AN XOA - TÓM TẮT ĐỀ TÀI HOÀN CHỈNH

Với mong muốn tìm hiểu tác dụng chữa bệnh gan của cây An xoa và góp phần làm rõ cơ sở khoa học về thành phần hóa học và hoạt tính chữa bệnh gan của cây này chúng em lựa chọn đề tài: “Ng

LÍ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Một lần, đi chợ phiên vùng cao tại xã Phương Độ, thành phố Hà Giang, em thấy nhiều người dân địa phương bán các bài thuốc nam chữa các bệnh như bệnh gút, bệnh tiểu đường, bệnh gan Em rất tò mò không biết thành phần các bài thuốc đấy là gì, tác dụng thật sự ra sao, đã được các nhà khoa học kiểm chứng chưa? Qua các bài học trên lớp cũng như qua tìm hiểu trên mạng, em biết được hiện nay có nhiều loài thảo dược được người dân sử dụng lâu đời nhưng chưa được khoa học chứng minh làm rõ khả năng chữa bện của các cây thuốc, trong đó có cây

An xoa

Cây An xoa được sử dụng trong dân gian làm thuốc chữa bệnh cảm cúm, sởi,

viêm gan, ung thư gan và được quảng cáo trên thị trường là “khắc tinh của bệnh gan” Tuy nhiên chưa có nghiên cứu đầy đủ và hệ thống về thành phần hóa học và

hoạt tính sinh học của loài cây này Với mong muốn tìm hiểu tác dụng chữa bệnh gan của cây An xoa và góp phần làm rõ cơ sở khoa học về thành phần hóa học và hoạt tính chữa bệnh gan của cây này chúng em lựa chọn đề tài:

“Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa, chống tế

bào ung thư, bảo vệ gan của các chất trong cây An xoa, (Helicteres hirsuta

L.)’’ Đây là đề tài có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao, sẽ góp phần làm sáng tỏ

cơ sở khoa học và khả năng ứng dụng của cây An xoa

Mục tiêu của đề tài là xác định được thành phần hóa học chính của cây An xoa và đánh giá được hoạt tính chữa bệnh gan

Để thực hiện được mục tiêu đó, đề tài tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:

- Thử nghiệm hoạt tính bảo vệ gan của cao tổng etanol trên chuột bị gây độc gan bằng paracetamol

- Nghiên cứu tách chiết và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ cây

An xoa

- Đánh giá hoạt tính sinh học (chống oxy hóa, nhằm đánh giá khả năng bảo

vệ gan khỏi tác nhân gây bệnh của gốc tự do Đánh giá khả năng diệt tế bào ung thư gan Hep-G2 nhằm tìm kiếm chất tiêu diệt tế bào ung thư gan) của các chất sạch phân lập được

- Đánh giá khả năng bảo vệ tế bào gan trên chuột thử nghiệm bị gây độc gan bằng paracetamol của 1 phân đoạn tách chiết từ cây An xoa để định hướng tạo chế phẩm bảo vệ gan

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Tổng quan về cây An xoa Helicteres hirsuta Loureiro (Sterculiaceae)

1.1 Đặc điểm hình thái cây An xoa

Cây An xoa (hay còn gọi là Dó lông, Tổ kén cái) có tên khoa học là

Helicteres hirsuta Loureiro thuộc Họ Trôm Sterculiaceae An xoa là cây bụi, cao

khoảng 1-3m, nhánh hình trụ, có lông Lá hình trái xoan, dài 5-17cm, rộng 2,5-7,5cm Gốc cụt hay hình tim, đầu thon thành mũi nhọn Mép có răng không đều Mặt dưới màu trắng, cả hai mặt phủ đầy lông hình sao; gân gốc 5, cuống lá dài

0,8-4cm, lá kèm hình dải, có lông, dễ rụng Cụm hoa là những bông ngắn, đơn hay xếp đôi ở nách lá Hoa màu hồng hay đỏ, cuống hoa có khớp và có lá bắc dễ rụng, đài hình ống phủ lông hình sao, màu đo đỏ, chia 5 răng Cánh hoa 5, cuống bộ nhị có vân đỏ, nhị 10, nhị lép bằng chỉ nhị, bầu có nhiều gợn, chứa 25-30 noãn trong mỗi

lá noãn Quả nang hình trụ nhọn, hạt nhiều, hình lăng trụ Ra hoa kết quả từ tháng

7 đến tháng 11

Hình 1: Cây An xoa (Helicteres hirsuta Loureiro.)

