CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP c2

Enzyme cắt hạn chế• Hiện nay đã có hàng trăm các loại enzyme hạn chế khác nhau được phân lập và được thương mại hóa trên thị trường • Tên các enzyme hạn chế được đặt theo trật tự: tên ch

CÔNG NGHỆ ADN TÁI TỔ HỢP

Gene Technology

How do clone a gene?

Clones -> Cells or organisms

with identical DNA

Gene Technology

Enzyme cắt hạn chế

• Hiện nay đã có hàng trăm các loại enzyme hạn chế khác nhau được phân lập và được thương mại hóa trên thị trường

• Tên các enzyme hạn chế được đặt theo trật tự: tên chi, tên loài, tên giống vi khuẩn và thứ tự Ví

Gene Technology

Tần suất cắt của các enzyme hạn chế

• Có thế tính tần suất lý thuyết theo công thức:

độ dài giữa các vị trí cắt bằng 4 n

- trong đó n số base trong trình tự nhận biết đặc hiệu của enzyme hạn chế

+ Enzyme cắt 4 : 44= 256 bp + Enzyme cắt 5 : 45= 1 024 bp + Enzyme cắt 6 : 46= 4 096 bp + Enzyme cắt 8 : 48= 65 536 bp

Restrictionendonucleases Type II

Gene Technology

Restriction endonucleases -> cut ds DNA

Gene Technology

Restriction endonucleases -> cut ds DNA

Gene Technology

Restriction endonucleases -> cut ds DNA

Gene Technology

11

Gene Technology

DNA interacts with EtBr -> illuminated with UV light -> fluorescence signal

Electrophoresis – Restriction analysis (maps)

Gene Technology

Ligases -> form phosphodiester bonds

Gene Technology

Nucleases -> Dnase / RNases

Plasmid cloning vector

Gene Technology

Plasmid cloning vector

Gene Technology

Viral cloning vector -> Bacteriophages

Gene Technology

Gene Technology

Vector systems for Cloning

Gene Technology

The 5 basic steps of cloning

Gene Technology

If cut DNA coming from 1 fragment

-> just colonies with no insert +

colonies with the same insert ->

normal cloning step !!!

If cut DNA coming from different

fragments (whole genome of organism)

-> colonies with no insert +

Colonies with different inserts ->

library !!!

Within one colony all cells have the

same insert -> clones !!!

Development of a cloning strategy

Gene Technology

- Conjugation -> DNA transfer by cell – cell contact

- Transduction -> DNA transfer by bacteriopage infection

In Eukaryotes: -> used with fungi, animal and plant cells:

- Electroporation

- Microinjection

- protoplasts

Choosing the right start material:

Gene Technology

-> Type of DNA -> dependent of origin of DNA and purpose of cloning

1 Chromosomal DNA -> genes and regulatory elements of prokaryotes

-> regulatory elements of eukaryotes

2 cDNA (complementary DNA) -> genes of eukaryotes

-> Purity of DNA or RNA -> important for successful cloning

(proteins or RNA impurity)

-> impurity (RNA or DNA impurities) will also be

present in library

Choosing the right start material -> Plasmid DNA isolation

Gene Technology

Choosing the right start material -> preparation of cDNA

Gene Technology

1 Grow organism (eukaryotic) under

conditions to induce production of

protein (mRNA) of interest

2 Isolate mRNA

Eukaryotic cells use

RNA Polymerase II

for transcription of genes -> just RNA Polymerase II transcripts ( mRNA )

have a polyA tail !!!

Choosing the right start material -> preparation of cDNA

Gene Technology

1 Grow organism (eukaryotic) under

conditions to induce production of

protein (mRNA) of interest

2 Isolate mRNA

3 Create cDNA based on mRNA

Directional cloning of cDNA

Gene Technology

Gene Library

Gene Technology

Clones ->

genetically identical

DNA fragments part of the genome

-> Library of one organism

-> Used to screen for gene of interest

Check for successful cloning ->

Insertional inactivation

Gene Technology

Gene in cloning site:

• LacZ -> pUC18 (lacZ complements the host defect in lacZ)

-> pUC18 into host organism -> active lacZ

(β-galactosidase) -> cleavage of X-gal (blue colonies)

-> gene cloned into polylinker -> lacZα gene disrupted -> no cleavage of X-gal (white colonies)

