hóa sinh thực hành

1 Hóa học Protid , enzy m 3.Tủa Protein bằng kim loại nặng Protein tạo muối với kim loại nặng thành phức hợp không tan trong nước - 10 giọt Pr 0,1% + 2 giọt chì acetl 5% - Kết tủa tr

1 Hóa

học

Protid

,

enzy

m

Protid : là hợp chất hữu cơ cấu

tạo bởi 4 nguyên tố chính là : C H

O N

Enzym : là chất xúc tác sinh học

có bản chất là Protein , không

được sinh ra cũng không mất đi

sau phản ứng

1.Phản ứng Biure

Trong môi trường kiềm, các nitơ trong liên kết peptid của Protein tạo phức hợp màu tím với Cu++

PT:

- ống 1 : 10 giọt Pr 0,1% +

10 giọt biure

- ống 2: 10 giọt glyci 0,1%

+ 10 giọt biure

- Ống 1: tạo phức tím ( do

Pr tạo phức với Cu(OH)2

- ống 2 : không tạo phức (

do Glycin là a.min không

có liên kết peptid)

Định lượng Pr trong huyết thanh

học

Protid

,

enzy

m

Pr Tủa khi

- mất lớp áo nước:

+ dùng chât hút nước như Ancol,

Cetol

+ biến tinhs Pr: đun sôi , Acid

mạnh, kiềm mạnh

- Mất lớp điện tích

+ đưa PH môi trường về PHi của

Pr : acid yếu nồng độ thấp

+ trung hòa điện tích: các chất

điện giải như NaCl

2.Tủa Protein bằng cách đun sôi

Khi đun sôi các tiểu phân protein bị mất lớp

áo nước, Nếu các tiểu phân này lại bị trung hoà điện tích hoặc đưa PH dung dịch

về gần bằng PHi thì Protein sẽ bị tủa

- Mỗi ống 1 ml Protein thẩm tích

- ống 1 : không thêm

- ống 2: thêm 2 giọt a.acetic 1%

- ống 3: thêm 5 giọt a.acetic 10%

- ống 4: thêm 5 giọt a.acetic 10% + 2 giọt NaCl bão hòa

- ống 5: thêm 2 giọt NaOH 10%

lắc đều đun sôi 5 phút

- ống 1: không tủa do đun sôi chỉ làm mất lớp áo nước

- ống 2: tủa trắng do a.acetic là acid yếu đưa

PH môi trường về PHi nên làm mất lớp điện tích, kết hợp đun sôi chỉ làm mất lớp áo nước

- ống 3: không tủa do a.acetic 10% là acid mạnh + đun sôi chỉ làm mất lớp

áo nước  Pr tích điện dương

- ống 4: tủa trắng do a.acetic 10% và đun sôi làm mất lớp áo nước, NaCl làm mất lớp điện tích  Ứ D : tìm Pr trong nước tiểu

- Ống 5: không tủa do NaOH là kiềm mạnh + đun sôi chỉ làm mất lớp

áo nước Pr  Pr tích điện

Tìm Protein trong nước tiểu, dịch màng bụng, màng phổi

1 Hóa

học

Protid

,

enzy

m

3.Tủa Protein bằng kim loại nặng

Protein tạo muối với kim loại nặng thành phức hợp không tan trong nước

- 10 giọt Pr 0,1% + 2 giọt chì acetl 5%

- Kết tủa trắng vì ion kim loại này làm phá vỡ màng nước trung hòa điện tích

- Sơ cứu ngộ độc kim loại nặng trong thơi gian chưa hấp thu( cho uống lòng trắng trứng)

học

Protid

,

enzy

m

4.Hoạt động của enzym catalase

Catalase là enzym oxy hóa khử có trong tất cả các tế bào

Catalase từ gan sẽ xúc tác phản ứng phân hủy H2O2 thành H2O và giải phòng oxy Oxy được phát hiện bằng phản ứng cháy

catalase H2O2  H2O+1/2 O2

- Cho 1g gan nghiền nhuyễn trong 10ml nước cấy vào ống đổ nhanh H2O2 1% vào đầy ống nghiệm, bịt nhanh ống nghiệm và lộn ngược ống nghiệm vào chậu nước Thả ngón tay để nước trong ống thoát ra ngoai, vẫn giữ thẳng ống nhấc ống ra khỏi mặt nước , gạt hết bọt trong ống đưa que đóm

