Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)

Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)

VIEN SINH THAI VA TAI NGUYEN SINH VAT

NGUYEN HA XUYEN

Nghiên cứu sản xuất, tinh sach Pfu DNA polymerase

tai to hop ttr Escherichia coli

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

LOI CAM DOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tác giả

Nguyễn Hà Xuyên

LOI CAM ON

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS Lê Quang

Hòa, trưởng phòng Kỹ thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người thầy đã luôn hướng dẫn, định hướng

và giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo trường Đại học Thái Nguyên cũng như các thầy cô thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các thầy cô Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy

và truyền thụ cho tôi kiến thức chuyên môn để thực hiện luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cô chị, các bạn đồng nghiệp và các em sinh viên phòng Kỹ thuật Gen đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong qua trình làm việc tại phòng thí nghiệm

Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ những người sinh thành, nuôi dưỡng tôi là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi suốt thời gian qua Cuối cùng tôi xin gửi lời cam on tới anh chị, bạn bè tôi đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Một lần nữa tôi vô cùng cảm ơn

Hà Nội ngày tháng năm 2015

Học viên

Nguyễn Hà Xuyên

CAC CHU VIET TAT

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 11

Tên viết tat

Coomassie brilliant blue Deoxyribonucleic acid Polymerase Deoxynucleoside triphosphate Escherichia coli

Ethylenediaminetetraacetic acid Ethidium bromide

Ethanol Isopropyl-thio-B-D-galactoside Kilo base

Kilo Dalton

Khéi luong phan tir

Luria — Bertani Mat d6 quang hoc (optical density) Polymerase chain reaction

plasmid plysS ma hdéa cho T7 lysozyme Phenyl methyl! sulphony] fluoride Ribonucleic acid

Sodium dodecyl sulphate Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis Soi don DNA (single stranded DNA)

Tris-acetate-EDTA

N, N, N’, N’-tetramethyl ethylendiamine

MUC LUC

CAC CHU VIET TAT wcscssscseescssesscassesscsetincsiersesneesssnessasetsseitendesnesdeinasasensditaniesnseedsnasasntsidetasaesdaesdsnassasnti iii

DANH MUC CAC BANG SU DỤNG TRONG LUẬN VĂN . s<sssecveseevsseerxeserrsserrsssrke vi DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN .-ces<c+rreseerrrxserrrkesrrrrke vii

L.1 — Téng quan vé DNA polymerase sccsssssessssesssssessssessssesssseessssessssessssesssssesessesssecssseesssvecesseessseceane 2 1.1.1 | DNA polymerase 6 sinh vat nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn ¿ z+c5s++ 3 1.1.2 Téng quan vé DNA polymerase bén mhiét sccccsccsssssssssecssssssessscesssssesssessssiueececsssnineeeseees 4 1:2, Tổng quan về Pu DNA POVMESE croncamma AERO ADORE 6

1221 Cấu trúc của HD NÀTpỌNTTETBSLiccceovicnosisbnikiEngAS10181151560565383061165660055355866156160805659//55 6

1.2.2 Cơ chế hoạt động sửa sai cia Pfu DNA polymerase

1/73, Một số tính chất của Pfu DNA polymerase

1.2.4 Ứng dụng của P# DNA polymerase

1.2.5 _ Tình hình nghiên cứu P/¿ DNA polymerase tái tổ hợp

2.1 _ Vật liệu, hĩa chất, thiết bị - + +k2+k£S k2 EEEEXEEE1127112111 111.11 T1 T11 T11 11 11g11 1y gyey 18

Qld, - YậEHÊUszzzssosarprnrrnrstotgiitotiddDDIAOOIOGIOLHHIGEORSDIGUDGEIIHHSNVGĐEGUAtaatitrasasg 18 2.1.2 Hĩa chất và thiết bị -+-5222+2+222E112222211222711122711122211112211111 1111 E1 cere 20

22 PHưGHE ĐHẨU sassssuuoaiaosdaddrddiditaildibitdlAlGA045ĐAEBARISGGINABIGSHISSHANLONHSHGSAASHSSGSHBNS.NWGiAAAlCHS 21 2.2.1 _ Tách chiết plasmid 22-©2< 2E++2EEEE2EX22271127112711122711 27112111 21 2.2.2 Nhân đoạn gen mã hĩa cho Pu DNA pol bằng phản ứng PCR :-c5s+ 21 20.3; Điện:di.DNA.trến:geÏ ggaFOSE: :s;sssessootybrrgsRoiatodtiogiltosDlGiGGAGS043300032038 002x008 23 2.2.4 Tỉnh sach bang kit Wizard SV Gel cccssssssessssssesssssssescosssescsssssecessssesesssesscssseeeessseceesssseseeass 23

2.2.5 Gh6p Oi get iececcccccssesssssessssesssseessssessssessssesesssessssecessesessecessssssvecsssesesseeesssesesteesssesesseeesssesess 23

2.2.6 Bién nap plasmid vao E coli bang phương pháp sốc nhiệt -¿©25sscc+2 24

227, ,VI0 HH HÌHfWĐNẨ:ziiatdgtiog0i00000000L 6 G0G0X0G0SE0VUWGGIENGSGINUWRNOaGM 25

2.2.8 Thiết kế vector biểu hiện gen mã hĩa cho Pu DNA pol -2:©25c2252222sevczxeezrrs 26

2.2.9 Biểu hiện gen mã hĩa cho P/ DA poI 22-222£22222E+2EEEEvEEEEvEEEEreErxrrrrxrrrrrerrres 26

2.2.10 Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE -©222c¿2222vcccccvvrrerrres 26 2.2.11 Sde ky ai luc qua cOt amylose .scssscsssssssesssseessseessssesssseessssessssessssesesseeesssesssseessseeesseeeessesees 27 2.2.12 Tinh sạch protein đuơi Histag bang Ni-charged Magbeads .cc.sssssssssessssessssesesseeesseeeess 28

2.2.13 Kiểm tra hoạt độ tong hop DNA ctia Pfu DNA pol tai t6 hop ssesssseesssecssseessseessseesessesess 28

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Vv

PHAN 3: KET QUA VA THAO LUAN wisssssssssscsossssssssssssssssssssansssesssssesstssvssanvbasansasassstsessatanusniasisconinstiins 29

3.1 Xác định trình tự gen mã hóa cho Ѓ; DNA pol từ tế bào mang vector pET 1la 29 3.2 Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho ?ƒ DNA pol c¿¿£2222522czz+t2cvvvecceeerr 36 3.3 Xây dựng quy trình tạo vector biểu hiện -2¿2¿++£+2E+++2EEE2SEEEEEEEEECEEEEtEEEErrrkkrrrrkrree 38 3.4 _ Lựa chọn chủng biểu hiện gen mã hóa cho Ѓ¿ DA pOÌ 6c tt sekrkeerrrerrvek 42 3.5 Tinh sạch protein Pu DNA pol tái tỔ hợp -2¿22+++2E++t2E+EeeEExeeErxeerrkrrrrrrrrrrrrrrrrcree 44

3.6 Thử hoạt tính Ѓz DNA pol tái tỔ hợp -2+22++222++22E++t2EExSEEEEEEEEtEEkxrrrrrrrrrkrrrrrrcee 47

PHAN 4: KET LUAN VA KIEN NGH sssccsssscsssscssseccsssccsnscssnsccsssccessecessecssnsccsnsccsnscsssecsenssesnsccesscesssees 49

PHU LY Cossessssesessasanswssncoese sevecenssusiasesensegessesvsvesse seveveresossasevaussgeswuseaverse saxcwenseorseweuee 51

Trình tự các cặp mỗi sử dụng trong luận văn

Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen mã hóa P/¿ DNA pol

Thành phần phản ứng nối ghép

Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE

Thanh phan phan img PCR thir hoat tinh Pfu DNA pol tai tổ hợp

DANH MUC CAC HiNH SU DUNG TRONG LUAN VAN

Kết quả điện di sản phâm PCR kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa Pƒu

DNA pol bang 2 cap méi T7- F/ Pfu - R1 và P/¿— F1/ T7- R

Sơ đồ thiết kế vector biéu hién gen ma hoa Pfu DNA pol

Kết quả điện di sản phẩm cắt Pfu va vector pMAL - c5X bang enzyme giới hạn trên gel agarose 1%

Kết quả PCR sàng lọc và tách chiết plasmid các dòng khuẩn lạc mang plasmid pMAL c5X —Pfu dién di trén gel agarose 1%

Kết quả biểu hiện protein Pfu DNA pol trong té bao E coli BL21(DE3)

va E coli BL21(DE3) pLysS dién di trén gel polyacrylamide 8%

Kết qua tinh sach protein MBP — Pfu bang xir ly nhiét điện di trên gel

polyacrylamide 8%

Kết quả tinh sach Pfu DNA pol tai tổ hợp điện di trên gel polycrylamide

Kết quả điện di sản phẩm PCR thử hoạt tinh Pfu DNA pol tai t6 hop trén

gel agarose 1%

38

39

4

MO DAU

Hiện nay PCR là một kỹ thuật phô bién trong sinh hoc phan tir nhằm nhân bản một đoạn