Gene Technology

Different types of libraries

Gene Technology

Different types of libraries

1 Genomic Library -> represents the complete sequence of an organism

-> in prokaryotes: used to clone genes, promoters, …

-> in eukaryotes: used to clone promoters, regulatory elements

-> all fragments are almost equally represented in library

2 cDNA Library -> represents all genes expressed under these conditions

-> in eukaryotes: used to clone genes

-> all cDNAs are not equally -> depended on mRNA level of transcript

Gene Technology

Screening of Libraries -> Identification of gene of interest

1 Hybridization -> screening on nucleic acid level

Requirement -> “Probe”

Methods: 1 Plaque hybridization (Phage library)

2 Colony hybridization (bacterial library)

2 Phenotypic -> screening on protein level

Requirements -> full length gene expressed

Methods: 1 High throughput screening (enzymatic activity screening)

2 Antibody screening

• Small stretches of nucleic acid

oligonucleotide

• Single stranded

• Detects specific nucleotide

sequences in unknown nucleic

acid samples

Probe

Gene Technology

Screening of Libraries -> Identification of gene of interest

Blotting -> Transfer of nucleic acids to a filter (part of the hybridization procedure)

Gene Technology

Analysis of DNA

• Electrophoresis -> fragment sizes

• Hybridization and probes -> identification of

fragment within a pool of DNA (library) or a larger

Gene Technology

DNA Sequencing according to Sanger

Polymerase reaction -> with low amount of

dideoxyribonucleotides (ddNTP)

-> when ever ddNTP incorporated growing chain

terminated

Gene Technology

DNA Synthesis

Chemical Synthesis: reaction 3’-> 5’ (no phosphate on 5’-end)

-> oligonucleotides (ssDNA fragments in range between 15 – 120 bp)

Used for: -> primer for sequencing or PCR (ssDNA)

-> linker for cloning (dsDNA)

-> assembly of whole genes (dsDNA)

Gene Technology

Polymerase Chain Reaction (PCR)

• Specific amplification of DNA

• Involves a denaturing, priming (annealing), and

extension cycle

• 30 cycles are sufficient for detection of DNA

• Can be used to detect disease or infectious agents

1993 Kary B Mullis received the Nobel Prize in Chemistry

Gene Technology

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Annealing of primer dependent on Tm of primer -> annealing

temperature 2-5 degree below Tm

Extention temperature depend on polymerase -> some engineered ones are better at 68° C In general Taq polymerase best at 72° C

• Target DNA (around 10 ng)

• Taq Polymerase (from Thermus aquaticus -> thermostable)

Fidelity: -> rate of misincorporation

-> in DNA replication : 1 in 109 nucleotides (proof reading)

-> in PCR (Taq polymerase) : 1 in 2x104 nucleotides

Contamination -> Target DNA normal around 10ng

-> in principle PCR from one molecule possible

Gene Technology

Polymerase Chain Reaction (PCR)

1st Cycle

Result after 30 cycles -> just DNA between

the primers amplified

Gene Technology

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Gene Technology

Polymerase Chain Reaction (PCR) Modification of the ends for directed cloning of PCR product:

Reverse transcriptase dNTPs

Mồi nhẫu nhiên

Real-Time PCR Instruments

ABI PRISM® 7900HT

Nguyên tắc của TaqMan realtime PCR (1)

Hai phát hiện quan trọng là nguyên lý của PCR:

- Taq polymerase có hoạt tính exonuclease 5‘ → 3‘

- Thiết kế thành công các mẫu dò đánh dấu huỳnh quang

FAM: a reporter dye, TAMRA: a quencher dye

Nguyên tắc của TaqMan realtime PCR (2)

Khi mẫu dò chưa bị phá hủy, huỳnh quang của repoter dye sẽ bị hấp phụ bởi quenching dye

Trong phản ứng PCR, reporter and quencher dyes sẽ bị tách ra và huỳnh quang của reporter dye sẽ phát sáng và được đo bằng thiết bị đặc hiệu

Có nhiều reporter dye khác nhau với những bước sóng khác nhau VD: FAM là 518 nm Quá trình này xảy ra ở mỗi chu kỳ PCR.

6 Extension continues until the Polymerase

Meets the fluorescent molecule.

