NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI

LẬP KARYOTYPE BỘ NST NGƯỜI Karyotype đuợc lập để mô tả đặc điểm bộ NST của một cá thể dựa trên bộ NST của tế bào ở kỳ giữa metaphase hoặc kỳ giữa sớm pro-metaphase của nguyên phân...

MỤC LỤC

Phần A: BỘ NHIỄM SẮC THỂ NGƯỜI

I ĐẶC ĐIỂM BỘ NST NGƯỜI

Ở người bình thường, mỗi tế bào lưỡng bội (2n) (diploid) mang 46 nhiễm sắc thể (NST) chia thành 23 cặp, trong đó có 22 cặp NST thường (autosome) và 1 cặp NST giới tính (sex chromosome) Tinh trùng và trứng được hình thành qua quá trình giảm phân (meiosis) mang bộ NST đơn bội (n) với 23 NST

- Số lượng NST phân biệt ở các tế bào:

+ Bộ đơn bội (n) đặc trưng cho các giao tử (tinh trùng, trứng)

+ Bộ lưỡng bội (2n) đặc trưng cho TB sinh dưỡng, TB sinh dục sơ khai Trong TB lưỡng bội NST tồn tại thành cặp NST tương đồng

II LẬP KARYOTYPE BỘ NST NGƯỜI

Karyotype đuợc lập để mô tả đặc điểm bộ NST của một cá thể dựa trên bộ NST của tế bào

ở kỳ giữa (metaphase) hoặc kỳ giữa sớm (pro-metaphase) của nguyên phân

1 Phân loại NST người

Những tiêu chuẩn để xác định và phân loại từng NST người:

- Kích thước (chiều dài) của NST Chiều dài của NST giảm dần từ cặp số 1 đến cặp 22 Cặp số 23 là cặp NST giứoi tính

- Chỉ số tâm

Chiều dài nhánh ngắn

Tổng số chiều dài của NST

p + q

p

Chỉ số tâm = =

p: chiều dài nhánh ngắn; q: chiêu dài nhánh dài

- Chiều dài tương đối của NST: là tỉ lệ giữa chiều dài của một NST nào đó so với chiều dài tổng cộng của bộ NST đơn bội có chứa NST X, tính theo phần nghìn trên cùng một tế bào

+ Nhóm tâm giữa (metacentric): Chiều dài của nhánh ngắn bằng nhánh dài (p = q)

+ Nhóm tâm lệch (submetacentric): Chiều dài nhánh ngắn ngắn hơn nhánh dài (p ˂ q)+ Nhóm tâm đầu (acrocentric): Chiều dài của nhánh ngắn rất ngắn như không có

- Sự phân bố của các band sáng tối (trong kỹ thuật nhuộm băng)

- Màu sắc huỳnh quang bắt màu trên NST ( trong kỹ thuật nhuộm màu huỳnh quang)

2 Karyotype (kiểu nhân)

2.1 Giai đoạn thích hợp để lập karyotype

Kỳ giữa (metaphase) hoặc tiền kỳ giữa (pro- metaphase) của nguyên phân là giai đoạn NST cho hình ảnh rõ nét nhất giúp đánh giá số lượng và cấu trúc của các NST một cách dễ dàng

2.2 Loại tế bào được sử dụng

Về mặt lý thuyết karyotype có thể được lập từ bất cứ loại tế bào nào có thể nguyên phân tuy nhiên trong thực tế karyotype được lập từ việc nuôi cấy 4 loại tế bào chính:

- Các tế bào lympho

- Các nguyên bào sợi thu được từ sinh thiết da

- Các tế bào nước ối thu được qua việc chọc dò nước ối vào tuần lễ thứ 13 - 14 của thai

