Nghiên cứu dược liệu mức hoa trắng thu hái ở chí linh hải dương

Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, bộ môn Dược học cổ truyền, ,Viện hoá học, Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học tr

B Ộ G IÁ O D Ụ C VÀ Đ À O T Ạ O B Ộ Y T Ế

PHÍ TÙNG LÂM

THU HẢI Ở CHỈ LINH - HẢI DƯƠNG

LUẬN VĂN THẠC s ĩ DƯỢC HỌC

L Ờ I CẢM ƠNTrong quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được sự quan tâm giúp

đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị trong các bộ môn của trường Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn Gs.Ts Phạm Thanh Kỳ đã trực tiếp hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn trân trọng tới:

Pgs.Ts Chu Đình Kính - Viện hoá học - TTKHTN và CNQG

Pgs.Ts Cao Văn Thu - Bộ môn Vi sinh -Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội

Ts Phùng Hoà Bình - Phòng đào tạo sau đại học

Đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, bộ môn Dược học cổ truyền, ,Viện hoá học, Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2005

DS Phí Tùng Lâm

PHÁP NGHIÊN c ú u

3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật và kiểm định tên khoa học 14

bằng SKLM

TÀI LIỆU THAM KHẢO

dung môi III.

L Ờ I CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài này tôi đã nhận được sự quan tâm giúp

đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị trong các bộ môn của trường Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn Gs.Ts Phạm Thanh Kỳ đã trực tiếp hướng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn trân trọng tới:

Pgs.Ts Chu Đình Kính - Viện hoá học - TTKHTN và CNQG

Pgs.Ts Cao Văn Thu - Bộ môn Vi sinh -Sinh học Trường Đại học Dược Hà Nội

Ts Phùng Hoà Bình - Phòng đào tạo sau đại học

Đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Nhân dịp này tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên bộ môn Dược liệu, bộ môn Dược học cổ truyền, ,Viện hoá học, Ban Giám hiệu, phòng Đào tạo sau đại học trường Đại học Dược Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2005

DS Phí Tùng Lâm

Đ Ặ T V Â N Đ Ể

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú Theo một số tài liệu nghiên cứu cho thấy: nước ta có khoảng 12 000 loài cây thuộc hơn 2500 chi và 300 họ Trải qua hàng nghìn năm tồn tại và phát triển của loài người, ngoài việc sử dụng

vô vàn cây cỏ cho các nhu cầu khác nhau của cuộc sống, nhân dân Việt Nam cũng như nhân dân nhiều nước khác trên thế giới đã tích luỹ, lưu truyền được rất nhiều kinh nghiệm, tri thức quý báu về phòng và chữa bệnh bằng cây cỏ Tuy nhiên cho tới nay việc sử dụng phần lớn còn dựa vào kinh nghiệm dân gian, mà chưa được nghiên cứu kỹ để có cơ sở khoa học trong việc sử dụng

chúng

Trcn thế giới nói chung và Việt Nam nói ricng, xu hướng sử dụng thuốc

có nguồn gốc thảo mộc ngày càng tăng Người ta đã thống kê rằng: ở các nước có nền công nghiệp phát triển thì 1/4 số thuốc thống kê trong các đơn đều có chứa các hoạt chất từ thảo mộc Hơn nữa, Việt Nam cũng như một số nước Á Đông (Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc .) có truyền thống phòng và chữa bệnh theo Y học cổ truyền nên đòi hỏi cung cấp một số lượng rất lớn dược liệu

Cây Mức hoa trắng mọc hoang ven triền núi ở nhiều nơi trong nước la và một số nước Nam Á Từ lâu đã được nhân dân dùng hạt và vỏ thân chữa lỵ amip Để góp phần nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu này, chúng tôi thực

hiện đề tài: "Nghiên cứu dược liệu Mức hoa trắng thu hái ở Chí Linh - Hải

Dưong" với nội dung sau:

1 Về thực vật:

+ Mô tả hình thái thực vật và kiểm định tên khoa học

+ Xác định đặc điểm vi phẫu lá, vi phẫu vỏ thân cây

+ Xác định đặc điểm bột lá, bột vỏ thân cây.

P H Ầ N 1: T Ổ N G Q U A N

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ PHÂN B ố

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Holarrhena [11],[19], [20]

Theo hệ thống phân loại Takhtajan 1987: Chi Holarrhena thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae), bộ Long đởm (Gentianales), liên bộ Long đởm (Gentiananae), phân lớp Hoa môi (Lamiidae), lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), giới thực vật (Plantae)

Giới thực vật (Plantae)

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magroliopsida)

Phân lớp Hoa môi (Lamiidae)

Liên bộ Long đởm (Gentiananae)

Họ Trúc đào có đặc điểm sau:

+ Cây gỗ, cây bụi hay dây leo thân gỗ, toàn thân có nhựa mủ, thường có hai vòng libe (có một vòng libe quanh tuỷ)

