Nghiên cứu cố định nấm men saccharomyces cerevisiae trên mía và thử khả năng lên men dịch đường mía

Hiện tại, để nâng cao sản lượng ethanol sản xuất từ các nguồn nguyên liệu quen thuộc như tinh bột và đường, một phương pháp được quan tâm là sử dụng nấm men cố định.. Có nhiều giá thể đã

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU CỐ ĐỊNH NẤM MEN

SACCHAROMYCES CEREVISIAE TRÊN MÍA VÀ THỬ

KHẢ NĂNG LÊN MEN DỊCH ĐƯỜNG MÍA

SVTH : PHAN THỊ TƯỜNG VI MSSV : 60602963

TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh đặc biệt là các thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình chỉ dạy cho em kiến thức cũng như phương pháp luận trong suốt 4 năm qua Sự chỉ dạy tận tình của thầy cô là nền tảng cho em trong quá trình làm luận văn này

Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS TS Nguyễn Đức Lượng, chủ nhiệm bộ môn công nghệ sinh học Thầy đã tận tình giúp đỡ và hướng dẫn em trong suốt quá trình làm luận văn

Em cũng xin chân thành cảm ơn thầy Huỳnh Nguyễn Anh Khoa, phụ trách phòng thí nghiệm 117B2 Thầy đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng em trong suốt quá trình thí nghiệm Đây là một sự giúp đỡ rất lớn để em hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình cũng như bạn bè đã ủng hộ không chỉ tinh thần mà còn cả vật chất cho em trong suốt quá trình học đặc biệt trong thời gian làm luận văn tốt nghiệp

Chúc quý thầy cô và các bạn nhiều sức khỏe, tiếp tục gặt hái nhiều thành công trong sự nghiệp!

TP Hồ Chí Minh, ngày 14 tháng 01 năm 2011

Phan Thị Tường Vi

TÓM TẮT

Việc gia tăng giá xăng dầu trong thời gian qua do những bất ổn về chính trị cũng như sự cạn kiệt của nhiên liệu hóa thạch đang thôi thúc các nhà khoa học tìm ra một nguồn nhiên liệu thay thế phù hợp mà ít ảnh hưởng đến môi trường hơn so với nhiên liệu hóa thạch Ethanol sinh học là một nguồn nhiên liệu đầy hứa hẹn trong tương lai Ethanol sinh học đang được sản xuất ngày càng nhiều trên thế giới không những từ nguồn nguyên liệu giàu tinh bột hay đường mà đang trong quá trình nghiên cứu tận dụng nguồn nguyên liệu lignocellulose Tuy nhiên, để có được quá trình sản xuất ethanol từ nguyên liệu lignocellulose hiệu quả và kinh tế thì cần thêm nhiều thời gian để nghiên cứu Hiện tại, để nâng cao sản lượng ethanol sản xuất từ các nguồn nguyên liệu quen thuộc như tinh bột và đường, một phương pháp được quan tâm là sử dụng nấm men cố định

Luận văn tốt nghiệp này tập trung vào quá trình nghiên cứu cố định nấm men

Saccharomyces cerevisiae trên mía và thử nghiệm lên men dịch đường mía Nấm men cố

định trên mía ở điều kiện lắc 100 vòng/phút, trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng cho mật độ tế bào cố định khoảng 2.11 107 tế bào/g mía Quá trình lên men dịch đường mía bằng chế phẩm nấm men cố định này cho kết quả lên men tốt nhất ở Brix 20%, tỷ lệ giống 10% (10g/100ml dịch lên men) và pH 4 sau 4 ngày lên men trong điều kiện tĩnh ở nhiệt độ phòng Chế phẩm cố định vẫn cho kết quả lên men tốt sau 6 chu kỳ lên men Cần nghiên

cứu thêm về khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định

MỤC LỤC

MỤC LỤC ii

DANH MỤC BẢNG iv

DANH MỤC ĐỒ THỊ v

DANH MỤC HÌNH vi

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 2

1.2 Nội dung đề tài 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 4

2.1 Công nghệ sản xuất cồn từ dịch đường mía 5

2.2 Phương pháp cố định tế bào 8

2.2.1 Một số kỹ thuật cố định tế bào 8

2.2.2 Yêu cầu đối với chất mang 11

2.2.3 Tác động của kỹ thuật cố định đến tế bào 11

2.3 Giá thể mía 13

2.3.1 Cellulose 14

2.3.2 Hemicellulose 15

2.3.3 Lignin 16

2.3.4 19

2.4 Ứng dụng phương pháp cố định tế bào trong sản xuất bioethanol 19

2.5 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol trên thế giới và trong nước 24

2.5.1 Tình hình sản xuất bioethanol trên thế giới 24

2.5.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol trong nước 25

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 28

3.1.2 Dụng cụ 29

3.2 Phương pháp nghiên cứu 29

3.2.1 Phương pháp tiến hành thí nghiệm 29

3.2.2 Phương pháp vi sinh vật 31

3.2.3 Phương pháp hóa lý 34

3.2.4 Các công thức tính 35

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 37

4.1 Đường chuẩn và đường cong sinh trưởng của nấm men 38

4.1.1 Đường chuẩn của nấm men 38

4.1.2 Đường cong sinh trưởng của nấm men 38

4.1.3 Đường chuẩn đường tổng 40

4.2 Kết quả cố định 41

4.2.1 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng cố định 41

4.2.2 Ảnh hưởng của chế độ lắc đến khả năng cố định 43

4.3 Kết quả khảo sát quá trình lên men nước mía bằng nấm men cố định 44

4.3.1 Ảnh hưởng đến thời gian lên men 44

4.3.2 Ảnh hưởng của độ Brix 46

4.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống 48

4.3.4 Ảnh hưởng của pH 49

4.4 Số lần tái sử dụng nấm men cố định 51

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4 1: Kết quả lập đường chuẩn nấm men 38

Bảng 4 2: Kết quả lập đường cong sinh trưởng của nấm men 38

Bảng 4 3: Kết quả lập đường chuẩn đường tổng 40

Bảng 4 4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng cố định 41

Bảng 4 5: Kết quả ảnh hưởng của chế độ lắc đến khả năng cố định 43

Bảng 4 6: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khả năng lên men 44

Bảng 4 7: Kết quả ảnh hưởng của độ Brix đến khả năng lên men 46

Bảng 4 8: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng lên men 48

Bảng 4 9: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến khả năng lên men 49

Bảng 4 10: Kết quả khảo sát số chu kỳ sử dụng chế phẩm cố định 51

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4 1: Đường chuẩn nấm men 38

Đồ thị 4 2: Đường cong sinh trưởng của nấm men 39

Đồ thị 4 3: Đường chuẩn đường tổng 40

Đồ thị 4 4: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng cố định 41

Đồ thị 4 5: Ảnh hưởng của chế độ lắc đến khả năng cố định 43

Đồ thị 4 6: Ảnh hưởng của thời gian lên men 45

Đồ thị 4 7: Ảnh hưởng của độ Brix đến khả năng lên men 47

Đồ thị 4 8: Ảnh hưởng của tỷ lệ giống đến khả năng lên men 48

Đồ thị 4 9: Ảnh hưởng của pH đến khả năng lên men 50

Đồ thị 4 10: Kết quả tái sử dụng chế phẩm nấm men cố định 51

DANH MỤC HÌNH

Hình 2 1: Con đường Embden-Meyerhoff- Parnas glycolytic của Saccharomyces

cerevisiae 6

Hình 2 2: Các phương pháp cố định cơ bản 9

Hình 2 3: Cấu trúc lignocellulose 13

Hình 2 4: Cấu trúc cellulose 15

Hình 2 5: Cấu trúc của hemicellulose 16

Hình 2 6: Ba tiền chất phenyl - propane của lignin 17

Hình 2 7: Cấu trúc lignin 18

Hình 2 8: Hình chụp mía dưới kính hiển vi điện tử quét 20

Hình 2 9: Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét phần giữa của giá thể mía sau cố định 21