Cây An xoa phân bố ở Nam Trung Quốc và nhiều nước Nam Á như Ấn Độ, Camphuchia, Thái Lan, Việt Nam, Malaysia, Philippin Ở Việt Nam, cây mọc rất phổ biến từ Bắc tới Nam, thường gặp trên các đồi cây bụi, rừng thưa, ven rừng

1.2 Tình hình nghiên cứu cây AN xoa trên thế giới

Khi nghiên cứu loài An xoa Helicteres hirsuta có nguồn gốc từ Indonesia,

nhóm tác giả Young-Won Chin (2006) đã phân lập được 6 lignan có tên là

(±)-pinoresinol (1); (±)-medioresinol (2); (±)- syringaresinol (3);

(–)-boehmenan (4); (-)-boehmenan H (5) và (±)-trans-dihydro diconiferyl alcohol (6)

O

O H H

OH

HO

R 1

R 2

R3

R4

R1 R2 R3 R4

1 OMe H H OMe

2 OMe OMe H OMe

3 OMe OMe OMe OMe

O

OMe

R1O

R2O

OMe OH

R1 R2

4 feruloyl feruloyl

5 feruloyl H

6 H H

Hình 2: Các lignan phân lập từ cây An xoa (theo Chin, 2006)

Trong số 6 lignan tách ra từ loài này thì có 3 chất là 1, 4 và 5 là có hoạt tính ức

chế 3 dòng tế bào ung thư là: ung thư phổi (Lu1), ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP)

và ung thư vú (MCF-7), trong đó, (±)-pinoresinol (1) thể hiện khả năng gây độc tế

bào mạnh trên dòng ung thư phổi Lu1, ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP), ung thư vú MCF-7, với IC50 từ 0,5-1,7µg/ml Đây là lớp chất đã được nhiều công trình công

bố có nhiều hoạt tính sinh học thú vị như kháng viêm, chống ung thư, đặc biệt là hoạt tính chống oxy hóa, bảo vệ gan Ví dụ như: pinoresinol và syringaresinol có

hoạt tính bảo vệ gan khi thử nghiệm trên chuột Pinoresinol có tác dụng chống oxy hóa, giảm sự hình thành các chất trung gian gây viêm thông qua sự ức chế trung tâm hoạt động kB (NF-kB) Đồng thời pinoresinol liều 200mg/kg/ngày làm giảm nồng độ enzyme ALT, AST xuống rõ rệt, gần tương đương với silymarin liều 800mg/kg khi thử nghiệm trên chuột gây tổn thương gan bằng CCl4 sau 24h

1.3 Tình hình nghiên cứu cây An xoa ở Việt Nam

Cho tới nay, các nghiên cứu khoa học trong nước về cây An xoa mới có số lượng hạn chế Nhóm tác giả Hồng Ngọc (2015) đã công bố cặn chiết nước và cặn chiết methanol từ lá và thân cây An xoa thu hái ở Khánh Hòa, Việt Nam giàu

nhóm chất phenol và flavonoid có tác dụng chống oxy hóa invitro trên hệ DPPH,

ABTS, FRAP

Nhóm tác giả Hữu Duyên (2016) đã phân lập được 4 hợp chất từ cặn

petroleum ether (PE) cây An xoa thu hái ở Kiên Giang: stigmasterol (7), lupeol (8), tiliroside (9) và apigenin (10), kết quả thử nghiệm gây độc tế bào cho thấy: cao

chiết PE và cao chiết dichloromethane (DC) có hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan HepG2 với IC50 lần lượt là 28,29 và 30,30 µg/ml