+ Lá đơn, nguyên, thường mọc đối hoặc mọc vòng, ít khi mọc sole, không có

lá kèm

+ Hoa mọc riêng lẻ hoặc thành cụm hoa chùm hay xim ở nách lá hay tận cùng Hoa đều, lưỡng tính, thường mẫu 5: Đài (4-)5 dính liền; Tràng 5, dính liền thành ống, thường có phần phụ ở bên trong (lông, vẩy), tiền khai hoa vặn, Nhị (4) 5, dính vào ống tràng, chỉ nhị có lông, bao phấn hẹp, hạt phấn rời Bộ

+ Công thức hoa: * ? cT K(5N C(5)A5 ọ _ (2)

+ Quả đại (1-2 đại), quả nang, đôi khi quả hạch hay quả mọng

+ Hạt thường có cánh hay một chùm lông mịn ở một hoặc hai đầu để dễ phát

lán

Họ Trúc đào có khoảng 200 chi với 2000 loài, phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, một số ở vùng ôn đới, Việt Nam có khoảng 52 chi, 170 loài, phần lớn mọc hoang, một số được trồng làm cảnh

1.1.3 Sô lượng loài và phân bô của chi Holarrhena.

Holarrhena là một chi nhỏ, có 4 loài ở vùng nhiệt đới châu Phi và châu

Á Ở Việt Nám, có 3 loài: [29], [31]

- H antidysenterica Wall (H pubescens Wall ; H malaccensis W ig h t.).

- H curtisii King et Gamble (H crassifolia Pierre in spire).

- H similis Craib.

Trong đó, H curtisii và H similỉs là những loài chưa được nghiên cứu.

Mức hoa trắng phân bố rải rác ở Ấn Độ, Thái Lan, Myanmar, Malayxia, Nam Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia và vùng nhiệt đới châu Phi

ở Việt Nam, Mức hoa trắng mọc hoang phổ biến ở các tỉnh miền núi và trung

du như Bắc Giang, Yên Bái, Cao Bằng, Lạng Sơn, Hoà Bình, Gia Lai, Kon

Turn, Sông Bé, Tây Ninh, Đồng Nai, nhưng tập trung nhiều nhất ở Đắc Lắc và Nghệ An [2] [9], [18], [24], [29].

1.1.4 Đặc điểm thực vật loài H antidysenterica Wall [2], [4], [12], [17],

[24], [29]

+ Mức hoa trắng còn có lên khác là Mức lông, Thừng Mực lá to, Sừng trâu,

Hồ liên lá to, Mộc hoa trắng, Mộc vài (Tày), Xi chào (K ’ Ho)

Cây nhỡ hay cây to, cao 10-15 m, đường kính thân có thể đến 40 cm Cành non hơi dẹt, nhẵn hoặc mang lông màu nâu đỏ, trên mặt lá có nhiều bì khổng trắng, rõ, cành già tròn nhẵn, màu nâu nhạt, có nốt sần nhỏ màu trắng và những sẹo lá còn sót lại thường nổi lên

Lá mọc đối, có cuống rất ngắn hoặc gần như không cuống, không có lá kèm,nguyên, hình bầu dục đầu tù hay nhọn, đáy lá tròn hoặc nhọn, dài 12-15 cm, rộng 4-8 cm, mặt lá bóng, màu xanh lục nhạt, mặt dưới có lông nhỏ rất mịn và gân nổi rõ

Hoa màu trắng, rất thơm, mọc thành xim hình ngù ở kẽ lá hay đầu cành, dài 5-10 cm; đài 5 răng rất hẹp, có lông ở lưng; tràng 5 cánh tròn đầu, ống tràng dài 1 cm, hơi thắt ở họng, nhị 5 đính gần phía gốc ống tràng, chỉ nhị có lông, bao phấn hẹp, vòi nhuỵ hơi dày

Quả đại, mọc từng đôi thành cung trông như sừng trâu Mỗi đại màu nâu có vân dọc, dài 15-30 cm, rộng 5-7 mm

Hạt nhiều, dài 1-2 cm, rộng 0, 2- 0, 25 cm, màu nâu nhạt, đầu hơi hẹp, lõmmột mặt, chùm lông của hạt màu hơi hung hung, dài 2- 4, 5 cm

Lá mầm gấp nhiều lần, toàn cây có nhựa mủ trắng

Mùa hoa nở: tháng 3-7, Mùa quả: tháng 6-12

1.2 NHỮNG NGHIÊN c ứ u VỂ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC [2], [24],

[29]

Vỏ Mức hoa trắng chứa alcaloid 0,4%, Gôm 9,56% , nhựa 0,2% , tanin 1,14%

Hạt mức hoar trắng chứa alcaloid 0, 025%, dầu 36 - 40%, chất nhựa, tanin

Lá mức hoa trắng có chất màu tương tự indigo

Lá, vỏ quả, hạt, vỏ thân Mức hoa trắng đều chứa alcaloid v ỏ chứa 2,82- 3,217% alcaloid toàn phần, ]á chứa 0, 60% alcaloid toàn phần [30]