● Các quy định quốc tế về xếp bộ nhiễm sắc thể người

Tại hội nghị tổ chức ở Denver (1960), ở London (1963) và ở Chicago (1966), các nhà di truyền tế bào học đã thống nhất với nhau: 22 cặp NST thường được (46 NST) được xếp thành 7 nhóm, ký hiệu là A, B, C, D, E, F và G Mỗi nhóm gồm các NST có kích thước gần giống nhau và

dễ nhầm lẫn với nhau khi phân loại Các NST thường được sắp xếp theo kích thước từ lớn tới nhỏ dần và được đánh số từ 1 đến 22 và cặp NST giới tính được ký hiệu là XX (người nữ) và XY (người nam) được xếp riêng ở góc dưới phải của karyotype hoặc NST X được xếp theo nhóm C

Nhóm C có 7 cặp NST, bao gồm từ số 6 ñến số 12 là các NST có chiều dài trung bình NST

X cũng được xếp vào nhóm này Tất cả các NST thuộc nhóm C ñều tâm lệch, khó phân biệt giữa chúng với nhau

Nhóm D có 3 cặp NST số 13, 14 và 15 Tất cả các NST thuộc nhóm này có kích thước trung bình và đều là NST tâm đầu, có vệ tinh gắn vào nhánh ngắn Khó phân biệt giữa chúng với nhau

Nhóm E có 3 cặp NST số 16, 17 và 18, các NST này tương đối ngắn NST số 16 có tâm giữa, còn cặp số 17 và 18 có tâm lệch

Nhóm F có 2 cặp NST số 19 và số 20 Cả hai NST này có kích thước ngắn và đều có tâm

giữa

Nhóm G có 2 cặp NST số 21 và số 22 Các NST có kích thước ngắn, đều có tâm đầu và có

vệ tinh NST Y cũng được xếp vào nhóm này Hai chromatid của NST Y xếp song song hơn so với NST của nhóm G NST Y không có vệ tinh

Phần B: BỘ GEN NGƯỜI

I ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA NGƯỜI

● Khoa học đã ước tính được tổng số DNA bộ NST đơn bội của người khoảng 3 tỷ đôi base (3164,7 triệu cặp base, năm 2001) ADN của người cũng như ADN của các Eukaryota khác bao

gồm những trình tự mã hóa (các exon) xen kẽ với những trình tự không mã hóa (intron)

● Kích thước của các gen nói chung rất biến thiên, trung bình gồm 27000 base, nhưng dao động lớn, có gen có thể lớn hơn 2 triệu đôi base (2,4 Mb gen của Dystrophin)

● Hiên nay bộ gen người khảng 30.000 đến 35000 gen, năm 2001 (20.000 đến 25.000 gen, công bố mới nhất)

● Gần như toàn bộ trình tự base giống nhau một cách chính xác ở tất cả mọi người

● Gần 50% các gen chưa biết chức năng

► Một số điều ngoài dự kiến

+ Ít hơn 2% (1,1 – 1,4%) gen mã hóa cho protein

+ 5% đến 8% trình tự được phiên mã ra RNA+ Các trình tự lặp lại không mã hóa cho protein chiếm ít nhất khoảng 50%

Tùy mức độ có mặt của chúng trong nhân mà các trình tự ADN được chia làm ba loại:

- ADN có trình tự duy nhất: là các gen mã hóa cho các protein, chiếm khoảng 10% bộ gen

Thuật ngữ gen đã có gần một thế kỷ (Johansen, 1909) nhưng khái niệm về gen, thực thể nó như thế nào thì thật là bí ẩn, sự khám phá về nó vẫn còn tiếp tục

Các gen này sẽ được dịch ra protein bằng ARN polymerase II và gen được gọi là gen nhóm

II Các gen này chỉ mã hóa ra một loại protein

Gen ở sinh vật bậc cao bị gián đoạn bởi những vùng không mã hóa Thường thì gen bắt đầu

từ phía 5’ bằng một vùng chứa các yếu tố điều chỉnh, kế đó là vùng khởi động, cả hai vùng này gộp lại thành vùng điều chỉnh Tiếp theo là các vùng mã hóa Các vùng mã hóa gọi là exon bị gián cách bởi các vùng không mã hóa gọi là intron Exon đầu tiên có thêm một vùng gọi là vùng khởi đầu dịch

mã, exon cuối có thêm về phía sau một vùng kết thúc dịch mã Hai vùng này cũng thuộc về exon

