nuoi cay mo dong - thuc vat

ự ậ ễ  Nhân gi ng invitro: ố Thuật ngữ nhân giống in vitro in vitro propagation hay còn gọi là vi nhân giống micropropagation được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi c

KỸ THUẬT NUÔI CẤY

MÔ VÀ TẾ BÀO

MÔN HỌC

GV Khúc Thị An

PH N I: NUÔI C Y MÔ T BÀO TH C V T Ầ Ấ Ế Ự Ậ

TÀI LI U THAM KH O Ệ Ả

 5.Vũ Văn Vụ, Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB GD –

1998

 6 Công ngh t bào ệ ế , Nguy n Hoàng L c,NXB-2006 ễ ộ

 7 Công ngh nuôi c y mô t bào th c v t ệ ấ ế ự ậ , Lê

M c tiêu và yêu c u môn h c ụ ầ ọ

- Ki n th c: ế ứ

+ nguyên t c c a m t s k thu t c b n c a nuôi ắ ủ ộ ố ỹ ậ ơ ả ủ

c y mô và t bào ấ ế Mục đích, ý nghĩa của từng loại kỹ thuật sử dụng

+ ng d ng c a k thu t nuôi c y mô t bào ứ ụ ủ ỹ ậ ấ ế

Một số yêu cầu

 Môn học tiên quyết:

 Không nghe điện thoại trong giờ học

 Không được vào muộn

 Kiểm tra giữa kỳ: 25%

 Thi cuối kỳ (viết tự luận): 75%

 Tính toàn năng (totipotency) : Một đặc ti ́nh của tế bào là có

khả năng phát triển thành mọi kiểu tế bào có trong cơ thể trưởng thành mà từ đó nó được tách ra, tức là có khả năng tái sinh thành một cơ thể hoàn chỉnh

M t s thu t ng ộ ố ậ ữ

 Nuôi c y mô, t bào th c v t ấ ế ự ậ

Là khái ni m mô t các ph ệ ả ươ ng th c nuôi c y các b ph n th c v t ứ ấ ộ ậ ự ậ trong ng nghi m có ch a môi tr ố ệ ứ ườ ng xác đ nh đi u ki n vô ị ở ề ệ trùng Nuôi c y các lo i mô tách ra t m t ph n nào đó c a m t c ấ ạ ừ ộ ầ ủ ộ ơ quan th c v t: lá, thân, hoa, r ự ậ ễ

 Nhân gi ng invitro: ố Thuật ngữ nhân giống in vitro (in vitro propagation) hay còn gọi là vi nhân giống (micropropagation) được sử dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ, sinh trưởng

ở điều kiện vô trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại bình nuôi cấy khác

 Lai t bào soma ế

Tất cả các dạng nuôi cấy mô đều tiến hành qua 2 bước

 Tách rời tế bào, mô hay cơ quan đang tương tác

 Đặt trong môi trường thích hợp để nó

có thể biếu lộ hết bản chất hoặc khả năng đáp ứng của nó.

(Tiến hành trong đk vô trùng)

Một số kỹ thuật dùng trong nuôi cấy

mô tế bào thực vật

A.Mô sẹo từ

(BNuôi cấy dịch tế bào

từ (C) Nốt

sần (D) Đầu

rễ (E)Tái sinh cây (F)

canephora (I)

Nuôi cấy rễ cây

T m quan tr ng c a ph ầ ọ ủ ươ ng

pháp nuôi c y mô t bào th c v t ấ ế ự ậ

 V m t lý lu n sinh h c ề ặ ậ ọ

 V m t th c ti n s n xu t ề ặ ự ễ ả ấ

- Nghiên c u qui lu t sinh tr ứ ậ ưở ng và phát tri n ể cùng m i quan h c a cá th v i môi tr ố ệ ủ ể ớ ườ ng.

 Do đó t o ra hàng lo t cá th m i gi nguyên các ạ ạ ể ớ ữ tính tr ng di truy n c a c th m và làm rút ng n ạ ề ủ ơ ể ẹ ắ

th i gian đ a gi ng m i vào s n xu t quy mô l n, ờ ư ố ớ ả ấ ở ớ

t o sinh kh i l n các ch t có ho t tính SH (alkaloid, ạ ố ớ ấ ạ

Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy

mô tế bào thực vật.