Hình 2 10: Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét của bề mặt giá thể trong quá trình lên men 22

Hình 2 11: Các nước sản xuất bioethanol chủ yếu trên thế giới 24

Hình 3 1: Mía sau khi tiền xử lý 28

Hình 3 2: Khuẩn lạc nấm men Saccharomyces cerevisiae trên môi trường Hansen 29

Hình 3 3: Sơ đồ quá trình thí nghiệm 31

Hình 4 1: Chế phẩm mía cố định nấm men S.cerevisiae sau 6 chu kỳ lên men 52

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Khi nào dầu cạn kiệt? Nhiều ước đoán khác nhau cho rằng điều đó sẽ xảy ra bất cứ khi nào trong vòng 20 năm đến hơn một thế kỷ Sự giảm sút nhanh của năng lượng hóa thạch thúc đẩy sự phát triển của năng lượng hạt nhân, nhiên liệu tế bào và năng lượng mặt trời Nhưng cái gì có thể thay thế cho xăng dầu dùng trong các động cơ đốt trong của các phương tiện giao thông trên thế giới Và cái gì sẽ đại diện cho dầu hóa học như là nền tảng cho sự mở rộng tổng hợp cái trở nên không thể thiếu trong thế kỷ thứ 20 Đó chính là nhiên liệu sinh học

Thử nghiệm sản xuất nhiên liệu sinh học hiện đại và kinh tế đầu tiên được Brazil tiến hành dùng glucose (như sucrose) hiện diện trong mía đường cung cấp nguồn vật liệu lên men sẵn có Mỹ là quốc gia sản xuất ethanol đứng thứ hai thế giới chủ yếu sản xuất ethanol từ bắp (ngô) Hiện nay, các nhà khoa học đang mở rộng nghiên cứu sản xuất ethanol sinh học từ các nguồn nguyên liệu lignocellulose vì tính sẵn có với trữ lượng lớn

và rẻ tiền của chúng Đây là một hướng đi đầy hứa hẹn trong tương lai Tuy nhiên, sản xuất ethanol sinh học từ vật liệu lignocellulose còn nhiều hạn chế cần phải khắc phục như hiệu suất lên men thấp, tiêu tốn nhiều năng lượng để xử lý nguyên liệu, lượng ethanol tạo

ra thấp…Hướng đi này cần thêm nhiều nghiên cứu để đưa vào sản xuất ở qui mô lớn trong tương lai

Hiện tại, để nâng cao hiệu suất lên men và giảm chi phí cho quá trình sản xuất ethanol sinh học, chúng ta cần tập trung vào cải thiện các quá trình sẵn có Một trong những phương pháp được chú ý nhiều là sử dụng nấm men cố định trong lên men Nấm men cố định có hiệu suất lên men cao, có khả năng chịu được nồng độ cơ chất cao, lên men được trong điều kiện pH thấp và thời gian lên men ngắn là những ưu điểm nổi bật

Có nhiều giá thể đã được nghiên cứu để ứng dụng trong sản xuất ethanol như alginate, mạt cưa, dăm bào, vỏ cam, bã mía, mía…Trong số đó, mía là một cơ chất rẻ tiền, sẵn có

và có nhiều triển vọng đặc biệt trong việc ứng dụng lên men dịch đường và mật rỉ đường

Với cấu trúc cellulose, mía có khả năng thu hút được nấm men hấp phụ lên bề mặt Cấu trúc mao mạch với lượng đường sẵn có trong mía có thể cung cấp cho nấm men tăng sinh và phát triển sâu bên trong cấu trúc giá thể Cấu trúc chắc chắn của mía, giúp chế phẩm mía cố định có thể được tái sử dụng nhiều lần và chịu được những tác động trong

lợi Việc ứng dụng chế phẩm mía cố định trong sản xuất ethanol sinh học từ dịch đường

là hoàn toàn có thể thực hiện và giúp tăng năng suất lên men

1.2 Nội dung đề tài

Đề tài “Nghiên cứu cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên mía và thử

nghiệm khả năng lên men dịch đường mía” tập trung vào việc khảo sát các yếu tố ảnh

hưởng đến quá trình cố định nấm men Saccharomyces cerevisiae trên mía, cũng như quá

trình lên men dịch đường mía bằng chế phẩm nấm men cố định được ở trên Các yếu tố như thời gian và chế độ lắc là hai yếu tố được quan tâm khi cố định nấm men trên mía bằng phương pháp hấp phụ và tăng sinh Mía đã cố định nấm men được thử nghiệm sản xuất ethanol từ dịch đường mía Tiến hành khảo sát các yếu tố thời gian lên men, độ Brix,

tỷ lệ giống và pH để tối ưu các yếu tố này trong quá trình lên men bằng chế phẩm nấm men cố định Đồng thời kiểm tra khả năng tái sử dụng của chế phẩm nấm men cố định trên mía ứng dụng trong lên men dịch đường mía

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN LÝ THUYẾT

2.1 Công nghệ sản xuất cồn từ dịch đường mía

Mía đường (Saccharum officinarum) là cây chịu hạn nhiệt đới và cận nhiệt đới chứa

12 -17% tổng đường trên khối lượng ướt với 68-72% độ ẩm (90% sucrose và 10% glucose hoặc fructose) Hiệu suất chiết tách trung bình để sản xuất dịch đường mía bởi ép lên đến 95% và phần bã rắn còn lại là xơ mía (bã mía) [4, 7,21]

Hình 2 1: Con đường Embden-Meyerhoff- Parnas glycolytic của Saccharomyces cerevisiae [20]

Dịch đường mía thông thường chứa đủ các chất dinh dưỡng hữu cơ và khoáng chất

thích hợp cho sản xuất ethanol bằng con đường lên men bởi Saccharomyces cerevisiae

Các phản ứng biến đổi sucrose trong dịch đường mía được thực hiện bởi tổ hợp enzyme thủy phân có sẵn trong nấm men theo con đường lên men đường đơn Đầu tiên, enzyme

enzyme xúc tác phản ứng chuyển glucose và fructose thành ethanol và CO2 Theo lý thuyết, một tấn đường hexose (glucose hoặc fructose) sản xuất ra 511 kg ethanol Tuy nhiên, hiệu suất lên men thực tế chỉ đạt được khoảng 92% giá trị lý thuyết này [3, 6] Trong những nhà máy chỉ sản xuất ethanol, nước mía được gia nhiệt lên đến 110oC

để loại bỏ vi sinh vật, lọc, đôi lúc cô đặc bằng bay hơi và sau đó lên men Trong những kết hoạch kết hợp sản xuất đường-ethanol (thêm chưng cất), tinh thể sucrose được hình thành sau khi cô đặc dịch đường mía được loại ra bằng ly tâm, phần dịch còn lại (mật rỉ) chứa đến 65% khối lượng đường Cả dịch đường mía và mật rỉ đường (sau khi chỉnh nồng

đồ đường) thường chứa những khoáng chất và chất dinh dưỡng hữu cơ thích hợp cho sản

xuất ethanol bằng lên men bởi Saccharomyces cerevisiae [4]