Hình 3: Một số hợp chất phân lập từ cặn PE cây An xoa

Từ tổng quan tài liệu trên đây, chúng ta thấy cây An xoa hiện chưa có công trình nghiên cứu hệ thồng về thành phân hóa học và hoạt tính sinh học Vì vậy, các nghiên cứu sâu rộng hơn nữa là việc làm cần thiết để chứng minh tác dụng chữa bệnh của loài thực vật này

2 Tổng quan về tình hình các bệnh về gan

2.1 Vai trò của gan

Gan là một trong những cơ quan quan trọng nhất trong cơ thể, tham gia vào

các quá trình trao đổi chất, bài tiết và dự trữ Gan được xem là “nhà máy hóa chất” của cơ thể vì nó là nơi sản xuất mật, tái tạo năng lượng, dự trữ glycogen,

vitamin, chuyển hóa hydratcacbon, protein và lipid

Gan còn chịu trách nhiệm chính trong việc thải độc khi cơ thể tiếp xúc với các tác nhân gây độc như thuốc, virut, vi khuẩn hay rượu Do đó mà gan rất dễ bị tổn thương và thiệt hại Một trong những bệnh về gan phổ biến là viêm gan, kết quả của tình trạng lạm dụng thuốc, uống quá nhiều rượu, béo phì và lối sống không lành mạnh

2.2 Gốc tự do là nguyên nhân gây ra nhiều bệnh, trong đó có bệnh về gan

Gốc tự do là những nguyên tử, những nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp điện tử ngoài cùng của chúng có chứa điện tử không cặp đôi Chúng có thể mang điện tích dương, điện tích âm hoặc không mang điện Các điện tử không cặp đôi thường tìm kiếm các điện tử khác để trở thành cặp đôi, vì vậy phần lớn các gốc tự

do thường hoạt động và tấn công các phân tử khác Sự dư thừa gốc tự do hoặc tổn thương hệ thống chống gốc tự do là nguồn gốc của nhiều bệnh lý như ung thư, lão hoá, rối loạn chuyển hoá, tim mạch… Các gốc tự do tồn tại dưới 10-6 giây là những gốc tự do không bền và có độc tính lớn Còn những gốc tự do tồn tại trên 10-6 giây

là những gốc tự do bền và có ít độc tính hơn

Chất chống oxy hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa chất khác Sự oxy hóa là loại phản ứng hóa học trong

đó electron được chuyển sang chất oxy hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng

2.3 Các bệnh về gan

Theo ước tính của Tổ chức y tế thế giới (WHO) có khoảng 600.000 người chết mỗi năm do hậu quả của viêm gan B cấp hoặc mãn tính Ung thư gan là loại ung thư hay gặp đứng hàng thứ 8 trên thế giới Ở Việt Nam có khoảng 20.000 ca mắc viêm gan mỗi năm Các bệnh lý về gan đang ngày càng trở nên trầm trọng hơn

và có xu hướng gia tăng trong những năm gần đây vẫn đang là một trong những mối đe dọa chính đối với sức khỏe cộng đồng trên toàn thế giới

Bệnh gan là một thuật ngữ chỉ ra những thiệt hại về cấu trúc, chức năng của

tế bào, mô gan Các tổn thương này bị gây nên bởi các tác nhân sinh học (vi khuẩn, virus, ký sinh trùng ), do ảnh hưởng của thuốc (paracetamol liều cao và các thuốc chống nghiện), các chất độc hại [cacbon tetrachlorua (CCl4), thioacetamid, dimethylnitrosamine (DMN), D-galactosamine/ lipopolysaccharide (GalN/LPS)] hay ngộ độc gan do uống quá nhiều rượu

Phần lớn các chất gây độc cho gan đều làm thiệt hại tế bào gan thông qua con đường oxy hóa lipid của gan, tạo nên các sản phẩm độc hại với gan và cơ thể,

