bài hướng dẫn thực hành công nghệ lên men

Phân bố thời gian Một tín chỉ thực hành 30 tiết bao gồm 2 bài thực hành 1 ngày và 2 ngày liên tiếp từ 8h-18h Bài 1: Chuẩn bị môi trường, phân lập và định lượng nấm men Bài 2: Ảnh hưởng c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

BÀI HƯỚNG DẪN THỰC HÀNH CÔNG NGHỆ LÊN MEN

Biên soạn: TS Đỗ Việt Hà

Thành phố Hồ Chí Minh, 10/2019

MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU CỦA HỌC PHẦN

1 Mục đích

Sau khi học xong học phần này sinh viên có khả năng:

2 Yêu cầu

 Dự lớp 100% (có mặt làm thực hành cho đến khi kết thúc buổi thực hành)

 Sinh viên đến trễ phải thông báo cho GV biết, kết thúc buổi thực hành mới thông báo thì không được chấp nhận hoặc bị trừ điểm.

 Chuẩn bị đầy đủ nguyên liệu cho buổi thực hành.

 Đọc kỹ phần hướng dẫn thực hành trước khi lên lớp.

 Viết báo cáo thực hành theo nội dung giảng viên yêu cầu.

 Sinh viên vắng mặt và không có tên trong bài báo cáo thí nghiệm sẽ không có điểm thực hành.

PHÂN BỐ THỜI GIAN VÀ ĐÁNH GIÁ HỌC PHẦN

1 Phân bố thời gian

Một tín chỉ thực hành 30 tiết bao gồm 2 bài (thực hành 1 ngày và 2 ngày liên tiếp từ 8h-18h) Bài 1: Chuẩn bị môi trường, phân lập và định lượng nấm men

Bài 2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên động học sinh trưởng của nấm men trong quá trình nuôi cấy mẻ

2 Đánh giá thực hành

Thang điểm đánh giá bài thực hành (0-10 điểm)

Điểm đánh giá: điểm trung bình cộng của tất cả các bài thực hành

3 Viết báo cáo thực hành

Bố cục bài báo cáo: giới thiệu bài thực hành, nguyên liệu, dụng cụ, trang thiết bị, nội dung thực hành, kết quả thực hành và trả lời câu hỏi

CÁC QUY TẮC AN TOÀN VÀ VỆ SINH TRONG PTN

(SV phải tuân thủ)

1 Mặc áo blouse và đeo bao tay trong thời gian thực hành.

2 Để ý quan sát và làm đúng theo hướng dẫn của giáo viên dạy thực hành

3 Trước và sau khi thao tác cần xịt cồn 70 vào tay và micropipet rồi lau sạch bằng khăn giấy Khi thực hiện thao tác này cần tránh xa ngọn lửa đèn cồn khi tay còn ướt Sau khi lau sạch không sờ tay vào bất cứ chỗ nào dơ

4 Khi lỡ tay làm đổ môi trường hoặc vsv, dùng khăn hay giấy tẩm cồn để lau sạch

5 Ghi chú tên chủng vsv và ngày tháng thí nghiệm lên các dụng cụ chứa môi trường & vsv

6 Khi sử dụng que cấy để cấy vsv cần phải nhúng đầu que cấy vào cốc chứa cồn 95 để rửa sạch rồi khử trùng bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn

7 Tất cả các chất thải và môi trường chứa hoặc nhiễm vsv cần được hấp khử trùng trước

khi đem đổ vào thùng rác Hộp petri sau khi nuôi cấy cần được loại bỏ thạch và vsv bằng

cách dùng thìa kim loại múc cho vào cốc thủy tinh, sau đó hộp petri, thìa kim loại và cốc thủy tinh được bọc bằng giấy nhôm hoặc giấy báo rồi đem đi khử trùng bằng nồi hấp Các dụng cụ nhiễm vsv cần được ngâm trong dung dịch sát khuẩn trước khi rửa