Ở Brazil, 70% nhà máy sản xuất ethanol từ mía đường dùng quá trình lên men theo chu kỳ với khả năng lên men lên đến 1.5 triệu lít ethanol/ngày Một quá trình lên men liên tục tương tự cũng được dùng trong khoảng 350 nhà máy chưng cất, cái gần đây nhất được xây dựng năm 1995 Trong cả quá trình, nấm men được phân tách khỏi môi trường lên men bằng phương pháp ly tâm và tái sử dụng trong quá trình lên men tiếp theo sau khi được rửa bằng acid sulphuric loãng để loại vi khuẩn tạp nhiễm Mật độ tế bào cao (8-17%v/v) và nhiệt độ 33-35oC góp phần làm giảm sự phát triển của tạp nhiễm đồng thời cho nồng độ ethanol cao (8-11% v/v) và sản lượng ethanol cao (90-92%) Thời gian lên men ngắn (6-10 giờ) cho phép nấm men xoay vòng 3 lần một ngày trong khoảng 200 ngày Sự nhiễm vi khuẩn có thể xuất hiện nhưng bị hạn chế bởi kháng sinh Một ưu điểm của các nhà máy chưng cất là hoàn toàn tự động

Cuối cùng, dịch sau lên men được chưng cất, sản xuất hỗn hợp ethanol và nước ở nồng độ 95.5% v/v Để sản xuất ethanol khan, nước được loại bỏ bằng phương pháp đề hydrate carbohydrate; hoặc gần đây, với sàn kích thước phân tử để hấp thụ nước Phần loại bỏ sau chưng cất gọi là stillage (hoặc vinasse ở Brazil) gấp 10 – 15 lần thể tích ethanol sản xuất được Trong các nhà máy chưng cất mía đường, tất cả vinasse được dùng như là phân bón và trong tưới tiêu Nhiều nhà máy chưng cất của người Brazil loại bỏ phần nấm men từ quá trình lên men như là nấm men khô cho thức ăn gia súc Bằng cách này, họ tận dụng được nguồn carbohydrate dự trữ trong nấm men (glycogen và trehalose) cũng như lượng protein của nấm men đó Do đó, có thể làm tăng giá trị thương mại lên nếu lượng protein trong nấm men cao hơn 40% khối lượng [4]

Brazil và Ấn Độ là hai quốc gia đứng đầu thế giới về sản xuất bioethanol từ mía đường Năm 2005, Brazil sản xuất được 16 tỉ lít ethanol nhiên liệu, 2 tỉ lít được xuất khẩu

Ấn Độ sản xuất được khoảng 300 triệu lít ethanol nhiên liệu chủ yếu từ mật rỉ đường Bên cạnh đó, các quốc gia như Trung Quốc, Thái Lan, Guatemala, Cuba, El Salvador cũng đang xúc tiến nhiều dự án phát triển ethanol nhiên liệu từ mía đường Do điều kiện thổ nhưỡng và khí hậu thích hợp, mía đường trở thành nguồn nguyên liệu sẵn có và rẻ tiền ở các quốc gia này, hứa hẹn nhiều tiềm năng trong việc sản xuất ethanol sinh học giá rẻ không những từ dịch đường mía, mật rỉ mà còn từ bã mía [6]

2.2 Phương pháp cố định tế bào

2.2.1 Một số kỹ thuật cố định tế bào

Kỹ thuật cố định tế bào được định nghĩa là “sự giam cầm vật lý hoặc sự hạn chế vị trí của tế bào nguyên vẹn trong vùng không gian nhất định mà vẫn giữ được toàn bộ các hoạt tính của tế bào đó” Sự cố định tế bào thường bắt chước điều xảy ra trong tự nhiên khi những tế bào phát triển trên bề mặt hoặc trong cấu trúc tự nhiên của các cơ chất Nhiều vi sinh vật có khả năng bám vào nhiều loại bề mặt tự nhiên khác nhau

Nhiều quá trình sinh học trở nên thuận lợi bởi kỹ thuật cố định Do đó, nhiều kỹ thuật cố định và giá thể được đề xuất Những kỹ thuật này có thể được chia thành 4 nhóm chính dựa trên đặc tính vật lý của kỹ thuật như: hấp phụ lên bề mặt chất mang rắn, nhốt trong cơ chất xốp, sự tự kết hợp bởi kết bông hoặc bởi tác nhân liên kết ngang và sự giới hạn tế bào bởi các vật cản

Hình 2 2: Các phương pháp cố định cơ bản [25]

Sự cố định tế bào lên chất mang rắn được tiến hành bởi hấp thụ vật lý do lực tĩnh điện hoặc bằng liên kết đồng hóa trị giữa màng tế bào và chất mang Độ dày của lớp màng tế bào thường trong khoảng một lớp của tế bào đến 1mm hoặc hơn Hệ thống dùng tế bào cố định trên bề mặt khá phổ biến do tương đối dễ tiến hành cố định theo cách này Sức bền của những tế bào được gắn với chất mang cũng như độ dày của lớp màng sinh học thường khác nhau và không dễ xác định Không có vật cản giữa tế bào và dung dịch, sự tách rời và tái phân bố tế bào có thể xảy ra với khả năng thành lập trạng thái cân bằng giữa tế bào hấp phụ và tế bào tự do trong huyền phù Những cơ chất rắn dùng trong kiểu cố định này là vật liệu cellulose (DEAE-cellulose,

gỗ, mùn cưa, mùn cưa đề lignin), vật liệu vô cơ (polygorskite, montmorilonite, hydromica, đồ sứ xốp, thủy tinh xốp)… Những vật liệu rắn như thủy tinh hoặc cellulose có thể được xử lý với nhiều cation, chitosan hoặc những hóa chất khác (tiền tạo thành chất mang) để gia tăng khả năng hấp phụ của chúng

Trong kiểu cố định bằng cách nhốt tế bào trong cơ chất xốp, những tế bào thâm nhập vào cơ chất xốp cho đến khi tính lưu động của chúng bị cản trở bởi sự hiện diện của những tế bào khác, hoặc vật liệu xốp được hình thành trong quá trình nuôi tế bào Phương pháp này dựa trên cả tế bào với mạng lưới cứng nhắc để ngăn cản tế bào khuếch tán ra môi trường xung quanh, trong khi vẫn cho phép chất dinh dưỡng và chất chuyển hóa di chuyển Ví dụ đặc trưng của loại cố định này là nhốt trong gel polysaccharide như alginate, -carrageenan, agar, chitosan và polygalacturonic acid hoặc những cơ chất khác như gelatin, collagen và polyvinyl alcohol Sự phát triển của

tế bào trong cơ chất xốp dựa vào giới hạn khuếch tán qui định bởi độ xốp của vật liệu

và sau đó là bởi sự va chạm của sinh khối tích tụ Một trong những vấn đề của việc nhốt tế bào trong cơ chất xốp như gel polysaccharide là khả năng tế bào định vị trên

bề mặt ngoài của hạt để nhân lên và giải phóng khỏi hạt Điều này dẫn đến một hệ thống bao gồm tế bào cố định và tự do Để tránh vấn đề này, hai lớp hạt được phát triển khi hạt hydrogel với một nhân trong chứa tế bào và một lớp ngoài ngăn tế bào từ nhân thoát ra

Sự kết bông tế bào được định nghĩa như một sự kết hợp của những tế bào tạo thành một đơn vị lớn hơn hoặc thuộc tính của tế bào trong huyền phù để dính chặt thành cục và lắng nhanh Sự kết bông có thể được coi như một kỹ thuật cố định khi kích thước của khối kết có khả năng sử dụng trong thiết bị phản ứng như thiết bị nhồi, tầng sôi và thiết bị phản ứng quay liên tục Khả năng hình thành khối kết được quan sát chính với mốc, nấm sợi và tế bào thực vật Tuy nhiên những tác nhân kết bông nhân tạo hoặc cầu nối ngang có thể được dùng để tăng sự kết hợp trong tế bào nuôi cấy cái không kết bông tự nhiên Sự kết bông của nấm men là đặc điểm quan trọng chính trong công nghiệp bia vì nó tác động đến khả năng lên men và chất lượng bia trong việc loại bỏ và thu hồi nấm men Điều này bị tác động bởi nhiều nhân tố như thành phần cấu tạo vách tế bào, pH, oxygen hòa tan và thành phần môi trường Sự ngăn chặn cơ học sau các vật cản