đỏ vào ống sẽ thấy que đóm bùng cháy

- Catalase có trong TB, TB

bị tổn thương giải phóng catalase , tác dụng với H2O2 giải phòng O2

- Nước H2O2 rửa vết thương mới, không rửa vết thương cũ vì làm chết tổ chức, mòn da ( 02 nguyên

tử có khả năng oxy hóa mạnh , phá hủy màng tế bào diệt khuẩn)

2 Hóa

học

Gluci

d,

lipid

Glucid : được cấu tạo bởi các

nguyên tố chính là C,H,O có công

thức phân tử là Cn(H2O)m được

chia làm 3 loại

+ Monosaccarid: được gọi là

đường đơn, dẫn xuất của aldehyt

hoặc cetol của polyancol, là các

đơn vị cấu tạo nhỏ nhất của

glucid, không thể thị thủy phân

VD: Glucose, Fructose,

Galactose, Mannose

Tính chât hóa học : chuyển dạng

dẫn nhau, tính khử, tính oxy hóa,

tạo Osazon, tạo Furfural, tạo

Glucosid, tạo dẫn xuất osamin, tạo

este , mất oxy

+ Oligosaccarid:2-14 phân tử

monosaccarid tạo nên : VD

Sacarose, lactose, Maltose

Polysaccarid: tạo nên từ nhiều

phân tử monosaccarid

5 Xác định tính khử của monosacar

id -phản ứng Fehling

Tất cả các phân tử monosaccarid đều chứa nhóm chức khử ( aldehyd H-C=O hoặc Ceton C=O) vì vậy chúng có tính khủ các ion kim loại thành các ion kim loại có hóa trị thấp hơn

Trong phản ứng Fehling , các monosaccarid khủ Cu(OH)2 thành CuOH, chất này lại bị mất nước thành Cu2O kết tủa đỏ gạch

PT:

Mỗi ống cho 1 ml Fehling thêm vào

- ống 1: 10 giọt nước cất

- ống 2: 10 giọt Glucose

- ống 3: 10 giọt Fructose

- ống 4: 10 giọt Galactose lắc đều đun sôi 5 phút

- ống 1: không có kết tủa

- ống 2: có kết tủa, do trong

dd Glucose có nhóm chức andehyt, nhóm này có tính khử nên Cu++ thành Cu+

 có kết tủa đỏ gạch

- ống 3: có kết tủa ít hơn .Fructose có nhóm chức Ceton không tham gia phản ứng này nhưng do trong dd Fehling có môi trường kiềm làm Fructose chuyển dạng đồng phân thanh Glucose, Glu có tính khử Cu(OH)2 thành Cu2O kết tủa đỏ gạch

- ống 4 : có kết tủa , do trong

dd Galactose có nhóm chức Andehyt, nhóm này có tính khử nên Cu++ thành Cu+,

có kết tủa đỏ gạch

- Tìm đường trong nước tiểu

Glucose:

Fructose:

6.Xác định tính khử của disaccarid

Disaccarid nào trong phân tử còn nhóm chức khử ( nhóm OH bán Acetal) thì có khả năng khử Cu(OH)2 theo nguyên tắc của phản ứng Fehling

Mỗi ống cho 1ml Fehling thêm vào

- ống 1: 10 giọt nước cất

- ống 2: 10 giọt saccarose

- ống 3: 10 giọt lactose

- ống 4: 10 giọt maltose lắc đều đun sôi 5 phút

- ống 1: không có kết tủa

- ống 2: có kết tủa màu đỏ gạch do saccarose trong quá trình đun nóng bị thủy phân thành αD glucose và

βD Fructose mà 2 chất này

có nhóm chức khử nên khử Cu++ thành Cu+ kết tủa đỏ gạch( khử gián tiếp

- ống 3: có kết tủa do trong lactose có nhóm OH bán cetal nên có tính khử, khủ Cu++ thành cu+ kết tủa đỏ gạch

- ống 4: có kết tủa , do trong maltose có nhóm Oh bán cetal nên nó còn tính khử, khử Cu++ thành Cu+ kết tủa đỏ gạch