8 Không đổ thạch vào bồn rửa và ống thoát nước.

9 Sinh viên vi phạm một trong các điều trên sẽ bị ghi tên và trừ điểm vào bài thực hành

Bài 1: Chuẩn bị môi trường, phân lập và định lượng nấm men

1 Mục đích

- Chuẩn bị môi trường thạch đĩa để phân lập và môi trường thạch nghiêng để giữ giống

- Phân lập giống vi sinh vật thuần khiết (nấm men)

- Định lượng mẫu vi sinh vật thuần khiết

- Bảo quản mẫu vi sinh vật thuần khiết

2 Nguyên liệu, trang thiết bị, dụng cụ

3 Nội dung thực hành

 Mỗi buổi thực hành chia làm 2 nhóm, mỗi nhóm khoảng 12-13 SV

 Dụng cụ mỗi nhóm: 1 cốc thủy tinh 250 ml, 1 bình tam giác 250 ml, 2 ống nghiệm nút

bông, 6 ống nghiệm pha loãng, 3 đĩa petri, 1 cá từ, 2 nút bông cho 2 ống nghiệm

 Chuẩn bị giống vsv và môi trường

Mỗi nhóm cân 2 mẫu nấm men bánh mì, mỗi mẫu 0.02 g, 1 mẫu pha loãng phân lập nấm

men, 1 mẫu pha loãng đếm trực tiếp trên kính hiển vi

Nhóm 1 pha 100 ml dung dịch HCl 0.1N dùng chung cho vào chai đựng bằng thủy tinh và

600 ml cồn 70 cho vào bình phun sương và bình vòi Nhóm 2 pha 100 ml nước muối peptone dùng chung (SPW, saline peptone water)(8.5 g/l NaCl, 1.0 g/l peptone, 100 ml nước cất cho

vào cốc thủy tinh 250 ml và khuấy đều bằng cá từ trong 15 phút, sau đó cho vào 3 ống nghiệm

đem đi hấp khử trùng đánh số 1, 2, 3 theo thứ tự 4.98 ml (ứng với độ pha loãng 10-2), 4.95 ml

hấp khử trùng để pha loãng đếm nấm men đánh dấu 1b, 2b, 3b theo thứ tự 4.98 ml (ứng với

độ pha loãng 10-2), 4.95 ml (ứng với độ pha loãng 10-4), 4.5 ml (ứng với độ pha loãng 10-5) Phần nước muối peptone còn lại cho vào chai nhựa đựng nước muối đã rửa sạch Bọc đầu mỗi ống nghiệm đem đi hấp bằng 2 lớp giấy nhôm và bọc đầu mỗi ống nghiệm không đem đi hấp bằng 1 lớp giấy nhôm Cho 12 ml nước cất vào các ống nghiệm đổ thạch nghiêng, dùng bút marker đánh dấu mực nước trên ống nghiệm để đổ môi trường thạch nghiêng xong rồi đổ nước đi, gắn nút bông vào, bọc đầu ống nghiệm có nút bông bằng hai lớp giấy nhôm

Pha 150 ml môi trường thạch Hansen (nhóm 1 và nhóm 2): 50 g/l glucose, 10 g/l peptone,

3.0 g/l KH2PO4, 2.0 g/l MgSO4.7H2O, 24 g/l agar và 140 ml nước cất cho vào bình tam giác 250

ml Khuấy đều bằng cá từ ít nhất 15 phút, điều chỉnh pH 5 ở nhiệt độ phòng bằng HCl 0.1N.