Sự giới hạn tế bào bởi các vật cản có thể đạt được bằng cách dùng màng lọc vi sinh xốp hoặc bởi sự nhốt tế bào trong vi vỏ hoặc bởi sự cố định tế bào lên bề mặt tương tác của hai dung dịch không hòa tan vào nhau Kiểu cố định này thì lý tưởng khi

tế bào tự do sản xuất và vận chuyển các hợp chất nhỏ Kỹ thuật bioreactor màng được dùng rộng rãi trong xoay vòng tế bào và quá trình liên tục Nhược điểm chính của sự

cố định tế bào giữa màng vi sinh xốp là giới hạn vận chuyển sinh khối và khả năng tắc nghẽn màng do sự phát triển của tế bào [19, 25]

2.2.2 Yêu cầu đối với chất mang

Một chất mang thích hợp để cố định tế bào phải thỏa mãn những yêu cầu sau:

- Chất mang có diện tích bề mặt lớn với những nhóm chức năng để tế bào đính vào

- Chất mang phải dễ sử dụng và phục hồi

- Khả năng tồn tại của tế bào và hoạt tính ổn định của xúc tác cố định phải cao và được duy trì trong thời gian dài

- Hoạt tính sinh học của tế bào cố định không bị tác động bất lợi bởi quá trình cố định

- Độ xốp của chất mang cần đồng đều và có thể kiểm soát, cho phép sự trao đổi của cơ chất tự do, sản phẩm, cofactor và khí

- Chất mang duy trì tính bền vững cơ, hóa, nhiệt và sinh học tốt; không dễ bị phá hủy bởi enzyme, dung môi, sự thay đổi áp suất hoặc lực kéo lớn

- Chất mang và kỹ thuật cố định nên dễ thực hiện, chi phí hiệu quả và dễ mở rộng [25]

2.2.3 Tác động của kỹ thuật cố định đến tế bào

Sự thay đổi trong sự phát triển tế bào, hoạt tính sinh lý và chuyển hóa có thể gây ra bởi quá trình cố định cho cả nấm men và vi khuẩn Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tìm hiểu những nguyên nhân làm thay đổi đặc tính chuyển hóa của tế bào

cố định Và người ta nhận thấy rằng khó để tiên đoán loại và độ lớn của những thay đổi chuyển hóa có thể xảy ra trong suốt quá trình cố định Một số yếu tố được cho là nguyên nhân cho những thay đổi này, chẳng hạn như giới hạn vận chuyển sinh khối bởi sự rườm rà, sự xáo trộn trong con đường phát triển, sự căng bề mặt do tác động của áp suất thẩm thấu, sự giảm hoạt độ của nước, sự liên lạc giữa tế bào với tế bào, sự

thay đổi trong hình thái học tế bào, sự thay đổi tính thấm của màng tế bào và thành phần môi trường có sẵn

So sánh những báo cáo của các nghiên cứu về tế bào cố định và tự do cho thấy

có những tác động lên sự hoạt hóa năng lượng chuyển hóa của nấm men, gia tăng hấp thụ cơ chất và sản xuất sản phẩm, sản lượng phụ phẩm lên men thấp, giá trị pH nội bào của nấm men cố định cao hơn, sự gia tăng tính chống chịu những chất độc và chất

ức chế và gia tăng hoạt tính chuyển đổi Trong số những tác động này, những tác động nổi bật nhất như tác động lên sự phát triển sinh lý, tác động lên sự trao đổi chất, tác động lên khả năng chống chịu

Tác động lên sự phát triển sinh lý trong quá trình cố định là do thuộc tính thiếu không gian để phát triển trong cơ chất Tế bào cố định có khả năng sống sót và duy trì được hoạt tính khi giữ ở nhiệt độ thấp trong một thời gian dài.Melzoch và cộng sự

(1994) thu được những hình thái và hình dạng khác nhau giữa tế bào Saccharomyces

cerevisiae tự do và cố định trên alginate Khi lên men dùng S.cerevisiae cố định trên

hạt gel calcium alginate trong bioreactor nhồi hay tầng sôi, tế bào cho đáp ứng phát triển thay đổi so với tế bào tự do; đặc điểm đáng chú ý là giảm mức độ phát triển khi

có sự cân xứng của nấm men gia tăng trong hạt gel Sự hấp phụ nấm men lên những

bề mặt rắn khác nhau cũng được cho là tác động đến mức độ phát triển của tế bào

Tế bào cố định thường chịu tác động lên sự trao đổi chất mà thấy rõ nhất là ở các điều kiện hoạt động tối ưu của tế bào Buzas và cộng sự (1989) cho rằng pH tối ưu

cho lên men khi dùng S.cerevisiae tự do là 4, trong khi khả năng lên men của tế bào cố

định trong alginate thì độc lập với pH Sự định lượng pH nội bào trong tế bào

S.cerevisiae tự do và cố định trên alginate lần lượt là 6.9 và 6.8 Sự giảm giá trị pH nội

bào trong tế bào nấm men cố định là do sự gia tăng hoạt tính của enzyme và vì vậy khả năng sản xuất tăng Sự giảm pH nội bào được cho là để tăng tính thấm của màn nguyên sinh chất với proton, dẫn đến tiêu thụ ATP cao hơn làm gia tăng hoạt tính

glucolytic và hấp thụ glucose Sự hấp thụ của S.carlsbergensis lên hạt thủy tinh xốp

làm gia tăng sản lượng của ethanol từ glucose và làm giảm lượng CO2 Những quan

sát tương tự được báo cáo với S.cerevisiae cố định trên ceramics Tế bào S.cerevisiae

nhốt trong gelatine cũng cho nồng độ polysaccharide, DNA và RNA cao hơn khi so sánh với tế bào tự do

Quá trình cố định cải thiện đáng kể đến khả năng chống chịu stress của tế bào

vi sinh vật Nấm men cố định có khả năng chịu được nồng độ cơ chất và ethanol cao hơn nấm men tự do Bên cạnh đó, nấm men cố định cũng chịu được pH thấp và có khả năng chống chịu với những thay đổi về nhiệt độ tốt hơn nấm men tự do [19, 25]

2.3 Giá thể mía

Thân mía chứa chủ yếu là nước, đường (sucrose và glucose hoặc fructose) và thành phần lignocellulose (hay còn gọi là bã mía) Trong đó phần lignocellulose đóng vai trò chính trong việc cố định nấm men lên giá thể mía

25% lignin Trong tế bào thực vật, bao gồm cả bã mía, có một bức tường thứ hai gồm có 3 lớp ( S1 S2, S3) được bao quanh bởi lignin Các lớp S1, S3 chứa chủ yếu là cellulose và hemicellulose vô định hình Lớp S2 chứa cellulose kết tinh Vùng kết tinh được dịnh dạng bởi liên kết hydrogen theo một sự sắp xếp có thứ tự Tuy nhiên, các vùng vô định hình cũng tồn tại trong cellulose Cellulose, hemicellulose, lignin hiện diện giữa 3 lớp S1, S2, S3 [26] Sự minh hoạ cho cấu trúc thành tế bào với sự sắp xếp các thành phần của nó sẽ được thể hiện qua hình sau:

Hình 2 3: Cấu trúc lignocellulose Lớp S1 và S3 chứa hemicellulose và cellulose vô định hình