Số lượng exon trong các gen khác nhau không giống nhau

Gen cấu trúc ở người (đoạn ADN) gồm các đoạn exon xen kẽ intron Toàn bộ các đoạn intron và exon này sẽ phiên mã thành phân tử mARN tiền thân Phân tử mARN tiền thân này sẽ cắt loại các đoạn mRAN phiên mã từ intron và nối các đoạn mARN phiên mã từ exon để tạo thành phân tử mARN thuần thục Số lượng các intron trong một gen cũng giống như số lượng exon của

nó, không giống nhau ở các gen

Không có mối tương quan trực tiếp giữa kích thước của protein với chiều dài của gen mã hóa

ra nó, mặc dù người ta thấy các chuỗi peptid lớn tương ứng với những gen lớn

- ADN có trình tự lặp lại nhiều lần (ADN vệ tinh): chiếm khoảng 10 - 15% DNA của bộ

gen, đó là các trình tự không mã hóa Phần lớn các ADN vệ tinh khu trú tại vùng tâm của NST, tương ứng với băng C tức là phần dị nhiễm sắc cấu trúc Các chuỗi Nu này không phân tán trong NST mà khu trú tập trung, chức năng chưa rõ

● ADN lặp lại nhiều lần được chia thành hai loại:

+ Loại thứ nhất có chuỗi nucleotid ngắn (5 - 10 đôi base) xếp nối đuôi nhau, số lượng bản sao có thể tới hàng trăm triệu Các chuỗi này tăng methyl hóa ở tế bào soma và giảm methyl hóa ở

tế bào tạo giao tử, tại NST Y

+ Loại thứ hai có chuỗi Nu dài hơn, từ 100 đến 200 đôi base, cũng xếp nối đuôi nhau

Ngoài hai loại có tính khu trú ở trên, còn có một loại nữa có tính phân tán gọi là vệ tinh nhỏ (minisatellite) không nằm trong vùng dị nhiễm sắc cấu trúc, loại này rất có ích cho việc lập bản đồ gen

- ADN có trình tự lặp lại trung bình: chiếm khoảng 25 - 40% DNA của bộ gen của người,

chúng cũng có cấu trúc gồm các đoạn chuỗi Nu lặp lại nhưng đoạn chuỗi dài hơn, từ 100 đến 1000 đôi base, kém đồng nhất hơn nhiều so với loại lặp lại nhiều lần Loại ADN này phân tán trong toàn

bộ gen, phần lớn chúng không thấy hoạt động phiên mã Chúng không mã hóa nhưng cũng có thể

có chức năng phiên mã: chúng là gen của các rARN, tARN và một số gen khác nữa

Ngoài ba loại trình tự kể trên, trong bộ gen người còn có các gen nhẩy (transposon), đó là những đoạn ADN có khả năng tích hợp vào bất cứ đâu của bộ gen

Như vậy, dựng bản đồ gen bao gồm xác định vị trí của các gen mã hóa protein (coding genes) đồng thời xác định vị trí của các đoạn ADN không mã hóa, có tính đa hình Hình 4.2 giới thiệu số lượng các gen mã hóa đã được phát hiện theo thời gian

Với các tiêu chuẩn lập bản đồ gen của người, người ta lập ra hai loại bản đồ: bản đồ di truyền và bản đồ hình thể Bản đồ di truyền dựa vào kết quả phân tích tổ hợp lại bằng phương pháp thống kê gián tiếp Bản đồ hình thể dựa vào đo đạc trực tiếp trên chiều dài của ADN

II PHÂN PHỐI CỦA EXON VÀ INTRON TRONG BỘ GEN NGƯỜI

Bộ gen của con người khoảng 26.564 gen trong hệ gen (xây dựng năm 2003) có chứa 233.785 exon và 207.344 intron Tính trung bình, có 8,8 exon và 7,8 intron mỗi gen Khoảng