DNA trong ống nghiệm lên hàng triệu bản sao Kỹ thuật này có ứng dụng rất nhiều trong

các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như: chân đoán bệnh

di truyền, bệnh nhiễm trùng, tách đòng gen và xác định huyết thống Do tính chất lặp lại nhiều chu kỳ phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau, đặc biệt là sự bién tinh DNA 6 95°C nén

PCR đòi hỏi phải có các enzyme DNA polymerase bền nhiệt để đảm bảo việc xúc tác quá

trình nhân bản DNA được thực hiện dễ dàng và đặc hiệu

Pfu DNA polymerase dugc tach từ vi khuan cé siéu wa nhiét Pyrococcus furiosus sinh trưởng tối ưu @ 100°C Pfu DNA polymerase cực kỳ bền nhiệt, vẫn giữ được hơn 95% hoạt d6 ban dau 6 95°C trong mét gid Ngoai hoat tinh tong hop mach Pfu DNA polymerase còn có hoạt tính đọc sửa 3ˆ- 5” exonuclease làm tăng độ chính xác của quá trình tổng hợp DNA Hién nay Pfu DNA polymerase thuong mại có xác suất gắn sai một nucleotide khoảng 1,3.105 Độ chính xác trong quá trình tổng hợp DNA cua Pfu DNA polymerase cao hơn nhiều so với Tag DNA polymerase va duoc xem là một trong số ít enzyme có tốc độ tổng hợp ít lỗi nhất trong tất cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được nghiên cứu Chính

vi vay, Pfu DNA polymerase dugc sit dung phé bién dé khuyéch dai cdc san pham ding cho mục đích nhân dòng, biểu hiện hay nghiên cứu các đột biến cũng như tổng hợp gen [25]

Pfu DNA polymerase dong vai trò quan trọng trong phản ứng PCR nên việc thu nhận

enzyme này từ vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết Tuy vậy, việc thu nhận

chế phâm enzyme trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là không đơn giản vì các vi khuân này thường yêu cầu môi trường sinh trưởng đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và enzyme quan tâm chỉ được sản xuất ở một lượng rất thấp Trên thế giới đã có nhiều các công trình khoa hoc nghién ciru va tinh sach Pfu DNA polymerase tai tổ hợp nhưng vẫn gặp khó khăn do

sử dụng các biện pháp tỉnh sạch chưa tối ưu như Heparin có giá thành đắt [22], cột P11 phosphocellulose và cột mono Q qui trình sử đụng phức tạp [12] Ở Việt Nam cho đến nay chỉ có công trình nghiên cứu sản xuất Pƒ DNA pol từ E coli của Giáo sư Phan Tuấn Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 1

Nghĩa được thực hiện vào năm 2005 với qui trình tinh sạch qua sắc ký ái lực với Ni? và

Heparin Sepharose [1, 2] Tuy nhién Ѓ¿ DNA pol tạo ra lại ở dạng dung hợp với 20 a.a của vector nên có thể ảnh hưởng đến khả năng kéo dài DNA trong phản ứng PCR và hơn nữa qui tình tỉnh sạch bằng Heparin khá tốn kém mà lại không đặc hiệu Trước những nhược điểm và khó khăn trong việc tinh sach dé thu due Pfu DNA pol tinh khiết, hiện nay

có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm cải thiện khả năng hòa tan của protein tái tổ hợp

trong tế bào E coli, cũng như khả năng tính sạch cao khi sử dụng hệ biểu hiện tạo

hexahistidine-tagged maltose-binding protein qua việc sử dụng hệ vector biểu hiện pMAL [5, 39] PMAL là hệ vector biêu hiện cho phép protein tạo ra ở trạng thái tan do được dung hợp với maltose - binding proein (MBP) Ngoài khả năng tạo dạng tan của protein, MBP có

ái lực với amylose nên có thể dễ dàng tỉnh sạch protein dung hợp qua viêc sử dụng cột amylose Điểm cắt của Factor Xa ngay trước Pfu DNA pol gitip hoan nguyén Pfu DNA

pol Bên cạnh đó việc sử dụng Histag để tinh sạch bằng NÉ? ở đầu N lại không ảnh hưởng

đến hoạt tính cia Pfu DNA tái tô hợp [15] Với những ưu điểm trên, chúng tôi sử dụng hệ vector biểu hiện pMAL kết hợp đuôi His đề thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất, tinh

sach Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escberichia coli?? với mục tiêu sản xuất Pu DNA polymerase chất lượng cao góp phần tích cực trong việc phục vụ các nghiên cứu về sinh học phân tử trong nước

PHAN 1: TONG QUAN TAI LIEU

1.1 Téng quan vé DNA polymerase

DNA polymerase la nhóm enzyme xúc tác cho sự tổng hợp chuỗi polydeoxyribonucleotide từ các cơ chất là DNA sợi đơn làm khuôn, cặp môi, các deoxyribonucleoside triphosphat (dNTPs) và trong môi trường có ion Mg?*' Mỗi là một

doan oligonucleotide dai ttr 5 đến vài chục nucleotide có bản chất DNA hoặc RNA Trong

điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp, DNA polymerase kéo dài môi theo hướng 5°—› 3° bằng cách nối các nucleotide qua liên kết phosphodiester theo trình tự bổ sung với sợi làm khuôn tạo nên chuỗi DNA mạch kép Ngoài hoạt tính kéo dài chuỗi oligonucleotide hay còn được gọi là hoạt tính DNA polymerase, một số DNA polymerase còn có hoạt tính của nuclease với vai trò sửa chữa hoặc giúp cho quá trình tổng hợp DNA được thực hiện chính xác Trên thực tế để đảm bảo tính chuẩn xác cho quá trình sao chép DNA tế bào phải sử dụng

không chỉ một loại DNÑA polymerase [8, 20, 25]

1.1.1 DNA polymerase ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn

Cho đến nay, rất nhiều loại DNA polymerase (DNA pol) khác nhau ở cả sinh vật

nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn đã được phát hiện và nghiên cứu kỹ về tính chất, cấu trúc

cũng như chức năng Ở sinh vật nhân sơ điển hình là E cofi có tới 5 DNA pol khác nhau và được ký hiệu là DNA pol I, II, II, IV và V Ở sinh vật nhân chuẩn các DNA pol được phát

hiện sớm nhất là DNA pol ơ, B, ö, e và y Trong những năm gần đây, một loạt các DNA pol mới cũng được phát hiện ở sinh vật nhân chuẩn, đó là các DNA pol có khả năng sửa chữa các vị trí hỏng như DNA pol š, DNA pol n, DNA pol t, DNA pol k, Revl và một nhóm các DNA pol khác được gọi là DNA pol 9, DNA pol 4, DNA pol np, DNA pol o, DNA pol ® thực hiện các chức năng khác Việc phát hiện và nghiên cứu tính chất của các DNA pol khác nhau đã khẳng định rằng một loại DNA pol có thể không chỉ có một chức năng và quá trình tổng hợp DNA trong các cơ thể có thể cần đến không chỉ một DNA pol, mà tế bào có

thể sử dụng đồng thời một số DNA pol khác nhau cùng thực hiện một chức năng [ 14]

Phần lớn các DNA pol ở dạng phức hệ gồm nhiều chuỗi polypeptide chứa các tiểu đơn vị chức năng khác nhau, trong đó không thể thiếu tiểu đơn vị polymer hoá Các tiểu đơn vị khác chịu trách nhiệm cho hoạt tính xúc tác khác ví dụ hoat tính đọc sửa 3 ’-5’ exonuclease, 5-3” exonuclease, hoạt tính tổng hợp các mỗi RNA (primase) hay tương tác với yếu tố sao chép, phối hợp với kháng nguyên nhân tế bào đang phân hóa (proliferating Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 3

cell nuclear antigen - PCNA) v6i muc dich cudi cing 1a làm cho quá trình tổng hợp DNA

dién ra nhanh chong va chinh xac [20]

Dựa vào tính tương đồng về trình tự và sự giống nhau về cấu trúc, các DNA pol

được chia thành 7 họ khác nhau là: A, B, C, D, X, Y và RT [40] Mặc dù các DNA pol ở

các họ khác nhau có sự sai khác về mặt cấu trúc nhưng chúng cũng có một vài đặc điểm chung, chúng cuộn gấp thành hình dạng giống với bàn tay phải của người bao gồm 3 vùng khác biệt: “lòng bàn tay” (palm), “ngón tay cái” (thumb) và “các ngón tay” (fingers)