 Vi nhân giống

 Tạo giống mới

 Sản xuất dược liệu

 Bảo quản giống invitro

 D a vào k thu t nuôi c y đ duy trì và b o ự ỹ ậ ấ ể ả

qu n đ ả ượ c nhi u gi ng cây tr ng quý hi m ề ố ồ ế

 S d ng k thu t nuôi c y và dung h p ử ụ ỹ ậ ấ ợ protoplast (t bào tr n) đ t o ra nh ng con ế ầ ể ạ ữ lai xa v m t di truy n mà ph ề ặ ề ươ ng pháp lai giông c đi n không th c hi n đ ổ ể ự ệ ượ c.

 Chuy n các gen mong mu n vào cây tr ng ể ố ồ

 S n xu t các ch t có ho t tính sinh h c t ả ấ ấ ạ ọ ừ

t bào nuôi c y ế ấ

Ứng dụng (tt)

ng d ng (tt)

 Nuôi c y mô t bào còn là m t ph ấ ế ộ ươ ng pháp nghiên c u ứ

hi u qu nh t quá trình phát sinh hình thái nhi u loài ệ ả ấ ở ề

th c v t ự ậ

 B ng ph ằ ươ ng pháp nuôi c y mô, ta hoàn toàn có th lo i b ấ ể ạ ỏ

đ ượ c nh ng cá th nhi m b nh (ph c tráng gi ng) ữ ể ễ ệ ụ ố

 T o ra s đ ng lo t v gi ng, t đó t o ra s đ ng lo t c a ạ ự ồ ạ ề ố ừ ạ ự ồ ạ ủ

s n ph m cu i cùng, giúp c gi i hoá đ ả ẩ ố ơ ớ ượ c khâu tr ng tr t ồ ọ

và thu ho ch Nh đó mà n ng su t lao đ ng t ng lên ạ ờ ă ấ ộ ă Với công nghệ mới này năng xuất của người nông nghiệp tăng thêm

2500 lần – không có lĩnh cực công nghệ nào có thể sánh nổi

Chỉ với 3 người, Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm Giống và Kĩ thuật cây trồng có thể tạo 500.000 cây lan cấy mô theo yêu cầu cầu của kháchhàng.

L CH S PHÁT TRI N Ị Ử Ể

 4 giai đoạn:

+ giai đoạn I: 1902 – 1930: Thử nghiệm ban đầu, giai đoạn khởi xướng: Haberlandt, Đức (1902): “Tính toàn năng

của tế bào thực vật’’ Tuy nhiên ông đã không thành

công với các tế bào mô mềm, biểu bì do chúng không

thể phân chia được ko thành công do thiếu thông tin về chất ĐHST, môi trường nuôi cấy… các yếu tố ảnh hưởng khác.

+ giai đoạn II: 1934- 1954: Phát hiện vai trò của các

vitamin, các chất ĐHST (au xin, cytokynin)

+ Xây dựng được môi trường cơ bản: MS, N6, B5.

L CH S PHÁT TRI N Ị Ử Ể

+ giai đoạn III: 1957 – 1999: Thực hiện tách và nuôi cấy tế bào đơn, Biết vai trò và tỷ lệ của Aux/ Cyt, tao protoplast và tái sinh cây Tạo cây đơn bội từ nuôi cấy hạt phấn Và từ 1980

là phát triển của CN gen thực vật

+ giai đoạn IV: 1999 – nay: Ứng dụng các thành tựu vào sản xuất với quy mô lớn.

Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN

 Công nghệ NCMTBTV du nhập vào nước ta từ năm 1960 ở miền Nam

và đầu những năm 1970 ở miền Bắc, nhưng thực sự phát triển từ

Sự phát triển và thành tựu của

nuôi cấy mô tế bào ở VN

 Vi nhân giống khoai tây, dứa, chuối, mía

 Cây hoa: Phong Lan, Cúc,cẩm chướng,

 Cây rừng: bạch đàn,keo lai

 Cây dược liệu:

 Chọn dòng: dòng tế bào kháng bệnh, chịu mặn, chịu hạn

 Dung hợp tạo cây lai:

 Hiện nay, 100% nông dân Đà Lạt sử dụng cây giống từ nuôi cấy

mô

 2008 công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: Nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng đặc biệt là loài lan Hài hồng - loài lan hài duy nhất có hương thơm trên thế giới…

Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN

Trinh nữ hoàng cung Crinium latifolium

Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô tế bào ở VN

 Ở nước ta cây trồng chuyển gen mới chỉ được nghiên cứu ở các viện, các phòng thí nghiệm, mà chưa được sản xuất ở quy mô lớn, đại trà như viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viên Lúa đông bằng sông Cửu Long…và một số chương

trình từ dự án quốc gia và quốc tế và thành công trong việc

chuyển một số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào một số cây như lúa, ngô, cải bắp…

Đậu tương chuyển gen kháng chất diệt cỏ

Đu đủ chuyển gen kháng virus

Cây không chuyển gen Cây chuyển gen

Ngô chuyển gen kháng côn trùng

Nguyễn Văn Uyển, 1982-1986).