Trong đó, alcaloid chủ yếu là Conessin Bromhydrat conessin (C^H^NjHBr)

đã được đưa vào Dược điển nhiều nước

Chất conessin có tinh thể hình lăng trụ (Kết tinh trong aceton) điểm chảy 125°, Ịa]D=-l,9°(C H C l3) hoặc +21°6 (CjHgOH) Muối chlohydrat, bromhydrat

và oxalat của conessin có tinh thể [2] [29]

1.2.2 Chất nhựa[2], [29].

Chất nhựa mủ trong cây (chứa nước và chất tan trong nước) 57,91%, cao su1,5 - 9,7%, chất tủa keo có cao su 15-22, 8%, nhựa 74,1 - 82, 8%, chất khôngtan 0,9 - 5,9 %.

Hai chất alcol nhựa (resinol) được tách từ nhựa mủ là:

+Lettoresinol A (C2gH50O5): độ chảy 227-28°C

- Thí nghiêm trên mèo, thuốc gây hạ huyết áp và ức chế tim, tác dụng này yếu

so với cmetin

- Liều lượng lớn của thuốc tren súc vật thí nghiệm gây co giật trước khi chết

- Cao cồn chiết từ quả mức hoa trắng có tác dụng chống ung thư và ức chế tế bào Carcinom epidermoid từ họng hầu trên môi trường nuôi cấy

- Cao chiết bằng chloroform và methanol từ hạt có tác dụng kháng khuẩn đối với Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus

+ Conessin:

Chất conessin rất ít độc Với liều cao, tác dụng gần giống morphin, nó gây liệt trung tâm hô hấp, giai đoạn đầu là kích thích, tiếp theo làm giảm hô hấp, dùng với liềụ ngộ độc làm ngừng thở trước khi tim ngừng đập

Nếu tiêm dưới da chuột lang, conessin gây tê tại chỗ (mạnh gấp 2 lần so với cocain) nhưng lại kèm theo hiện tượng hoại thư nên tác dụng này không được sử dụng trên lâm sàng Đối với ếch, tiêm dưới da, thuốc có tác dụng gây mc

Đối với hệ tim mạch, conessin dùng liều lớn có tác dụng giống quinin, phong bế dẫn truyền nhĩ- thất, gây hạ huyết áp và giảm nhịp tim

Conessin dùng đường uống có tác dụng ức chế hoạt động các men ptyalin, pepsin và trypsin

Conessin kích thích sự co bóp ruột và tử cung

Ngoài ra, conessin còn có tác dụng diệt côn trùng bằng cách làm bất dục và gây biếng ăn, conessin có tác dụng trừ giun đối với chuột bạch

Conessin có tác dụng diệt amip, thí nghiêm ngoài cơ thể nồng độ có hiệu quả đối với Entamoeba histolytica của conesssin là: 1:71000 - 1:45000, còn của emetin là: 1: 200000 - 1: 300000, Trên lâm sàng, người ta dùng conessin chlohydrat hay bromhydrat chữa lỵ amíp Nó tác dụng cả đối với kén và amip, còn emetin chỉ tác dụng đối với amip Hiện tượng không chịu thuốc rất ít hoặc không đáng kể Kết quả cho thấy tác dụng diệt amíp của conessin kém hơn emetin, conessin có tác dụng diệt cả Trichomonas vaginalis và Trichomonas intestinalis [2],[24], [29].

+ Kurchicin:

Chất kurchicin thí nghiệm trên động vật cũng có tác dụng ức chế tim, đặc biệt là phong bế sự dẫn truyền bó Hiss, làm hạ huyết áp Nó còn có tác dụng kích thỉch cơ trơn, gây tăng co bóp đối với ruột và tử cung cô lập [29]

1.3.2 Độc tính

Độc tính cấp của alcaloid toàn phần trên chuột nhắt trắng, bằng đường uống, theo phương pháp Litchfield-Wilcoxon có LD50=625 mg/kg (588-700 mg/kg) và bằng đường tiêm phúc mạc có LD50=130 mg/kg [2], [24], [29]

1.3.3 Công dụng

Vỏ thân và hạt được dùng làm thuốc chữa lỵ amip và tiêu chảy Thường dùng dưới dạng bột, cồn thuốc hoặc cao lỏng:[2], [8], [24],[28], [29]

Bột vỏ uống 10 g/ngày

Bội hạt uống 3-6 g/ ngày

Cao lỏng (1 :1 ) uống 1-3 g/ ngày

Cồn hạt (1: 5) uống 2-6 g/ ngày

vỏ cũng được dùng trị sốt, ỉa chảy, viêm gan và làm nguyên liệu chiết xuất alcaloid Ngoài ra, vỏ và lá dùng nấu nước tắm ghẻ; có thể dùng vỏ rễ giã giập ngâm rượu cùng với vỏ rễ cây hoa Hoè bôi ngoài.