Trên cơ sở trình tự của DNA pol ơ, người ta đã phát hiện có 6 trình tự (I-VI) mang

tính bảo thủ cao trên các DNA pol ở cả sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus với

trật tự trên chuỗi polypeptide là IV-II-VI-IHI-I-V, còn khoảng cách giữa các trình tự bảo thủ

là khác nhau ở các loài khác nhau Trình tự I nằm ở vùng “lòng bàn tay” gần với vùng

“ngón tay cái” và chứa một trong các gốc axit aspartic bảo thủ tạo thành trung tâm xúc tác

của tất cả các DNA pol họ B đã biết (với motf YGDTDS) Axit aspartic khác thuộc trình

tự II có dạng DxxSLYPS nằm ở đầu của lá gấp cũng thuộc vùng “lòng bàn tay” Thuộc vùng này còn có SLYP-II mang tính bảo thủ cao, giữ vai trò quan trọng cho quá trình liên

kết đNTP Mặc dù các motif này là tuyệt đối bảo thủ ở các dưới họ DNA pol œ và DNA pol

ö nhưng ở DNA pol e lại có sự khác nhau đáng kể, motif trình tự I của DNA pol z là

ELDTDG còn trình tự II là DxxAMYPN Các gốc khác có vai trò trong quá trình liên kết

dNTP nằm ở trình tự III và chúng cuộn gấp thành xoắn ơ nằm ở dưới vùng “các ngón tay”

Trình tự IV nằm ở đầu N thuộc vùng có hoat tinh 3’- 5’ exonuclease Hai trinh tu bao thủ

khác V và VI tương ứng nằm ở các đưới vùng “ngón tay cái” và “các ngón tay” [20, 24] Mức độ bảo thủ cao về trình tự và cấu trúc của các vùng giữa các DNA pol sinh vật nhân chuân, sinh vật nhân sơ và virus chứng tỏ các DNA pol này xuất phát từ một gen tổ tiên chung Cấu trúc của chúng đã được tối ưu hoá qua quá trình tiến hoá để thích hợp với các chức năng chuyên hoá mà mỗi DNA pol thực hiện trong tế bào Các vùng bảo thủ nhất

chịu trách nhiệm cho các chức năng xúc tác cơ bản và cần thiết, trái lại các phần khác nhau

giữa các DNA pol tiễn hóa một cách độc lập để thực hiện các vai trò chuyên biệt [14,20]

1.1.2 Tổng quan về DNA polymerase bền nhiệt

Việc ra đời và ứng dụng của kỹ thuật PCR để nhân bản gen in vitro đã tạo ra sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu đến các DNA pol bền nhiệt Hàng loạt DNA pol

bền nhiệt từ các vi khuẩn ưa nhiệt đã được phát hiện, nghiên cứu và sử dụng cho PCR cũng

như các nghiên cứu khác của sinh học phân tử Hầu hết các DNA pol này đều hoạt động tốt

ở nhiệt độ cao và bền với nhiệt Chúng có khả năng xúc tác cho quá trình tổng hợp DNA ở

nhiệt độ thậm chí trên 70°C, cần thiết cho sự nhân bản đặc hiệu các đoạn DNA, cũng như chịu được nhiệt độ thậm chí trên 90°C, thích hợp cho việc biến tính DNA (tách các chuỗi

DNA thành các sợi đơn)

Các loại DNA polymerase bền nhiệt

* Ven: DNA pol được phân lập đầu tiên từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt Thermococcus litoralis được tìm thấy ở đáy đại dương với nhiệt độ khoảng 98°C Veør DNA pol là một DNA pol thuộc họ B, có trình tự giống với DNA pol ơ của người và DNA pol II của E coli hon la DNA polymerase I cua E coli [9] Enzyme nay là một protein có KLPT 90 - 93 kDa, enzyme kéo dài mỗi với tốc độ 67 nucleotide/giay Vent™ DNA polymerase bén nhiệt hơn so với Taq DNA polymerase va co kha nang kéo dai méi để thu được các sản

phẩm có độ dài 8-13 kb VenrTM DNA pol có hoạt tính 3°-5” exonuclease đảm bảo độ chính

xac cao hon 5-15 lan so véi Tag DNA polymerase Vent™ DNA polymerase ciing tao ra trên 90% các đoạn DNA đầu bằng nhờ đó làm đơn giản hóa quá trình nhân dòng trực tiếp các sản phâm PCR

Tma DNA polymerase 1a m6t protein có 893 a.a với KLPT 103 kDa, được tách ra từ khuẩn Gram âm Thermotoga maritima siêu ưa nhiệt, sống ky khí ở suối nước nóng, sinh truong 6 nhiét d6 trén 90°C Tma DNA polymerase giéng DNA polymerase I 6 E coli ở chỗ có cả hoat tinh 3’- 5’ exonuclease va 5’- 3’exonuclease Khi Tma DNA polymerase bi cắt đi một phần đầu thì tạo thành dạng enzyme thiéu hoat tinh 5’- 3’ exonuclease, giéng như mảnh Klenow và Stoffel, protein này vẫn còn hoạt tính polymerase cũng như hoạt tính 3’- 5° exonuclease Các nghiên cứu bước đầu cho thấy độ chính xác trong PCR của enzyme

này gần như 100% nhờ có hoạt tính đọc sửa [6]

«+ Pfu DNA polymerase được tách từ vi khuan c6 siéu wa nhiét Pyrococcus furiosus (Pfu) chiém ưu thế trong các chất lắng đọng của biển nóng ở Italia, sinh trưởng tối ưu ở Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 5

100°C Pfu DNA pol thuộc họ B, là một protein có 775 a.a với KLPT khoảng 91 kDa Trình tự a.a của Pfu DNA pol tuong déng voi DNA pol a DNA polymerase nay cuc ky

bén nhiét, van giữ được hơn 95% hoạt độ ban đầu ở 95°C trong một giờ Hoạt tính đọc sửa

3°- 5” exonuclease của P#¿ DNA pol làm tăng độ chính xác của qua trinh tong hop DNA Xác suất gắn sai một nucleotide của P#¿ DNA pol khoảng 1,3.105 Độ chính xác trong quá trình tổng hợp DNA cua Pfu DNA pol cao hon 8 lan so voi Tag DNA pol va duge xem 1a enzyme có tốc độ tông hợp ít lỗi nhất trong tat cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được nghiên cứu Chính vì vậy, P#¿ DNA pol được sử dụng phổ biến để khuyếch đại các sản

phẩm dùng cho mục đích nhân dòng biểu hiện hay nghiên cứu các đột bién Pfu DNA pol

cũng có thể phối hợp cùng với 7øq DNA pol để khuyếch đại các đoạn DNA có kích thước

lớn với độ chính xác lớn hơn nhiều so với khi sử dung Taq DNA pol don le [1,38]

1.2 Téng quan vé Pfu DNA polymerase

1.2.1 Cau tric ciia Pfu DNA polymerase

Pfu DNA pol 1a mt phan tit cé hinh donut v6i téng kich thuéc khoảng 50A'x 80A°x100 A’ Cau tric cia Pfu DNA pol ciing gan giéng voi cau tric kinh dién của các DNA pol ho B Pfu pol là một chuỗi đơn polypeptide của 775 a.a được phân thành 5 vùng cấu trúc riêng biệt: vùng N - terminal (1 - 130, 327 - 368), vùng 3’- 5’ exonuclease (131 - 326), vùng lòng bàn tay (369 - 450 và 501 - 588), vùng các ngón tay (451 - 500) và vùng ngón tay cái (589 - 775) (Hình 1.1) Vùng các ngón tay và ngón tay cái được xoay ra ngoài

33° va 24°, vi vay cau hinh téng thé cua Pfu DNA pol tuong tự như cấu trúc của KODI

DNA polymerase [17]

Hình1.1: Cấu trúc tổng thé ctia Pfu DNA polymerase [41]

Trong đó có 5 vùng riêng biệt: màu xanh da trời - vùng exonuclease, mau tim - ving

N - terminal, mau cam - ving long ban tay, mau xanh 14 cay - vùng ngón tay, màu đỏ - vùng ngón tay cái

Mặc dù cấu trúc của một vài DNA pol cổ đã được xác định nhưng những tìm hiểu chỉ tiết về độ trung thực và hoạt tính tổng hợp vẫn chưa được biết đến một cách đầy đủ Gần đây nghiên cứu về cấu trúc và đột biến của Pƒ DNA pol đã chỉ ra rằng cơ chế phối hợp giữa hoạt tính đọc sửa và hoạt tính tổng hợp liên quan đến sự tương tác giữa vùng loop của miền exonuclease và phần gờ tích điện dương của vùng ngón tay cái Tuy nhiên sự phá vỡ liên kết giữa hai ving nay cho phép Pfu DNA pol cé mét cấu hình mở phù hợp với chức năng sửa chữa hơn là chức năng tổng hợp Phần gờ của miền các ngón tay có vị trí tương đương với phần loop của exonuclease trong cấu tric tinh thé cia Pfu DNA pol Nhưng trong cấu hình mở tự nhiên lại không có bất kỳ sự tương tác trực tiếp nào giữa các vùng này