- tìm đường trong thuốc,

có giá trị kiểm định thuốc

- 3 con đường thoái hóa glucose 7 xác định

acid lactic trong cơ

Acid lactic được chiết xuất tư cơ tươi Phát hiện sự có mặt của a.lactic trong dịch chiết bằng phản ứng tạo lactac sắc màu vàng theo cơ chế

Phenol+FeCl3 Phenol sắt( màu tím)

Phenol sắt +acid lactic lactac sắt ( màu vàng)

Cho vào ống nghiệm

1 ml phenol 1% khoảng 15 giọt

2 giọt FeCL3 ,1%

4-8 giọt dd chiết cơ Lắc đều

- ống nghiệm lắc đều lúc đầu có màu tím , khi thêm dịch chiết cơ vào thì dd chuyển thành màu vàng chanh, thêm 1-2 giọt dd chiết cơ nữa thì màu vàng đậm hơn

- định lượng acid lactic trong máu (

để đánh giá chức năng gan), khả năng tưới máu ở cơ

Lipit : là este của acid báo và

ancol hoặ amid của acid béo và

amin ancol

Phân loại

Thuần : glycerid, cerid

Tạp: photpholipit, lipoprotein

Ứng dụng

-Khi ăn trong thức ăn có lopit , do

trong máu có Pr nên khi P+Lipit

 liprotein là chất vận chuyển

lipit trong máu nên lipit không bị

bám vào thành mạch gây tắc mạch

-Mật: dịch mật đổ vào khúc 2 tá

tràng để nhũ tương hóa lipit cơ

thể hấp thu lipit nhờ enzym

lipase( chỉ tiêu hóa lipit ở dạng

nhũ tương hóa) Thiếu dịch mật

 ko hấp thu được lipit  thiếu

các vitamin tan trong lipit như A,

E

-Xà phòng: Ứng dụng trong sản

xuất dầu gội , sữa tắm…

-Ancol – Ether: làm sạch các vết

bẩn trên đồ da – len

8 Nhũ tương hóa dầu lạc

Dầu mỡ không tan trong nước nhưng khi lắc mạnh với nước sẽ tạo thành nhũ tương không bền: nghĩa là nếu để yên

1 thời gian dd sẽ chia thanh 2 lớp , nêu thêm chất nhũ tương hoa như NaCO3 , muối mật, Protit, xà phòng … sẽ tạo nhũ tương bền

Cho vào 6 ống nghiệm mỗi ống 2 giọt dầu lạc, thêm vào

- ống 1: 20 giọt nước cất

- ống 2: 20 giọt Na2CO3 , 1%

- ống 3: 20 giọt dd Pr 1%

- ống 4: 20 giọt dd mật 30%

- ống 5: 20 giọt dd xà phòng 5%

- ống 6 : 20 giọt Alcol – ether

Lắc kỹ quan sát hiện tượng nhũ tương bền và không bền

- ống 1 nhũ tương hóa không bền khi lắc mạnh làm tách các phân tử lipit

ra, nước đến bao quanh tạo thành những mảng lipit nhỏ ở trong lớp nước

để yên 1 lúc các mảng lipit này liên kết với nhau tạo thành nhũ tương hóa không bền

- ống 2,3,,5: tạo thành nhũ tương hóa bền khi lắc mạnh làm các p.tử lipit tách ra, nước đến bao quanh tạo thành những mảng lipit nhỏ ở trong lớp nước do các chất nhũ tương hóa vừa có đầu kị nước vừa có đầu ưa nước, đầu kị nước của nó bao lấy đầu kị nước của lipit đưa đầu ưa nước ra ngoài và liên kết chặt chẽ với phân

tử nước làm cho các p.tử lipit không thể liên kết lại với nhau  tạo thành nhũ tương bền

- ống 6: tạo nhành nhũ tương bền dd gần như trong suốt do ancol – ether

là chất nhũ tương hóa mạnh

-

3 Nguồn gốc: nội sinh

- Được tổng hợp từ các a.amin tại

gan ( có 8 a.amin cần thiết và 12 a.a không cần thiết)

- Bao gồm

+ Albumin : được tổng hợp từ gan

+ Globulin: được tổng hợp từ gan

, TB limph

Vai trò :

