng chỉ thị SSR……… 30

2.2.4 Các phương pháp xử lý số liệu chính trong nghiên cứu……… 34

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN……… 35

3.1 THU THẬP CÁC DÒNG, GIỐNG BÔNG TIỀM NĂNG NĂNG SUẤT CAO, CHẤT LƯỢNG TỐT VÀ GIỐNG KHÁNG BỆNH…… 35

3.2 ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG CỦA CÁC GIỐNG BÔNG CỎ NHẰM XÁC ĐỊNH NGUỒN GEN LÀM VẬT LIỆU BAN ĐẦU CHO VIỆC LAI TẠO QUẦN THỂ……… ……… ……… …

36 3.3 ĐÁNH GIÁ ĐẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC CÁC GIỐNG BÔNG CỎ NGHIÊN CỨU……… ……… ……….…… 39

3.3.1 Thời gian sinh trưởng và các đặc điểm thực vật học của các giống 39

bông nghiên cứu.……… ……… ……… ………

3.3.2 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất các giống bông… 42

3.3.3 Chất lượng xơ của các giống bông nghiên cứu……… 44

3.4 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG BÔNG NGHIÊN CỨU BẰNG CHỈ THỊ SSR……… ……… … 49

3.4.1 Tách chiết DNA tổng số của các giống bông phục vụ phân tích SSR… 49 3.4.2 Kết quả phân tích đa hình DNA các giống bông bố mẹ bằng chỉ thị phân tử SSR…… ……… ……… ……… ……… 49

3.4.3 Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống bông… 54

3.5 CHỌN CẶP LAI TRIỂN VỌNG TẠO QUẦN THỂ F1 PHỤC VỤ LẬP BẢN ĐỒ GEN KHÁNG BỆNH XANH LÙN……… 58

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……… 60

4.1 KẾT LUẬN……… 60

4.2 KIẾN NGHỊ……… 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO……… 6

1 Tiếng Việt……… 61

Tiếng Anh……… 62

Tài liệu từ Internet……… 64

PHỤ LỤC……… 65

DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Các nước có diện tích bông lớn nhất thế giới năm 2009-2010 10

Bảng 1.2 Các nước có sản lượng bông cao nhất thế giới năm 2009-2010 11

Bảng 1.3 Tình hình sản suất bông vải tại Việt Nam năm 2000-2010 13

Bảng 2.1 Mã số tập đoàn, tên và nguồn gốc của 30 giống bông cỏ thu thập 25

Bảng 2.2 Các nhóm mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 26

Bảng 2.3 Bảng số liệu đánh giá chiều cao cây 28

Bảng 2.4 Thành phần đệm chiết 31

Bảng 2.5 Thành phần đệm rửa I (wash buffer I) 31

Bảng 2.6 Thành phần đệm rửa II (Wash buffer II) 31

Bảng 2.7 Chương trình chạy phản ứng PCR 32

Bảng 3.1 Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh xanh lùn các giống bông 37

Bảng 3.2 Kết quả chọn lọc các dòng kháng bệnh xanh lùn của cỏ Nghệ An… 38 Bảng 3.3 Thời gian sinh trưởng và các đặc điểm thực vật học chính của các giống bông cỏ trong nghiên cứu 40

Bảng 3.4 Các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất của các giống bông…. 43 Bảng 3.5 Một số chỉ tiêu chính về chất lượng xơ của các giống bông cỏ 45

Bảng 3.6 Một số dòng/giống bông tiềm năng năng suất cao và chất lượng tốt 48

Bảng 3.7 Các chỉ tiêu về alen, chỉ số đa dạng PIC của các locus SSR nhận 52

biết trên 31 giống bông nghiên cứu

Bảng 3.8 Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền SSR trên cây bông đã

được công bố 53

Bảng 3.9 Mối quan hệ di truyền giữa 31 giống bông cỏ trong nghiên cứu 56

Bảng 3.10 Danh sách các giống bố mẹ dùng cho lai tạo quần thể F1 59

Phụ lục 1 Danh sách 50 cặp mồi SSR đã sử dụng trong nghiên cứu đa hình

các giống bông cỏ 65

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Loài bông cỏ châu Á (Gossypium arboreum L.)………. 4

Hình 1.2 Các loài bông thu thập được……… 7

Hình 1.3 Phân bố tự nhiên của các loài bông nhị bội……… 8

Hình 1.4 Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT)n……… 19

Hình 2.1 Các cấp bệnh xanh lùn đánh giá trong phòng thí nghiệm………… 27

Hình 2.2 Chiều dài xơ đo bằng thiết bị HVI……… 30

Hình 3.1 Gieo trồng ngoài đồng……… 35

Hình 3.2 Cây bông nhiễm và kháng bệnh xanh lùn……… 38

Hình 3.3 Ruộng đánh giá các đặc tính nông sinh học của các giống bông…. 39 Hình 3.4 Biểu đồ đánh giá một số đặc tính nông sinh học chính của các dòng/giống bông nghiên cứu……… ……… 47

Hình 3.5 Kết quả kiểm tra DNA của một số giống bông trên gel agarose 0,8%……… ……… 49

Hình 3.6 Sản phẩm PCR của các giống bông nghiên cứu với một số cặp mồi nhóm BNL trên gel agarose 3%……… ……… 50

Hình 3.7 Sản phẩm PCR của các giống bông nghiên cứu với một số cặp mồi nhóm NAU, TM và STV trên gel agarose 3%……… 51

Hình 3.8 Sơ đồ hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền của các giống bông cỏ trong nghiên cứu……… ……… 57

Hình 3.9 Sơ đồ lai tạo tổ hợp lai F1……… ……… 58

Phụ lục 2 Biểu đồ biểu thị các đặc tính nông sinh học của các giống bông cỏ trong nghiên cứu.……… ……… 69

BẢNG KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

ADN Acid deoxyribonucleic

ARN Acid ribonucleic

dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates

EthBr Ethidium bromide

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EST Expressed sequence tag

ISSR Inter-simple sequence repeat

Kb Kilo base

LSD0,05 Least Significant Difference

MAS Molecular Assisted Selection

PCR Polymerase Chain Reaction

PIC Polymorphism Information Content

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

STS Sequence- tagged site

TAE Tris-Acetic acid- EDTA

TBE Tris-Boric acid-EDTA

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây bông (Gossypium L.) là loại cây trồng lấy sợi tự nhiên hàng đầu và quan

trọng nhất trên thế giới, được trồng khắp mọi nơi ở điều kiện khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới Bông vải cũng là mặt hàng thương mại quan trọng mang lại lợi nhuận cho hàng triệu nông dân ở các nước phát triển cũng như đang phát triển Sản phẩm chính xơ bông được biết đến như là nguồn nguyên liệu chủ yếu cho ngành công nghiệp dệt may Hiện nay, với sự phát triển của xã hội, con người ý thức rõ giá trị của bản thân bằng việc làm đẹp với thời trang, đặc biệt là thời trang quần áo Con người sử dụng quần áo, vải vóc hàng ngày không chỉ giữ ấm cơ thể mà còn coi đó

là một nét văn hóa, thể hiện sự văn minh và đẳng cấp xã hội Qua những tính năng vượt trội như hút ẩm, mau khô, tạo sự thông thoáng, mát về mùa hè và ấm vào mùa đông của vải cotton, cây bông thực sự là cây trồng hữu ích và quan trọng đối với cuộc sống của con người

Cho đến nay, bông vẫn là nguyên liệu cơ bản của công nghiệp dệt chưa có gì thay thế được Phát triển nghề trồng bông vải đã trở thành ngành kinh tế nông nghiệp trọng điểm ở nhiều quốc gia với sản phẩm bông xơ đem lại giá trị kinh tế cao Hàng năm, ngành công nghiệp bông đã đóng góp vào nền kinh tế thế giới khoảng 500 tỉ USD với việc sử dụng khoảng 115 triệu kiện bông xơ (Chen & cs., 2007) Tuy nhiên, sản lượng bông vải hàng năm phụ thuộc vào nhiều yếu tố trong

đó yếu tố ngoại cảnh như sâu bệnh và giống là hai yếu tố quan trọng nhất Hiện nay

đã có hơn 20 loại bệnh hại bông do virus gây ra được công bố, trong đó bệnh xanh lùn hay còn gọi là bệnh xanh lá (cotton blue disease) là loại bệnh xuất hiện từ sớm

và gây hại nghiêm trọng cho sản xuất bông (Correae et al., 2005) Bệnh đã xuất

hiện và làm giảm sản lượng bông đáng kể ở khá nhiều nước trên thế giới, và cũng chính là loại bệnh gây hại lớn nhất cho cây bông ở nước ta hiện nay

Theo dự kiến của chính phủ đề ra, đến năm 2011, nông nghiệp nước ta phải đáp ứng được 20% sản lượng bông xơ, mở rộng diện tích trồng bông lên 0,5 triệu ha

(Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2003) Nhưng chính vì những hạn chế do giá bông không ổn định, năng suất, chất lượng bông thu hoạch thấp do sâu bệnh, chưa có giống kháng, chi phí sản xuất cao dẫn đến thua lỗ đã không khuyến khích được việc mở rộng diện tích trồng bông, cũng như tăng sản lượng bông trong nước.