Cu tric cia Pfu DNA pol khi liên kết với DNA

Cấu hình đóng (khi liên kết với DNA) của P# DNA pol được mô hình hóa dựa trên

cấu trúc của protein Gp43 có hoạt tính gắn DNA [7]

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 7

Từ mô hình cấu tạo đóng, vòng loop của miền exonuclease và phần gờ của miền ngón tay cái nằm trong khoảng cách liên kết hydro Trong mô hình cấu tạo đóng, motif - hairpin (phần dư 243-248) của miền exonuclease được cho là nằm gần và cho phép tiếp xúc trực tiếp với miền ngón tay cái [37] Trình tự a.a của các motIf -hairpin cũng là duy nhất được tìm thấy trong DNA polymerase cô (Hình 1.2) Các motif -hairpin nằm ở khe nối của vùng liên kết DNA khuôn và vùng chỉnh sửa đóng một vai trò quan trọng trong chuyển đổi đầu kết thúc 3° của sợi mồi giữa vị trí trùng hợp và chỉnh sửa đang hoạt động để việc nhân bản được nhanh chóng và chính xác [L7]

240 250 380 390

› ý ov % PFU PKMWRIGDMTAVE SEEEYORRLRESYTGGFVK KOD1 PKIORMGDRFAVE DEKELARR ROSYEGGYVK D.TOK PKIQRMGDRFAVE DERELARR TESYAGGYVK TGO PKIORMGDRFAVE DERELARR RESYAGGYVK 9N? PKIORMGDRFAVE DERELARR RGGYAGGYVK

The Ê-hairpin motif The Y-GG/A motif

Hình 1.2: So sánh trình tự a.a và cấu trúc của motif B -hairpin (vùng exonulcease)

va motif Y-GG/A (vung ngon tay cai) Trong do: KOD, Thermococcus kodakaraensis DNA polymerase; D TOK, Desulfurococcus tok DNA _ polymerase; TGO, Thermococcusgorgonarious DNA polymerase; 9°N-7, Thermococcus sp.DNA polymerase; PFU, Pyrococcusfuriosus DNA polymerase [41]

Hầu hết các loop của DNA polymerase trong từng vùng từ cô khuẩn ưa nhiệt được rút ngắn so với các loài khác sống ở nhiệt độ thấp hơn hoặc trong môi trường ấm hơn (ví

dụ sinh vật nhân chuẩn), nhưng phần gờ của miền ngón tay cái trong vi khuẩn cô vẫn giữ

lại một đoạn của vòng loop dài mặc dù gặp phải áp lực tiến hóa về khả năng chịu nhiệt như

thế nào Các gờ được bảo tồn của miền ngón tay cái cho phép tương tác chặt chẽ với các khu vực khác nhau của miền exonuclease, hỗ trợ vai trò điều phối quan trọng của việc đọc

sửa và trùng hop [41]

1.2.2 Cơ chế hoạt động sửa sai của Pu DNA polymerase

Mỗi DNA polymerase cé thé duge phân vào lớp có chức năng nhân bản hay sửa chữa, cũng như là có lỗi hay dễ bị lỗi dựa trên đặc điểm riêng của từng DNA pol Các chức năng khác nhau của DNA pol trong sự tái bản DNA gồm việc polymerase gắn vào khuôn, vận chuyển nucleotide, đảm bảo độ chính xác và kéo dải chuỗi đã được đề xuất dựa vào cấu trúc bậc 2/ bậc 3 của DNA pol trong phức hợp với các khuôn DNA khác nhau [11] Vùng các ngón tay và vùng ngón tay cái thay đổi vị trí phụ thuộc vào việc polymerase được liên kết với DNA khuôn hay không [30] Những DNA pol không bị ràng buộc tạo thành những cấu trúc mở của vùng các ngón tay và vùng ngón tay cái, khi khuôn được gắn

vào 2 vùng này di chuyển xuôi về phía lòng bàn tay để giữ sợi khuôn/ mồi chặt hơn

Sự tổn tại của những vùng bồ sung ví dụ như vùng exonuclease là thay đôi giữa các DNA pol Trong trường hợp các DNA pol từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt bao gồm Pf DNA pol,

có 5 vùng gồm: vùng các ngón tay, vùng lòng bàn tay, vùng ngón tay cái, exonuclease va vùng N - terminal [17, 19] Vùng exonuclease thay đổi cấu trúc của nó tùy thuộc vào trạng

thái của việc DNA pol đang thực hiện tái bản hay sửa chữa DNA Khi một nucleotide bắt

cặp sai được liên kết vào sợi DNA tổng hợp mới, sợi khuén/méi gan vao polymerase yéu

hơn hoặc bị lệch với vị trí hoạt động của polymerase Cuối cùng chuỗi xoắn kép tháo ra và

nucleotide đã bắt cặp nhằm được di chuyển tới vị trí hoạt động của vùng exonuclease và

được cắt bỏ (Hình I.3) [36]

s3 ionamin nt activity 745" onnnneen activity

polymerases extends complemetary If Polymerase add: Synthesis continues from 5

strands from primers nucleotide, Mis pe

removed by proof to 3' direction,

Tai DNA pol bi rang buộc, cấu trúc đóng của vùng ngón tay cái làm cho đầu 3° của sợi mỗi không thê gắn vào vùng exonuclease do trở ngại về không gian chủ yếu gây ra bởi phần gờ của vùng ngón tay cái Chỉ có cấu trúc mở của vùng ngón tay cái mới cho phép

VIỆC gắn soi don DNA moi (ssDNA) vào vị trí hoạt động cua exonuclease Vi vay cấu trúc

tổng thể của mỗi vùng là sự kết hợp chặt chẽ với các vùng khác để thực hiện quá trình sao chép DNA

Cấu trúc vòng (loop) của vùng exonuclease là vùng bảo tồn mà chỉ có trong DNA pol của vi khuẩn cổ ưa nhiệt [27] Khi gây đột biến điểm vùng exonuclease làm cho vị trí của vùng này gần hơn với vùng ngón tay cái, sẽ ngăn cản sự liên kết đầu 3” của ssDNA với

vị trí hoạt động của vùng exonulcease, do vậy làm giảm hoat tinh 3’- 5’ exonuclease Vi

vậy cấu trúc mở tự nhiên của vùng ngón tay cái là cần thiết cho chức năng sửa chữa của polymerase [41]

1.2.3 Một số tinh chat ciia Pfu DNA polymerase

s* Độ chính xác và khả năng kéo dài chudi cla Pfu DNA pol

Pfu DNA polymerase được cho là hữu ích trong việc khuyếch đại gen với độ chính xác

cao những mục tiêu DNA lên đến 2,5 kb [22] Nghiên cứu tối ưu héa b6 dém véi Pfu DNA

pol để đánh giá xem sự chính xác của Pƒ¿ DNA pol có thể được tăng cường hơn nữa đã được nghiên cứu qua tý lệ gây lỗi trong PCR được so sánh khi thay đổi nồng độ MgSO¿, dNTP va giá trị pH khác nhau Kết quả cho thay rằng, Pƒ¿ DNA pol tạo lỗi ít nhất khi phan

ứng PCR được thực hiện với sự có mặt của 2 - 3 mM MgSOa, 100 — 300 uM mỗi loại

dNTP va khoảng pH từ 8,5 — 9,1 ở 25°C (tương ứng với pH 7,1 — 7,7 ở 72°C) Những điều kiện trên cũng là tối ưu đề thu được lượng sản phẩm PCR cao Trong khi đó, với cùng điều

kiện về nồng độ dNTP 1a 800 uM, su co mat cua 1 mM MgSO¿ lại tạo ra tỷ lệ lỗi cao hơn 3 lần so voi 2 — 10 mM MgSO, [21]

Pfu la DNA pol cé d6 trung thuc cao thong duge str dung cho PCR và có tỷ lệ lỗi trung bình là 1,3.105 đột biến/bp/phản ứng, chính xác hơn 7z DNA pol 8 lần [21] Độ

trung thực cao này là do Pfu pol cé hoat tinh doc stra 3’—5’ exonuclease Khi loại bỏ hoạt

tinh 3°—5” exnonuclease (exo — Pfu), trong diéu kién PCR cé mat cia dém Pfu PCR (2mM MgSOu, 200 1M mdi loai dNTP, pH 8,8) thi exo — Pfu co tỷ 1é 16i 1a 4,7.10°° cao hon Pfu