đó là các aldehyde như: malondialdehyde (MDA) và 4-hydroxynonenal (HNE) Ngoài ra, còn gây độc gan bằng cách tạo ra các gốc tự do gây tổn thương trực tiếp vào tế bào gan Các chất gây độc gan còn tác động vào ty thể làm rối loạn quá trình chết tế bào theo chương trình apoptosis làm giảm Glutathione dự trữ (một chất chống oxy hóa tự nhiên của cơ thể)

Khi tế bào gan bị tổn thương, một số enzym có nhiều trong gan sẽ được giải phóng vào máu làm hoạt độ các enzym này tăng cao Đặc trưng nhất là enzym Aspartat aminotransferase (AST): là enzym vận chuyển nhóm amin, nồng độ enzym này có nhiều nhất ở tim, gan, cơ, xương; và enzyme Alanin aminotransferase (ALT): cũng là một enzym vận chuyển nhóm amin, có chủ yếu ở gan Ngoài ra, còn có các enzyme khác như Phosphatase kiềm (AP ), Gamma glutamyl transpeptidase (GGT)…Do vậy, để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan người ta thường xác định hoạt độ của các enzym này ở trong máu

2.4 Xu hướng sử dụng dược liệu có nguồn gốc thiên nhiên chữa bệnh gan

Cho tới nay, cây dược liệu vẫn đóng một vai trò quan trọng trong chăm sóc sức khoẻ con người Theo thống kê của tổ chức y tế thế giới (WHO) hiện có khoảng 80% dân số thế giới vẫn tin dùng Y học cổ truyền, chủ yếu là từ thực vật Đối với điều trị bệnh gan, việc sử dụng các loại thảo dược làm thuốc chữa bệnh đã

có lịch sử lâu đời và hiện vẫn đang được sử dụng ở hầu khắp các nước trên thế giới Một số loại thảo dược theo y học cổ truyền điều trị bệnh gan mật như: nhân trần, astiso, nghệ, diệp hạ châu, ké sữa

GIẢ THUYẾT KHOA HỌC

Từ tổng quan tài liệu về cây An xoa và các bệnh về gan nhận thấy rằng, nước ta nhiều vị thuốc có nguồn gốc từ thảo dược có tác dụng bảo vệ gan được sử dụng nhiều nhưng chỉ theo kinh nghiệm dân gian mà chưa có nhiều nghiên cứu một cách hệ thống để chứng minh tác dụng Vì vậy, việc tìm kiếm và nghiên cứu các loại thảo dược từ thiên nhiên có tác dụng giải độc, bảo vệ gan đang là vấn đề cấp thiết có giá trị khoa học và thực tiễn Góp phần khai thác, sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên thiên nhiên Việt Nam, tạo ra các thuốc chữa bệnh hiệu quả, giá thành hạ phục vụ đại bộ phận những bệnh nhân nghèo ở Việt Nam

Sự lựa chọn cây An xoa làm đối tượng nghiên cứu của đề tài dựa vào kinh nghiệm sử dụng của nền Y học cổ truyền dân tộc cũng như các nghiên cứu của các nhà khoa học trong nước Tuy nhiên các nghiên cứu về An Xoa còn hạn chế Do

đó, vẫn chưa thể kết luận chính xác được liệu cây An xoa có phải là “khắc tinh của bệnh gan” hay không?

Để trả lời câu hỏi này, chúng em nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu thành

phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa, chống tế bào ung thư, bảo vệ gan của các chất trong cây An xoa” để làm rõ cơ sở khoa học chữa bệnh của cây này.

Nếu cây An xoa có tác dụng chữa các bệnh về gan thì trong cây An xoa có chứa các chất có hoạt tính sinh học như: bẫy gốc tự do chống oxy hóa, gây độc tế bào ung thư gan Hep G2 , bảo vệ tế bào gan Do vậy, đề tài sẽ tiến hành tách chiết ,xác định cấu trúc các chất hoá học từ cây An xoa, sau đó thử hoạt tính bẫy

gốc tự do, hoạt tính gây độc tế bào invitro và hoạt tính bảo vệ tế bào trên mô hình gan chuột bị gây độc bằng paracetamol invivo.