3 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong vi nhân giống cây cà phê lai Arabusta MS 52D 01-05, UBKHKT Nhà Nước (CNĐT: PGS TS Nguyễn Văn Uyển, 1987-1990)

4 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nhân

nhanh cây ăn trái, cây dược liệu và cây rừng KC.08.13, Bộ Nông nghiệp (CNĐT: PGS TS Nguyễn Văn Uyển, 1991-1994).

Một số thành tựu

 5 Nghiên cứu nhân nhanh một số dòng điều (Anacardium

occidentale L.) cao sản bằng phương pháp quang tự dưỡng và nuôi cấy lớp mỏng Đề tài nhánh của chương trình KC 04.08 (CNĐT: PGS TS Nguyễn Thị Quỳnh, 2001-2003)

6 Nghiên cứu phương pháp vi nhân giống thích hợp cho một

số giống điều (Anacardium occidentale L.) có chất lượng cao

để phục vụ cho việc ghép cành Đề tài nhánh của đề tài trọng điểm cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (CNĐT: PGS

TS Nguyễn Thị Quỳnh, 2002 -2003).

 7 Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên sự

tăng trưởng của cây thân gỗ nhiệt đới nuôi cấy in vitro Đề tài KHCB, MSĐT: 62 07 02, Bộ KH&CN (CNĐT: PGS TS Nguyễn Thị Quỳnh, 2002 -2004).

Một số thành tựu



8 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy không đường kết hợp với kỹ thuật tăng cường CO2 và O2 trong hộp nuôi cấy lên sự tăng trưởng của một số cây trồng có giá trị kinh tế cao trong giai đoạn in vitro và ex vitro Đề tài KHCB, MSĐT: 62 13 05, Bộ KH&CN (CNĐT: PGS TS Nguyễn Thị Quỳnh, 2005 -2006).

9 Hoàn thiện quy trình nhân nhanh in vitro bằng mầm chồi cây điều

(Anacardium occidentale L.) cao sản Đề tài cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (CNĐT: PGS TS Nguyễn Thị Quỳnh, 2005 -2006).

10 Nghiên cứu triển khai phương pháp ứng dụng các nguồn hydratcacbon

khác nhau trong môi trường nuôi cấy lan Dendrobium và Phalaenopsis ở điều kiện ánh sáng tự nhiên và chuyển giao quy trình nhân giống phong lan nuôi cấy

mô tại tỉnh Bình Phước.

Một số thành tựu

 11 Nghiên cứu xây dựng công nghệ vi

nhân giống quang tự dưỡng bán tự động

để sản xuất cây cấy mô (lan Dendrobium

và Hông Paulownia) (CNĐT: PGS TS

Nguyễn Thị Quỳnh, 2007 -2009).

12 Tái sinh cây Hồ tiêu (Piper nigrum L.)

in vitro bằng nuôi cấy mảnh lá (CNĐT: Đỗ Đăng Giáp, 2006-2007)

CẤU TẠO VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO THỰC VẬT

M t s đ c đi m c a t bào th c ộ ố ặ ể ủ ế ự

v t ậ

 Có thành xellulô bao b c ọ

 Có l p th là c quan c a s c t óng ạ ể ơ ủ ắ ố Đ vai trò quan tr ng trong quang h p ọ ợ

 Có không bào là n i ch a ch t d tr ơ ứ ấ ự ữ

ch y u là tinh b t ủ ế ộ

Các quá trình chức năng của

tế bào

 Sinh trưởng và trao đổi chất của tế bào

 Sinh tổng hợp protein

 Hình thành các tế bào mới

Sinh trưởng và trao đổi chất của

tế bào

 Quá trình dị hóa (catabolism) nhằm phân huỷ các phân tử hữu cơ phức tạp để thu nhận năng lượng (dưới dạng ATP ) và lực khử ;