DNA pol 40 lần trong cùng điều kiện phản ứng Cũng trong điều kiện phản ứng trên nhưng khi thay đôi pH của đệm từ 8,§ xuống 8,0 thì tỷ lệ lỗi của exo — Pu DNA pol chi cao hon Pfu DNA pol 7 lan Nhiing kết quả trên cho thấy rằng, khi có hoạt tính 3’- 5’ exonuclease

và thực hiện PCR trong những điều kiện thích hợp P/# DNA pol là một trong số ít các

enzyme DNA pol bén nhiét cho tỷ lệ lỗi thấp nhất (Bảng 1.1)

Bảng 1.1: So sánh độ chính xác của các DNA polymerase bén nhiệt trong PCR

Các DNA Tỷ lệ sao chép lỗi Tỷ lệ sản phẩm

polymerase bền nhiệt (x10°) PCR bị đột biến (%)

trong PCR nhưng lại bị hạn chế bởi thiếu hoạt tính đọc sửa Pfu DNA pol co hoat tinh đọc

stra 3°—5’ exonuclease nhung lai cé hiéu qua thap trong viéc khuéch dai DNA do kha nang

kéo dài thấp Khi sử dụng P#¿ DNA pol lẻ để nhân đoạn gen 5 kb không cho kết quả đương

tinh Taq DNA pol cé kha nang tổng hợp đoạn 5 kb nhưng lại không tổng hợp được đoạn 7,4 kb Khi kết hợp hai enzyme trên với tỷ lệ 4 Tag: 1 Pƒ¿ cho phép tổng hợp được cả 2

đoạn 5 và 7,4 kb [2] Hiện tượng này liên quan đến hoạt tính 3'- 5° exonuclease của Pfu

DNA pol, khi có mặt cling voi Tag DNA pol trong phan ứng th Pfu DNA pol da giup loai

bỏ những nuecleotide bị đưa nhằm vào và làm cho quá trình kéo đài chuỗi được tiếp tục, nhờ đó nâng cao khả năng kéo dài chuỗi Tuy nhiên khi kết hợp 7aa DNA pol va Pfu DNA pol theo tỷ lệ 16 Taq: 1 Pfu dé khuéch đại đoạn 30 kb, hỗn hợp 2 enzyme này cho tỷ lệ lỗi

5,6.10°° (sir dung Tag PCR buffer) Ty 16 16i trén cao hon ty 16 cua Pfu pol 6 lần nhưng lại thấp hơn tỷ lệ lỗi của 7a DNA pol đơn lẻ 30% trong cùng một điều kiện PCR [21]

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 11

+* Ảnh hưởng của một số chất khác nhau lên hoạt động tổng hợp DNA của P¿ DNA pol

Sự có mặt của các chất có trong phản ứng PCR có ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt tính tổng hợp của Pu DNA pol

Nôồng độ đNTP thường được sử dụng trong phản ứng PCR là 20 — 200 iM Nong do

cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần các đNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Sự mắt cân bằng trong thành phần các

dNTP sé lam tang cdc 16i sao chép cua DNA polymerase Tuy nhién Pfu DNA pol hoat

động tốt khi có mặt của 100 — 250 uM mỗi loại đNTP [26]

Nồng độ MgCh là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR Mg”* rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xtic tac cho enzyme Pfu DNA pol, lam tang Tm cia DNA

mạch kép Mg?* 1a Co — factor cua Pfu DNA pol nén néu long Mg?* qua thap thi Pu

DNA pol sẽ không thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài, hạn chế quá trình kéo dài Ngược lại nồng độ Mg?” cao sẽ giúp ổn định sợi đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn của sản phâm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, nồng độ Mg?* cao có thể làm cho hiện tượng bat cặp giả xảy ra nhiều hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyên biét thap Pfu DNA pol hoạt động tối ưu trong môi trường có 2 mM Mg”* [33, 44]

NaN: từ lâu được biết đến là một chất kháng khuẩn tốt với nồng độ hiệu quả là 0,02%

(w/v) tức 3 mM, trong khi đó với phản ứng PCR có 0,1 - 3 mM NaN: không làm ức chế hoạt động của P# DNA pol Điều này cho phép bổ sung NaNa ở nồng độ 3 mM vào chế phẩm P/#¿ DNA pol để chống nhiễm khuẩn khi cần thiết mà không làm ảnh hưởng đến hoạt

tính xúc tác của enzyme [1,3]

Tương tự như vậy thì NaF ở nồng độ 1-50 mM, monocaprin ở nồng độ 2-50 mM, heptyl paraben ở nồng độ 10- 80 mM đều không ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp DNA cia Pfu DNA pol Ngugc lai, kém sunphat (ZnSOx) ở nồng độ 0,5 mM và EDTA ở nồng

độ 2 mM trở lên đã ức chế mạnh hoạt động của P#¿ DNA pol Tác dụng ức chế của EDTA

liên quan đến hoạt tính tạo phức của EDTA với ion Mg?* vốn rất cần cho hoạt động tổng hợp DNActa Pfu DNA pol cũng như các DNA pol khác [1]

s* Độ bền nhiét cua Pfu DNA pol

Pfu DNA pol duoc phan lap từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt có độ bền nhiệt rất cao vì vậy khi san xuat Pfu DNA pol tái tổ hợp, độ bền nhiệt là một chỉ tiêu vô cùng quan trọng để Pƒu DNA pol có thể ứng dụng được trong PCR với các điều kiện gia nhiệt biến tính DNA ở

nhiệt độ cao cũng như thời gian kéo dai Vi mét Pfu DNA pol tai tổ hợp có gắn thêm đuôi 6His ở đầu N - terminal van giữ được hoạt tính tổng hợp sau 1 giờ để ở nhiệt độ phòng (25

- 30°C) hay xử lý nhiệt ở 100°C Tương tự, việc giữ enzyme ở nhiệt độ phòng trong vòng 4 ngày sau đó thử hoạt độ qua khả năng nhân bản DNA bang PCR cho thay Pfu DNA pol tai

tổ hợp vẫn duy trì hoạt tính nhân bản tốt như giữ ở -20°C [2]

s* Một số tính chất khác của Pu pol

Nhu da biét, Tag DNA pol cé hoat tinh terminal transferase cho phép gan thém gốc

adenosine monophosphat (A) vao đầu 3° của đoạn DNA sợi kép [13] Chính vì đặc điểm

này mà các sản phâm nhân bản PCR dùng 7øa DNA pol có thê được đưa vào vector hở có gốc T ở hai dau 3’, dựa trên sự ghép cặp đặc hiệu gữa A và T Trong khi đó sản phâm nhân ban bang PCR ding Pfu DNA pol lai c6 dau bang Viéc tao ra sản phẩm có đầu bằng tạo thuận lợi cho việc nối gen vào những vector cũng có đầu tù mà không cần phải dùng đến

một loại enzyme cắt giới hạn nào cả

1.2.4 Ung dung ciia Pfu DNA polymerase

Chức năng chủ yếu của các DNA pol 1a téng hop chudi polynucleotide va sửa lỗi bằng cách loại bỏ các nucleotide không bổ sung với sợi khuôn, đảm bảo cho quá trình tự nhân đôi của DNA được diễn ra một cách chính xác Phần lớn các DNA pol dùng DNA để làm khuôn cho sự tổng hợp Tuy vậy, cũng có DNA pol đặc biệt có khả năng phiên mã ngược sử dụng khuôn là ARN để tổng hợp DNA (7h DNA polymerase) [12] Ngoài ra, cũng phải kể đến một hoạt tính terminal transferase của một số DNA pol cho phép gắn nuleotide vào đầu phân tử DNA có sẵn Nhờ những tính chất này mà các DNA pol được ứng dụng rộng rãi trong sinh học phân tử

Ứng dụng phổ biến nhất của DNA polymerase chính là dùng trong việc xác định

trình tự nucleotide các gen Bằng việc dựa trên DNA khuôn để tổng hợp các đoạn sợi

DNA mới chỉ khác nhau một nucleotide mà người ta có thé dé dang giải được trình tự của Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 13

DNA Điều này chỉ đảm bảo chính xác khi DNA pol dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới tuân thủ nguyên tắc bô sung một cách nghiêm ngặt

Nhân bản các gen hay DNA bằng kỹ thuật PCR là ứng dụng phổ biến thứ hai của

các DNA pol Cho đến nay, kỹ thuật PCR trở thành một phương pháp thường ngày và không thể thiếu trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử hay kỹ thuật gen Điều này

cũng nói lên rằng, các DNA pol, mà cụ thể là các DNA pol bền nhiệt luôn luôn được cần