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Mẫu thực vật

Thu hái bộ phận trên mặt đất của cây An Xoa, phân loại riêng thân cành và lá; phơi sấy khô, xay n hỏ Dược liệu được giám định tên khoa học bằng phương pháp Hình thái so sánh dựa trên mô tả của Võ Văn Chi - Từ điển Cây thuốc Việt Nam Tên khoa học của các loài thực vật này được PGS.TS Trần Thế Bách, Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam xác định

2.1.2 Các dòng tế bào ung thư thực nghiệm

Các dòng tế bào ung thư của người được cung cấp bởi ngân hàng tế bào American Type Culture Collection (ATCC) bao gồm: ung thư biểu mô biểu bì miệng

KB (CCL -17TM), ung thư gan Hep G2 (HB - 8065TM) được chuẩn hóa và nuôi cấy thường quy tại phòng Hóa sinh ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam

2.1.3 Động vật nghiên cứu

Chuột nhắt trắng đực, chủng Swiss khỏe mạnh, cân nặng 20 - 25g do Viện vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Động vật được nuôi trong điều kiện tiêu chuẩn, đầy

đủ thức ăn và nước uống 5 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu

2.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.2.1 Hóa chất

Các loại dung môi hữu cơ: hexan, điclometan, etylaxetat, etanol, n-butanol, metanol

Chất đối chứng: quercetine, ellipticine, silymarin (Legalon 70 mg) do Madaus GmbH (Đức) sản xuất, Paracetamol 500 mg (biệt dược Efferalgan do Bristol-Myers Squibb sản xuất)

Kít định lượng: AST (aspartat aminotransferase), ALT (alanin aminotransferase) của hãng BIOSYSTEM

2.2.2 Thiết bị nghiên cứu

Các thiết bị nghiên cứu của Viện Hóa học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Gồm:

- Máy cô quay chân không Buchi

- Máy quang phổ UV-VIS

- Máy xét nghiệm sinh hóa bán tự động TC-3300 Plus (Teco diagnostics, USA)

- Máy nghiền dịch đồng thể Wisestir HS-30E

- Máy ly tâm Gilson GmClab

- Cân phân tích Shimadzu AY 220

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp xử lý và chiết mẫu thực vật

Các mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45o C, sau đó đem nghiền nhỏ Tiếp theo, mẫu được ngâm chiết

với Etanol 700, 800 và 90o bằng siêu âm ở 30-350C Quá trình chiết được lặp lại 3-4 lần Gộp các dịch chiết và cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cao chiết Etanol tổng tương ứng Tiếp đó, hòa các cao chiết tổng bằng dung dịch Etanol: H2O (1:1) và chiết lần lượt với dung môi n- hexan và diclometal thu được

các cặn chiết tương ứng Dung dịch nước còn lại được chiết tiếp bằng EtOAc Dịch chiết EtOAc được cô cất chân không ở 40oC, thu được cặn chiết EtOAc Phần nước còn lại cô cất chân không thu được cặn chiết nước

Cặn chiết EtOAc được sử dụng để tách chiết các chất sạch, sau đó tiến hành đánh giá hoạt tính sinh học chống oxy, chống tế bào ưng thư, bảo vệ gan của các chất sạch đó

2.3.2 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên

Việc phân lập, tinh chế các hợp chất từ các cặn chiết được thực hiện bằng các phương pháp kết tinh và sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát, điều chế lượng nhỏ), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck) và sephadex LH-20 Dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như

n-hexan/CH2Cl2, n-hexan/EtOAc, n-hexan/axetone, CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý như điểm nóng cháy, độ quay cực []D… với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 1 chiều và 2 chiều

2.3.3 Phương pháp gây độc tế bào MTT

* Nguyên lí:

Hoạt tính gây độc tế bào được thực hiện dựa trên phương pháp MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2 - yl )- 2, 5 - diphenyltetrazolium) được mô tả lần đầu tiên bởi tác giả Tim Mosman, 1983 Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào qua khả năng khử MTT (màu vàng) thành một phức hợp formazan (màu tím) bởi hoạt động của enzym dehydrogenase trong ty thể Sản phẩm formazan được hòa tan bằng DMSO và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 540 nm Giá trị thể hoạt tính là IC50 (nồng độ chất thử ức chế 50% sự phát triển của tế bào)