+ tạo áp suất keo

+ vận chuyển bilirubin, lipit,

thuốc…

+ bảo vệ cơ thể

+ điều hòa hormon

9.Định lượng Pr huyết thanh ( Phương pháp đo điểm cuối)

Nguyên tắc : so màu Các peptid tạo phức màu tím với ion Cu++

trong môi trường kiềm đậm độ phức màu tỉ lệ thuận với nồng độ Pr

Đo mật độ quang của phức màu tại bước sóng

546 nm

Pr + Cu++ phức màu tím

Hút 1000 µl thuốc thử ( 1ml)

Thêm 10 µl huyết thanh bệnh nhân

Lắc đều , ủ ở 37 o C trong

5 phút, đem đo trong máy

Giá trị bình thường 65-85g/l Tăng: mất thể tích tuần hoàn như mất máu, sốt, bỏng, tiêu chảy

Tăng giả tạo : do cô đặc máu

Giảm + giảm tổng hợp : giảm chức năng gan( suy gan, viêm gan, sơ gan) thiếu a.amin( suy dd)

+ tăng đào thải : tổn thương màng lọc cầu thận( viêm cầu thận, Hc thận hư, suy thận

Đánh giá chức năng gan, tổn thương thận, phù

10.định lượng Albumin ( Phương pháp đo điểm cuối

Nguyên tắc : so màu Albumin kết hợp với xanh Bromcresol trong môi trường acid tạo phức hợp màu xanh Đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ Albumin

Đo phức hợp màu ở bước sóng 578 nm

Hút 1000 µl thuốc thử ( 1ml)

Thêm 10 µl huyết thanh bệnh nhân

Lắc đều , ủ ở 37 o C trong

5 phút, đem đo trong máy

Giá trị BT : 35-55 g/L Tăng : Mất thể tích tuần hoàn như mất máu, sốt, bỏng , tiêu chảy…

Giảm : + giảm tổng hợp : Giảm chức năng gan( suy gan, viêm gan, Xo gan) thiếu a.amin ( suy dd)

+ tăng đào thải : tổn thương màng lọc cầu thận( viêm cầu thận, hc thận hư, suy thận

Chỉ định đánh giá chức năng gan

Tổn thương thận, phù

11.phản ứng Rivalta

Phản ứng Rivalta nhằm bán ddihj lượng Pr trong dung dịch chọc dò dựa trên nguyên tắc của

Pr bằng a.amin hữu cơ

Cho vào ống 100ml nước cất nhỏ 1 giọt acid acetic đặc, nhỏ từ từ 100 µl bệnh phẩm( 2 giọt)

Quan sát phản ứng trên nền đen

Rivalta (+) xuất hiện hình ảnh làn khói Dịch tiết tương đương Pr dịch

≥30g/L, thường gặp trong:

Lao màng bụng/phổi, K gan,

K phổi – màng phổi, apsxe phổi

Rivalta (-) không có hiện tượng gì Dịch thấm nồng

độ <30 g/L, thường gặp trong HC Thận hư, xơ gan, suy dd

Lưu ý : dương dính giả ; tỉ trọng bệnh phẩm cao hơn bình thường , do chạm ven

Âm tính giả : nước cất bẩn làm sai PH dung dịch

Chỉ định : để chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh

Ý nghĩa: pro niệu gặp nhau trong

- Sinh lý : trơi lạnh đứng lâu,

stress, PN có thai

- Bệnh lý

+ N nhân trước thận : nhiễm

khuẩn, sốt, suy tim THA ( tăng

lưu lượng máu qua thận ( giảm Pr

máu ))

+ NN tại thận: HC TH, VCT, suy

thận  giảm Pr máu

+ NN sau thận: NK tiết niệu, sỏi ,

u bàng quang ( không giảm Pr

máu)

12

Tìm Pr niệu bằng

pp đun sôi

Pr có mặt trong nước tiểu sẽ bị kết tủa dưới tác dụng của nhiệt độ trong môi trường acid yếu và có mặt chất điện giải

Nước tiểu 2ml Acid acetic 10% 5 giọt NaCl bão hòa 2 giọt Lắc đều đun sôi cách thủy

5 p

Pr niệu dương tính khi dd có vẩn đục hoặc tủa trắng

Chỉ định

BN phù, PN

có thai

Nguồn gốc : ngoại sinh: ăn uống

Nội sinh

+ Glycogen do gan phân ly

+ các sản phẩm trung gian : đồng

phân hóa các đường khác

Vai trò

+ cung cấp năng lượng: qua con

đường đường phân yếm khí,

pentose, uỏnic

+ tạo Tb , xây dựng cơ thể

3 con đường đường phân ?