đến

Ung dung Pfu DNA pol trong PCR cần độ chính xác cao: Trong nhiều ứng dụng sinh học phân tử bao gồm nhân bản, các đột biến có hướng và dịch mã DNA là rất quan

trọng để bảo tổn các chuỗi DNA chính xác trong việc nhân bản PCR Một nucleotide kết

hợp không chính xác có thé thay đổi codon tương ứng và kết quả là việc bổ sung các a.a sai trong quá trình dịch mã Điều này có thể ảnh hưởng đến tính gấp và chức năng của protein Ngoài ra, việc xóa một nucleotide có thê phá hủy các khung đọc đúng Pu DNA pol có độ trung thực cao nhất trong các polymerase chịu nhiệt Tỷ lệ lỗi cua Pfu DNA pol thap hon khoảng 8 lần so với polymerase 7aq DNA pol Vì vậy P/¿ DNA polymerase có ứng dụng quan trọng trong PCR cần độ chính xác cao [38]

Sử dụng P# DNA pol trong PCR tạo các gen tông hợp: sử dụng phương pháp PCR

2 giai đoạn (two step — PCR) để tạo nhanh các đoạn gen tổng hợp dựa trên cơ sở những nucleotide chồng lên nhau (overlapping) có thể tạo ra đoạn cần tổng hợp thông qua nhiều chu kỳ khuếch đại PCR [29] Người ta có thể thiết kế một gen tổng hợp có chứa codon tối

ưu được dung dé biểu hiện protein trong cơ thể sinh vật hoặc gen tông hợp được thiết kế để

thêm vị trí cắt hạn chế tạo điều kiện thuận lợi cho các thí nghiệm vé sau Nguyên tắc của

PCR 2 giai đoạn là hai phản ứng PCR xảy ra liền nhau, phản ứng thứ nhất tạo ra khuôn tương ứng với gen tổng hợp và sau đó được khuếch đại trong phản ứng PCR thứ hai Dé tạo độ chính xác cho đoạn gen tổng hợp và các đoạn oligo có thể overlap lên nhau tạo ra đoạn gen hoàn chỉnh thì enzyme thực hiện phản ứng kéo dài không được tạo đầu lồi (có dư nucleotide A) nhu Tag DNA pol Vi vay Pfu DNA pol 1a enzyme phu hop nhat cho muc tiêu tổng hợp gen

Việc sử dụng PCR trong phân tích các mau DNA chat lượng kém và nhiễm bẩn ví

dụ như mẫu máu được di truyền pháp y ứng dụng triệt để Trong phản ứng với nồng độ Mg”' cao, Pƒu¿ DNA pol có khả năng nhân một đoạn gen từ DNA genome trong môi trường

chứa đến 14% máu Với khả năng khuếch đại cao và hoạt động tốt trong điều kiện mẫu

máu khác nhau, Pfu DNA pol dugc img dung trong các phòng thí nghiệm lâm sàng đề phân

tích tính đa hình của các sợi đơn DNA (SNP§) trong các mẫu máu [19, 32]

Nhân đoạn gen có % GC cao: đối với các gen mục tiêu có tỷ lệ GC cao việc thiết kế

chương trình nhiệt để khuếch đại các đoạn gen này cũng phải được chú ý để không xảy ra

hiện tượng bắt cặp không đặc hiệu khi nhiệt độ gắn moi thap Do Pfu DNA pol van giữ được 94 — 95% hoạt tính sau 1 giờ ở 100°C nên việc nhân các đoạn gen trên ở nhiệt độ cao

trở nên vô cùng dễ dàng mà không phải lo việc enzyme có bị mất hoạt tính hay không [32]

1.2.5 Tinh hinh nghién ctru Pfu DNA polymerase tai t6 hop

Pfu DNA polymerase dong vai tro quan trong trong phan tmg PCR nén viéc thu nhận

enzyme nay ttr vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết Tuy vậy, việc thu nhận

chế phẩm enzyme trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là không đơn giản vì các vi khuẩn này

thường yêu cầu môi trường sinh trường đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và enzyme quan

tâm chỉ được sản xuất ở một lượng rất thấp Vì vậy sản xuất enzyme này bằng công nghệ protein tái tổ hợp hiện đang là giải pháp ưu việt nhất và đã có nhiều công trình khoa học nghién ciru san xuat Pfu DNA pol

“ Trên thế giới

Có rất nhiều các nghiên cứu với mục đích tạo ra các DNA pol bền nhiệt có hoạt tính

cao đề ứng dụng trong PCR Cho đến năm 1991, Marthur và cộng sự đã nhân dòng gen mã hoa Pfu DNA polymerase tir Pyrococcus furiosus

Đến năm 1997, Lu va Erickson da biéu hién thanh céng Pf DNA pol trén té bao E coli BL21 DE3 (pLysS) Trong nghién ctru cuia Lu va Erickson da str dung vector pET11 dé tao

Pfu tai t6 hop va tién hanh tinh sach bang cach gia nhiét ở 70 °C tiếp đó sử dụng cột P11

phosphocellulose va cột mono Q Với phương pháp trên nhóm tác giả đã thu được 3,7 mg

Pfu DNA pol tinh sach tir 1 lit dịch nuôi tế bảo cùng độ tính sạch là 97% và hoạt độ 22.500 unit/mg Mot don vi hoat d6 cua enzyme (unit) dugc tinh bang lượng enzyme xúc tác cho

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 15

sự kết hợp của 10 nmol đeoxyribonucleotides vào một đoạn polynucleotide trong 30 phút

ở 72 °C Kết quả tuy thấp hơn việc thu P/z DNA pol trực tiếp từ chủng Pyrococcus

uriosus (31.713 unit/mg) và biểu hiện qua baculovirus (26.000 unit/mg) nhưng tốc độ kéo dai chuéi cua Pfu DNA pol tai t6 hợp lại cao hơn so với Pfu DNA pol cé nguồn gốc từ tự nhiên [31, 33] Ưu điểm của phương pháp này là protein tạo ra mang đúng trình tự a.a mã hóa cho P#¿ DNA pol mà không chứa thêm bất kỳ một a.a nào của vector biểu hiện, điều này tạo ra Pu DNA pol cuộn xoắn theo đúng cấu trúc tự nhiên và không ảnh hưởng đến

hoạt tính xúc tác của Pƒ#¿ DNA pol tai tổ hop Tuy nhién viée tinh sach Pfu DNA pol tai tổ

hợp gặp khó khăn và đất tiền do phải sử dụng hệ thống tự động để thu các phân đoạn khi tinh sạch bằng PII phosphocellulose và cột mono Q và lam mat mat một lượng lớn

enzyme trong quá trình thực hiện các bước tinh sạch [13]

Để đơn giản hóa quá trinh tinh sach Pfu DNA pol tai t6 hop, nim 1998 Dabrowski va

Kur da nghién ctru biéu hién 6Histag — Pfu trong té bao E coli qua vector biểu hiện pET30LIC Vi protein tao ra cé 6His 6 dau N- terminal nên việc tỉnh sạch chỉ tiến hành qua bước gia nhiệt và sử dụng duy nhất cột Ni?* - TED Sepharose Kết quả sau biểu hiện và tinh sạch theo phương pháp này cho phép thu được một lượng P/¿ DNA pol nhiều hơn 6 lần (24 mg/ 1 lít dịch nuôi) so với nghiên cứu của Lu và cộng sự ở trên và hoạt độ enzyme thu được tương đương với Pƒ#¿ DNA pol từ P furiosus (31.000 unit/mg) Các kết quả cũng

cho thấy rằng khi có thêm đuôi 6His ở đầu N - terminal, P#z DNA pol vẫn có hoạt tính

tổng hợp chuỗi như Pƒ¿ DNA pol tự nhiên và vẫn giữ được hoạt tính tông hợp sau 8 giờ gia nhiệt ở 98°C [15,38] Bên cạnh những nghiên cứu về P#¿ DNA pol, nhóm tác giả cũng đã chứng minh phương pháp trên cho kết quả tương tự khi áp dụng với Pwo — một DNA pol

có độ tương đồng về nucleotide gần như 100% với Pƒ#¿ DNA pol [4, 15] Qui trình tinh

sạch thu được lượng protein nhiều, tuy nhiên việc chỉ tinh sạch bằng gia nhiệt và ái lực với