Sự lựa chọn tối ưu nhất cho công tác quản lý bệnh cây và hạn chế ô nhiễm môi trường do dùng thuốc hóa học hiện nay chính là việc sử dụng giống kháng bệnh Nhờ sự tiến bộ của công nghệ sinh học, các nhà khoa học đã dễ dàng chuyển nạp các gen kháng vào các giống mới cho năng suất chất lượng tốt, kháng sâu bệnh, kháng thuốc diệt cỏ, giảm thiểu chi phí sản xuất và tăng thu nhập cho người trồng bông Tuy nhiên, hiện nay vẫn chưa có nhiều công trình nghiên cứu về tính kháng bệnh xanh lùn ở bông

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

Nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen bông cỏ (Gossypium arboreum L.)

phục vụ lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn.

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu của đề tài

2.1 Mục tiêu của đề tài

Thu thập các giống bông cỏ địa phương và nhập nội để tiến hành đánh giá khả năng kháng/nhiễm bệnh xanh lùn qua chỉ tiêu hình thái, đồng thời đánh giá sự

đa dạng di truyền của các giống bông bằng chỉ thị phân tử (SSR), từ đó xác định các cặp lai phục vụ nghiên cứu lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn và chọn tạo giống bông kháng bệnh

2.2 Nội dung nghiên cứu của đề tài

1 Thu thập một số giống bông cỏ có tiềm năng năng suất cao, chất lượng xơ tốt và một số dòng bông kháng bệnh xanh lùn

2 Đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn và một số đặc tính nông sinh học chính của cácgiống bông đã thu thập

3 Sử dụng chỉ thị phân tử SSR để phân tích mối quan hệ di truyền phân tử giữa các giống bông cỏ

4 Xác định cặp giống bông vải kháng bệnh và giống bông không kháng bệnh nhưng có nhiều đặc tính ưu việt về năng suất cũng như chất lượng sợi làm vật liệu lai tạo quần thể, phục vụ lập bản đồ phân tử gen kháng bệnh xanh lùn

3 Phạm vi nghiên cứu của đề tài

3.1 Các giống bông nghiên cứu của đề tài

Trong nghiên cứu của đề tài, chúng tôi tiến hành đánh giá 30 giống bông cỏ trong tập đoàn giống bông của Viện nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố, Ninh Thuận

3.2 Địa bàn nghiên cứu của đề tài

Đề tài nghiên cứu của chúng tôi được thực hiện tại Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố

Đề tài nghiên cứu này nằm trong đề tài khoa học cấp Nhà nước “Chọn tạo giống bông kháng bệnh xanh lùn bằng chỉ thị phân tử” thuộc chương trình Công

nghệ Sinh học Nông nghiệp do Viện Di truyền Nông nghiệp chủ trì và Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố phối hợp thực hiện

3.3 Thời gian nghiên cứu của đề tài

Đề tài được tiến hành từ tháng 01 năm 2009 đến tháng 04 năm 2011

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ CÂY BÔNG VẢI (Gossypium L.)

1.1.1 Vị trí phân loại và nguồn gốc phân bố

Theo cơ sở dữ liệu ITIS (Integrated Taxonomic Information System), cây bông được phân loại như sau:

Chi bông – Gossypium

Cây có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Các loài bông có thể cao đến tận 3 mét Lá có cuống dài, phiến non có lông về sau không lông, có 3-5 thùy sâu đến một nửa Hoa to 5-8 cm, vàng vàng, tâm đỏ bầm; lá đài phụ rời nhau hay dính nhau ít, có khía rất sâu; đài hình chén; ống nhị dài 1,5 cm Quả nang xoan (quả bông), 3-4 mảnh; hạt nhiều, có lông trắng dễ tróc phủ quanh hạt gọi là sợi bông

Hình 1.1 Loài bông cỏ châu Á (Gossypium arboreum L.)

Theo Jiang (2004), Brubaker và cs (2002), chi Gossypium có khoảng 50 loài

và chỉ có bốn loài có giá trị thương phẩm cao là:

- Gossypium arboreum L - Bông cỏ châu Á, có nguồn gốc ở miền nam châu Á.

- Gossypium barbadense L.- Bông hải đảo, có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới Nam Mỹ.

- Gossypium herbaceum L - Bông cỏ châu Phi, có nguồn gốc ở miền nam châu Phi.

- Gossypium hirsutum L - Bông luồi, có nguồn gốc ở khu vực Trung Mỹ, Caribe và

miền nam Florida, Hoa Kỳ

Các loài bông còn lại không được trồng do sợi bông ngắn và có màu nâu hung đỏ, không phù hợp cho việc xe sợi hay xoắn sợi thành các sợi chỉ:

+ Gossypium sturtianum J.H Willis – Bông Úc hay hồng sa mạc Sturt (Sturt’s

Desert Rose), có nguồn gốc ở Australia

+ Gossypium thurberi Tod – Bông dại Arizona, có nguồn gốc ở Arizona, New

Mexico và miền bắc Mexico

+ Gossypium tomentosum Nutt – Bông Hawaii, là loài đặc hữu của khu vực quần

đảo Hawaii…

Cũng theo Brubaker và cs (2002), chi Gossypium phân bố ở phía Tây và

Nam Mexico khoảng 18 loài, ở Đông Bắc châu Phi và Arập khoảng 14 loài, và ở Australia khoảng 17 loài Trong bốn loài bông có giá trị thương phẩm trên, ở Việt NamViệt Nam, canh tác phổ biến nhất là ba loài bông là: G hirsutum L., G

arboreum L và G barbadense L.

a) Gossypium hirsutum L.

Loài G hirsutum thường được gọi là bông luồi, là loài bông tứ bội (song

lưỡng bội) khác nguồn A, D có bộ nhiễm sắc thể 2n = 2x = 52 (Jiang, 2004) Bông

luồi có nguồn gốc từ Trung Mỹ, nay được trồng lan rộng ra khắp nơi trên thế giới, sản lượng xơ bông Luồi chiếm trên 90% sản lượng toàn thế giới Bông luồi được trồng nhiều nhất là ở Mỹ, trên 95% (Jiang, 2004), sau đó là Nga, Ấn Độ, Trung Quốc, Braxin, Achentina, Nam Phi và châu Úc

Ở Việt NamViệt Nam, bông luồi du nhập vào nước ta khoảng cuối thế kỷ XIX đầu thế Kỷ XX Phần lớn các giống thuộc loài này do người Pháp đưa vào nhằm mục đích khai thác và sản xuất bông hàng hóa Về sau, loài này được du nhập vào bằng nhiều con đường khác nhau, chủ yếu thông qua các chương trình viện trợ

của các tổ chức quốc tế Qua quá trình thực nghiệm cho thấy loài này có khả năng thích ứng rộng, phù hợp với điều kiện thời tiết ở nước ta Với tiềm năng cho năng suất cao và chất lượng xơ tốt, các giống bông này dần dần thay thế các giống bông

cỏ trước đó (Lê Quang Quyến, 2004) Bông luồi có nhiều loài phụ như: G hirsutum ssp Mexicanum, G hirsutum ssp Punctatum (Achum và Thonn), G hirsutum ssp

Panicultum (Balanco)…

b) Gossypium barbadense L.

Loài G barbadense thường được gọi là bông hải đảo, cũng giống như bông

luồi, bông hải đảo là loài bông tứ bội (song lưỡng bội) khác nguồn A, D có bộ nhiễm sắc thể 2n = 2x = 52 Bông hải đảo có nguồn gốc từ Nam Mỹ, nay được trồng nhiều ở Nga, Mỹ, Ai Cập và một số nước khác Bông hải đảo cung cấp khoảng 10% sản lượng xơ bông trên thế giới và hiện nay diện tích trồng bông hải đảo đang được mở rộng do phẩm chất xơ đặc biệt tốt

Ở Việt NamViệt Nam, chưa tìm thấy tài liệu nào nói về loài bông hải đảo được trồng phổ biến trong sản suất và bắt nguồn từ đâu Loài này thường gặp dưới dạng cây lâu năm ở trong các vườn hoang và bờ giậu Đến năm 1941-1945 mới du nhập một số giống như Ghiza, Pima vào miền Nam, các giống Trường Nhung, Menufi, Tiến Vọt vào miền Bắc năm 1955-1956 qua chương trình hợp tác và trao đổi giống Qua quá trình nghiên cứu và thử nghiệm, cho thấy loài bông hải đảo thích hợp trong vụ khô có tưới, không hợp với điều kiện mưa nhiều và độ ẩm cao

Bông hải đảo có nhiều loài phụ như: G barbadense ssp Darwwinii (Watt) Mauner, G barbadense ssp Redurale Mauner, G barbadense ssp Ventifolum (Lam) và G barbadense ssp Eubarbadense Mauner.

c) Gossypium arboreum L.