13 Định lượng Glucose huyết thanh

Nguyên tắc: enzym màu Đậm độ màu phụ thuộc nồng độ Gluco huyết

Đo mật đọ quang của phức hợp màu ở bước sóng 546 nm

Hút 1000 µl thuốc thử ( 1ml) thêm 10 µl huyết thanh bệnh nhân

Lắc đều, ủ trong 37 độ trong 10 phút, đem đo trên máy

Giá trị BT: 3,9-5,5 mmol/l Tăng

≥ 5,5 lúc đói : tiền ĐTĐ

≥ 7,0 lúc đói hoặc ≥ 11lucs bất kì :ĐTĐ

Tăng sinh lí : sau ăn Bệnh lí: ĐTĐ type I,II Giảm : hạ đường huyết( <

2,5) Giảm SL : nhịn đói Bệnh lí : tiêm insulin quá liều, u tụy ngoại tiết, cát dạ dày

Theo dõi và quản lí điều trị , chẩn đoán điều trị ĐTĐ

Cholesteron trong cơ thể : 80% ở

dạng este, 20% ở dạng tự do Cho

lesterol được tổng hợp ở dạng tự

do sau đó được este hóa bằng cahs

gắn với acid béo

Nguồn gốc :

- Ngoại sinh: thịt , gan, não, lòng

đỏ trứng.( cholesteron được hấp

thu ở ruột vào máu, được vận

chuyển dưới dạng lipoprotein)

Vai trò

- Là Tp cấu tạo màng TB, dịch

mật

- Tham gia tổng hợp hormon

steroid ( vỏ thận, sd)

- tạo lipoprotein

14

Định lượng cholesterol

TP

Nguyên tắc : enzym màu

Đậm độ màu phụ thuộc nồng độ cholesterol

Đo mật độ quang của phức hợp màu ở bước sóng 546 nm

Hút 1000µl thuốc thử ( 1ml)

Thêm 10 µl huyết thanh bệnh nhân

Lắc đều, ủ ở 370C trong 5p Lắc đều đem đo trên máy

Giá trị bình thường 3,9-5,2 mmol/l

Tăng : Rối loạn lipit máu nguyên phát, thứ phát sau đó ĐTĐ type II , viêm tụy, xơ vữa

ĐM, béo phì…

Giảm : cường giáp, suy gan,

Chỉ định vàng

da tắc mật, dấu hiệu 4 nhiều Hc thận hư, tiên

sử rối loạn

mỡ máu

Glucose oxydase Glucose + O2+H2O Gluconic +H2O2

Peroxydase H2O2 + phenol+4amino Antipirin Quinonein+ H2O ( phức màu hồng)

Cholesterol esterase ( enzym) Cholesterol este cholesterol +A.béo

Cholesterol oxydase

Peroxydase H2O2+phenol+4aminoatiprin Quinoein + H2O

( phức màu hồng)

Nguồn gốc:

Ngoại sinh: ăn uống nhiều dầu mỡ

Nội sinh tổng hợp tại gan, mô mỡ

Vai trò

-Dự trữ lipit

- Tạo lipoprotein

- Bảo vệ cá TB tham gia cấu tạo

màng

15

Định lượng triglycerid

TP

Nguyên tắc enzym màu Đậm độ màu phụ thuộc nồng độ triglycerid

Đo mật độ quang của phức hợp màu ở bước sóng 546 nm

Hút 1000µl thuốc thử ( 1ml)