Lớp S2 chứa các vùng cellulose kết tinh [26]

2.3.1 Cellulose

Cellulose là một loại polysaccharide được tạo thành bởi nhiều phân tử đường

Số lượng phân tử đường lặp lại được gọi là mức độ polymer hoá (DP) Cellulose của

gỗ mềm tự nhiên và của các thớ gỗ làm giấy có DP lần lượt là 3500 và 600-1500 DP = Khối lượng phân tử cellulose/khối lượng phân tử của một phân tử đường [17]

Cellulose chiếm khoảng một nửa khối lượng của thực vật (Klass, 1998) Cotton thì chứa hầu hết là cellulose, trong khi bã mía chứa khoang 40% cellulose

Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose đựơc liên kết với nhau bởi liên kết -1,4-glycoside giữa nguyên tử carbon số 1 với nguyên tử carbon số 4 của phân

tử glucose kế tiếp Liên kết glycoside giúp tạo dạng sợi khó cắt, và bản chất không tan trong nước bởi vì cấu tạo này bảo đảm mỗi đơn vị glucose được định hướng “ trans” với glucose bên cạnh Sản phẩm thuỷ phân của cellulose là một loạt oligosaccharide như cellobiose, cellotriose, và cellotetrose [17]

Ngoài ra, liên kết hydrogen nội phân tử giữa các nhóm hydroxyl trong cùng một mạch cellulose làm cho cellulose trở nên cứng, căng, và dai Các nhóm hydroxyl

ở mỗi đầu mạch cellulose có đặc điểm khác nhau Carbon số 1 ở đầu mạch cellulose chứa nhóm aldehyde có tính khử Ở cuối mạch cellulose, carbon số 4 chứa nhóm hydroxyl không có tính chất của rượu [17]

Liên kết hydrogen giữa các mạch cellulose cạnh nhau dẫn đến các bó mạch song song ( mỗi bó khoảng 40-70 mạch), gọi là vi sợi cellulose Mỗi đơn vị đường glucose của một mạch cellulose có 3 nhóm hydroxyl tương tác với 3 nhóm hydroxyl trong mạch kia bởi liên kết hoá trị thứ cấp Lực liên kết khoảng 25 KJ/mol, mạnh hơn gấp 100 lần so với lực Van der Waals ( khoảng 0,15kJ/mol), nhưng chỉ bằng khoảng 1/10 liên kết cộng hoá trị O-H ( 460kJ/mol) Tương tác giữa các nhóm hydroxyl nội phân tử và các nhóm hydroxyl giữa các phân tử cạnh nhau cũng góp phần duy trì cấu trúc của cellulose [26]

Cellulose không đồng nhất,có thể tồn tại ở dạng kết tinh hoặc vô định hình Vùng cấu trúc vô định hình chiếm ít hơn vùng kết tinh Vùng cấu trúc kết tinh là vùng

có trật tự cao và khó bị thuỷ phân bởi enzyme cellulase, hoá chất hoặc dung môi Là vùng mà các vi sợi được định hướng, ví dụ như một đầu có tính khử và một đầu không

sợi tập hợp lại trong thành tế bào thành các lớp ( hoặc phiến mỏng) với khoảng trống giữa mỗi vi sợi khoảng 20-40 nm, được liên kết bởi lignin và các glycan liên kết ngang với nhau gọi là hemicellulose [17]

Hình 2 4: Cấu trúc cellulose [26]

2.3.2 Hemicellulose

Hemicellulose hiện diện trong thành tế bào có mối liên quan với cellulose Nó

là một polysaccharide phức tạp có thể tan được trong cả kiềm và acid Công thức hoá học của hemicellulose là (C5H8O4)n Hemicellulose là polymer hỗn tạp, không như cellulose, và được cấu thành bởi 50-200 đơn vị đường đơn [26]

Các đường đơn có thề tồn tại trong hemicellulose bao gồm đường pentose (arabinose, xylose) và đường hexose ( galactose, glucose, mannose) Trong đó, xylose chiếm số lượng nhiều hơn cả Xylan chứa D-xylose được liên kết với nhau bởi liên kết β-1,4-glycoside Arabinose là thành phần có số lượng lớn thứ 2 trong hemicellulose Các thành phần còn lại thường chỉ chiếm với số lượng ít Một vài hemicellulose chứa

cả glucomannan và galactoglucomannan Glucomannan chứa glucose và mannose với tỷ lệ 30:70 Galactoglucomannan bao gồm D-galactose, D-glucose, và D-mannose với tỷ lệ 2:10:30 [26]

D-Hemicellulose là một polymer phân nhánh với cấu trúc ngẫu nhiên, vô định hình, trái với cấu trúc kết tinh, không phân nhánh của cellulose Mạch nhánh có cấu trúc đơn giản, thường là disaccharide hoặc trisaccharide Và chính cấu trúc phân nhánh này làm cho sự tận dụng hemicellulose khó khăn hơn, do nó sẽ làm quá trình

thuỷ phân xảy ra chậm hơn Sự liên kết hemicellulose với các polysaccharide khác và lignin chính là nhờ mạch nhánh này [26]

Hình 2 5: Cấu trúc của hemicellulose [26]

2.3.3 Lignin

Trong tế bào thực vật, các xơ sợi đƣợc kết dính với nhau nhờ một vật liệu nội bào gọi là lignin Lignin là một polymer phân nhánh tìm thấy trong thành tế bào thực vật, có khả năng chống lại sự phát triển của vi sinh vật và tích tụ đƣợc nhiều năng lƣợng mặt trời hơn so với cellulose và hemicellulose Cấu trúc phức tạp, ngẫu nhiên, lộn xộn, và chứa chủ yếu là các vòng thơm của lignin sẽ làm tăng tính đàn hồi, mềm dẻo cho việc kết dính cellulose và hemicellulose, tạo nên một hàng rào phòng thủ mạnh mẽ nhằm chống lại sự tấn công của enzyme và các hoá chất khác, bằng cách gắn chặt và làm cứng các sợi cellulose lại với nhau Để thuỷ phân đƣợc lignin và tiếp cận đƣợc cellulose là một thử thách lớn Thậm chí khi ta vƣợt qua đƣợc thử thách này, nhƣng ta lại gặp một vấn đề khác là các sản phẩm thủy phân trung gian của lignin (nhƣ các hợp chất phenol) lại là các chất độc kiềm hãm sự lên men đề chuyển thành ethanol sau này

Lignin được chia thành 3 nhóm chính: lignin của gỗ cứng, lignin gỗ mềm và lignin trong cỏ Sự khác biệt giữa các nhóm phụ thuộc vào cấu trúa hoá học của các đường đơn cấu tạo nên lignin [17]

Thành phần chủ yếu của lignin là các đơn vị phenylpropane ( C9).Vòng thơm chứa trong lignin rất nhiều, do bởi enzyme xúc tác phản ứng polymer hoá 3 đơn vi phenyl-propane là: guaiacylpropane, syringylpropane, p-hydroxyphenylpropane, với các tiền chất tương ứng là rượu coniferyl, rượu sinapyl, và rượu p-coumaryl Hàm lượng tiền chất của lignin phụ thuộc vào nguồn gốc lignin Chẳng hạn như, gỗ mềm chứa chủ yếu là coniferyl alcohol, trong khi đó gỗ cứng thì chứa coniferyl alcohol và sinapyl alcohol với hàm lượng ngang nhau Còn para-coumaryl alcohol hầu hết chỉ tìm thấy trong cỏ [17]

Hình 2 6: Ba tiền chất phenyl - propane của lignin [17]