 Quá trình đồng hóa (anabolism) sử dụng năng lượng và lực khử để xây dựng các phân tử hữu

cơ phức tạp, đặc thù và cần thiết

Hình thành các tế bào mới

 Phân bào là quá trình sinh sản từ một tế

bào (gọi là tế bào mẹ ) phân chia thành hai

tế bào non

 Đây là cơ chế chính của quá trình sinh

trưởng của sinh vật đa bào và là hình thức sinh sản của sinh vật đơn bào

Pha M: Phân chia nhiễm sắc thể và tế bào chất

Hệ thống các điểm kiểm soát

• Kiểm tra các tổn thương của DNA và các sai sót trong các quá trình quan trọng của chu kỳ

tế bào

• Khi có sự không tương thích nào đó, các điểm kiểm soát có thể chặn quá trình luân chuyển qua các pha của chu kỳ tế bào

• Nếu hệ thống này phát hiện có điều gì bất thường, thì một mạng lưới các phân tử dẫn truyền thông tin (signal transduction) sẽ hướng dẫn tế bào ngưng phân chia ngay

S PHÂN BÀO Ự

 Th c v t có th sinh tr ự ậ ể ưở ng đ ượ c nh ờ

s phân bào Có 2 ki u phân bào: ự ể

- Nguyên phân

- Gi m phân ả

Nguyên phân

2 tế bào con

hình thành

• Ở thực vật, quá trình phân chia nguyên phân xảy ra

ở mô phân sinh

NGUYÊN PHÂN

đ i chéo c a các NST K t qu là hình ổ ủ ế ả thành 2 t bào con có s NST b ng n a ế ố ằ ử

t bào m ế ẹ

Các tế bào được phân chia theo kiêu gián phân – số NST không thay đổi để tạo nên 4 tế bào mang một nửa số lượng NST của tế bào

mẹ ban đầu

Chúng được gọi là những tế bào đơn bội

Giảm phân II

 Cơ quan:tập hợp nhiều mô: thân, lá, rễ…

 Cơ thể: tập hợp của nhiều cơ quan

Chu trình sinh trưởng ở thực vật

 Sự nảy mầm của hạt

 Sự phát triển cây con

 Sự tăng trưởng của rễ và thân

 Sự biệt hóa của các tế bào.

Sự nảy mầm của hạt

 Cơ thể thực vật có phôi phát triển kể từ khi hạt nảy mầm gồm rễ phát triển

xuống đất và chồi gồm thân mang lá

phát triển trong khí quyển

Sự nảy mầm của hạt

Sự phát triển của cây con

 Ðầu tiên cây con tăng trưởng hơi chậm, nhưng sau đó tăng trưởng với một tốc độ nhanh hơn trong một thời gian dài hơn và cuối cùng chậm lại và có thể dừng tăng

trưởng khi cây sắp trưởng thành

Sự tăng trưởng của thân và rễ

 Sự tăng trưởng của rễ và thân của cây con có được là nhờ

sự phân cắt và sự tăng dài của tế bào của hai mô phân sinh ngọn rễ và ngọn thân.

 vùng mô phân sinh ngọn rễ, và thân gồm những tế bào

nhỏ có khả năng phân chia tích cực

 Khi các tế bào được mới được đẩy ra khỏi vùng mô phân sinh ngọn, do số lượng tế bào tăng lên sự phân cắt chậm lại thì sự gia tăng kích thước tế bào loàm cho rễ và thân dài

và to lên

Sự tăng trưởng của rễ và thân

Sự biệt hóa của các tế bào

 Tất cả những tế bào mới được sinh ra từ

mô phân sinh thì cơ bản giống nhau, chúng sẽ trở thành các loại mô khác nhau Quá trình tế bào thay đổi từ những hình dạng chưa trưởng thành đến trưởng thành gọi là sự chuyên hóa (differentiation)

Sinh s n vô tính ả

 Ki u sinh s n không qua th tinh ể ả ụ

 S tách r i m t ph n c th m và s phát ự ờ ộ ầ ơ ể ẹ ự tri n cá th m i t ph n đó ể ể ớ ừ ầ

 C quan th c v t dùng đ sinh s n vô tính là ơ ự ậ ể ả

ch i nách, thân, r , c , giò, thân bò… ồ ễ ủ

 Không qua th tinh và tái t h p gen nên ụ ổ ợ không làm thay đ i n i dung di truy n ổ ộ ề