Loài G arboreum thường được gọi là bông cỏ, là loài bông lưỡng bội

genome A (2n=2x=26) Loài này có lẽ được trồng lâu đời nhất, có nguồn gốc từ Tây Nam Ấn Độ, lan truyền sang vùng Đông Nam Á, vùng có gió mùa khí hậu ẩm ướt Bông cỏ thường được trồng ở vùng đồng bằng nhưng cũng có trồng ở vùng núi cao 1500-2000 mét Vùng sản suất chính là Ấn Độ, Trung Quốc, Việt NamViệt Nam,

Myanmar, Lào Trước đây, sản lượng bông cỏ chiếm 20% tổng sản lượng bông trên thế giới mỗi năm Hiện nay, diện tích trồng bông cỏ ngày càng thu hẹp do chất lượng xơ cũng như năng suất của bông cỏ không bằng bông luồi và bông hải đảo

Ở Việt NamViệt Nam khoảng thế kỷ XIII-XIV, loài bông này được trồng phổ biến khắp mọi miền đất nước, từ đồng bằng đến vùng Trung du và Miền núi Đến năm 1955, loài bông cỏ vẫn còn phổ biến trên các vùng trồng bông ở Bắc bộ và một

số vùng thuộc Bắc Trung bộ; trong lúc đó ở các vùng bông ở Nam và Trung bộ đang dần thay thế bằng các giống bông luồi

Các giống bông cỏ hiện có ở Việt NamViệt Nam thuộc hai loài phụ: G

arboreum ssp Neglectum và G arboreum ssp Nanking, kể cả hai dạng bông lâu

năm và hàng năm (Lê Quang Quyến, 2004)

Hình 1.2 Các loài bông thu thập được: (a) bông luồi, (b) hải đảo, (c) bông cỏ

1.1.2 Xuất xứ và sự đa dạng genome cây bông

Cây bông (Gossypium L.) bao gồm khoảng 45 loài nhị bội và 5 loài tứ bội với cách thức di truyền phức tạp Nhóm bông nhị bội được chia làm 8 nhóm genome từ A đến G và K (Fryxell, 1992) Cho đến nay, các loài bông nhị bội có 3 nhóm bông chính: nhóm bông châu Phi có kiểu genome A, B, E, và F có xuất xứ từ châu Phi và châu Á; nhóm bông có kiểu genome D có nguồn gốc xuất xứ từ các nước châu Mỹ; nhóm bông thứ 3 có kiểu genome C, G và K được tìm thấy ở châu

Úc (Wendel & Cronn, 2003)

Tất cả 50 loài bông, kể cả hai loài bông tứ bội tự nhiên Gossypium hirsutum

và Gossypium barbadense, đều có nguồn gốc từ các loài bông tổ tiên châu Phi A

genome và các loài bông D genome

Tổ tiên của các loài bông tứ bội còn tồn tại cho đến nay là các loài bông nhị

bội Gossypium herbaceum (A1) và Gossypium arboreum (A2), và Gossypium raimondii (D5) Ulbrich (Brubaker & cs., 1999) Quá trình tứ bội hóa xảy ra khoảng

1 đến 2 triệu năm trước đây (Wendel & Cronn, 2003) đã tạo ra 5 loài bông tứ bội

Trong các loài bông, chỉ có 4 loài bông được trồng lấy sợi bao gồm hai dạng

nhị bội genome A (2n=2x=26) là G herbaceum (A1); G arboreum (A2) và hai dạng tứ bội (song lưỡng bội) khác nguồn A, D (2n=2x=52) là G hirsutum và G.barbadense.

Hình 1.3 Phân bố tự nhiên của các loài bông nhị bội.

Hiện nay, các giống bông trồng phổ biến trong sản xuất đều là bông tứ bội có nguồn gốc lai giữa hai nhóm genome A và D Trong khi đó, chỉ có các loài bông thuộc nhóm genome A cho bông lấy sợi còn nhóm genome D thì không (Chen & cs., 2007) Vì thế, nghiên cứu genome, lập bản đồ di truyền cây bông nhị bội A và

D là định hướng cơ bản giúp tìm hiểu sự hình thành, mối tương quan và biểu hiện gen ở cây bông thương mại tứ bội, giúp cải thiện các tính trạng quan trọng ở cây bông (Jiang & cs., 1998; Saha & cs., 2006; Yang & cs., 2006)

Kích thước genome của cây bông biến động tùy loài: Kích thước đơn bội

genome nhỏ nhất được ghi nhận ở loài G raimondii Ulbrich, đạt khoảng 880Mb Genome đơn bội của G arboreum có kích thước khoảng 1,75 Gb và G hirsutum có

kích thước 2,5 Gb (Hendrix & Stewart, 2005) Biến động thành phần ADN ở các loài nhị bội phản ánh mức độ nhiều hay ít của bản sao của các trình tự lặp lại khác nhau (Zhao & cs., 1998), và các yếu tố transposome (Hawkins & cs., 2006) Thành phần ADN của các loài đa bội xấp xỉ bằng tổng số của genome bố mẹ A và D (Liu

& cs., 2001)

1.2 TÌNH HÌNH SẢN XUẤT BÔNG TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.2.1 Tình hình sản xuất bông trên thế giới

1.2.2.1 Phương thức sản xuất

Trên thế giới hiện nay tồn tại hai phương thức sản xuất bông:

- Sản xuất bông không có sự hỗ trợ của nhà nước: Đây là phương thức sản xuất ở những vùng mà cây bông vẫn có ưu thế vì không có cây trồng nào tốt hơn hoặc những nước và vùng trồng bông là vùng đất xấu (Châu Phi…), đời sống nhân dân còn nghèo, thu nhập thấp; cây bông có năng cao và trở thành cây có tác dụng xóa đói giảm nghèo

- Sản xuất bông có sự hỗ trợ của nhà nước: Điển hình cho phương thức sản xuất này là ba nước lớn (Hoa Kỳ, Ấn Độ và Trung Quốc) chiếm hơn 75% sản lượng bông thế giới Việc hỗ trợ của mỗi nước tuy khác nhau, nhưng mục đích là làm cho việc trồng bông có thu nhập cao hơn so với các cây trồng cạnh tranh khác (kể cả trong nước và quốc tế)

Phương thức sản xuất được nhà nước hỗ trợ sản xuất bông tạo điều kiện áp dụng tiến bộ khoa học trong nghiên cứu giống, cơ giới hóa việc trồng, chăm sóc và tưới tiêu nên sản xuất bông có năng suất cao, chất lượng sản phẩm tốt

1.2.2.2 Hiện trạng sản xuất

Vụ bông 2009-2010, tổng diện tích bông trên thế giới là 33,5 triệu ha, trong

đó các nước đang phát triển chiếm 70% diện tích và các nước phát triển chỉ chiếm

có 30% diện tích Mười nước có diện tích trồng bông lớn nhất thế giới được liệt kê

ở bảng 1.2, trong đó Ấn Độ dẫn đầu với diện tích là 8,7 triệu ha, tiếp theo là Mỹ 5,6 triệu ha, Trung Quốc 4,8 triệu ha và Pakistan 3,1 triệu ha Điều đáng chú ý là 70% diện tích bông trên thế giới được trồng ở các nước miền Nam và diện tích trồng của

ba nước châu Á là Ấn Độ, Trung Quốc, Pakistan đã chiếm khoảng 50% diện tích bông thế giới (ISAAA, 2010)

Bảng 1.1 Các nước có diện tích bông lớn nhất thế giới năm 2009-2010

STT Nước Diện tích (triệu ha)

kg bông xơ/ha (ISAAA, 2010)

Bảng 1.2 Các nước có sản lượng bông cao nhất thế giới năm 2009-2010

Mặt khác, diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới ngày càng gia tăng Nếu diện tích trồng bông trên thế giới năm 2009 là 32 triệu ha (ISAAA, 2009) thì trong đó, bông chuyển gen chiếm 28% (9 triệu ha) So với năm 2008, diện tích trồng bông chuyển gen tăng 11% (9 triệu ha trong năm 2009 so với 7,2 triệu ha trong năm 2008) Trong số các nước trồng bông chuyển gen, Ấn Độ là nước có diện tích trồng bông chuyển gen tăng nhanh nhất thế giới (tăng 400% so với năm 2008) Năm 2008, Ấn Độ chỉ có 100 ngàn ha bông chuyển gen nhưng năm 2009 diện tích bông chuyển gen tăng lên 500 ngàn ha Trung Quốc cũng là nước có sự gia tăng diện tích trồng bông chuyển gen đáng chú ý: năm 2008 có 2,8 triệu ha nhưng năm

2009 đã tăng lên 3,7 triệu ha (chiếm 60% diện tích bông) Theo dự báo của các chuyên gia, diện tích trồng bông chuyển gen trên thế giới sẽ tiếp tục gia tăng trong những năm tới và hướng chuyển gen vào cây bông sẽ tập trung vào việc tạo ra các giống bông kháng sâu bệnh là chủ yếu, nhưng bên cạnh đó chất lượng sợi bông cũng được quan tâm nhiều (ISAAA, 2010)