80% của exon trên mỗi nhiễm sắc thể là dài < 200 bp <0,01% của intron chiều dài <20 bp và

<10% của intron là dài hơn 11.000 bp

Bắt đầu với 26.564 gen, lọc ra 233.785 exon và 207.344 intron từ hệ gen của con người

Kích thước nhiễm sắc thể (kích thước bộ gen) là 3017700646 basepair (bp) Sự phân bố của các gen trên nhiễm sắc thể khác nhau dựa trên CDS tính năng được hiển thị trong Bảng 1

Nhiễm sắc thể nhỏ nhất là Y với 98 gen được chú thích Nhiễm sắc thể lớn nhất là nhiễm sắc thể số 1 với 2514 gen Số lượng gen trên mỗi nhiễm sắc thể là nhẹ tương quan với

kích thước nhiễm sắc thể ( r = 0.73) Tương quan yếu này có thể đề nghị một mối quan hệ hạn

chế quan hệ nhân quả giữa số lượng gen và kích thước nhiễm sắc thể Nó cũng cho thấy rằng các yếu tố khác ngoài số lượng gen cũng ảnh hưởng đến kích thước nhiễm sắc thể Gen dài nhất được chú thích là DMD (dystrophin Dp140bc isoform) 2217347 bp (79 exon) được tìm thấy trên nhiễm sắc thể [Nishio etX al 1994

Bảng 1: Exon - intron phân phối cho hệ gen của con người

Max

# exon / gen

Kích thước nhiễ

m sắc thể (xác định)

Trun

g bình

# exon / gen

Trun

g bình chiều dài (bp)

Std dev.

Tổng chiều dài (bp)

Ngắn nhất (bp) Dài nhất (bp)