* Chuẩn bị thí nghiệm:

Các dòng tế bào có nguồn gốc từ Bảo tàng giống chuẩn Hoa kỳ (ATCC) gồm: ung thư biểu mô biểu bì miệng KB (CCL -17TM), ung thư gan Hep G2 (HB

- 8065TM)

Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng như DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) hoặc MEME (Minimum Esental Medium with Eagle salt) có bổ sung 7-10% FBS (Fetal Bovine Serum) và một số thành phần thiết yếu khác Tế bào được nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2, độ ẩm 98%, nhiệt độ 370C, vô trùng tuyệt đối) và được cấy chuyển 1-2 lần trước khi thí nghiệm Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng

để thử độc tính

Mẫu thử được hòa tan bằng dung môi DMSO với nồng độ ban đầu là 20 mg/

ml Tiến hành pha loãng 2 bước trên đĩa 96 giếng thành 5 dãy nồng độ từ cao xuống thấp lần lượt là 2564, 640, 160, 40 và 10 µg/ml Nồng độ chất thử trong đĩa thử nghiệm tương ứng là 128, 32, 8, 2 và 0.5 µg/ml Chất tham chiếu Ellipticine (Sigma) pha trong DMSO với nồng độ 2 mg/ml

* Tiến hành thí nghiệm:

- Bước 1: Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm tế bào Tiếp đó, pha tế bào bằng môi trường sạch và điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (khoảng 1-3x104 tế bào/ml tùy theo từng dòng tế bào)

- Bước 2: Lấy vào mỗi giếng 10 µl chất thử đã chuẩn bị ở trên và 190 µl dung dịch

tế bào Đối chứng dương của thí nghiệm là môi trường có chứa tế bào, đối chứng âm chỉ có môi trường nuôi cấy

- Bước3: Đĩa thí nghiệm được ủ ở điều kiện tiêu chuẩn

- Bước 4: Sau 72 giờ mỗi giếng thí nghiệm được tiếp tục ủ với 10 µl MTT (5 mg/ml) trong 4h Sau khi loại bỏ môi trường, tinh thể formaran được hòa tan bằng 100 µl DMSO 100%

- Bước 4: Kết quả thí nghiệm được xác định bằng giá trị OD đo ở bước sóng 540

nm trên máy quang phổ Genios Tecan Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

*Xử lý kết quả thực nghiệm:

Giá trị IC50 được xác định thông qua giá trị % ức chế tế bào phát triển và phần mềm máy tính Rawdata

% ức chế tế bào = (ODchứng (+) – ODmẫu thử)/( ODchứng (+)– ODchứng

(-)) x 100%

IC50 = HighConc

-(High Inh% - 50) x (High Conc - Low Conc )

High Inh% - Low Inh%

(Trong đó, HighConc/LowConc: chất thử ở nồng độ cao/chất thử thấp ở nồng độ thấp; HighInh%/LowInh%: % ức chế ở nồng độ cao/% ức chế ở nồng độ thấp)

* Đánh giá hoạt tính:

Giá trị IC50 ≤ 20 µg/ml (với dịch chiết thô) và IC50 ≤ 4 µg/ml (với chất sạch) được đánh giá là có hoạt tính gây độc tế bào

2.3.4 Phương pháp bẫy gốc tự do DPPH

* Nguyên lý:

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là chất tạo ra gốc tự do được dùng để thực hiện mang tính chất sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu Hoạt tính chống oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu của DPPH, được xác định bằng cách đo quang ở bước sóng  = 517 nm

* Cách tiến hành:

- Bước 1: Pha dung dịch DPPH có nồng độ 300 M trong Methanol Chất thử được pha trong DMSO 100% sao cho nồng độ cuối cùng đạt được một dãy các nồng độ 256; 64; 16; 4; 1 g/ml