Cho nước cất vừa đủ 150 ml, bọc đầu bình tam giác chứa môi trường bằng hai lớp giấy nhôm

 Tiệt trùng môi trường

Cho vào nồi hấp tiệt trùng 2 bình tam giác chứa môi trường thạch Hansen bọc đầu bằng giấy nhôm, 6 ống nghiệm chứa SPW bọc đầu bằng giấy nhôm, 4 ống nghiệm có nút bông bọc đầu bằng giấy nhôm, 6 đĩa petri bọc bằng giấy nhôm, 1 hộp chứa pipet tip màu xanh (100-1000 l)

trong 15 phút

 Chuẩn bị tủ cấy trước khi đổ môi trường và cấy vsv

Xịt cồn 70 vào trong buồng cấy và lau sạch buồng cấy, sau đó thắp hai đèn cồn (chứa cồn 96) để khử trùng buồng cấy ít nhất 30 phút

 Chuẩn bị môi trường thạch nghiêng và thạch hộp petri

Ghi tên nhóm và ngày làm TN lên ống nghiệm có nút bông và hộp petri, ghi đĩa đối chứng

và đĩa tỉ lệ pha loãng 10 -4 , 10 -5 lên hộp petri Lắc nhẹ và đổ môi trường còn ấm trong bình tam giác vào ống nghiệm có nút bông đã tiệt trùng bên ngọn lửa đèn cồn, đậy nút bông lại rồi để đầu ống nghiệm nằm trên mép khay melanin để nguội tạo môi trường thạch nghiêng Đổ môi trường thạch hộp petri: hé nắp hộp petri, đổ nhanh môi trường thạch còn ấm vào với độ dày môi trường khoảng 3 mm, đậy nắp hộp lại và để yên đến khi môi trường nguội và đông đặc lại

 Pha loãng và phân lập nấm men

bằng máy lắc ống nghiệm Cho 50 l dung dịch trong ống nghiệm 1 vào ống nghiệm 2 chứa

4.95 ml SPW rồi lắc đều (tỉ lệ pha loãng 10-4) Cho 500 l dung dịch trong ống nghiệm 2 vào

100 ml chứa cồn 95, hơ qua ngọn lửa để khử trùng, để đầu que trải nguội trong không gian vô

hộp môi trường thạch, dùng que trải xoay sang phải kết hợp xoay đĩa sang trái để trải đều dung

dịch lên bề mặt thạch Mỗi nhóm trải 1 đĩa petri 10 -4 , 1 đĩa petri 10 -5 , và một đĩa không trải

để đối chứng Bao đĩa petri bằng màng bọc thực phẩm Úp ngược các hộp petri để ở nhiệt độ

phòng trong 18-48 h Sau khi quan sát thấy các khuẩn lạc mọc trên thạch hộp petri, chọn 1

khuẩn lạc đơn có hình thái giống như nấm men để cấy chuyền sang các ống thạch nghiêng, ủ ở

nhiệt độ phòng (28-30C) trong 18-48 h cho lên các khuẩn lạc và giữ giống trong tủ mát ở 4C

 Định lượng nấm men

+ Đếm trực tiếp (tế bào/g hoặc tế bào/ml): mật độ vsv đơn bào có kích thước lớn như nấm

men có thể xác định trực tiếp bằng buồng đếm trên kính hiển vi

Nguyên tắc đếm trực tiếp bằng buồng đếm neubauer thủy tinh tráng bạc:

 Pha loãng huyền phù tế bào vsv (10 -4, 10-5 hoặc 10-6)

sao cho trong mỗi ô lớn 16 ô nhỏ chỉ từ 10 - 50 tế bào.