exon intron exon intron exon intron exon intron gen exon intron gen

1 2514 22345 19831 107 22682

8929 8,89

167,0 1

4736, 52

229,3 7

14268 ,19

37318 70

93929

47615 8

98096 1

2 1354 12506 11152 148 23834

9289 9,24

163,9 8

5883, 23

226,8 8

17012 ,24

20508 55

65609

48341 2

18975 44

3 1394 13517 12123 118 19507

3306 9,70

164,0 6

6375, 63

224,2 1

21019 ,22

22177 00

77291

49781 6

99099 9

4 926 8299 7373 85 18723

9983 8,96

174,7 8

7168, 94

266,6 4

19497 ,08

14505 41

52856

617 2 53 132 6255

49470 8

14678 42

5 1186 9946 8760 90 17769

6509 8,39

189,5 0

7277, 28

332,8 6

21277 ,20

18847 77

63748

37036 0 93040 1

6 1306 11406 10100 145 16921

2327 8,73

173,6 2

5961, 61

253,5 6

18967 ,75

19803 97

60212

251 2 31 159 7152

46989 2

13775 70

7 2508 23045 20537 82 31021

0944 9,19

167,8 7

6703, 87

271,8 8

20177 ,41

38687 69

13767

7396 2 1 14 11923

45813 9

16415 67

8 908 7823 6915 86 14329

7300 8,62

171,1 6

7354, 15

258,4 3

21384 ,09

13390 52

50853

45326 8

20558 33

9 1033 8941 7908 72 11779

0386 8,66

170,6 6

5351, 68

253,1 9

14121 ,26

15259 26

42321

074 2 33 105 6598

27630 6

86566 1

10 1017 10273 9256 69 13201

6990 10,10

153,7 9

6412, 91

219,9 7

20271 ,48

15798 98

59357

955 2 52 105 7812

48257 5

17271 84

11 1567 12459 10892 87 13090

8954 7,95

177,6 6

4341, 42

237,0 3

15362 ,46

22135 26

47286

43754 3

14633 02

12 1299 12399 11100 89 12982

6379 9,55

158,0 7

4570, 21

192,2 3

12979 ,23

19599 45

50729

32854 5

12486 78

13 426 3784 3358 83 95749

578 8,88

183,4 7

7351, 75

396,7 9

19082 ,4

69426 8

24687

182 2 37 279 11555

31764 6

11757 62

14 854 6837 6106 114 87191

216 8,01

176,2 4

5653, 70

276,6 6

19076 ,38

12049 82

33826

109 2 51 51 11304

47907 9

12107 40

15 843 8106 7263 104 81992

482 9,62

169,7 9

4660, 70

271,3 8

11542 ,05

13763 21

33850

20717 8

62036 2

16 1093 9986 8893 62 79932

432 9,14

166,9 6

3661, 25

242,6 0

13092 ,99

16673 40

32559

46604 9

11679 38

17 1459 13179 11720 74 79376

966 9,03

165,0 8

3193, 16

215,8 9

9875, 72

21756 98

37423

28376 2

71266 8

18 367 3333 2966 75 74658

403 9,08 174,9

7905, 40

256,5 3

19377 ,24

58305 4

23447

419 3 67 225 4721

41117 5

11898 66

19 1609 12169 10560 106 55878

340 7,56

187,3 1

2032, 87

279,9 2

4741, 54

22794 36

21467

17079 6

29890 9

20 775 6492 5717 80 59424

990 8,38

160,3 4

4403, 10

215,2 9

13613 ,39

10409 52

25172

558 3 54 135 3738

30371 3

11088 55

21 309 2539 2230 47 33924

367 8,22

168,5 9

5086, 89

306,5 1

16098 ,67

42805 6

11343

761 3 74 102 5916

32356 3

83362 7

22 671 5173 4502 54 34352

072 7,71

171,1 4

3924, 83

281,8 5

12999 ,39

88535 6

17669

44725 2

49296 9

X 1048 8568 7520 79 15211

8949 8,18

185,3 3

7627, 85

299,6 6

23527 ,35

15879 26

57361

443 2 54 129 6102

49351 2

22173 47

Y 98 660 562 44 24649

555 6,73

173,7 4

5288, 54

255,0 5

19676 ,46

11467 0

29721

40034 9 68111 9

1 Kích thước exon và intron

Số trung bình của exon trong gen của con người là khoảng 8-10 và giá trị trung bình 8,8 exon mỗi gen Độ dài Exon được phân phối chặt chẽ hơn rất nhiều (SD = 192,23 - 396,79) so với intron trên mỗi nhiễm sắc thể (xem bên dưới)

Exon chiều dài trung bình khoảng 170bp Khoảng 80-85 % exon trên mỗi nhiễm sắc thể

đã được tìm thấy chiều dài nhỏ hơn 200bp

Ngược lại, các intron kích thước trung bình là khoảng 5419bp Tuy nhiên, độ lệch chuẩn (SD) có kích thước intron có nghĩa là trên 24 nhiễm sắc thể trong phạm vi của 4741,54 - 23527,35 ( Bảng 1 )

Khoảng 5,24% intron dài hơn 200.000 bp và < 10% của intron là dài hơn 11.000

bp Ngoài ra, < 0,01% của intron dài < 20 bp Một gen của con người trung bình chứa khoảng 6-9 intron Số trung bình của intron mỗi gen là 7,8

2 Tương quan giữa kích thước nhiễm sắc thể và chiều dài tổng exon, intron

Tổng chiều dài trong exon là 39.841.315 bp và intron là 1.123.657.235 bp

Một tương quan trung bình của r = 0,77 tổng chiều dài trong exon (bp) và kích thước nhiễm sắc thể, (tương quan r = 0.73 cho gen và kích thước nhiễm sắc thể)

Một mối tương quan được quan sát thấy ( r = 0,95) giữa tổng chiều dài intron (bp) và

kích thước nhiễm sắc thể (bp)