7 The polymerase breaks down

the tagged primer The fluorescent

tag and quencher molecule become

separated.

8 As PCR continues, the tagged primers

are degraded and “free” fluorescent

molecules accumulate

9 The detector records fluorescence as a

measure of amplification progress.

Phân tích số liệu

Dạng chuẩn của một mẫu phản ứng reatime PCR

RealTime PCR Amplification

http://www.gene-quantification.de/qpcrGuide-Stratagene.pdf

Mutagenesis

Mutagenesis -> change in DNA sequence

-> Point mutations or large modifications

In vitro mutagenesis: -> Point mutations

- Substitution: change of one nucleotide (i.e A-> C)

- Insertion: gaining one additional nucleotide

- Deletion: loss of one nucleotide

Applications of invitro mutagenesis

Approaches for Invitro Mutagenesis

-> site-directed mutagenesis

-> point mutations in particular known area

result -> library of wild-type and mutated DNA (site-specific) not really a library -> just 2 species

-> random mutagenesis (Directed Evolution)

-> point mutations in all areas within DNA of interest

result -> library of wild-type and mutated DNA (random)

a real library -> many variants -> screening !!!

if methods efficient -> mostly mutated DNA

Gene Technology

Site-directed Mutagenesis

-> mainly done by PCR (with Pfu)

-> only one mutation at specific

location introduced

-> requires knowledge of DNA

sequence

- Increasing amount of Taq

polymerase (Polymerase with NO

proof reading function)

Gene Technology

Some important protein products generated by recombinant DNA technology

1 Cloning by use of Topoisomerase I

DNA topoisomerase I -> functions as both a restriction enzyme and a ligase Its biological role is to cleave and rejoin DNA during replication

This enables fast ligation of DNA sequences with compatible ends

After only 5 minutes at room temperature, the ligation is complete and ready for transformation into E coli

2 Cloning by conjugation and recombinantion in E coli

Swap of fragment from one vector to another by the use of a lambda

recombinase

Gene Technology

Cloning by use of Topoisomerase I

Gene Technology

Cloning by conjugation and recombinantion in E coli

Gene Technology

Expression systems

Gene Technology

Expression systems

Gene Technology

Expression systems

-> Mainly in Prokaryotic systems

-> Mainly in Eukaryotic systems

Gene Technology

Expression systems Most Expression systems are inducible !!!!

In Prokaryotes (E coli) -> many of them are based on the lac regulation (LacI /IPTG)

-> lac system, tac system, T7 system,…

Selection markers: -> antibiotic resistance genes (AmpR, TetR, CmlR)

In Eukaryotes: -> more complex

-> expression in yeast, insect cells, mammalian cells (cancer cell lines) (-> advanced gene technology)

-> transgenic plants and animals

Selection markers: -> genes coding for metabolic enzymes (complementation) -> antibiotic resistance genes

-> genes coding for enzymes degrading toxic substances

Gene Technology

Expression systems

The Tet-off system:

Originally from E coli

Tetracycline resistance protein

(tet R ) coded on TN10 in E coli

Adaption for mamalien cells

-> novel transcription factor

(DNA-binding from TetR and

Activator domain from herpes

virus protein VP16) -> activator

Binds to tet operator when no

Phương pháp miễn dịch học phân tử

Nguyên tắc “chìa khóa + ổ khóa” = kháng nguyên + kháng thể

Cấu trúc của một phân tử kháng thể

Các lớp kháng thể

IgG IgD IgE

IgA (monomer or dimer) IgM (pentamer or hexamer)

Hapten+ protein tải = kháng thể

hapten

Quá trình tạo kháng thể điển hình

Qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng

Gene Technology

Monoclonal Antibodies

Antigen stimulates production of lymphocytes

(spleen cells) -> express antibodies

Fusion of lymphocytes with cancer cells (myeloma

cells) -> hybridoma cells

Selection for hybridoma cells:

Myeloma cells do not produce hypoxanthine

phosphoribosyltransferase (HPRT)

Lymphocytes are not alive over many generations

in culture

-> Selection for growth on hypoxanthine (HAT) ->

just hybridoma cells can survive

Monoclonal vs Polyclonal

Lot-to-lot consistency Lot-to-lot variability

Highly specific More Broadly Reactive

Limited Supply Indefinite Supply

High Development

Costs Lower Initial Costs

Often Less Sensitive Often More Sensitive

Which is Better??