Nhỏ 2 giọt xanh methylen vào dung dịch đã pha loãng.

vuông lớn, mỗi ô vuông lớn chia thành 16 ô vuông nhỏ,

như vậy buồng đếm có tổng cộng có 400 ô vuông nhỏ Độ sâu của buồng đếm 0,1 mm Diện tích một ô lớn 0,04 mm2, thể tích ô lớn 0,004 mm3

giấy vệ sinh Lắc mạnh dịch huyền phù đã pha loãng, dùng micropipet để hút 20 l dịch

huyền phù đã pha loãng nhỏ vào buồng đếm, đậy lá kính Di chuyển nhẹ nhàng lá kính để

dịch huyền phù tràn đầy các khoang đếm, sau đó đưa lên kính hiển vi để đếm (dùng vật kính

4 để tìm buồng đếm sau đó chuyển sang vật kính 40 để đếm)

bào ở ranh giới giữa 2 ô lớn thì quy ước đếm các tế bào ở cạnh trên và bên trái ô đó Đếm

3~5 ô lớn rồi lấy số lượng trung bình Chụp ảnh nấm men có trong buồng đếm bằng camera Đếm số lượng tế bào chết là tế bào thấm màu xanh đậm của thuốc nhuộm.

Đếm ở vùng giữa buồng đếm có 25 ô lớn x 16 ô nhỏ

N: số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù A: số tế bào trung bình trong 1 ô lớn V: thể tích buồng đếm (0,1  10-6 ml) 25: số ô lớn trong buồng đếm

n: độ pha loãng mẫu

Từ đó tính ra tổng số tế bào và tỉ lệ tế bào sống/chết có trong 1 g mẫu men bánh mì (tế bào/g

mẫu) ban đầu.

+ Đếm khuẩn lạc (Colony Forming Unit-CFU): đếm tất cả số các khuẩn lạc xuất hiện trên

các đĩa sau khi ủ Chọn các đĩa có số đếm từ 25 đến 250 để tính kết quả Tính số lượng tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 g hay 1 ml cơ chất ban đầu tạo dịch huyền phù:

N = A : V : D f (CFU/ml)

A: số CFU trung bình trên mỗi đĩa petri ở độ pha loãng nhất định V: thể tích mẫu cấy trên mỗi đĩa petri

Df: độ pha loãng mẫu

Từ đó tính ra số tế bào có trong 1 g mẫu men bánh mì (tế bào/g mẫu) ban đầu.

45 CFU/đĩa petri N = (45/0,05)/10-6 = 9  108 (CFU/ml)

Đếm số tế bào trong 5 ô khoanh tròn nằm trong ô này: a + b + c + d + e

Nếu ở độ pha loãng cao nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa >250, ví dụ ở nồng độ 10-5 số đếm lớn hơn 250, kết quả được ghi >2,5 × 107 CFU/g

Nếu ở độ pha loãng thấp nhất, số khuẩn lạc đếm được trên 1 đĩa <25, ví dụ ở nồng độ 10-1 số đếm nhỏ hơn 25, kết quả được ghi <2,5 × 102 CFU/g

4 Yêu cầu viết báo cáo

- Chụp ảnh ống thạch nghiêng và đĩa petri sau khi phân lập và ủ cho mọc khuẩn lạc (2đ)

- Mô tả hình thái của khuẩn lạc nấm men bánh mì phân lập được và xác định tên chủng nấm men (1đ)

- Tính nồng độ tế bào nấm men và tỉ lệ tế bào sống có trong men bánh mì bằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi và đếm khuẩn lạc (2đ)

5 Câu hỏi

- Nêu ưu, nhược điểm của phương pháp đếm tế bào vsv bằng cách dùng buồng đếm trên kính hiển vi và phương pháp đếm khuẩn lạc (1đ)

Bài 2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên động học sinh

trưởng của nấm men trong quá trình nuôi cấy mẻ

1 Mục đích

- Vẽ đồ thị động học sinh trưởng của nấm men theo thời gian nuôi cấy mẻ ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau

- Xác định tỉ lệ tăng trưởng của nấm men trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau

- Đo độ đục OD (optical density) và đếm tổng số tế bào trong môi trường nuôi cấy, lập mối liên hệ giữa OD và tổng số tế bào đếm được