Tương tự như mối tương quan ( r = 0,97) cũng quan sát thấy giữa DNA intergenic và

kích thước nhiễm sắc thể (intergenic DNA = nhiễm sắc thể xác định kích thước (chiều dài + exon trong intron)) Điều này cho thấy rằng đối với các nhiễm sắc thể lớn hơn các khu vực được bảo hiểm trong intron và DNA intergenic

Kết quả cho thấy rằng sự thay đổi trong kích thước bộ gen giữa các sinh vật thường liên quan đến những thay đổi đồng dạng thông qua các lớp khác nhau không mã hóa DNA (ví dụ như các intron và vùng intergenic) thống nhất trên toàn bộ gen Gần đây, Morey và các đồng

nghiệp lập luận cho vai trò của không mã hóa RNA trong việc điều hòa biểu sinh [ Morey và Avener năm 2004 Vì vậy, sự hiểu biết về các chức năng của những cái gọi là "trình tự không

mã hóa" các protein tự sẽ được quan trọng để hiểu biết về di truyền học, sinh học và sự tiến hóa của con người

Phần C PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HỌC NGƯỜI

I PHƯƠNG PHÁP DI TRUYỀN TẾ BÀO

1.1 Quan sát nhiễm sắc thể ở kỳ giữa

Kỹ thuật làm tiêu bản, quan sát và đánh giá NST của người được áp dụng rộng rãi từ những năm 1960 Để phát hiện bộ NST của tế bào sinh dưỡng của người, có thể dùng tế bào trong tủy xương, tế bào bào thai, tế bào bạch cầu lympho, tế bào tua rau thai… Bạch cầu lympho ở máu ngoại vi là loại tế bào thường được dùng trong nghiên cứu NST của người Bạch cầu lympho ở máu ngoại vi là những tế bào không còn khả năng phân chia, vì vậy phải dùng PHA để kích thích cho tế bào chuyển thành những tế bào phân chia và dùng colchicin hoặc colcemid để cho NST dừng ở kỳ giữa

Nhuộm NST bằng kỹ thuật nhuộm thông thường hoặc bằng kỹ thuật nhuộm băng

Để quan sát NST trong quá trình tạo tinh, sau khi sinh thiết một số ống sinh tinh, người ta làm tiêu bản để phân tích NST ở các giai đoạn trong quá trình tạo tinh

Đánh giá tình trạng của bộ NST bằng đánh giá, phân tích ở kính hiển vi, ở các ảnh chụp theo các quy định quốc tế

1.2 Quan sát nhiễm sắc thể ở nhân tế bào gian kỳ

Bên cạnh xét nghiệm NST kỳ giữa, xét nghiệm vật thể giới tính ở nhân tế bào gian kỳ cũng

là một xét nghiệm cần thiết để đánh giá đột biến NST Xét nghiệm vật thể giới tính thường được thực hiện ở tế bào niêm mạc miệng, tế bào niêm mạc âm đạo, tế bào chân tóc… Các vật thể giới thường được phân tích là vật thể Barr, vật thể Y, vật thể dùi trống

Phương pháp nhân nhỏ cũng là một phương pháp để phát hiện đột biến NST khi mẫu vật không xử lý colchicin Nhân nhỏ là một phần nhân tách ra từ phần chính của nhân tế bào, đa số được hình thành trong kỳ giữa của giảm phân hoặc nguyên phân do NST chậm hay đoạn NST tạo thành Nhân nhỏ nếu nhiều giống như hình ảnh vụn NST, một loại tổn thương thoái hóa Ở kỳ trung gian, bên cạnh nhân lớn phát hiện được hình ảnh nhân nhỏ

1.3 Các kỹ thuật di truyền tế bào

NST được phân tích dựa trên việc nuôi cấy mô (thường là máu ngoại vi) trong các điều kiện và thời gian thích hợp (thường từ 48 đến 72 giờ đối với tế bào lympho trong máu ngoại vi) Colcemid được sử dụng để làm đình chỉ quá trình phân bào ở kỳ giữa nguyên phân Sau đó các