1.2.2 Hiện trạng ngành sản xuất bông ở Việt NamViệt Nam

STT Nước Sản lượng (triệu tấn) Năng suất xơ (kg/ha)

Ngành trồng bông và kéo sợi tại Việt NamViệt Nam đã có lịch sử lâu đời nhưng nó chỉ trở thành ngành trọng điểm trong khoảng 2 thập kỷ gần đây khi đất nước tiến vào công cuộc Công nghiệp hóa, hiện đại hóa Chỉ trong 10 năm từ 2000 đến 2010, Dệt May Việt NamViệt Nam đã vươn trở thành ngành đạt kim ngạch xuất khẩu lớn nhất cả nước với doanh thu 11,5 tỷ đô la Mỹ, trong đó trồng bông và kéo sợi là hai khâu đoạn đầu của chuỗi dệt may Cũng trong 10 năm đó, ngành kéo sợi

đã tăng trưởng trên 300% từ 1,2 triệu cọc sợi với tổng sản lượng 120.000 tấn lên 3,75 triệu cọc đạt 420.000 tấn Trong khi đó, ngành trồng bông lại diễn ra theo chiều hướng ngược lại Năm 2000, sản lượng bông cả nước đạt 18.000 tấn thì đến năm 2010 chỉ còn 13,000 tấn – tức còn khoảng 70% sản lượng năm 2000 Nếu như năm 2000 bông trong nước đáp ứng khoảng 20% nhu cầu kéo sợi thì đến năm 2010,

tỷ lệ này chỉ còn 1,3% - đây là một dấu hiệu rất đáng lo ngại đặc biệt giá bông thế giới tăng cao một cách bất thường (tăng 2,2 lần) chỉ trong vòng hai năm 2009, 2010,

đe dọa tới sự tăng trưởng ổn định của ngành sợi Việt NamViệt Nam nói riêng và toàn ngành dệt may nói chung

1.2.2.1 Hình thức tổ chức, chế độ sản xuất bông tại Việt NamViệt Nam

Trước năm 1995, sản xuất bông trong nước tập trung ở các nông trường quốc doanh Lúc bấy giờ sản xuất bông chưa hội đủ các yếu tố để đảm bảo cho sự thành công như kỹ thuật, hệ thống quản lý, đội ngũ công nhân… nên sản xuất bông chưa hiệu quả Vì vậy, chủ trương của nhà nước là giao các nông trường về cho địa phương quản lý và từ năm 1996 đến nay sản xuất bông chuyển sang hình thức trồng trong nông dân Hình thức này có hiệu quả và phù hợp với điều kiện ở Việt NamViệt Nam Nhưng mặt trái của hình thức này là nguyên liệu không ổn định do phụ thuộc vào giá cả thị trường và nông dân tự do lựa chọn, quyết định trồng cây nào có lợi trên đất của mình

Quy mô sản xuất bông ở Việt NamViệt Nam còn phân tán, nhỏ lẻ trong hộ nông dân, rất ít nhóm kinh tế, mức độ cơ giới hóa còn rất thấp và đặc biệt là chưa có vùng tập trung lớn nên rất khó áp dụng các tiến bộ kỹ thuật đồng bộ để nâng cao

năng suất và chất lượng bông hạt Số hộ sản xuất bông tự cấp tự túc chiếm hơn 80% Dân tộc thiểu số chiếm 15-20% tổng số hộ sản xuất bông.

1.2.2.2 Diện tích, năng suất, sản lượng bông trong nước

- Về diện tích: Nhờ có các tiến bộ kỹ thuật và đổi mới về phương thức quản

lý sản xuất nên sản xuất bông tăng mạnh, cao nhất là niên vụ 2002/2003 đạt 34.100 ha; vụ 2003/2004 diện tích bắt đầu giảm sút; vụ 2006/2007 diện tích giảm còn 20.900 ha, bằng khoảng 60% vụ 2002/2003 và vụ 2009/2010 chỉ còn 9.600 ha Nguyên nhân chính khiến diện tích bông vải giảm mạnh là do năng suất quá thấp (trung bình chỉ chừng 12 tạ/ha) và giá thu mua không cao (9.000 đồng/kg), khiến nông dân không “mặn mà” với cây bông vải bằng một số loại cây công nghiệp ngắn ngày khác

- Sản lượng bông phụ thuộc khá nhiều về diện tích trồng bông, trong 10 năm qua, sản lượng bông trong nước cũng có xu hướng giảm dần Đỉnh điểm ở niên vụ 2002/2003, diện tích gieo trồng đạt 34,1 nghìn ha thì sản lượng bông cũng đạt cao nhất tới 40,0 nghìn tấn Vụ 2006/2007 giảm xuống còn 28,6 nghìn tấn và đến năm 2008/2009, sản lượng rớt xuống thấp nhất, chỉ còn 8,0 nghìn tấn tương ứng với diện tích trồng bông bị thu hẹp nhất là 5,8 nghìn ha

- Về năng suất: Năng suất bông vải qua các năm 2000-2010 nhìn chung có xu hướng tăng, nhưng thực chất là tăng rất chậm, không đáng kể so với sự phát triển của cầu thị trường ngành dệt may Suốt trong 10 năm, chỉ dao động từ 10-14,6 tạ/ha, trung bình tăng khoảng 0,46 tạ/ha/1 năm Với sản lượng thấp và năng suất tăng chậm như vậy, thì bông vải trong nước chỉ đáp ứng được khoảng 2% nhu cầu bông xơ cho ngành sợi Như vậy, ngành sợi của Việt NamViệt Nam xem như mất trắng nguồn cung nguyên liệu từ trong nước và phải nhập khẩu gần 100% bông xơ

từ nước ngoài

Bảng 1.3 Tình hình sản suất bông vải tại Việt NamViệt Nam năm 2000-2010

Năm Diện tích gieo trồng

(nghìn ha)

Sản lượng (nghìn tấn)

Năng suất (tạ/ha)

(Theo Tổng cục thống kê Việt NamViệt Nam , năm 2011)

1.2.2.3 Tác động của sâu bệnh đối với năng suất và chất lượng của cây bông vải.

Ở Việt NamViệt Nam, do đặc thù khí hậu là nhiệt đới ẩm nên cây bông bị rất nhiều loại côn trùng, sâu bệnh khác nhau gây hại, làm ảnh hưởng đến năng suất cũng như chất lượng bông sợi trong nước Những loài gây hại thường thấy xuất hiện trên cây bông là sâu (sâu xanh, sâu đo, sâu hồng, sâu loang), rầy xanh (Amrasca devastans), bọ trĩ (Thrips tabaci) và rệp bông (Aphis gossypii)

Trong các loài gây hại, rệp là loài có sức tàn phá mạnh nhất cho cây bông Rệp có đặc tính đẻ con, cả rệp non và trưởng thành đều chích hút dịch cây làm cho

lá co rút lại, cây sinh trưởng kém Trong quá trình gây hại rệp thải ra chất mật dính tạo điều kiện cho nấm đen phát triển đồng thời truyền virus gây bệnh xanh lùn cho cây bông – một loại bệnh khá phổ biến và gây hại quan trọng cho cây bông ở Việt NamViệt Nam hiện nay

Từ những năm 1984-1985, bệnh xanh lùn được phát hiện lần đầu tiên tại Nha

Hố (Ninh Thuận), nhưng chưa gây hại đáng kể, sau đó, tác hại của bệnh tăng dần Dịch bệnh đầu tiên xảy ra tại Ninh Thuận năm 1991, tại Nha Hố trên 80 ha trồng bông bị bệnh với tỷ lệ 50-100%, gây thiệt hại trên 50% sản lượng bông Năm 1993, dịch bệnh xảy ra tại huyện Tuy Phong (Bình Thuận), 450 ha trồng bông bị bệnh với

tỷ lệ 90-100%, nhiều nơi không thu hoạch được, thiệt hại ước tính trên 80% sản

lượng bông, gây ảnh hưởng đến thu nhập của nhiều nông dân trồng bông Trước năm 2000, bệnh thường xuyên xuất hiện và gây hại nặng cho các vùng trồng bông như Ninh Thuận, Bình Thuận và Bình Phước Từ năm 2000 đến nay, bệnh đã xuất hiện cả ở Đắc Lắc và Gia Lai Năm 2001 bệnh đã gây thiệt hại lớn và làm mất hoàn toàn 14 ha bông ở huyện Đắc Mil (Đắc Lắc), năm 2002 ở huyện Chư Sê (Gia Lai) với 20 ha không cho thu hoạch… Bệnh là một trong những trở ngại chính trong việc

“tăng tốc” mở rộng diện tích và nâng cao năng suất bông của ngành bông Việt NamViệt Nam

Ở Việt NamViệt Nam, nghiên cứu bệnh xanh lùn được bắt đầu từ năm 1985 tại Viện Nghiên cứu bông và Cây có sợi (nay là Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố) Kết quả cho thấy triệu chứng bệnh xanh lùn bông ở Việt NamViệt Nam giống như bệnh xanh lá và cuốn lá ở Châu Phi, Nam Mỹ và Thái Lan Con đường lan truyền của bệnh trong tự nhiên cũng nhờ côn trùng môi giới là rệp bông (Aphis gossypii) mà việc phòng trừ, tiêu diệt chúng là không thể thực hiện được (Nguyễn Thị Thanh Bình, 1999)