- Bước 2: Đĩa thí nghiệm 96 giếng gồm:

Giếng phản ứng: Trộn mẫu 10 l và 190 DPPH l

Giếng chứng: 10 l DMSO 0.5 % và 190 DPPH l

Chất tham chiếu: resveratrol, quercetin

- Bước 3: Thời gian phản ứng 30 phút ở 370C, đọc mật độ hấp phụ của DPPH bằng máy quang phổ ở bước sóng 517 nm

* Xử lý số liệu:

% bẫy gốc tự do DPPH của mẫu thử được tính theo công thức sau:

SC% = (OD chứng – OD mẫu thử)/ ODchứng (%)

EC50 (nồng độ chất thử bắt giữ hiệu quả gốc tự do) được tính theo giá trị SC tương quan với các nồng độ khác nhau của chất thử

2.3.5 Phương pháp đánh giá tác dụng bảo vệ gan trên mô hình chuột thử nghiệm invivo

* Nguyên lý phương pháp:

Xác định hoạt độ enzyme aspartat aminotransferase và alanin aminotransferase (AST, ALT) trong huyết thanh chuột, cùng với sự quan sát mô bệnh học của gan chuột thực nghiệm để đánh giá tác dụng bảo vệ gan của mẫu thử

* Cách thức tiến hành:

Gồm 2 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Mẫu thử nghiệm là cao tổng etanol của cây An xoa

Giai đoạn 2: Mẫu thử nghiệm là một phân đoạn cao chiết của cây An xoa

Cả 2 giai đoạn đều tiến hành trên chuột theo qui trình như sau:

- Bước 1: Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô gồm 8 con:

+ Lô 1 (Lô chứng trắng): Uống nước cất 0,1 ml/10g /lần/ngày

+ Lô 2 (Lô mô hình): Uống nước cất 0,1 ml/10g/lần/ngày + uống paracetamol 300 mg/kg

+ Lô 3 (Lô chứng dương): Uống silymarin 100 mg/kg/lần/ngày + uống paracetamol 300 mg/kg

+ Lô 4 (Lô dùng thuốc nghiên cứu): Uống mẫu thử liều 12g/kg (Liều tương đương dự kiến trên lâm sàng) + Uống paracetamol 300 mg/kg

+ Lô 5 (Lô dùng thuốc nghiên cứu): Uống mẫu thử liều 24g/kg (Liều gấp 2 lần dự kiến trên lâm sàng) + uống paracetamol 300 mg/kg

- Bước 2: Chuột được uống nước hoặc mẫu nghiên cứu liên tục trong 8 ngày Ngày thứ 8, sau uống mẫu nghiên cứu 3 giờ, gây tổn thương gan chuột ở các lô từ

lô 2 đến lô 5 bằng uống paracetamol liều 300mg/kg Sau 48 giờ uống paracetamol, chuột được lấy máu, sau đó giết chuột, tách lấy gan

- Bước 3: Lấy máu, ly tâm với 5000 vòng/phút trong 15 phút để thu huyết thanh để định lượng AST, ALT

- Bước4: Lấy và xử lý gan: giết chuột, tách lấy gan Rửa gan bằng nước muối sinh lý rồi dùng gạc thấm khô Cân khối lượng gan và quan sát đại thể gan Cắt một phần gan để làm tiêu bản mô bệnh học cấu trúc vi thể gan

* Các chỉ tiêu theo dõi:

- Quan sát đại thể gan

- Hoạt độ transaminase huyết thanh: xác định hoạt độ transaminase huyết thanh (AST, ALT) theo phương pháp động học của IFCC (international federation

of clinical chemistry) (1977-1980)

- Mô bệnh học: sau khi giết động vật, mẫu gan được cố định bằng dung dịch Carnoy, vùi trong parafin, cắt lát mỏng 5-7 µm, nhuộm hematoxylin-eosin và quan sát dưới kính hiển vi quang học để đánh giá vi thể gan

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả thử hoạt tính bảo vệ gan trên chuột thử nghiệm của cao tổng etanol cây An xoa