Sự sinh tổng hợp lignin được gây ra bởi phản ứng nối gốc tự do, nơi mà các enzyme sẽ bẻ gãy liên kết cộng hoá trị giữa oxy và hydro của phenol Sự bẻ gãy liên kết này sẽ dẫn đến việc các gốc tự do sẽ cố gắng ổn định chính nó trở lại bằng cách di chuyển electron thông qua các phân tử, quá trình này được gọi là sự ổn định cộng hưởng Khi một gốc tự do gặp một gốc tự do khác chúng sẽ tự kết hợp nhau hình thành một liên kết cộng hoá trị khác Chất nhị trùng hợp này vẫn còn một nhóm hydroxyl tự do ccủa phenol và enzyme có thề loại bỏ hydro và electron để tạo nên thêm một gốc tự do nữa Quá trình này sau đó cứ tiếp tục và sẽ hình thành nên một cấu trúc polymer ngẫu nhiên và dài hơn

Lignin có cấu trúc không đồng nhất, chứa đựng các vùng vô định hình và các vùng hình cầu hoặc dài Cấu trúc và thành phần hoá học của mỗi lignin được tạo

thành có mối tương quan mạnh mẽ với bản chất của chất kết dính polysaccharide Mặc

dù lignin kỵ nước, nhưng sự mô hình hoá phân tử đã cho thấy được nhóm hydroxyl và methoxyl trong tiền chất lignin với vi sợi cellulose có tác động lẫn nhau Các vi sợi cellulose có thể giữ được một lượng nước đáng kể trong các vùng rỗng và vô định hình

Toàn bộ phân tử lignin là một cơ cấu phức tạp, 3 chiều, chứa đựng hàng ngàn đơn vị phenyl-propane, được tạo nên bởi sự polymer hoá không có hệ thống của các C6-C3, dẫn tới sư vững chắc của thành tế bào thực vật, và gây khó khăn cho sự thuỷ phân sau này

Lignin là chất hữu cơ có nhiều thứ 2 trên thế giới sau cellulose, do đó nó đóng vai trò then chốt trong bất kỳ quá trình tận dụng cellulose nào Trong công nghiệp giấy

và bột giấy, lignin được thu hồi lại và được dùng làm chất đốt, hoặc tận dụng để làm nguồn nguyên liệu để tạo các chất hoá học như chất tẩy, chất hấp thu sinh học Một khuynh hướng tương tự có thể được thực hiện trong quá trình sản xuất ethanol, đó là

sự đốt cháy lignin sinh ra năng lượng hơi nước và nhiệt để cung cấp trở lại cho quá trình [17]

2.3.4

tr

2.4 Ứng dụng phương pháp cố định tế bào trong sản xuất bioethanol

Hệ thống tế bào cố định có nhiều ưu điểm hơn hẳn hệ thống tế bào tự do như:

- Hoạt tính kéo dài và ổn định của chất xúc tác sinh học Cơ chất cố định có thể hoạt động như là tác nhân bảo vệ chống lại các tác động hóa lý của pH, nhiệt

độ, dung môi hoặc kim loại nặng

- Mật đố tế bào cao hơn trong 1 đơn vị thể tích nên làm tăng khả năng sản xuất, rút ngắn thời gian lên men

- Gia tăng hấp thu cơ chất và cải thiện sản lượng

- Có thể ứng dụng trong hệ thống liên tục

- Gia tăng sự chịu đựng với nồng độ cơ chất cao và giảm sự ức chế do sản phẩm cuối

- Có thể lên men ở nhiệt độ thấp để cải thiện chất lượng sản phẩm

- Dễ thu hồi vì giảm quá trình phân chia và lọc, do đó làm giảm chi phí dụng cụ

và năng lượng

- Sự tái sinh và tái sử dụng của chất xúc tác được mở rộng trong một thời gian trong lên men chu kỳ, mà không loại bỏ khỏi thiết bị phản ứng

- Giảm nguy cơ nhiễm vi sinh vật do mật độ tế bào cao và khả năng lên men cao

- Có thể dùng thiết bị phản ứng nhỏ hơn với thiết kế quá trình đơn giản hóa và do

đó chi phí vốn thấp hơn

- Giảm thời gian chín của sản phẩm

Do những ưu điểm kể trên, các chế phẩm cố định ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các quá trình sản xuất Trong công nghiệp sản xuất ethanol nhiên liệu, chế phẩm nấm men cố định cũng được coi là một phương án khả thi để làm giảm giá thành sản phẩm [19, 25]

Nhiều vật liệu đã được chọn làm chất mang cố định trong sản xuất bioethanol như alginate, vỏ cam, vật liệu cellulose đã đề lignin Trong số này, vật liệu cellulose đã đề lignin được quan tâm vì tính sẵn có, giá thành rẻ và độ bền Vật liệu lignocellulose tự nhiên chứa lượng lớn nhóm ưa nước ở dạng nhóm mang, với sự hấp phụ các tế bào mang

Trong quá trình xử lý đề lignin, lignin được loại bỏ một phần và các nhóm ưa nước được phơi bày ra, làm gia tăng sự hấp phụ Xử lý đề lignin hóa với dung dịch NaOH làm gia tăng khả năng tế bào đi vào và cư trú trong chất mang

Mía là vật liệu tự nhiên, dư dật, rẻ tiền và là cơ chất thích hợp cho sự phát triển của

tế bào, do đó, mía cũng như bã mía được ứng dụng làm giá thể trong công nghiệp sản xuất ethanol nhiên liệu

Hình 2 8: Hình chụp mía dưới kính hiển vi điện tử quét a.Hình chụp cắt ngang mía trước khi

cố định, b.Cấu trúc tế bào nhu mô của mía sau xử lý đông - rã đông [18]

Hình chụp dưới kính hiển vi của thân mía trước khi cố định nấm men cho thấy bề mặt ngoài, bao gồm tế bào nhu mô và mạch mở (hình 2.8) Mạch được cấu tạo bởi các bó mạch, anular, mạch xoắn và ống lưới… được hiện diện trong toàn bộ thân Cần thiết để

xử lý nguyên liệu trước khi cố định bằng quá trình làm đông và rã đông để phá vỡ cấu trúc tế bào (hình 2.8) Thông thường, mía để làm cơ chất cố định được được trữ ở -20oC Trong khi rã đông, những lỗ hổng rõ nét trong mô mía là kết quả của sự phá hủy tế bào,

mô phân chia hoặc sắp xếp Vì thế làm xuất hiện những kẽ hở lớn ở trung tâm của thân mía Đường kính của lỗ hổng của cơ chất thì lớn hơn nhiều lần kích thước của tế bào và

có khả năng chứa đựng nhiều tế bào Trong suốt quá trình ủ và lên men, tế bào nấm men

có thể tiến sâu vào bên trong của mía nơi mà tế bào gia tăng số lượng bởi sự sinh sản

Tế bào nấm men cố định được xem thấy bởi kính hiển vi điện tử quét Có lượng lớn tế bào nấm men bám chặt vào bề mặt của miếng mía (hình 2.10) Cả phần dọc của cấu trúc bó sợi và phần dài của bề mặt đều thấy mật độ tế bào hấp phụ cao (hình 2.9)

Hình 2 9: Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét phần giữa của giá thể mía sau cố định

Theo chiều ngang, nấm men hấp phụ lên tế bào nhu mô (a); theo chiều dọc, sự hấp phụ nấm men lên bó mạch (b), mạch vòng (c), mạch xoắn (d), ống aieve (e), tế bào nhu mô (f) [18]