Hiện nay, việc sử dụng giống kháng là sự lựa chọn tối ưu nhất trong công tác quản lý bệnh cũng như giải quyết các vấn đề liên quan đến môi trường do sử dụng thuốc trừ sâu và nguồn gen kháng bền vững nhất vẫn là nguồn gen được chọn lọc tự nhiên từ các giống kháng

Tại Việt NamViệt Nam, công tác chọn tạo giống bông năng suất cao, chất lượng xơ tốt, chống chịu với sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh đã đạt được nhiều kết quả khả quan Nhiều giống bông do Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố chọn tạo đã được công nhận là giống quốc gia và đưa vào phổ biến trong sản xuất, gồm có các giống bông lai: L18, VN20, VN35, VN15, VN01-2, VN01-4, GL03 và các giống bông luồi: TH1, TH2, M45610, TM1, MCU9, LRA5166, D162, C118

1.3 MỘT SỐ CHỈ THỊ ADN TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN

1.3.1 Sự đa dạng ADN

Sinh vật trên hành tinh của chúng ta rất phong phú và đa dạng, chính vì sự đa dạng đó mà từ xa xưa để phân biệt giữa chúng với nhau, con người đã xếp sinh vật vào các bậc phân loại khác nhau.

Một hệ thống phân loại sinh vật truyền thống được dùng phổ biến đó là thang phân loại 6 bậc gồm: ngành, lớp, bộ, họ, chi, loài Thang phân loại này được xây dựng dựa trên các tiêu chuẩn hình thái (chỉ thị hình thái), vì vậy nó vẫn chưa mô tả được hết sự phong phú của thế giới sinh vật nên người ta lại phải sử dụng đến các tiêu chuẩn bổ sung để phân loại sinh vật chi tiết hơn nữa như dưới chi, dưới loài…

Vì hệ thống phân loại nói trên dựa vào kết quả quan sát các đặc điểm hình thái, chính vì vậy mà đã gặp rất nhiều khó khăn khi tiến hành phân loại sâu hơn, chi tiết hơn như các nghiên cứu đa dạng dưới loài, nhất là đối với giới thực vật và vi sinh vật, trong khi đó sự phân loại dưới loài lại đóng vai trò rất quan trọng Để khắc phục hạn chế này người ta phải sử dụng chỉ thị “phi hình thái” ở dạng phân tử mà một trong số đó là chỉ thị ADN Khi nói đến đa dạng ADN, nghĩa là sự khác nhau ở mức

độ phân tử ADN giữa các cá thể trong cùng một loài sống ở một vùng địa lý nhất định Nghiên cứu đa dạng ADN thực chất cũng là phân loại nhưng ở mức độ ADN

để xác định sự khác biệt hay giống nhau giữa hai cá thể trong cùng loài; chẳng hạn như sự giống, khác nhau giữa các giống bông vải trong một loài phụ mà không thể phân biệt được qua chỉ thị hình thái

1.3.2 Chỉ thị ADN.

Chỉ thị ADN (DNA marker) bao gồm các chỉ thị RFLP, PCR…, các chỉ thị này được dùng để phát hiện, phân tích và tổng hợp ra những đoạn ADN mới Chỉ thị RFLP gồm các mẫu dò (probe) là những đoạn ADN (hoặc ARN) được sử dụng

để lai với ADN của hệ gen cần phân tích Chỉ thị PCR được phân chia thành các chỉ thị khác nhau như: AFLP, RAPD, SSR, RGA, STS, CAPS… Mỗi chỉ thị PCR nói trên có một loại mồi (primer) đặc trưng, là những đoạn ADN sợi đơn có kích thước phổ biến khoảng từ 10 đến 30 nucleotide được sử dụng làm đoạn khởi đầu trong

phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để tổng hợp nhân tạo ra những đoạn ADN mới

(Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2004)

1.3.2.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Đầu những năm 80 của thế kỷ 20, kỹ thuật RFLP ra đời và được biết đến là loại chỉ thị mới – chỉ thị ADN thế hệ đầu tiên, với những ưu điểm vượt trội so với những chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh đang được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền lúc đó (Botstein, 1980) RFLP là một kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic Bản chất của kỹ thuật này là dựa trên sự phân cắt ADN bằng enzym giới hạn và sự lai (liên kết) giữa các bazơ bổ sung trên hai sợi đơn axit nucleic (sợi ADN hoặc mARN) Khi xử lý ADN bằng enzym giới hạn sẽ thu được những mảnh ADN nhỏ hơn có kích thước khác nhau, những mảnh này sau đó được điện di và cho lai với mẫu dò, nếu chúng bổ sung với mẫu dò thì sẽ cho phản ứng lai Kết quả của phản ứng lai là chúng ta có thể xác định được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau

RFLP là chỉ thị đồng trội do có thể phát hiện được các alen khác nhau của một locus trong hệ gen nhân, hệ gen ti thể hay hệ gen lục lạp bằng một mẫu dò đặc hiệu, chính vì thế, kỹ thuật lai axit nucleic này còn có ý nghĩa rất quan trọng trong lập bản đồ gen, phân lập gen, xác định số bản sao của một gen, phân tích cấu trúc và chức năng gen…

1.3.2.2 Chỉ thị PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR có nghĩa là phản ứng trùng phân hay phản ứng chuỗi polymerase Bản chất của PCR đó là sự tổng hợp nhân tạo tạo ra các đoạn ADN mới, với sự tham gia của các thành phần chính gồm: ADN khuôn, dNTP, mồi (primer), enzym polymerase (Taq), MgCl2 và đệm PCR; phản ứng được thực hiện trong máy chu kỳ nhiệt, hay còn gọi là máy PCR

Hiện nay, một số kỹ thuật như: RAPD, AFLP, Microsatelite đang được ứng dụng khá phổ biến để phân tích genome thực vật, những kỹ thuật này có điểm giống nhau chính là đều dựa vào nguyên lý PCR, sự khác nhau cơ bản giữa chúng đó là mỗi kỹ thuật có một loại mồi đặc trưng

a) Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphism DNA)

RAPD có nghĩa là đa hình ADN được nhân bản ngẫu nhiên RAPD là một kỹ thuật xây dựng dựa trên nguyên lý PCR, với những mồi được thiết kế ngẫu nhiên dài khoảng 10 nucleotide Trong phản ứng, các mồi RAPD gắn ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó Phản ứng sau đó xảy

ra với sự tham gia của enzym Taq, dNTP và các thành phần khác Về cơ bản, chỉ thị RAPD là một chỉ thị trội, nghĩa là chỉ thị này không phân biệt được giữa những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thể F2

RAPD là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian, ít tốn kém Kỹ thuật này rất phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản đồ gen sử dụng quần thể RIL (Recombinant Inbred Line) Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật RAPD đó là nó rất nhạy cảm với nhiều yếu tố như: các thành phần tham gia phản ứng và đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi, vì yếu tố gắn mồi mà có thể có hai kết quả khác nhau với cùng một thí nghiệm sử dụng hai máy PCR khác nhau

b) Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Kỹ thuật AFLP được phát triển cũng dựa trên nguyên lý PCR để nhân bản những đoạn ADN đã được phân cắt bởi enzym giới hạn (restriction enzyme) Điểm

cơ bản nhất của kỹ thuật này đó là sự thiết kế mồi PCR đặc trưng Các bước chính của kỹ thuật AFLP bao gồm: (i) phân cắt DNA đồng thời bằng hai enzyme giới hạn tạo đầu cắt so le, sau đó gắn với các adapter oligonucleotide có trình tự được thiết

kế dựa trên trình tự nhận biết của enzyme giới hạn; (ii) cặp mồi được thiết kế bổ sung với trình tự adapter gắn vào sẽ được sử dụng để nhân đoạn DNA giữa hai vị trí nhận biết giới hạn; (iii) điện di phân tách sản phẩm PCR

Do kết hợp được những đặc điểm của RFLP và RAPD nên kỹ thuật AFLP có nhiều ưu điểm như: đơn giản, ổn định, khả năng ứng dụng rộng Về cơ bản, AFLP

là chỉ thị trội và vị trí nhiễm sắc thể của chúng chưa xác định, do vậy nếu dùng chỉ thị này để lập bản đồ gen ở quần thể F2 thì cần phải sử dụng kết hợp với các chỉ thị khác đã biết trước vị trí nhiễm sắc thể như: RFLP hoặc Microsatelite

c) Chỉ thị Microsatelite

Khi nghiên cứu genom của một số sinh vật người ta đã phát hiện ra những đoạn ADN có chiều dài khác nhau phân bố một cách ngẫu nhiên mà trình tự của nó bao gồm các nhóm nucleotide giống nhau nhắc lại nhiều lần; các nhóm này thường

có số lượng không vượt quá 5 nucleotide ví dụ như (TG)n hoặc (AAT)n Và ở cây bông vải, các nhóm nucleotide đã phát hiện được gồm GA, GT, CAT, CTT Những đoạn ADN lặp lại như vậy được gọi là Microsatelite hay còn có các tên khác như: SSLPs (single sequence length polymorphism), SSRs (simple sequence repeats), STRs (short tADNom repeats) Các đoạn ADN nhắc lại này có trình tự hai đầu rất đặc trưng cho mỗi đoạn; bởi vậy mà trình tự đặc trưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại này đã được sử dụng để thiết kế mồi cho PCR