Enzym aspartat aminotransferase (AST) và enzym alanin aminotransferase (ALT) là các enzym vận chuyển nhóm amin, nồng độ các enzym này có nhiều ở gan

Do vậy, khi gan bị tổn thương AST, ALT được phóng thích vào trong máu Điều này làm cho AST, ALT là chỉ số quan trọng để đánh giá chức năng gan Kết quả nghiên

cứu ảnh hưởng của cao chiết An Xoa lên hoạt hoạt độ AST, ALT huyết thanh chuột được trình bày trong bảng 3.1 và 3.2

Từ kết quả bảng 3.2 và 3.2 cho thấy, khi gây độc gan bằng paracetamol, hoạt

độ AST và ALT trong huyết thanh chuột tăng lên so với chuột không bị gây độc gan Sau khi chuột bị gây độc gan bằng paracetamol, cho uống cao chiết cây An xoa thì hoạt độ 2 enzim AST và ALT giảm đi đáng kể Đặc biệt, tác dụng của An Xoa liều 24g/kg cho thấy tác dụng tương đương, thậm chí tốt hơn Silymarin liều 100g/kg Điều này chứng tỏ, cao chiết An xoa ở 2 liều 12g/kg và 24g/kg có khả năng bảo vệ tế bào gan chuột thông qua làm giảm hoạt độ 2 enzim AST và ALT trong huyết thanh chuột Kết quả này là cơ sở để tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học bảo vệ gan từ cây An xoa

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của cao lỏng An xoa lên hoạt độ AST trong huyết

thanh chuột

Lô thí nghiệm Hoạt độ AST(UI/l)X ± SE p so với 1 p so với 2

Lô 1: Chứng trắng 54,84 ± 6,43

Lô 2: Mô hình 806,54 ±213,84 < 0,05

Lô 3: Silymarin 100 mg/kg 348,88 ±121,68 < 0,05

Lô 4: An Xoa 12 g/kg 399,81±115,52 >0,05

Lô 5: An Xoa 24 g/kg 172,76 ± 21,10 < 0,05

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của cao lỏng An xoa lên hoạt độ ALT trong huyết

thanh chuột

Lô thí nghiệm Hoạt độ ALT (UI/l)X ± SE p so với1 p so với2

Lô 1: Chứng trắng 50,02 ± 3,82

Lô 2: Mô hình 351,32 ± 54,21 < 0,05

Lô 3: Silymarin 100 mg/kg 209,68 ± 28,89 < 0,05

Lô 4: An Xoa 12 g/kg 268,81 ± 67,92 >0,05

Lô 5: An Xoa 24 g/kg 249,76 ± 48,57 > 0,05

3.2 Kết quả phân lập các hợp chất từ cây An xoa

Từ cặn chiết EtOAc (65g) của cao chiết An Xoa, bằng các phương pháp sắc

ký và kết tinh phân đoạn đã phân lập được 11 chất sạch ký hiệu: HH1 (30mg), HH2 (11mg), HH3 (20mg), HH5 (9mg), HH6 (15mg), HH8 (12mg), HH11 (5mg), HH12 (7mg), HH16 (7mg), HH28 (8mg), HH30 (30mg)

Cấu trúc hóa học của các chất này đã được xác định nhờ phân tích các dữ liệu phổ bao gồm phổ IR, MS, 1D và 2D NMR, đồng thời so sánh với các tài liệu

đã công bố trước đây

Cấu trúc 11 chất này được xác định là: β-sitosterol (HH1), 6β-hydroxyenone hay stigmast-4-ene-6β-ol-3-one (HH2), β-sitosterol glucoside (HH3), heliclactone

(HH05), cucurbitacin D (HH6), axit bentulinic (HH8), isokaemferide (kaemferol-3-O-methyl ether) (HH11), axit alphitolic (HH12), hibiscolactone A hay 3, 9 – dihydroxy-1,3,5,7,9 cadinapentaene-14,2-olide (HH16), betulin (HH28), propacin (HH30)