Ni??? vẫn chưa đủ tinh khiết dé phục vụ các thí nghiệm về sinh học phân tử

Năm 2013, Ji Hye Heo va céng su da su dung semi — nested PCR dé nhan doan gen ma

héa cho Pfu DNA pol tir chinh DNA cé 1an trong hén hop Pfu DNA pol thuong mai va

biểu hiện thành công trên E coil BL21 DE3 voi hé vector pET21(b) Pfu DNA pol tai té

hợp được thu bằng cách gia nhiệt ở 100 °C trong 10 phút để ly giải và biến tính các protein

cua E.coli sau đó tỉnh sạch bằng sắc ký qua cột heparin Ưu điểm của phương pháp này là

chỉ cần 1 - 2 giờ để có thể tinh sạch Pfu DNA pol khi su dung một loại đệm, nhưng hóa

chat Heparin str dung cho tinh sạch có giá thành cao mà lại liên kết đặc hiệu không chỉ với voi Pfu DNA pol ma con DNA pol cua tế bào vi khuẩn, do vậy enzyme thu được vẫn còn lẫn tạp đo chỉ sủ đụng một bước sắc ký ái lực [23]

s* Tại Việt Nam

Mặc dù trên thế giới đã có rất nhiều các công trình khoa học nghiên cứu sản xuất Pu DNA pol tái tổ hợp nhưng tại Việt Nam cho đến nay mới chỉ có 1 công trình nghiên cứu

san xuat Pfu DNA pol tái tổ hợp trên Escherichia coli của Giáo sư Phan Tuấn Nghĩa và

cộng sự được thực hiện vào năm 2005

Trong nghiên cứu của nhóm tác giả đã sử dụng vector pET28a để biểu hiện và kết hợp

trình tự 6His vào đầu N của Pfu DNA pol, tao diéu kiện cho viéc tinh sach enzym qua cột

sắc ký ái lực Ni - Agarose Việc phát hiện ra kha nang bam ctl Pfu DNA pol vao gel Heparin -Sepharose và bố sung thêm bước sắc ký ái lực qua cột này một lần nữa loại trừ khả năng lẫn các protein không mong muốn trong chế phẩm Pfu DNA pol Qui trinh tinh

sạch được thiết lập đã thu duge 25-26 mg Pfu DNA pol tinh khiết từ 1 lit dịch tế bào E coli

nuôi cấy VỚI tổng hoạt độ khoảng 40.000 unit, tương tự như hiệu suất mà Dabrowski và Kur (1998) thu được khi dùng với hệ thống vector pET30LIC Mặc dù qui trình thu được

lượng lớn Pu DNA pol trên nhưng thực hiện qua giai đoạn tính sạch sử dụng Heparin

Sepharose có giá thành cao mà lại không đặc hiệu do Heparin có thể liên kết voi cac DNA

pol của tế bào vi khuẩn chủ [1, 2] Ngoai ra Pfu DNA pol tao ra lại mang thêm một đoạn khoảng 20 a.a của vector pET28a ở đầu N, đoạn a.a này có thể làm ảnh hưởng đến khả năng cuộn xoắn, tổng hợp chuỗi DNA của enzyme

Vì vậy các nghiên cứu sản xuất Pƒ#¿ DNA pol trên thế giới và ở Việt Nam vẫn tồn tại

nhiều nhược điểm và khó khăn trong việc tinh sạch dé thu dugc Pfu DNA pol dam bao tinh

khiết Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu với mục đích làm tăng khả năng

hòa tan và tinh sạch protein tái tổ hợp cho hiệu suất cao và tinh khiết từ tế bào E coli với

hexahistidine-tagged maltose-binding protein (HistagMBP) khi su dung hé vector pMAL

[5, 39] Hé vector biéu hién pMAL có những ưu điểm như: protein tạo ra ở trạng thái tan

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 17

hoàn toàn khi được dung hợp với maltose - binding protein, có thể dễ dàng tỉnh sạch qua

việc sử dụng sắc ký ái lực qua cột amylose với chi phí rẻ, protein đích được hoàn nguyên

bằng Factor Xa nằm ở ngay trước đầu N của protein tái tổ hợp Bên cạnh đó việc sử dụng

Histag dé tinh sạch bằng Ni”? ở đầu N lại không ảnh hưởng đến hoạt tính của Pu DNA tái

tổ hợp Do vậy chúng tôi đã kết hợp sử dụng hệ vector pMAL gắn thêm đuôi (His)s để nghiên cứu sản xuất và tinh sach Pfu DNA polymerase chất lượng cao sẽ góp phần tích cực trong việc phục vụ các nghiên cứu về sinh học phân tử trong nước

PHAN 2: VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU 2.1 Vật liệu, hóa chất, thiết bi

2.1.1 Vật liệu

s* Nguyên liéu: chung £ coli mang plasmid pET 11a chira gen ma hda cho Pfu dugc cung cấp bởi Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; DNA genome chủng Lisferia monocyfogenes EGD-e dùng làm khuôn cho

phản ứng thử họat tính Pfu tai té hợp

Chung vi sinh vật: chủng E coli Top 10 duoc str dung dé tach dong gen mã hóa cho

Pu, chủng E coli BL21 (DE3) và chủng E coli BL21 (DE3) pLysS được sử dụng để biểu

hiện protein Pƒ; DNA pol đều của hãng Thermofisher (Hoa Kỳ)

s* Các vector: vector biểu hiện pMAL-e5X (5677 bp) của hãng New England Biolabs (ÑEB) (Anh)

s*Các cặp môi: các môi thiết kế đều được đặt tổng hợp từ hãng Macrogen (Hàn Quốc), và PHUSA Biochem (Việt Nam)

+Cap mi Pfu F-His/ Pfc R ding dé nhan gen, chon déng va biéu hiện gen Trình tự

mỗi được thiết kế dura vao trinh tu gen ma hoa cho Pfu DNA pol đã được xác định trình tự

DNA

+Hai cip méi T7-F/T7-R va Pfu-F1/Pfu-R1 ding dé chọn dòng và giải trình tự gen được thiết kế dựa trên trình tự của vector pET11a và trinh ty gen ma héa cho Pfu DNA pol +Cặp mỗi pMAL — F/ pMAL — R dùng để chọn dòng tế bào biểu hiện được thiết kế

dựa trên trình tự của vector pMAL - c5X

+ Cặp mỗi LmA/LmB dùng trong phản ứng thử hoạt tinh Pfu DNA pol tái tổ hợp cho kích thước đoạn gen 234 bp

Bang 2.1: Trình tự các cặp mỗi sử dụng trong luận văn

STT | Tên môi Trinh tu (5’-3’)

1 Pfu-F His | CACCATCACCATCACCATCATCACGGTATGATTTTAGA

acetic, acrylamide, bis-acrylamide, TEMED, APS, SDS; hoa chat cam ung: IPTG (Sigma,

Mỹ); kit tỉnh sạch sản phẩm PCR trén gel: Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, MY), kit tinh sach sin phim PCR: GeneJET Genomic DNA Purification (Thermofisher, Hoa Kỳ), thang chuẩn DNA (Fermentas, Mỹ), thang chuẩn protein

- Enzyme:Q5 Hot Start High-Fidelity DNA polymerase (NEB),Taq DNA polymerase, enzyme gidi han NcoI va XmnI (NEB, Anh), T4 Ligase (Fermentas, My), RNase

s* Thiết bi

Các máy, thiết bị đều đang trong thời gian được kiểm định chuẩn, bao gồm:

- Máy chu kỳ nhiệt 96 mẫu (Eppendorf, Đức);

- May soi chup anh gel (BioRad, My);

- B6 dién di DNA Horrizontal mini (CBS Scientific, MY);

- Máy đồng hóa bằng siêu âm Sonics Vibra cell (VCX130, MIDSCD;

- Bộ điện di protein (Bio-rad, Mỹ);

- Máy cô đặc mẫu (Thermo Fisher, Mỹ);

- May quang phé NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, My);

- Nồi khử trùng (Harayama, Nhật Ban);

- Cân phân tích CPA 324S (Satorius, Đức);

- Tủ cấy vô trùng Class II Type Az(ESCO);

- Máy lắc đảo ngược Mini laboroller (Labnet);

- Máy lắc 6n nhiệt DTU-2C (Taitec, Nhật Bản);

- Máy lắc 6n nhiét (eppendorf, Mỹ);

- May li tam lanh Eppendorf Legend XIR (Thermo Fisher, Mỹ);

- May ly tam (Eppendorf, CHLB Duc);

- Lồ vi sóng (Samsung);

~Tủ lạnh (0-4°C) (Toshiba, Nhật);

- Tu lanh Biomedical Freezer (Thermo Fisher, My);

- May vortex (Rotolab, OSD; May do pH (HI 8424, HANNA Instruments);

- Micropipette cac loai Gilson (Phap) va Biohit (Phan Lan)

2.2 Phuong phap

2.2.1 Tach chiét plasmid

Quy trình tach chiét DNA plasmid nhu sau: Cay chuyển 1 khuẩn lạc mang plasmid cần tách vào trong éng falcon 50ml chtra 5 ml méi trường LB có bồ sung Amp+ (100 tig/ml), nuôi lắc qua đêm ở 37°C, 120 vòng/phút Chuyên 1,5 ml dich nuôi cấy vào ống Eppendorf loại 1,5

ml, ly tam 3 phút tốc độ 12000 vòng/phút Loại bỏ dịch nồi thu tế bảo Lặp lại bước thu tế bào một lần nữa Rửa cặn tế bảo bằng 1 ml H20 deion, ly tam thu can Hoa đều tế bào thu được với