Chỉ thị SSR có hai ưu điểm lớn so với các chỉ thị ADN khác là:

- Tính đặc hiệu cao: các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp SSR, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị DNA ngẫu nhiên (RAPD) Bên cạnh đó, nhờ tính chất bảo thủ của vùng trình tự sườn mà các mồi SSR có thể được

sử dụng chéo giữa các loài có quan hệ di truyền gần gũi (Roder và cs, 1995; Lã Tuấn Nghĩa, 2004)

- Di truyền đồng trội và mức độ đa hình cao: Trải qua tiến hóa và các biến đổi di truyền, số lần lặp lại các motif SSR thay đổi rất nhiều và làm cho các đoạn SSR có chiều dài khác nhau Bởi vậy, phản ứng SSR-PCR có thể phát hiện các alen khác nhau trong một locus SSR, qua đó phát hiện được các cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử ở locus đó (chỉ thị đồng trội)

Hình 1.4 Đa hình ADN SSR giữa hai cá thể có motif (AT) n

Ngày nay, cùng với sự ra đời và phát triển nhanh chóng của các cơ sở dữ liệu

di truyền (NCBI, EMB…) đặc biệt là ngân hàng EST thì việc phân lập và phát triển chỉ thị SSR dựa trên cơ sở trình tự sẵn có đã trở thành hướng đi nhanh chóng, đơn giản, ít tốn kém và ngày càng phổ biến hơn trong nghiên cứu đa dạng di truyền, lập bản đồ phân tử, phân lập gen và chọn tạo giống cây trồng nông nghiệp (lúa, ngô, đậu tương…)

1.4 THÀNH TỰU TRONG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY BÔNG VẢI BẰNG CHỈ THỊ ADN

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trong những năm gần đây, sự phát triển của sinh học phân tử đã đạt được nhiều thành tựu mà sự phong phú của các chỉ thị phân tử chỉ là một trong số đó Chỉ thị phân tử đã được ứng dụng rất hiệu quả trong nghiên cứu di truyền thực vật mà phân tích đa dạng di truyền và chọn giống phân tử (MAS-Marker Assisted Selection) là hai lĩnh vực thành công nhất

M J Iqbal và cs (1996) đã sử dụng chỉ thị RAPD để đánh giá đa dạng di

truyền 23 giống bông thương mại, gồm: 22 giống bông luồi (G hirsutum L.) và 1 giống bông cỏ (G arboreum L.) Trong nghiên cứu này, tác giả đã sử dụng 50 mồi

RAPD, kết quả thu được 49 mồi cho đa hình trên tổng số 23 giống và 349 băng ADN đã được phát hiện, chiếm 89,1% Ở hệ số tương đồng di truyền 0,82, 22 giống bông nghiên cứu chia thành 7 nhóm chính Nhóm 1 gồm 5 giống bông luồi, dao động tương đồng từ 0,82-0,90 Nhóm 2 gồm 12 giống bông luồi, dao động tương

đồng từ 0,84-0,94 Cả 2 nhóm này có mối quan hệ di truyền khá gần so với các nhóm còn lại, các nhóm còn lại đều gồm 1 giống, có mức độ tương đồng lần lượt là

0,78; 0,74; 0,69; 0,57; 0,55 Trong đó giống bông cỏ (G arboreum L.) có hệ số

tương đồng di truyền xa nhất so với các nhóm thuộc giống bông luồi, 0,55

Tại Trung Quốc, bông cỏ (Gossypium arboreum L.) được trồng khá rộng rãi

và phổ biến, trong đó có nhiều dòng/giống mang đặc tính nông sinh học tốt cũng như có giá trị về kinh tế cao Diqiu Liu và cs (2005) đã sử dụng 358 chỉ thị SSR để đánh giá và so sánh mức độ đa dạng di truyền của 39 giống bông cỏ được thu thập

từ nhiều vùng khác nhau ở Trung Quốc với 1 giống bông thuộc loài G herbaceum

(có nguồn gốc ở miền nam châu Phi) Kết quả thu được 74 cặp mồi cho đa hình với tổng số 165 băng ADN xuất hiện Hệ số tương đồng di truyền giữa 40 giống bông dao động từ 0,58 đến 0,99, điều này chỉ ra rằng mức độ đa dạng di truyền các giống bông nghiên cứu khá cao Trong phân tích sự tương quan di truyền qua sơ đồ hình cây, các giống bông được chia thành 7 nhóm (A-G) Nhóm A gồm 4 giống bông cỏ

(G arboreum) và 1 giống bông thuộc loài G herbaceum với mức độ tương đồng di

truyền dao động từ 0.75-0,82 Nhóm B gồm 9 giống bông cỏ, dao động từ 0,99, cả 2 nhóm A và B chủ yếu tập trung ở vùng phía nam và đông nam Trung Quốc Nhóm C gồm 18 giống bông cỏ, dao động từ 0,76-0,85, nhóm này tập trung ở hầu hết các tỉnh thuộc miền trung và thung lũng Yangtze Nhóm D có 5 giống bông, dao động từ 0,74-0,80 và các nhóm E, F, G, mỗi nhóm gồm 1 giống bông đại diện cho các vùng khác nhau của Trung Quốc, có hệ số tương đồng di truyền so với các nhóm khác lần lượt là 0,73; 0,70 và 0,66

0,77-Trong một nghiên cứu khác về chỉ thị SSR, Candida H.C de Magalhaes Bertini và cs (2006), đã tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền của 53 giống bông

luồi (G hirsutum L.) thu thập từ Brazil bằng 31 cặp mồi SSR Kết quả thu được 66

alen, trung bình 2,13 alen/locus và chỉ số PIC (polymorphism information content) thay đổi từ 0,18-0,62, với giá trị trung bình 0,40 Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,00 đến 0,71 Khi biểu diễn sơ đồ hình cây về mối tương quan di truyền giữa các giống, tác giả đã dựa theo vùng địa lý khí hậu khác nhau ở Brazil để chia

các giống bông nghiên cứu thành 2 nhóm lớn chính A và B Nhóm A gồm có 21 giống bông được thu thập từ vùng bán khô hạn ở Brazil, có chu kỳ sinh trưởng 140-

180 ngày với tỷ lệ xơ khoảng 40%, hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,0-0,4 Nhóm B gồm có 32 giống, là các giống lai tạp được trồng ở vùng phía tây và đông nam Brazil, những giống này có chu kỳ sinh trưởng từ 110-140 ngày với tỷ lệ xơ khoảng 38% và hệ số tương đồng di truyền của nhóm B này dao động từ 0,00-0,45 Nghiên cứu của tác giả đã cho thấy sự khác nhau khá lớn về mức độ tương đồng di truyền giữa các giống bông luồi Brazil

Một nghiên cứu khác của tác giả người Pakistan, Naveed Murtaza (2006), đã

sử dụng chỉ thị AFLP (Amplified fragment length polymorphism) để đánh giá đa

dạng di truyền giữa một số giống bông luồi (G hirsutum L.) mang kiểu gen hiện đại với một giống bông cỏ (G arboreum L.) thuộc loài bông thời cổ trên thế giới Để tiến hành nghiên cứu, tác giả đã thu thập được 20 giống bông luồi (G.hirsutum L.)

từ Pakistan và 1 giống bông cỏ (G arboreum L.) từ Mỹ Sự kết hợp của 4 cặp mồi (EcoRI-MseI) đã được sử dụng để phân tích AFLP Kết quả số băng thu được trung

bình từ 40 đến 80 băng sau khi chạy PCR với mỗi tổ hợp mồi và các băng có kích thước từ 50 – 500 bp Kết quả phân tích trên sơ đồ hình cây về hệ số tương đồng di truyền đã chỉ ra 21 giống bông nghiên cứu chia thành 5 nhóm chính, trong đó bông

cỏ được tạo thành một nhóm riêng biệt, do khác nhau về mặt di truyền với 4 nhóm thuộc giống bông luồi khá lớn, hệ số tương đồng của giống bông cỏ là 0,20

1.4.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt NamViệt Nam

Kết quả nghiên cứu của Thái Thị Lệ Hằng (2008) khi đánh giá đa dạng di truyền 20 giống bông luồi có nguồn gốc khác nhau sử dụng 15 cặp mồi SSR đã thu được 29 allen, với giá trị trung bình 2,0 allen/locus, độ tương đồng di truyền 71% các giống bông chia làm 2 nhóm chính: nhóm 1 chỉ gồm 1 giống bông L.36 và nhóm 2 gồm 19 giống bông còn lại