Dầu béo chiết từ hạt mức hoa trắng có tác dụng chữa giun sán

Nhân dân Ân Độ dùng nước săc vỏ cây tươi hay giã vỏ tươi vắt lấy nước uống Cây cũng là một nguyên liệu quý để chiết lấy bán thành phẩm tổng hợp các nội tiết tố như cortison.[25]

ớ Thái Lan, lá mức hoa trắng là thuốc trị ký sinh trùng đường ruột, hạt chữa sốt kèm theo tiêu chảy, vỏ thân có tác dụng hạ sốt, chữa lỵ [29],

Chế phẩm:

Viên Holanin 50 mg do Viện Dược liệu sản xuất là hỗn hợp nhiều alcaloid chiết từ vỏ cây mức hoa trắng dùng chữa lỵ.[31 ]

Conessin bromhydrat viên 0 1 g chữa lỵ

Để chữa lỵ amip, dùng vỏ mức hoa trắng riêng hoặc phối hợp với rễ Hoàng đằng, mỗi vị 10 g, sắc nước uống [2], [10], [16], [24], [29],

Ngoài ra còn có viên Mộc hoa trắng lOOmg alcaloid toàn phần do công

ty cổ phần dược và thiết bị ytế Hải Dương sản xuất

P H Ầ N 2: N G U Y Ê N L IỆ U , P H Ư Ơ N G T I Ệ N V À P H Ư Ơ N G

P H Á P N G H IÊ N C Ứ U

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN c ứ u

Mẫu nghiên cứu được thu hái tại xã Hoàng Hoa Thám, thị trấn Bến Tắm, huyện Chí Linh, tỉnh Hải Dương vào tháng 9, 10 năm 2004 Mãu làm thí nghiệm lấy riêng lá và vỏ thân phơi khô rồi tán nhỏ tạo nguyên liệu nghiên cứu, mẫu tiêu bản có hoa để kiểm định tên khoa học

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN c ú u

2.2.1 Các máy và thiết bị dùng trong nghiên cứu.

- Đặc điểm vi học của dược liệu được chụp ảnh trực tiếp trên kính hiển vi MBI - 15(Nga) tại bộ môn Dược liệu - Trường Đại học Dược Hà Nội

- Phổ lử ngoại đo trên máy UV-VIS Spectrophotometer carry (Australia) tại phòng thí nghiệm Trung tâm, trường Đại học Dược Hà Nội

- Phổ hồng ngoại đo trên máy FT - IR - IMPACT - 410 tại Viện hoá học - TTKHTN và CNQG

- Phổ khối đo trên máy 5989 - MS tại phòng cấu trúc - Viện hoá học - TTKHTN và^CNQG

- Phổ NMR đo trên máy NMR - Bruker - 500 MHZ tại phòng cấu trúc Viện hoá học - TTKHTN và CNQG

- Xác định độ ẩm trên máy Sartorius (Germany) tại bộ môn Dược liệu, trường Đại học Dược Hà Nội

2.2.2 Hoá chất.

- Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích

* Vi phẫu:

Lá và vỏ thân Mức hoa trắng được cắt ngang, tẩy, nhuộm kép theo phương pháp ghi trong các tài liệu:

- Thực tập dược liệu ( phần vi học ) [1]

- Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật [21 ]

Bột lá và vỏ thân đã tán nhỏ, làm tiêu bản soi dưới kính hiển vi và xácđịnh các đặc điểm bột dược liệu [26],

2.3.2 Nghiên cứu về hoá học.

* Định tính các thành phần hoá học chính trong dược liệu theo các tài liệu:

- Bài giảng dược liệu tập I, II [2]

- Thực tập dược liệu phần hoá học [3]

- Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc [15]

^ Định tính flavonoid và alcaloid trong dược liệu bằng sắc ký lớp mỏng, dùng

Phân lập bằng sắc ký cột, dùng gel lọc là Sephadex LH20 đối với flavonoid trong lá.

* Phân lập bằng sắc ký cột, đối với alcaloid trongvỏ thân Mức hoa trắng chất hấp phụ là Silicagel có kích thước hạt 40 - 60 ịim (Merck)

% Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào số liệu các phổ: phổ hổng ngoại

(IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

2.3.3 Nghiên cứu về tác dụng kháng khuẩn:

P H Ầ N 3 T H ự C N G H IỆ M V À K Ế T q u ả

3.1 Nghiên cứu về thực vật.

3.1.1 Mô tả đặc điểm thực vật và kiểm định tên khoa học.

Quan sát trên thực tế tại nơi thu hái:

Cây nhỡ, cao 5-6 m, cành non hơi dẹt, cành già tròn nhẵn, màu nâu nhạt, có những nốt sần nhỏ và sẹo lá còn sót lại Toàn cây có nhựa mủ Lá mọc đối, cuống ngắn, không có lá kèm, nguyên, hình bầu dục, dài 1 0- 15 cm, rộng 3- 10 cm, mặt lá bóng, màu xanh lục nhạt, mặt dưới có lông nhỏ rấl mịn Hoa màu trắng, rất thơm, mọc thành xim hình ngù ở đầu cành hoặc kẽ lá, mẫu

5, đầu tràng tròn, ống tràng hơi thắt ở họng, nhị đính gần phía ống tràng, chỉ nhị có lông, bao phấn hẹp, vòi nhuỵ dày Hoa nở vào tháng 5-6.(Hình 3.1 và hình 3.2)

Sau khi quan sát, phân tích các đặc điểm hình thái của mẫu cây nghiên cứu, đối chiếu các tài liệu tham khảo [2], [4], [9], [10], [18], [23], [24], [29] Đối chiếu với các mẫu tại Bách thảo thực vật, khoa sinh học trường đại học khoa học tự nhiên, mẫu số HNV - 0153 thu hái tại phố Vi tỉnh Bắc Giang tháng 06 năm 1936 dò Petelot, mẫu HNV - 0152 thu hái tại Tam Đảo tỉnh Vĩnh Phúc tháng 10 năm 1936 do Petelot, các mẫu này đã được tiến sĩ David Middleton giảng viên Harvard University Herbaria kiểm định lại (ảnh phụ lục), chúng tôi thấy mẫu cây nghiên cứu cũng phù hợp với mẫu đối chiếu Mặt khác chúng tôi

đã gửi mẫu thu hái được có hoa tới Giáo sư Vũ Văn Chuyên và cũng được Giáo sư Vũ Văn Chuyên định tên khoa học mẫu cây chúng tôi nghiên cứu:

Holarrhena antidysenterica Wall = H olarrhena pubescens (Buch - Ham)

Wall, ex G Don, thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae).

Hình 3.1 Ảnh cây Mức hoa trắng lúc ra hoa

Hình 3.2 Ảnh cành mang hoa của Mức hoa trắng

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu lá

Cắt vi phẫu lá, nhuộm kép Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi Ihấy các

đặc điểm (Hình 3.3): Phần gân lá: Phía trên lồi ít, phía dưới lồi nhiều Biểu bì

(1) trên và dưới gồm một lớp tế bào hình tròn, xếp đều đặn Phía ngoài biểu bì

rải rác có lồng che chở(2) đơn bào hoặc đa bào (gồm 5-7 tế bào) Mô dày(3)

cấu tạo bởi các tế bào hình trứng thành dày, xếp lộn xộn Mô mềm(4) cấu tạo

bởi các lế bào thành mỏng, hình tròn hoặc đa giác Các bó libe- gỗ(5) xếp sál

nhau Các mạch gỗ (6) xếp thành hàng, tập trung thành bó

Phần phiến lá: Biểu bì trên và dưới(l) hình chữ nhật, tế bào biểu bì trên to

hơn tế bào biểu bì dưới, mang lông che chở(2) tương tự như gân lá Mô

giậu(7) gồm 2 lớp tế bào hình chữ nhật, xếp xít nhau và thẳng góc với biểu bì

trôn Mô khuyết(8) là những tế bào to nhỏ không đều, thành mỏng Trong

phiến lá có một vài bó libe- gỗ(9) nhỏ của gân phụ

Tinh thể calci oxalat(l) hình cầu gai Lông che chở (2) đơn bào hoặc đa bào

Mảnh biểu bì (3) là những tế bào hình đa giác, đôi khi mang lỗ khí Mảnh

phiến lá(4) Mảnh mạch (5) Bó Sợi dài (6), lỗ khí (7) (Hình 3.4)

3.1.4 Đặc điểm vi phẫu vỏ thân

bần (1) bắt màu xanh, gồm 3-5 lớp tế bào hình chữ nhật Mô mềm vỏ (2) cấp

2, gồm các tế bào hình chữ nhật 4-5 lớp tế bào, xếp thành dãy hướng tâm Tế

bào mô cứng (3) xếp thành nhiều tầng Tia ruột (4) gồm 1-2 lớp tế bào, chạy theo hướng xuyên tâm Trong cùng là tầng sinh libe gỗ (5) (Hình 3.5).