100 pl dung dich Sol A (50mM Tris-HCI pH 7.5; 10 mM EDTA) bang cach vortex nhanh.Bé

sung 100 pl dung dich Sol B (0.2 M NaOH; | % (w/v) SDS), dao đầu ống Eppendorf nhanh, nhẹ

nhàng để tránh đứt gẫy DNA, ủ nhiệt độ phòng 2 phút Bồ sung tiếp 100 pl dung dich Sol C

(1.32 M potassium acetate (CHzCOOK pH 4,8) và đảo nhẹ 5 lần, trong hỗn hợp sẽ xuất hiện kết

tủa trắng Ly tâm 5 phút với tốc độ 14000 vòng/phút Thu dịch nổi và chuyên sang ống Eppendorf mới Cho 1 ul RNAse, ủ 37 °C 30 phút đề loại bỏ hết RNA trong mẫu Bồ sung 125

ul dung dich 5M guanidine thiocyanate, trộn thật đều và đưa lên cột Ly tâm cột 14000 vòng/phút, I phút, loại dịch ở tube phía bên dưới Đặt lại cột lên tube, rửa cột bằng 500 pl Sol E

(10 mM Tris pH 7,5; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 50% EtOH), ly tam 14000 vong/phit đề loại

dich Lap lai bước rửa cột 2-3 lần Ly tâm khô màng ở 14000 vòng/phút, chuyển cột sang ống

Eppendorf 1,5 ml mới, ủ cột ở 65%C cho cồn bay hơi hết Cho 50 Iul H2O vào giữa cột, ủ 2 phút,

ly tâm thu dịch chứa DNA plasmid và đo nồng độ DNA bằng máy Nanodrop Kiểm tra bằng cách điện di 8 ul trén gel agarose 1%

2.2.2 Nhân đoạn gen mã hóa cho P# DNA pol bằng phản ứng PCR

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 21

PCR (Polymerase chain reaction) dugc phat minh boi Kary Mullis (Mulliset al., 1986), là phương pháp tổng hợp lượng lớn DNA dựatrên mẫu khuôn (một trình tự DNA đích ban đầu) Thông thường, một phản ứng PCR gồm một chuỗi từ 20-40 chu kỳ, mỗi chu

kỳ có ba bước: biến tính, gắn mỗi và kéo đài chuỗi Sau một khoảng thời gian xác định

lượng DNA sẽ được khuếch đại lên hàng triệu lần

Một phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50 u1 với các thành phần theo Bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen mã hóa P/ DNA pol

2.2.3 Dién di DNA trén gel agarose

Kỹ thuật điện di trên gel agarose được thực hiện để kiểm tra sự phan tach cua DNA theo Sambrook va Russel (Sambrook and Russel, 2001) Vì DNA là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trường đều có hiệu điện thế và cường độ dòng

điện thích hợp, chúng sẽ đi chuyên từ cực âm về cực dương của điện trường với tốc độ tỷ lệ

nghịch với kích thước đoạn DNA Từ đó mà DNA được tách thành các vạch khác nhau

trên bản gel Sự lựa chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tách Đoạn DNA có kích thước lớn hơn 0,5 kb có thể được phân tách trên gel agarose nồng độ 0,8-1% (w/v) và nhỏ hơn 0,5 kb có thê phân tách trên gel nồng độ 1,7-

2% (w/v) DNA được điện di trong hệ dung dịch đệm chứa 40 mM Tris-HCI, 20 mM acetic acid, 2 mM EDTA, pH 8,3 với hiệu điện thế đao động từ 100-120 V Bản gel sau đó được

nhuộm bang ethidium bromide (EtBr) 0,5 ug/ml va céc bing DNA được quan sát dưới tia

UV

2.2.4 Tinh sach DNA bang kit Wizard SV Gel

Mẫu DNA sau khi được xác định trên bản gel điện di sẽ được tách chiết ra khỏi gel

agarose bằng cách sử dụng kit thôi gel Wizard SV Gel Quy trình như sau: dién di DNA trên gel agarose 1%, cat mảnh gel chứa DNA cho vào ống Eppendorf và cân để xác định khối lượng gel B6 sung Binding Buffer theo tỷ lệ 1g gel:1ml Binding buffer, ủ 60 °C cho

đến khi gel tan hoàn toàn Cho toàn bộ hỗn hợp trên lên cột Wizard, ủ nhiệt độ phòng 2

phút, sau đó ly tâm 14000 rpm trong 1 phút, loại dich bén dudi Bé sung 500 pl Washing

Buffer, u 2 phut, ly tim 14000 rpm trong 1 phút, loại dịch; lặp lại bước rửa một lần nữa Ly

tâm khô màng ở 14000 rpm, 1 phút sau đó đặt cột lên ống tube 1,5 ml mới, ủ cột ở 65°C 10

phút để cồn bay hơi hết Bổ sung 50 H1 H:O vào giữa cột, ủ nhiệt độ phòng 2 phút, ly tâm

14000 rpm trong 1 phút Thu dịch bên dưới, đo OD và kiểm tra DNA thu được bằng cách điện di trên gel agarose 1%

2.2.5 Ghép nối gen

Vector biểu hiện pMAL — c5X của hang New England Biolabs (Anh) được sử dụng

để biểu hiện gen mã hóa P#¡ DNA pol Ưu điểm của vector này là có promotor mạnh cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp ở dạng tan hoàn toàn và chiếm tỉ lệ 20 — 40% protein tổng

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 23

sé cua té bao Vector duge xit ly voi enzyme Xmnl cat dau bang va Ncol cat dau dinh dé dễ dang néi doan gen ma hda Pfu DNA đã được cắt bằng Ncol Phản ứng nối sản phâm PCR vao vector co su xtc tac cua enzyme T4 DNA ligase

Phan img ndi ghép cé téng thé tich 14 20 ul véi cdc thành phần được liệt kê theo Bang 2.3

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng nối ghép

nạp vào tế bào khả biến chủng E coli Top10

2.2.6 Bién nap plasmid vao E coli bang phương pháp sốc nhiệt

¢ Quy trình tạo tế bào khả biến:

Cay chuyén mét khuan lac E coli (Top10 , BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS) trong

5 ml môi trường LB lỏng, lac 200 vong/phut & 37°C qua dém.Chuyén 0.5 ml dich nudi tế

bào qua đêm sang 50 ml môi trường LB lỏng (pha loãng 100 lần dung dịch tế bào ban đầu),

tiếp tục nuôi lắc ở 200 vòng/phút, 37°C đến khi ODøoo am đạt 0,4 — 0,6 Dịch nuôi cấy sau

khi chuyển sang ống ly tâm được để trong đá 20 phút Ly tâm 1600 vòng/phút ở 4°C trong

10 phút, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào Tế bào sau khi ly tam dugc hoa trong 10 ml CaCl 0,1

M lạnh Ủ trong đá 5 phút, ly tâm 1200 vòng/phút ở 4°C trong 5 phút dé thu tế bào Hòa tan

tế bào vào 10 ml CaCls 0,1 M lạnh Ủ trong đá 30 phút, ly tâm 1200 vòng/phút ở 4°C trong

5 phút đề thu tủa tế bào Hòa tế bào vào 2 ml dung dịch CaCls 0,1 M chứa 20%glycerol

Chia 100 pl dich té bao vao cdc éng Eppendorf 1,5 ml và bảo quản ở -80°C

s* Quy trình biến nạp:

Tế bào khả biến sau khi lấy ra từ -80°C được làm tan trên đá trong 30 phút (tránh sốc

nhiệt) Bổ sung vào mỗi ống tế bao kha biến 5 wl mẫu sản phẩm ligation (DNA + Vector +

Ts DNA ligase), 2 Hl vector pUC19 đã đóng vòng làm mẫu chứng dương, đảo nhẹ nhàng

dé DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến Sau đó, đặt toàn bộ trên đá trong thời gian

30 phút

Sốc nhiệt: mẫu đang đặt trên đá được chuyên ngay sang bê ôn nhiệt có nhiệt độ 37°C trong 1 phút Sau đó mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong thời gian 5 phút Bổ

sung 900 ul LB lỏng, lắc hỗn hợp tế bao 6 37°C trong 60 phút Hút 200 k1 dịch tế bao va

cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có chứa kháng sinh Ampicilin (Amp*) 100 ug/ml đối với E.coli Top 10 va E.coli BL21(DE3); 100 ug/ml Amp va 50 ug/ml chloramphenicol

(Cam*) d6i với E.coli BL21(DE3) pLysS Ủ đĩa ở 37°C qua đêm

Bảng 2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật

khác nhau Sự có mặt của các ddNTP sẽ làm mất khả năng hình thành các cầu nối

phosphodieste với các nucleotide tiếp theo dẫn đến làm ngừng quá trình tổng hợp DNA

Các đoạn DNA có kích thước khác nhau một nucleotide được phân tách bằng diện di mao

quản và phát hiện bằng hệ thống phân tích tự động nhờ máy giải trình tự ABI 3700 của

hãng Macrogen, Hàn Quốc

Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 25