Như chúng ta biết, sự gắn chặt của tế bào ưa nước chẳng hạn như S.cerevisiae phụ

thuộc vào tương tác tĩnh điện giữa giá thể và bề mặt không tích điện của tế bào Dựa vào những kỹ thuật cố định này, mía được tin rằng có thể cố định nấm men bằng cách bẫy tự nhiên vào cấu trúc xốp của mía bằng hấp phụ vật lý bởi lực điện giữa màng tế bào và chất mang Cũng vậy, sự theo dõi chỉ ra rằng sự giữ lại tế bào là do tác động của lực mao dẫn trong suốt quá trình cố định, giúp điền đầy tế bào và giữ nó trên bề mặt của kênh nơi chúng có thể bị bẫy, tiếp xúc và phân chia Dòng tế bào qua cơ chất xốp do áp suất khác nhau giữa mạch làm cho tế bào đi vào trong mạch Mật độ tế bào cố định cao trên bề mặt của giá thể được Lei Liang và cộng sự ghi nhận sau 10 lần lên men Điều này có thể được

giải thích bởi nguồn dinh dưỡng sẵn có lớn (đường) gần bề mặt của giá thể Thêm vào đó, nguồn dinh dưỡng sẵn có lớn trong lỗ trống của tế bào nhu mô cũng thu hút nấm men di chuyển vào trong tế bào nhu mô và sinh sôi trong quá trình cố định [18]

Hình 2 10: Hình chụp dưới kính hiển vi điện tử quét của bề mặt giá thể trong quá trình lên

men A: bề mặt giá thể sau quá trình cố định B: bề mặt giá thể sau 10 chu kỳ lên men [18]

Lei Liang và cộng sự sử dụng mía làm giá thể cố định Saccharomyces cerevisiae

đạt được kết quả khả quan Nồng độ ethanol (khoảng 89.73 – 77.13g/l là giá trị trung bình), và sự sản xuất ethanol (khoảng 59.53 – 62.79 g/ld là giá trị trung bình) thì cao và

ổn định còn nồng độ đường sót thì thấp (0.34 – 3.60g/l) với mức độ biến đối từ 97.67 – 99.80%, hiệu suất (90.11 – 94.28%) và sự ổn định của chất xúc tác trong lên men ethanol Quá trình lên men bằng giá thể mía cố định trải qua 10 chu kỳ mà sản lượng ethanol tạo được vẫn ổn định Trong trường hợp lên men từ nước mía ( 173.85g đường ban đầu/l) và mật rỉ (154.07 g đường ban đầu/l) bởi nấm men cố định trên mía, lượng ethanol thực tế là 91.72% (0.47) và 88.94% (0.45) lý thuyết, là giá trị có thể chấp nhận được So sánh với những kết quả thu được với nấm men tự do, nồng độ ethanol thu được tương tự, tuy nhiên, điểm khác nhau chính là mức độ lên men cao hơn của nấm men cố định cho thấy khả năng sản xuất cồn cao hơn và hiệu suất lên men cao thu được với nấm men cố định

Chúng ta cũng biết rằng nấm men có thể được bẫy trong calcium aglinate và kết quả nấm men cố định có thể dùng cho lên men nhanh Nhiều nghiên cứu miêu tả kỹ thuật này như là kỹ thuật được ứng dụng thường xuyên trong phòng thí nghiệm Tuy nhiên cũng có nhiều nỗ lực để thương mại hóa kỹ thuật này Một trong những hiểu biết tốt nhất

là của Kyowa Hakko ở Nhật, nơi mà sử phát triển S.cerevisiae cố định trong hạt gel

liên tục từ mật rỉ đường mía và nhiều nguồn đường khác Theo đó, sự sản xuất ethanol thì hơn 50g ethanol/l gel h và giữ ổn định hơn nửa năm Nồng độ tế bào trong chất mang ước tính khoảng hơn 250g tế bào khô/l gel Nồng độ ethanol sản xuất được từ dịch mất rỉ pha loãng không khử trùng là 8 – 10% (v/v) trong hơn nữa năm Sự sản xuất ethanol được tính 0.6l ethanol/ một lít thể tích thiết bị phản ứng một ngày với sự chuyển hóa là 95% lý thuyết trong trường hợp này là 8.5% (v/v) dịch ethanol Kết quả của công việc này thường được so sánh với những nghiên cứu trước đây ở mức độ lên men, sản lượng và hiệu suất

và sự kết hợp để cải thiện quá trình chưng cất để đạt nồng độ ethanol cao từ 10 – 11.5% (v/v) Theo cách khác, có một vài khuyết điểm của nấm men cố định trên alginate cho mức độ thương mại hóa Khó khăn chính với sự bẫy trong alginate là cách các phần được tạo thành Nó phải được tiến hành ở nơi sản xuất, nơi mà nấm men sệt và sodium alginate được trộn với nhau Khi hỗn hợp này cho thêm vào dung dịch muối calcium, alginate kết tủa và ở thời điểm này giữ nấm men trong cấu trúc Phần này thường được tạo thành bằng nhỏ giọt tạo hạt gel Một quá trình sử dụng alginate để bẫy nấm men phải được thiết kế những dụng cụ đặc biệt chỉ để sản xuất những hạt gel Hơn nữa, có một nguy cơ lớn nhiễm nấm men với những vi sinh vật hoang dại Khó khăn thứ hai cho các hạt gel alginate dùng ở qui mô thương mại là độ bền vật lý của nó Những hạt gel này mềm và dễ chịu nén Các cột lên men lớn có thể là vấn đề và dòng chảy nhanh thì khó giữ Khó khăn thứ ba là là giới hạn khuếch tán, với những dòng chảy chậm, cơ chất có thể tiếp xúc với nấm men trong hạt gel Cuối cùng, nếu hệ thống bị bẩn hoặc bị rối loạn thì quá trình liên tục không thể được thực hiện, cả vật liệu làm cột phải bị bỏ Không thể tái sử dụng Tuy nhiên, giá thể mía cố định đã sử dụng có thể tái sử dụng như là nguồn giàu protein làm thức ăn cho động vật Do đó, sự so sánh với nấm men nhốt trong Ca- alginate, nấm men

cố định trong mía thì cạnh tranh hơn cho quá trình công nghiệp [18]

Chất xúc tác từ vật liệu tự nhiên để sản xuất cồn được nghiên cứu mở rộng như táo, vỏ cam, quả sung khô… Mỗi quá trình lên men cho kết quả sự tiêu thụ glucose ở mức

90 – 99% cho nước ép chứa 134 – 187g đường /l, và sự sản xuất ethanol ổn định với khả năng sản xuất ethanol từ 26 – 110.4g/l d ở 30o

C [19,25]

Như vậy, việc ứng dụng giá thể cố định trong lên men ethanol cho hiệu suất cao và

có giá trị kinh tế lớn Ứng dụng các giá thể cố định nấm men vào sản xuất công nghiệp là hoàn toàn có thể thực hiện được

2.5 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol trên thế giới và trong nước

2.5.1 Tình hình sản xuất bioethanol trên thế giới

Năm 2003, toàn thế giới đã sản xuất khoảng 38 tỉ lít ethanol thì đến năm 2005 con số này đã lên đến 50 tỉ lít và sẽ đạt 80 tỉ lít vào năm 2012 Năm 2005, diesel sinh học (biodiesel) nguồn gốc động - thực vật đạt 4 triệu tấn và sẽ đạt mức 20 triệu tấn vào năm 2010

Các nước đã có thành công nghiên cứu và sử dụng nhiên liệu sinh học là Brazil,

Mỹ, Canada, Mexico, Châu Âu có Anh, Pháp, Đức, Tây Ban Nha, Bỉ, Áo, … Châu Á

có Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật Sở dĩ nhiều nước đẩy nhanh chương trình nghiên cứu và sử dụng nhiên liệu sinh học vì đã cam kết thực hiện nghị định Kyoto về cắt giảm khí nhà kính và để đảm bảo an ninh năng lượng khi nguồn dầu mỏ trở nên đắt đỏ và sẽ cạn dần cuối thế kỷ này