3.1.5 Đặc điểm bột vỏ thân:

- Cảm quan: Bột có màu hồng sẫm, vị đắng chát

- Đặc điểm quan sát dưới kính hiển vi thấy:

Mảnh mô mềm (1) gồm những tế bào hình đa giác thành mỏng Mảnh bần (2) màu nâu nhạt gồm những tế bào nhiều cạnh, thành dày, khoang hẹp

Tế bào mô cứng(3) rời hay xếp thành từng đám có màu vàng nhạt, hình nhiều cạnh, màng dày, khoang rộng Sợi và bó sợi (4) Tinh thể calci oxalat (5) hình khối chữ nhât Mảnh mạch (6) Hạt tinh bột hình trứng dài (7) và có những

Hình 3.3 Ảnh vi phẫu lá Mức hoa trắng

Hình 3 4 Ảnh một sô'đặc điểm bột lá Mức hoa trắng

1 Tinh thể Calci oxalat 2 Lông che chở đơn bào và đa bào

7 Lố khí

Hình 3.5 Vi phẫu vỏ thân Mức hoa trắng

Hình 3.6 Ảnh một s ố đặc điểm vi phẫu bột vỏ thân Mức hoa trắng

3.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học của lá và vỏ thân.

3.2.1 Định tính bằng phản ứng hoá học trong lá và vỏ thân.

3.2.1.1 Định tính Alcaloid

Cho khoảng 3g bột được liệu vào bình nón dung tích 100ml, thấm ẩm dược liệu bằng dđ amoniac đặc Đậy kín trong 30 phút Cho 15ml chloroform lắc đcu, ngâm 12 giờ Lọc lấy dịch chiết cho vào bình gạn Sau đó lắc kỹ với 10

ml dd H2S 041N Gạn lấy dịch chiết acid, cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1

ml dịch chiết

• Ống 1: Nhỏ 2-3 giọt TT Mayer -> có tủa trắng

• Ống 2: Nhỏ 2-3 giọt TT Dragendorff ->có tủa da cam

• Ống 3: Nhỏ 2-3 giọt TT Bouchardat ->có tủa nâu

Kết quả: Dịch chiết lá và vỏ thân đều có alcaloid

- Phản ứng với kiềm:

^ Phản ứng với NH3: Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô, rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, thấy màu vàng của vết đậm lên

Phản ứng với NaOH: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vài giọt

dd NaOH 10%, thấy xuất hiện tủa và màu vàng của dịch chiết tăng lên rõ rệt

- Phản ứng với FeCl3 5%:

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd FeCl3 5% thấy xuất hiện màu xanh đen

- Phản ứng với A1C13 3% trong cồn:

Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm 2-3 giọt dd AICI3 3% trong cồn thấy xuất hiện màu vàng ánh xanh

Kết quả: Dịch chiết lá và vỏ thân đều có flavonoid

3.2.1.3 Định tính Saponin

- Hiện tượng tạo bọt:

Cho vào ống nghiệm to 0, 5g bột dược liệu, thêm 5 ml nước, đun sôi nhẹ, lọc nóng Dịch lọc cho vào ống nghiệm to, thêm 10 ml nước Lắc mạnh trong 5 phút theo chiều dọc ống nghiệm Để yên, quan sát thấy cột bọt bền vững sau

15 phút ở dịch chiết lá còn dịch chiết vỏ thân âm tính

+ Nhận xét: Dịch chiết lá có Saponin, dịch chiết vỏ thân không có Saponin

- Phản ứng phân biệt hai loại Saponin ở dịch chiết lá:

Cho vào ống nghiệm lớn 0, 5g bột dược liệu, thêm 5 ml cồn 90° Đun cách thuỷ đến sôi, lọc nóng, lấy dịch lọc làm các thí nghiệm:

• Ống 1: Cho 5 ml dd NaOH 0, IN + 5 giọt dịch lọc trên

• Ống 2: Cho 5 ml dd HC1 0, IN + 5 giọt dịch lọc trên

Lắc đều 2 ống nghiêm trong 1 phút Để yên, thấy cột bọt ở ống 1 cao hơn ở ống 2

Kết quả: Dịch chiết lá có saponin triterpenoid

3.2.1.4 Định tính Anthranoid:

- Phản ứng Bomtrager:

Cho 3g bột dược liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thêm 50 ml dd

H2S 04 10%, đun sôi cách thuỷ trong 15 phút Lọc nóng vào bình gạn Để

nguội rồi lắc với 5 ml ether ethylic Gạn lấy phần ether cho vào 2 ống nghiệm,

mỗi ống 1 ml dịch chiết

• Ống 1: Thệm 1 ml NH4OH 10% -—>2 lớp dung môi trong suốt

• Ống 2: Thêm 1 ml NaOH 10% — > 2 lớp dung môi trong suốt

- Vi thăng hoa:

Đặt lg bột dược liệu trên nắp nhôm Hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn đến khi bay hơi hết nước trong dược liệu Đặt lên miệng nắp nhôm một lam kính, trên lam kính có để một miếng bông tẩm nước lạnh Đốt nắp nhôm trên ngọn lửa đòn cồn Sau 5-10 phút, lấy lam kính ra để nguội Soi dưới kính hiển vi, không thấy có tinh thể

Kết quả: Dược liệu không có anthranoid

- Phản ứng Liebermann:

Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, cô cách thuỷ đến cắn Thêm 1 ml anhydrid acetic, lắc đều cho đến khi tan hết cắn Đặt nghiêng ống nghiệm 45°, them từ từ theo thành ống 1 ml dd H2S 04 đặc để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành 2 lớp Thấy xuất hiện 1 vòng tím đỏ ở mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng

- Phản ứng Baljet:

Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 0, 5 ml thuốc thử Baljet mới pha (gồm 1 phần dd acid picric 1% và 9 phần dd NaOH 10%), không thấy xuất hiện màu đỏ cam ở dịch chiết lá, có thấy xuất hiên màu đỏ cam ở dịch chiết

vỏ Ihân

- Phản ứng Legal:

Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 5 giọt dd Natri nitroprussiat 1%

và 2 giọt dd NaOH 10% Lắc đều, không thấy xuất hiện màu đỏ ở dịch chiết

lá, có thấy xuất hiện màu đỏ ở dịch chiết vỏ thân

Kếl quả: Dịch chiết lá không có Glycosid tim, dịch chiết vỏ thân có Glycosid tim

Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội Quan sát thấy:

• Ống 1: Tủa đục màu vàng đối với dịch chiết lá

Kết quả: Dịch chiết lá có Coumarin, dịch chiết vỏ thân không có Coumarin.

3.2.1.7 Định tính Tanin

Cho vào ống nghiệm lg bột dược liệu, thêm 10 ml nước cất, đun sôi trực tiếp 5 phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp Dịch lọc cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1 ml dịch chiết

• Ống 3: Thêm 2-3 giọt dd chì acetat 10% thấy xuất hiện tủa

Kết quả: Dịch chiết lá và vỏ thân đều có tanin

3.2.1.8 Định tính Acid hữu cơ

Cho lg bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm 10 ml nước cất Đun sôi trực tiếp

10 phút, để nguội, lọc Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể Na2C 0 3, thấy có bọt khí C 02 bay lên ở dịch chiết lá, phản ứng âm tính ở dịch chiết vỏ thân

Kếl quả: Dịch chiết lá có acid hữu cơ, dịch chiết vỏ thân không có acid hữu cơ.

3.2.1.9 Định tính Acid amin

Cho lg bột dược liệu vào ống nghiệm, thêm 10 ml nước cất, đun sôi 5 phút Lọc nóng, lấy 2 ml dịch chiết cho vào một ống nghiệm khác, thêm 2-3 giọt

TT Ninhydrin 3%, đun cách thuỷ sôi 10 phút, không thấy xuất hiện màu tím

Kết quả: Dịch chiết lá và vỏ thân đều không có acid amin

Kết quả: Dịch chiết lá và vỏ thân đều không có chất béo

3.2.1.12 Định tính Steroid

Cho vàổ ống nghiêm 1 ml dịch chiết ether dầu hoả trên Bốc hơi dung môi đến khô Thêm vào ống nghiệm 1 ml anhydrid acetic, lắc kỹ Để nghiêng ống nghiệm 45° rồi thêm 1 ml H2S 04 đặc theo thành ống nghiệm, thấy mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng có màu xanh

Kết quà: Dịch chiết lá và vỏ thân đều có steroid

3.2.1.13 Định tính caroten

Cho vào ống nghiệm 2 ml dịch chiết ether dầu hoả trên, bốc hơi cách

sang màu xanh da trời

Kết quả: Dịch chiết lá và vỏ thân đều không có caroten

3.2.1.14 Định tính polysaccharid

Cho 2g bột dược liệu vào một cốc có mỏ, thêm 10 ml nước cất, đun cách íhuỷ sôi 5 phút, lọc nóng Cho vào 2 ống nghiệm:

• Ống 1: 4 ml dịch chiết và 5 giọt TT Lugol ( I2/K I )

• Ống 2: 4 ml nước cất và 5 giọt TT Lugol

Quan sát thấy ống 1 có màu đỏ đậm hơn ống 2

Kết quả: Dịch chiết lá và vỏ thân đều có polysaccharid

Kết quả định tính các nhóm chất chính trong lá và vỏ thân Mức hoa trắng được tóm tắt ở bảng 3 1

Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong lá và vỏ thân Mức hoa

Pư với A1C13 3%

9 Acid amin Pư với TT Ninhydrin

3%

-Khôngcó

Khôngcó

-Khôngcó

Khôngcó

-Khôngcó

Khôngcó

(++): Phản ứng dương tính rõ (+++): Phản ứng dương tính rất rõ

Nhân xét: Qua các phản ứng định tính, chúng tôi thấy:

+ Trong lá cây Mức hoa trắng có chứa: alcaloid, flavonoid, saponin, coumarin, tanin, acid hữu cơ, đường khử, steroid và polysaccharid

+ Trong vỏ thân Mức hoa trắng có chứa: alcaloid, flavonoid, glycoside tim, tanin, đường khử, steroid, polysaccharide Trong đó: alcaloid và flavonoid là 2 nhóm chất chính Do đó, hướng nghiên cứu của chúng tôi tập trung vào nhóm flavonoid trong lá và alcaloid trong vỏ thân cây Mức hoa trắng

3.2.2 Định tính flavonoid và alcaloid trong dược liệu bằng SKLM.