Thêm 10 µl huyết thanh bệnh nhân

Lắc đều, ủ ở 370C trong 5p Lắc đều đem đo trên máy

Giá trị bình thường 0,8 – 1,7mmol/l

Tăng : rối loạn lipit máu nguyên phát, thứ phát sau ĐTĐ, viêm tụy, suy giáp

Giảm : cường giáp, suy gan, suy dd

Chỉ định : Rối loạn lipit máu

Vì nước tiểu có HP hơi axit nên

dùng thuốc thử là Bennodict

Glucose niệu gặp trong

+ bệnh toàn thân : ĐTĐ tụy, ĐTĐ

có các bệnh liên quân đến các

tuyến nội tiết khác nhau: u tuyến

yên

+ do các bệnh ở thận: HC

Fanconi( do giảm / mất khả năng

tái hấp thu Glu của ống thận)

16 Định tính Glucose niệu

Dựa trên nguyên tắc của phản ứng Fehling các monosaccarid khử Cu(OH)2 thành CuOH, chất này mất nước tạo thành Cu2O kết tủa đỏ gạch

PTPỨ:

Thuốc thử Benedict 2,5ml Nước tiểu 10 giọt

Lắc đều đun sôi 3p

dương tính khi có kết tủa đỏ gạch

binh thường có đường trong nước tiểu không? Tại sao?

TL: ko vì ngưỡng tái hấp thu đường của thận Khi nào có đường trong nước tiểu? tại sao

Lipase Triglycerid Glycerol + A béo Glycerokinase

Glycerol+ATP Glycerophosphat Glycerophosphat oxydase

Glycerophosphat dihydroxy Acetol phosphat

(PDA) + H2O2 Peroxydase

H2O2+ Clorophenol+4aminoantipirin quinoein+H2O

(Phức màu hồng)

Thể Cetongoomf những chất :

Acetoacetic, Aceton

hydroxybutyric

Bình thường có Ceton trong máu,

vừa đủ để cơ hoạt động và không

dư nên Ceton không có trong

nước tiểu

Ceton xuất hiện trong nước tiểu

khi bị đói đường

Glucose giảm khi nhịn ăn, đói

đường

Glucose tăng : ĐTĐ

17

Định tính ceton niệu bằng phản ứng Legal

Tìm chất cetonic trong nước tiểu bằng phản ứng Legal Các chất có chứa nhóm Cetol hay Andehyt khi tác dụng với Natri nitroprussiat trong môi trường kiềm cho phức hợp màu tím hồng

Nước tiểu 5ml Acid acetic đặc 5 giọt

Dd natri nitroprussiat 10%

5 giọt Lắc đều , để nghiêng ống

45 độ

Cho nhẹ nhàng vào thành ống nghiệm 1mk amoniac ( ~ 15-20 giọt) không lắc

để thẳng ống và quan sát

Dương tính nếu xuất hiện 1 vòng tím hồng ở mặt tiếp xúc giữa 2 lơp chất lỏng

Ý nghĩa: ceton niệu (+) trong bệnh ĐTĐ , viêm tụy , nôn nhiều

Chỉ định ĐTĐ

Nguồn gốc

- Nội sinh : sản phẩm thoái hóa

Hb tại lách và liên hợp tại gan

- Bilirubin Tham gia quá trình

khử độc gan

- Bilirubin Tạo sắc tố mất

18 định lượng Bilirubin

TP và Bilirubin

TT

Nguyên tắc : so màu Bilirubin kết hợp với thuốc thử Diazo trong môi trường acid mạnh tạo phức hợp

Dimethylsulfocid ( DMSO) màu tím Thuốc thử định lượng Bilirubin không có dung môi hòa tan Bilirubin tự

do

Đo Bilirubin TP Hút 1000 µl thuốc thử ( 1ml) ( Diazo)

Thêm 100 µl huyết thanh

Đo Bilirubin TT Hút 1000 µl thuốc thử ( 1ml) ( Diazo + dung môi) Thêm 100 µl huyết thanh

Ủ ở 37 độ trong 5p lắc đều, đo trên máy

Giá trị bình thường Bilirubin TP: <17,0 µmol/l Bilirubin TT: <4,5 µmol/l Tăng

Bilirubin TP : Trước gan: tan huyết( vàng

da sinh lí, bệnh hồng cầu dễ

vỡ, bất đồng nhóm máu, sốt rét )

Tại gan: viêm gan, xơ gan K gan…

Sau gan: tắc mật, sỏi mật

Chỉ định Vàng da