Các hình thức sinh sản vô tính

 Sinh sản bằng bào tử:Cơ thể mới được

phát triển từ bào tử, bào tử lại hình thành trong túi bào tử từ thể bào tử (rêu, dương xỉ)

 Sinh sản sinh dưỡng: giâm, chiết , ghép

 Nuôi cây mô tế bào thực vật

Sinh s n h u tính ả ữ

 S tham gia c a các y u t quy đ nh gi i ự ủ ế ố ị ớ tính: k t h p hai giao t đ c và cái trong ế ợ ử ự quá trình th tinh hình thành h p t ụ ợ ử

- TV b c cao (TV có hoa): th ph n và th Ở ậ ụ ấ ụ tinh

PHÒNG THÍ NGHI M NUÔI C Y MÔ Ệ Ấ

6 Phòng nuôi

cây

7Phòngnuôi

8Phòng phân kính hiển vi

9.Phòng phân tích và xử

lý sô liệu 10Hệ thống vườn ươm, nhà lưới

2.Phòng sấy hấp

4 PHÒNG C Y VÔ TRÙNG Ấ

 Laminar (tủ cấy vô trùng)

 Quạt thông gió

 Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo tường

 Thiết bị lọc không khí

 Giá và bàn để môi trường

 Bộ dụng cụ cấy, đèn cồn

M t s d ng c ộ ố ụ ụ

5.Phòng nuôi m u c y ẫ ấ

 T t c các m u c y đ u đ ấ ả ẫ ấ ề ượ c nuôi trong

đi u ki n nhi t đ , ánh sáng, đ m, đ ề ệ ệ ộ ộ ẩ ộ dài chi u sáng, đ thông khí thích h p ế ộ ợ

 Phòng nuôi có nhi t đ 15 – 30 ệ ộ 0 tu theo ỳ

m u c y và m c đích c a thí nghi m ẫ ấ ụ ủ ệ

 Ánh sáng: ánh sáng hu nh quang và có ỳ

th đi u ch nh đ ể ề ỉ ượ c c ườ ng đ và th i ộ ờ gian chi u sáng ế

Các thi t b trong phòng này ế ị

 G m có các giá có t ng đ bình ho c ồ ầ ể ặ

ng nghi m nuôi c y Các giá có l p đèn

đ chi u sáng ể ế có độ chiếu sáng ở chỗ để bình nuôi cấy từ 2000-3000 lux.

 Trong phòng c n có máy móc đ ki m ầ ể ể tra chính xác nhi t đ , ánh sáng, đ m, ệ ộ ộ ẩ máy đi u hoà nhi t đ ề ệ ộ

Phòng nuôi cây

Cải biến hệ thống phát sáng (đèn

Compact 3U)

6 Phòng sinh hóa

- Phòng này dùng để tiến hành các phân tích sinh hoá, phân tử và di truyền.

- Phòng này cần các thiết bị: tủ hút, ccân các loại,

tủ ấm, máy cắt tiêu bản, máy đo pH, máy điện di, máy PCR, máy sắc ký…

Phòng thí nghi m ệ

Một số kiểu

bình nuôi cấy

Bình serum (đựng dung dịch

khoáng trong các bệnh viện)

Các loại hộp nhựa

Cây hoa Lily nuôi cấy trong hộp nhựa

(sản xuất tại Mỹ, giá 5 USD)

Cây hoa Lily nuôi cấy trong hộp nhựa (sản xuất tại Viêt Nam, 700 -

1000 đồng)

Túi nhựa (nylon, có bán rộng rãi trên thị

trường, giá 30 – 50 đồng/túi)



Các nhân tố đảm bảo thành công

trong nuôi cấy mô tế bào thực vật:

 Đảm bảo điều kiện vô trùng.

 Chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách

 Chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy.

1.Đảm bảo điều kiện vô trùng

1.1.Ý nghĩa của vô trùng trong nuôi cấy mô

và tế bào thực vật

1.2.Khử trùng

Ý nghĩa của việc vô trùng

 Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, muối khoáng, vitamin rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn nhiều so với các tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy

bị nhiễm bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày

sẽ phủ đầy vi khuẩn hoặc nấm,khi đó mô nuôi cấy

sẽ chết dần thí nghiệm phải bỏ đi.