3.2.2.1 Định tính íìavonoid trong lá:

+ Mãu nghiên cứu:

Lấy 20g bột lá chiết bằng 200 ml ethanol 90° trong Soxhlet Cất thu hồi dung môi, cô cách thuỷ đến cạn Thêm 20 ml nước cất nóng và đun cách thuỷ

30 phút Lọc lấy dịch nước cho vào bình gạn, lắc 3 lần với ethylacetat, mỗi lần

5 ml Gộp dịch chiết ethylacetat, cô tới khô Hoà cắn trong methanol để chấm sắc ký

+ Chất hấp phụ: Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) được hoạt hoá ở 110°c trong 1 giờ Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm

+ Hệ dung môi: Chấm dịch chiết methanol ở trên lên bản mỏng Sấy nhẹ cho khô Triển khai sắc ký với các hệ dung môi sau:

Hệ I: Ethylacetat: Methanol: H20 (100: 17: 13)

Hệ II: Ethylacetat: Acid formic: H20 (8: 1: 1)

Hệ III: Toluen: Ethylacetat: Acid formic (5: 6: 2, 5)

Hệ IV: Toluen: Ethylacetat: Methanol (6: 8: 1)

Hệ V: n-Butanol: Acid acetic: H20 (4: 1: 2, 5)

Hệ VI: Chloroform: Methanol (9: 1)

Hệ VII: Ethylacetat: Chloroform: Acid formic (5: 5: 1)

Bản sắc ký được sấy nhẹ 15 phút cho bay hết hơi dung môi

+ Hiện màu: Phun hiện màu bằng TT A1C13 5% trong cồn Sau đó quan sát

dưới ánh sáng thường và đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm

Qua 7 hệ dung môi chúng tôi thấy hệ III tách tốt nhất

được trình bày ở bảng 3.2 và hình 3.9

Bảng 3 2 Kết quả định tính flavonoid trong lá Mức hoa trắng bằng SKLM.

3.2.2.2 Định tính alcaloid trong vỏ thân bằng SKLM

+ Lấy 20g bột dược liệu vỏ thân thẩm ẩm bằng NH4OH trong 12 giờ, sau đóchiết bằng 200 ml chloroform, trong bình Soxhlet Cất thu hồi dung môi, côtới khô Hoà cắn trong methanol để chấm sắc ký

+ Chất hấp phụ: Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) hoạt hoá ở 110°c trong 1

giờ Để nguội và bảo quản Irong bình hút ẩm

+ Hệ dung môi: Chấm dịch chiết methanol ở trên lên bản mỏng Sấy nhẹ cho khô Triển khai sắc ký với các hệ dung môi sau:

Hộ I: Chloroform: Methanol: NH4OH (50: 9: 1)

Hệ II: Ether: NH4OH (60:40)

Hộ III: Chloroform: Methanol: NH4OH (9: 1: 1)

Hộ V: Chloroform: Methanol: NH4OH (19: 1: 0, 5)

Hệ VI: Chloroform: Methanol (9: 1).

+ Hiện màu:

Bản sắc ký để ở nhiệt độ phòng cho bay hết hơi dung môi Phun hiện màu bằng TT Dragendorff quan sát dưới ánh sáng thường

Sau nhiều lần triển khai cho thấy hệ I tách tốt nhất Kết quả SKLM với

hệ dung môi I được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả định tính alcaloid trong vỏ thân Mức hoa trắng bằng SKLM

3.2.3 Chiết xuất flavonoid và alcaloid toàn phần trong dược liệu.

3.2.3.1 Chiết xuất flavonoid trong lá: Cân khoảng 50g bột dược liệu, Chiết bằng ethanol 90° trong Soxhlet đến khi dịch chiết trong suốt Cất thu hồi cồn,

cô cách thuỷ còn cắn Hoà cắn nhiều lần trong nước nóng, lọc vào bình gạn Lắc với n-Hexan để loại tạp Lắc nhiều lần với ethylacetat Gộp dịch chiết

ethylacetat, cất Ihu hồi dung môi đến cạn Bay hơi trên nồi cách thuỷ, thu được căn riavonoid.

H ình 3 7 So' tỉ ồ cliiừì xuất fluYonoid troni> lá M ức lìoa trắHỊị.

3 2.3.2 Chiết xuất alcaloid toàn phần trona vỏ thân.

Cân khoảng 50« bột dược liệu đã thấm ẩm bằng NH4OH trong 12 giờ, sau đó chiết bàng chloroform trong Soxhlct đến kiệt alcaloid Cất thu hổi Chloroform, cô cách ihuỷ còn cắn alcaloiđ bazơ