cs517 ELISA2

Nguyên tắc SANDWICH ELISA

KN KN KN

Cơ chất

KT2 phát hiện gắn enzymMẫu

Đĩa ELISA

các vùng không gắn KTRửa

Đo bằng máy đọc màu

Coated Tube Format

• Detects to 0.01%

09/06/13 DE 88

Lateral Flow Format

Nguyên lý của que thử nhanh dựa vào kỹ thuật ELISA

Que thử nhanh virus cúm A và B

Ưu điểm của kỹ thuật ELISA

- Rất nhạy

- Nhanh, kỹ thuật thao tác khá đơn giản

- Kết quả ít bị ảnh hưởng do nhiễm

- Có thể làm một lúc nhiều mẫu

+ Sử dụng robot

+ Sử dụng máy cho kết quả 96 mẫu/lần phân tích + Định lượng

Các kỹ thuật phân tích đa hình DNA

• RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphisms

RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism)

Điện di so sánh kích thước của các đoạn DNA được hình thành sau khi cắt toàn bộ DNA của genome của một loài sinh vật bằng các enzyme hạn chế

5 Lai phân tử (southern blott) với các mẫu (probe) được

đánh dấu phóng xạ P32 hoặc không phóng xạ (huỳnh

quang) và phát hiện trên thiết bị hiện phim

RFLP

Các loại đa hình được phát hiện

Các chú ý khi lựa chọn RFLP

• Cần phải tách chiết được DNA có chất lượng tốt

• Cần phải phát triển các mẫu lai (probe) có thể

thu được đa hình – công việc này tốn kém

• Mất khá nhiều thời gian

• Nếu sử dụng lai phóng xạ thì cần thiết phải có phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn an toàn (hiện

nay đã có nhiều phương pháp lai không sử dụng phóng xạ).

• Cần phải có một lượng lớn DNA và thí nghiệm khó tiến hành tự động hóa mà phải tiến hành

đơn lẻ

Các kỹ thuật phân tích đa hình dựa trên

PCR

• “Phản ứng kéo dài chuỗi (PCR) nhân bản các

vùng DNA được xác định có biên giới là các

trình tự có thể kết hợp bổ sung với các đoạn mồi được chọn”

• Cần thiết:

- Phải có DNA khuôn mẫu

- Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (Taq)

- Các đoạn mồi (oligonucleotide primer(s)

(7-30nt)

- dNTPs + Mg++

Một số chú ý khi thực hiện PCR

• Không đòi hỏi chất lượng DNA quá cao

• Rất nhạy vì thế cũng rất dễ bị nhiễu do nhiễm

• Điều kiện của PCR cần phải được tối ưu và luôn kiểm soát

• Thí nghiệm nhanh có kết quả và không quá tốn kém

Kỹ thuật RAPD: random amplified

polymorphic DNA

- Thuộc loại chỉ thị sử dụng các đoạn mồi 10 – 12 bp để nhân PCR ngẫu các đoạn DNA từ khuôn mẫu là DNA genome

- Các đoạn DNA nhân bản được sẽ được phân tách bằng điện

di gel Agarose và phát hiện, so sánh sau khi được nhuộm

bằng ethidium bromide

Kỹ thuật RAPD

• RAPD là chỉ thị không xác định tuy nhiên có thể được

chuyển thành chỉ thị SCAR (Sequenced Characterized

Amplified Region Markers)

• Ưu điểm: là tiến hành nhanh, dễ, khá rẻ và các bộ mồi cho RAPD đã đươc thương mại hóa

Ví dụ về phân tích RAPD

Chỉ thị STS: Sequence Tagged Sites

• Là loại chỉ thị PCR sử dụng các đoạn mồi 20-25 bp

• Được phát triển lên từ xác định trình tự các đoạn DNA của các loại chỉ thị RFLP, RAPD, AFLP hoặc là từ trình

tự của các gen đã được xác định

• Nhân bản ổn định và dễ lặp lai được

• Thường là đã được xác định vị trí trong genome

• Dễ dàng tiến hành phân tích hàng loạt, tự động

• Tuy nhiên hiện nay số lượng chỉ chị STS cho đa hình

đã được phát hiện còn chưa nhiều