Hình 2 11: Các nước sản xuất bioethanol chủ yếu trên thế giới [8]

Trong số quốc gia phát triển nhiên liệu sinh học, Brazil là điển hình do có chiến lược phát triển từ rất sớm Nước này đi đầu thế giới về sử dụng ethanol làm nhiên liệu

ở quy mô công nghiệp, với lượng sử dụng năm 2006 là 16 tỉ lít Các loại xăng sử dụng tại đây đều được pha chế 25% ethanol (E25) Brazil hiện có 17 triệu ô tô sử dụng E25

và 3 triệu ô tô sử dụng 100% ethanol Thành công này bắt nguồn từ chương trình nghiên cứu, sản xuất nhiên liệu sinh học có từ năm 1975 Mô hình sản xuất nhiên liệu sinh học của Brazil đang được nhiều nước học tập

Mỹ là quốc gia sản xuất ethanol lớn nhất thế giới - 19 tỉ lít/ năm 2006, chiếm 3% thị trường xăng của nước này Hiện nay tại Mỹ có 116 nhà máy sản xuất ethanol,

79 nhà máy đang xây dựng, 11 nhà máy được mở rộng và 200 nhà máy sẽ đi vào hoạt động khi vụ thu hoạch ngô bắt đầu vào tháng 9/2008 Mục tiêu của Mỹ là nâng sản

dầu tiêu thụ Ở Venezuela, công ty dầu quốc gia đang hỗ trợ dự án xây dựng 15 nhà máy chế cồn từ mía trong 5 năm tới khi chính phủ sắp ban hành đạo luật bắt buộc sử dụng xăng E10 (pha 10% ethanol) Chính phủ Canada nhắm đến việc 45% xăng trong

cả nước có pha 10% ethanol vào năm 2010

Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Malaysia, đều đã có chiến lược dài hơn, tạo thành công khả quan trong việc phát triển nhiên liệu sinh học Từ năm 1985, Thái Lan đã triển khai dự án do nhà vua đề xướng để phát triển công nghệ sản xuất ethanol

từ khoai mì và diesel sinh học dầu cọ Tháng 9/2000, nước này thành lập ủy ban ethanol quốc gia để điều hành chương trình phát triển nhiên liệu sinh học; tháng 8.2002 ban hành chính sách hỗ trợ tín dụng cho các nhà đầu tư vào nhiên liệu sinh học

và điều tiết thuế để gasohol (E10) có giá bán thấp hơn 0,5 bạt/lít so với xăng Hiện nay, 4,3 triệu lít xăng E10 (10% ethanol) được tiêu thụ mỗi ngày Thái Lan khẳng định

sẽ sử dụng E10 và B10 (10% diesel sinh học) trong cả nước vào thập kỉ tới [8]

2.5.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất bioethanol trong nước

Ở nước ta phầ ản xuất từ rỉ đường mía, dùng làm ethanol cho thực phẩm và công nghiệp Tổng cộng năng suất là 25 triệu lít/năm, trong đó có 3 nhà máy sản xuất 15000 – 30000 lít/ngày là nhà máy đường Lam Sơn, nhà máy đường Hiệp Hòa và nhà máy rượu Bình Tây và hàng trăm cơ sở sản xuất 3000 – 5000 lít/ngày Tốc độ tăng trưởng của ngành công nghệ ethanol rất chậm và mang tính tự phát, chưa có chiến lược phát triển, so với các nước trên thế giới, sản lượng ethanol của nước ta rất thấp Hiện nay các cơ sở sản xuất ethanol đang gặp khó khăn vì hiệu suất tạo ethanol từ rỉ đường mía là 4 kg rỉ đường mía tạo 1 lít cồn với giá thành 9000 đồng/ lít, do đó không thể cạnh tranh với các nước láng giềng như Trung Quốc, Thái Lan

Theo TS Đặng Tùng, Vụ trưởng Vụ Khoa học và Công nghệ (Bộ Công Thương), năm 2007, nhiều nhà máy sản xuất cồn công nghiệp để sản xuất nhiên liệu sinh học đã được dồn dập triển khai ở Việt Nam Cụ thể:

Công ty Cổ phần Cồn sinh học Việt Nam đã đầu tư xây dựng nhà máy sản xuất cồn công nghiệp với công suất 66.000 m3/năm tại Đắc Lắc Để đảm bảo nguyên liệu, công ty đã lên kế hoạch trồng 4.000 ha cây khoai mì

Một nhà máy sản xuất xăng sinh học công suất 300 triệu lít /năm sắp được công

ty TNHH Sơn Hà xây dựng tại Hậu Giang Sản phẩm sẽ có giá thành rẻ hơn 60-70%

so với xăng đang lưu hành

Bên cạnh đó là các dự án hợp tác đầu tư liên doanh liên kết giữa Công ty đường Biên Hòa với Tập đoàn Fair Energy (Thụy Sĩ) ký kết hợp tác tháng 8/2007 đầu tư nhà máy sản xuất cồn sinh học công suất 220.000 lít/ngày

Đáng chú ý nhất là vào ngày 9-3-2007, Petrosetco (thuộc Petro Vietnam) ký kết thỏa thuận hợp tác thành lập liên doanh xây dựng nhà máy sản xuất ethanol từ khoai

mì (củ mì) với tập đoàn Itochu (Nhật Bản) Nhà máy đặt tại Khu Công nghiệp Hiệp Phước (TPHCM) với công suất 100 triệu lít/năm Với công suất này, nhà máy sẽ sử dụng lượng nguyên liệu khoảng 300 ngàn tấn khoai mì lát mỗi năm Ông Trần Công Tào, Chủ tịch Hội đồng Quản trị Petrosetco, cho biết: “Với sản lượng 1,2 triệu tấn khoai mì lát xuất khẩu hằng năm chúng ta có thể sản xuất ít nhất 400 triệu lít ethanol/năm và với tỉ lệ pha 10% vào xăng thì lượng ethanol nói trên đủ đáp ứng 50% nhu cầu ethanol hiện tại của thị trường xăng Việt Nam” Với công suất 100 triệu lít ethanol/năm liên doanh Petrosetco và Itochu mới đáp ứng 1/7 nhu cầu hiện tại (hiện nay mỗi năm ta phải nhập 7 triệu tấn xăng) Theo Petro Vietnam, trong tương lai, sẽ xây dựng thêm ít nhất 6 nhà máy sản xuất ethanol nữa từ nguồn nguyên liệu đầu vào không chỉ là khoai mì lát mà còn từ rỉ đường, bắp và gạo

Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015 và tầm nhìn 2025 nêu rằng:

“Việt Nam sẽ đẩy mạnh phát triển nhiên liệu sinh học và mục tiêu dự kiến đến năm

2025 sẽ sản xuất và đưa vào sử dụng xăng E5 (95% xăng khoáng và 5% ethanol) và dầu B5 (95% diesel khoáng và 5% diessel sinh học) trên phạm vi cả nước, đáp ứng đủ nhu cầu thị trường”

Như vậy, song song với các dự án nghiên cứu khoa học về năng lượng sinh học, việc triển khai phát triển, sử dụng nhiên liệu sinh học đã được Việt Nam quan tâm đẩy mạnh và hướng đầu tư sản xuất ở quy mô công nghiệp Mặc dù chưa thực sự phát triển rầm rộ và nhiên liệu sinh học chưa được ứng dụng rộng rãi nhưng việc đầu

tư phát triển nhiên liệu sinh học ở Việt Nam được coi là hướng đi tất yếu