Hình: Đường cong sinh trưởng của nấm men

2 Nguyên liệu, dụng cụ, trang thiết bị

MgSO4.7H2O Cốc thủy tinh 250 ml, 1000 ml

3 Nội dung thực hành

 Mỗi buổi thực hành chia làm 2 nhóm, mỗi nhóm khoảng 12-13 SV

 Dụng cụ cho mỗi nhóm: 1 cốc thủy tinh 250 ml, 2 bình tam giác 250 ml có nút bông, 1 cá

từ , 2 cuvet 1.5 ml bằng nhựa

 Chuẩn bị môi trường lỏng để nhân giống nấm men

Nhóm 1: Pha 100 ml môi trường Hansen lỏng: 50 g/l glucose, 10 g/l peptone, 3.0 g/l

KH2PO4, 2.0 g/l MgSO4.7H2O và 90 ml nước cất cho vào cốc thủy tinh 250 ml Khuấy đều bằng

cá từ, điều chỉnh pH 5 ớ nhiệt độ phòng bằng HCl 0.1N Cho nước cất vừa đủ 100 ml rồi chia

vào 2 bình tam giác 250 ml mỗi bình 50 ml Gắn nút bông và bọc đầu bình tam giác chứa môi

trường bằng giấy nhôm, tiệt trùng ở 121C trong 15 phút

Nhóm 2: Pha nước chiết giá đậu Cân 200g giá đậu, cắt nhỏ, cho 150 ml nước vào đun sôi

nhỏ lửa 30 phút Lọc lấy dịch trong, để nguội, điều chỉnh pH 5, bổ sung nước cất đến 1000 ml Pha 100ml nước chiết giá đậu có bổ sung đường cát (saccharose) 160 g/l, chia vào 2 bình tam

giác 250 ml mỗi bình 50 ml Gắn nút bông và bọc đầu bình tam giác chứa môi trường bằng

giấy nhôm, tiệt trùng ở 121C trong 15 phút

 Cấy nấm men giống vào môi trường và nhân giống cấp 1

đầu que cấy trên ngọn lửa đèn cồn Để nguội đầu que cấy trong vùng vô trùng trong tủ cấy, dùng

đầu que cấy lấy 1~2 khuẩn lạc nấm men phân lập trên đĩa petri cho vào 50 ml môi trường lỏng

tiệt trùng (môi trường Hansen, môi trường dịch chiết giá đậu) trong bình tam giác, lắc đều

 Khảo sát động học sinh trưởng của nấm men

Nhân giống nấm men trong các bình tam giác ở nhiệt độ phòng kết hợp với lắc khoảng 1

phút với chu kỳ 5 phút lắc 1 lần Chụp ảnh môi trường trong hai bình tam giác trước khi lấy

môi trường đo OD và đếm nấm men Dùng micropipet hút 1.2 ml môi trường trong 2 bình tam giác trước khi cấy nấm men (0 h) và sau khi cấy nấm men 2 h, 4 h, 6 h, 23 h, 25 h cho vào cuvet, đo OD (optical density) ở bước sóng 600 nm rồi đổ môi trường trong cuvet vào ống

nghiệm, cho xanh methylen vào rồi đếm số lượng nấm men có trong môi trường bằng buồng

đếm trên kính hiển vi Nếu số lượng nấm men trong mẫu trên buồng đếm quá nhiều có thể

pha loãng mẫu với tỉ lệ thích hợp rồi đếm lại

4 Yêu cầu viết báo cáo

- Vẽ đồ thị động học sinh trưởng của nấm men theo thời gian nuôi cấy mẻ ở các môi trường dinh dưỡng khác nhau (2đ)

- Thiết lập mối liên hệ giữa OD và số lượng tế bào nấm men theo thời gian nhân giống (2đ)

- Tính tỉ lệ tăng trưởng của nấm men (0.5đ)

- So sánh và giải thích đồ thị (0.5đ)

5 Câu hỏi

- Nêu các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm men trong quá trình nuôi cấy mẻ (1đ)