Nguyễn thị Minh Nguyệt và cs (2009) đã nghiên cứu đa dạng di truyền của

49 giống bông địa phương và nhập nội, đại diện cho 3 nhóm bông luồi (G.hirsutum L.), bông hải đảo (G.babardense L.) và bông cỏ (G.arboreum L.) Tác giả đã sử

dụng 50 cặp mồi SSR để đánh giá đa dạng di truyền Kết quả tổng số allen thu được

là 128, hệ số tương đồng di truyền giữa các giống bông nằm trong khoảng 0,48-0,97 trung bình là 0,8, các cặp giống xa nhau nhất về di truyền (có hệ số tương đồng 0,48) chủ yếu là những cặp bông luồi-bông hải đảo Đa dạng di truyền quan sát được trong nhóm các giống bông luồi cao hơn so với hai nhóm bông hải đảo và bông cỏ Cũng trong nghiên cứu này, 49 giống bông nghiên cứu đã chia làm 3 nhóm: nhóm 1 gồm 16 giống bông hải đảo, nhóm 2 gồm 21 giống bông luồi, nhóm

3 gồm 12 giống bông cỏ Hệ số tương đồng di truyền của nhóm 1 với 2 nhóm bông còn lại thấp, chỉ khoảng 0,59 Nhóm bông luồi và bông cỏ gần nhau về mặt di truyền hơn, với độ tương đồng di truyền khoảng 0,67 Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống bông trong cùng nhóm phân loại khá cao, trên 0,84

1.5 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN TÍNH KHÁNG BỆNH XANH LÙN

Hiện nay, cơ chế kháng bệnh xanh lùn ở bông vẫn chưa được làm sáng tỏ Có nhiều giống tỏ ra kháng bệnh được cho là do có nhiều đặc điểm không được rệp ưa thích (Stephen J Allen, 2006) Đó là các đặc điểm hình thái liên quan đến màu sắc cây, có lông tơ, có thân cứng hoặc các đặc điểm hóa sinh như có thành phần gossypol, có lớp hóa chất bao phủ (Krisnamoorthy, 2005) Cây có màu đỏ được nhận thấy có liên quan đến tính kháng rệp (El zik & Thaxton, 1989) Những kiểu gen có biểu hiện tính kháng rệp thường có hàm lượng protein, phenol và axit nucleic cao, lượng dầu và lưu huỳnh thấp (Alimukhamedov, Shvetsova, 1988)

Những hiểu biết về kiểu di truyền tính kháng bệnh xanh lùn đóng vai trò quan trọng trong công tác lập bản đồ di truyền và sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống kháng bệnh xanh lùn ở cây bông vải

Nghiên cứu đầu tiên về di truyền tính kháng bệnh xanh lùn được tiến hành

trên giống bông G155-7 có nguồn gốc lai 3 dòng (HAR) (Gossypium hirsutum/ G arboreum/ G raimondii) và đã xác định được một gen trội kiểm soát tính kháng ở

giống này Nghiên cứu không xác định được nguồn gen kháng có từ bông cỏ châu

Á G arboreum hay từ bông dại D raimondii.

Cho đến gần đây, công trình của các tác giả Brazil (Junior & cs., 2008) đã xác định được tính kháng bệnh xanh lùn ở hai giống bông luồi tứ bội G hirsutum L

CD401 và Delta Opal là tính trạng đơn gen di truyền trội khi phân tích sự phân ly di truyền các cá thể của quần thể F2, BC1F1, BC1F1, F2:3 với phương pháp đánh giá bệnh nhờ lây nhiễm bằng truyền bệnh qua rệp mang mầm bệnh xanh lùn Theo như công bố, đây là công trình đầu tiên báo cáo về di truyền tính kháng bệnh xanh lùn ở

cây bông vải Nhóm tác giả đặt tên cho gen kháng bệnh xanh lùn này là Rghv1 Tuy

nhiên, nghiên cứu chưa xác định được di truyền tính kháng bệnh xanh lùn ở hai giống bông này là do cùng một gen trội quy định hay là hai gen khác biệt Những nghiên cứu tiếp theo để xác định các gen kháng này đang được tiến hành

Gần đây nhất, báo cáo đầu tiên về lập bản đồ gen kháng bệnh xanh lùn ở giống bông luồi tứ bội Delta Opal của Fang và cộng sự (2009) đã được tiến hành dựa trên 364 cá thể thuộc họ F2.3 của ba quần thể được phát triển từ giống Delta Opal mà mang gen kháng trước đó, sử dụng phương pháp phân ly nhóm Locus đơn gen kháng trội được định vị tại vùng telomere trên nhiễm sắc thể số 10, với 3 chỉ thị SNP được thiết kế liên kết với gen kháng ở khoảng cách từ 0.05 đến 5.4 cM Nhóm

nghiên cứu đã đặt lại tên cho locus gen kháng trội này là Cbd.

Nhóm tác giả đã sử dụng các chỉ thị liên kết với gen kháng này để khảo sát nguồn gen bông từ 25 nước khác nhau Kết quả khảo sát alen tại locus này cho thấy phần lớn các nguồn gen có nguồn gốc từ các nước châu Phi, Nam Mỹ và Nam Á

đều có alen kháng tại locus Cbd Đa phần các nguồn gen bông có nguồn gốc từ Nam Mỹ, châu Âu, Úc và Trung Quốc đều mang alen nhiễm tại locus Cbd này.

Ở nước ta, những nghiên cứu đánh giá của Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố cho thấy, hiện nay các giống bông luồi đang trồng phổ biến ở Việt NamViệt Nam đều nhiễm bệnh xanh lùn, các giống kháng của Châu Phi, Nam Mỹ

và Thái Lan khi được khảo sát ở Nha Hố cũng đều nhiễm bệnh

Năm 2000, lần đầu tiên, trong quỹ gen cây bông hiện có của loài bông cỏ

Châu Á (Gossypium arboreum L.), Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố đã xác

định được một số đầu dòng bông cỏ Nghệ An có khả năng kháng hoàn toàn đối với bệnh xanh lùn Nghiên cứu đặc điểm di truyền tính kháng bệnh xanh lùn của các dòng bông cỏ Nghệ An bước đầu cho thấy tính kháng bệnh xanh lùn được quy định

bởi đơn gen trội (Đặng Minh Tâm, 2006) Đây là nguồn gen kháng bệnh quý cần được đánh giá để khai thác sử dụng

Di truyền đơn gen trội cũng đã được xác định là kiểu di truyền đối với nhiều

tính trạng khác ở cây bông vải: tính kháng bệnh nấm Colletotrichum gossypii var cephalosporioides (Zandona & cs., 2006); tính kháng bệnh đốm góc lá do Xanthomonas axonopodis pv malvacearum (Zandona & cs., 2005), Metha & Arias (2001) (Zandona & cs., 2005); tính kháng bệnh Stemphylium solani.

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

2.1.1 Vật liệu thực vật

30giống bông cỏ nhập nội và địa phương được chọn lọc từ nguồn gen có sẵn của Viện nghiên cứu Bông và PTNN Nha Hố và những giống này được thu thập từ các nước Việt NamViệt Nam, Ấn Độ, Liên xô cũ (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Tên và nguồn gốc của 30 giống bông cỏ thu thập được

* Chú thích: MSTĐ – Mã số tập đoàn

TĐ

Tên giống

Nguồn

MS TĐ

Tên Giống

Nguồn gốc

1 2 Cỏ Thanh Hóa

Việt NamViệt Nam

2 3 Hà Sơn Bình

Việt NamViệt Nam

3 5 Cỏ Phú Khánh

Việt NamViệt Nam

18 79 BAA (bar x arb) Ấn độ

4 6 Cỏ Nghệ An

Việt NamViệt Nam

19 80 BAA (bar x arb) Ấn độ

5 7 Cỏ Bắc Ái

Việt NamViệt Nam

20 81 BAA (bar x arb) Ấn độ

6 15 AK-235 Ấn Độ 21 82 BAA (bar x arb) Ấn độ

7 18 Lục Ngạn

Việt NamViệt Nam

22 83 BAA (bar x arb) Ấn độ

8 34 B2III4 Ấn Độ 23 85 BAA (bar x arb) Ấn độ

9 35 B2IV10 Ấn Độ 24 86 BAA (bar x arb) Ấn độ

10 42 Akola Ấn Độ 25 87 BAA (bar x arb) Ấn độ

11 43 Tka 283 Ấn Độ 26 92 BAA (bar x arb) Ấn độ

12 44 Tka 188 Ấn Độ 27 93 BAA (bar x arb) Ấn độ

13 46 Ava Liên Xô 28 94 BAA (bar x arb) Ấn độ

2.1.2 Các cặp mồi SSR

50 cặp mồi SSR cho cây bông, bao gồm 6 nhóm mồi khác nhau: BNL (Brookhaven National Laboratory, 2007), MUCS (Mauricio Ulloa, 2005), MUSS (Mauricio Ulloa, 2005), NAU (Nanjing Agricultural University, 2007), STV (Taliercio E, Scheffler J 2006), TM (John Yu, 2002) (Bảng 2.2, phụ lục 1)

Bảng 2.2 Các nhóm mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu

sử dụng

1 BNL Brookhaven National Laboratory, 2007 20

4 NAU Nanjing Agricultural University, 2007 10

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU, KỸ THUẬT SỬ DỤNG

2.2.1 Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn của các giống bông cỏ

2.2.1.1 Phương pháp chuẩn bị nguồn rệp mang bệnh

Cách 1: Rệp được thu thập ở các lá cây bị bệnh xanh lùn (có triệu chứng điển hình) sau đó được truyền trực tiếp lên cây bông thí nghiệm

Cách 2: Thu rệp trên đồng ruộng (cây bông và các cây ký chủ) rồi truyền cho cây bông D16-2 Sau đó lấy rệp từ cây bị bệnh truyền sang cây bông thí nghiệm

Quá trình chuẩn bị nguồn rệp mang bệnh được thực hiện tại Viện Nghiên cứu bông và PTNN Nha Hố

2.2.1.2 Phương pháp lây nhiễm và đánh giá tính kháng bệnh xanh lùn

Các giống bông cỏ được gieo trồng với ba lần nhắc lại và được bố trí theo phương pháp ngẫu nhiên Tính kháng/nhiễm của các giống bông được đánh giá bằng 2 phương pháp lây nhiễm nhân tạo: (1) truyền rệp ở giai đoạn cây bông được 3 – 5 ngày tuổi, truyền rệp mang nguồn bệnh xanh lùn (15 con/cây), cho chích hút trên cây bông 48h sau đó phun thuốc diệt rệp; (2) ghép cây, ở giai đoạn 25 – 30 ngày tuổi, nếu cây chưa bị bệnh thì ghép với cây bị bệnh xanh lùn theo phương pháp ghép áp

Phương pháp đánh giá bệnh được tiến hành dựa trên mức độ biểu hiện bệnh xanh lùn theo 4 cấp của Junior và cs (2008), thang điểm được ghi nhận như sau:

+ Cấp 0: Không nhiễm bệnh

+ Cấp 1: Màu lá bình thường nhưng lá bị biến dạng nhẹ

+ Cấp 2: Lá có màu đậm và bị biến dạng dễ nhận thấy

+ Cấp 3: Lá có màu xanh nhạt, bị biến dạng nhiều và gân lá vàng

- Cách tính điểm kháng/nhiễm: Cây có bệnh cấp 0: được đánh giá kháng Cây

có có bệnh 1-3 được đánh giá nhiễm

Sau khi lây bệnh nhân tạo tiến hành theo dõi các chỉ tiêu tỷ lệ bệnh và thời gian ủ bệnh Căn cứ vào kết quả này, những cây không bị bệnh tiếp tục chăm sóc và chọn lọc theo đặc điểm hình thái, chất lượng và năng suất xơ.

Hình 2.1 Các cấp bệnh xanh lùn đánh giá trong phòng thí nghiệm

2.2.2 Phương pháp đánh giá đặc tính nông sinh học, tiềm năng năng suất của các giống bông

Các giống bông được gieo trồng và theo dõi theo các chỉ tiêu, quy trình chung của ngành bông:

- Diện tích ô thí nghiệm: 6m2/1 giống

- Diện tích bảo vệ: 100m2

- Tổng diện tích thí nghiệm: 400m2

Phương pháp đánh giá đặc tính nông sinh học, các chỉ tiêu cấu thành năng suất và chất lượng xơ của các giống bông trong nghiên cứu được thực hiện theo đúng Quy phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và giá trị sử dụng của cây bông (10TCN 911: 2006)

2.2.2.1 Nhóm chỉ tiêu về sinh trưởng

a Chiều cao cây: Theo dõi 10 cây trong số 20 cây đã chọn theo nguyên tắc

cách 1 cây đo 1 cây (trừ cây dị dạng, mất đỉnh sinh trưởng và 2 cây đầu hàng), đo từ vết hai lá sò đến đỉnh sinh trưởng ngọn

Bảng 2.3 Bảng số liệu đánh giá chiều cao cây

I

II

b Số đốt trên thân chính : Được tính từ vết hai lá sò, cứ một mắt là một đốt

c Chiều dài đốt thân trung bình : Chiều cao cây chia cho số đốt trên thân

chính ở giai đoạn tương ứng

d Vị trí cành quả đầu tiên: Lá thật đầu tiên được gọi là vị trí 1, lá thật thứ 2

được gọi là vị trí 2 vị trí cành quả đầu tiên tương ứng với vị trí lá thật Cành quả đầu tiên thường đâm từ nách lá thật thứ 5, 6 trở lên

e Số cành quả: Cành quả sinh trưởng theo phương thức mầm nách, do đó cành

có dạng gãy khúc chữ chi Cành quả thường đâm thẳng từ thân chính ra thành một góc thẳng, là loại cành trực tiếp mang nụ, hoa và quả Cành quả được tính khi đã có nụ

f Số cành đực : Cành đực là mầm chính phát triển từ thân chính, là loại cành

không trực tiếp mang nụ, hoa và quả Cành đực thường phát triển ở phần gốc

g Chiều dài cành quả: Đo từ thân chính đến đỉnh sinh trưởng của cành.

h Số đốt trên cành quả: Được tính từ thân chính, cứ một lá là một đốt.

2.2.2.2 Nhóm chỉ tiêu về năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất

a Số quả/cây: Đếm số quả cây (quy định quả to bằng ngón tay cái trở lên)

vào thời kỳ 50% số cây có quả đầu tiên nở

b Khối lượng quả: Trước mỗi đợt thu hoạch thu 20-25 quả/điểm (thí nghiệm

ô lớn) hoặc 20-25 quả/ô (thí nghiệm ô nhỏ) để cân khối lượng quả sau đó tính trung bình

c Năng suất lý thuyết: Sau khi có khối lượng quả, dựa trên mật độ cây cuối

vụ để tính năng suất lý thuyết

NSLT = Số quả/cây x mật độ cây/m2 x khối lượng quả(g) x 10000m2 x 10-5 (tạ/ha)

2.2.2.3 Nhóm chỉ tiêu về hạt, tỉ lệ xơ và chất lượng xơ.

Thu toàn bộ lượng bông hạt có trên cây của mỗi điểm qua các lần thu hoạch (trừ bông múi cau), trộn đều và lấy mẫu đại diện theo cách phân tư cho đến lúc đủ lượng bông cần thiết dùng cho phân tích xơ (khoảng 100-150g)

a Khối lượng 100 hạt: Đếm 100 hạt đem cân để biết khối lượng.

b Tỷ lệ xơ

Tỷ lệ xơ (%) = Khối lượng xơ bông / Khối lượng bông hạt

c Các chỉ tiêu về chất lượng xơ: Độ bền, độ mịn, độ chín, chiều dài xơ, độ

đều xơ… được thực hiện trên máy

- Chiều dài trung bình nửa trên (Upper Half Mean length: UHML): Chiều

dài trung bình nửa trên là chiều dài trung bình của một nửa số xơ có chiều dài dài hơn nửa còn lại, được biểu thị bằng tiếp tuyến từ điểm 50% trên biểu đồ phân bố xơ của chùm xơ thử (hình 2.1b)

- Chiều dài trung bình (Mean Length, ML): Chiều dài trung bình là chiều dài

xơ trung bình của tất cả các xơ có trong mẫu bông, được biểu thị bằng tiếp tuyến từ điểm 100% trên biểu đồ phân bố xơ của chùm xơ thử (hình 2.2a)

(a) (b)

Hình 2.2 Chiều dài xơ đo bằng thiết bị HVI

(a) Chiều dài trung bình (b) Chiều dài trung bình nửa trên

- Chỉ số độ đồng đều (Uniformity Index): Chỉ số độ đồng đều là tỷ số giữa chiều

dài trung bình và chiều dài trung bình nửa trên được tính bằng đơn vị phần trăm

- Độ bền (Strength): Độ bền xơ biểu thị sức bền của một chùm xơ đối với

một lực kéo đứt được tính bằng đơn vị gam lực/tex (G/tex) Trong đó, đơn vị tex là khối lượng được tính bằng gam của 1.000 mét xơ Độ bền ở đây chính là độ bền tương đối tính trên đơn vị tex thay cho việc xác định ứng suất kéo của xơ

- Chỉ số độ chín (Maturity Index): Chỉ số độ chín là tỷ lệ giữa bề dày thành

xơ và bề ngang xơ

- Độ ẩm xơ (Moisture content): Độ ẩm xơ là tỷ số giữa khối lượng nước có

trong mẫu xơ và khối lượng khô tuyệt đối của mẫu xơ được tính bằng phần trăm

Độ ẩm thực tế là độ ẩm của mẫu xơ trong điều kiện thực tế mà mẫu xơ được lưu giữ

2.2.3 Phương pháp phân tích đa hình di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR

2.2.3.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA lá bông được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Doyle, J.J và cs (1987)

Bảng 2.6 Thành phần đệm rửa II (Wash buffer II)