BG vi sinh vật thú y đã sửa 14 7

Trong các dung huyết tố trên thì dung huyết tố  là đặc điểm cần thiết của các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh.. * Các enzyme: Các tụ cầu vàng sản sinh các loại enzyme ngoại bào coagu

TS TRẦN ĐỨC HOÀN

BÀI GIẢNG

VI SINH VẬT THÚ Y

Bắc Giang, năm 2015

Phần 1 Vi khuẩn học thú y

Chương 1 Họ Micrococcaceae

Đây là những vi khuẩn có hình cầu, sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, bắt màu Gram dương khi nhuộm, trong họ này gồm các giống Staphylococcus, Streptococcus, Diplococcus

1.1 Giống Tụ cấu khuẩn (Staphylococcus)

1.1.1 Đặc tính sinh học của tụ cầu khuẩn

1.1.1.1 Hình thái và tính chất bắt màu

Theo Hội nghị quốc tế xếp loại Micrococcus (Warsaw, 1975), thì tụ cầu bao gồm 3

loại S aureus, S epidermidis và S saprophyticus.

Đây là những cầu khuẩn Gram dương có đường kính 0,7 - 1,0 μm, không di động, không sinh nha bào và thường không có giáp mô, không có lông Trong bệnh phẩm có thể thấy tụ cầu phân bố riêng lẻ hoặc xếp thành từng đôi, nhưng thường tạo khối thành hình chùm nho Trong canh khuẩn thì thường xếp thành từng đám như chùm nho

Hình 1.1 Tụ cầu khuẩn bắt màu Gram dương khi nhuộm

Hình 1.2 Tụ cầu khuẩn chụp dưới kính hiển vi điện tử

1.1.1.2 Đặc tính nuôi cấy

Tụ cầu sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp 32 - 37C, pH thích hợp 7,2 - 7,6 Dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường

* Với môi trường nước thịt:

Vi khuẩn làm đục môi trường sau khi cấy chỉ 5 -6 giờ, và sau 24 giờ, môi trường đục rõ, lắng cặn nhiều, không có màng

* Với môi trường thạch thường:

Sau khi cấy 24h, xuất hiện khuẩn lạc to dạng S (Smouth - trơn nhẵn), mặt khuẩn lạc hơi ướt, bờ nhẵn đều, màu trắng, vàng thẫm hoặc vàng chanh Màu sắc của khuẩn lạc

là do vi khuẩn sinh ra, sắc tố này không tan trong nước Chỉ có khuẩn lạc có màu vàng

thẫm của S aureus là có độc lực và có khả năng gây bệnh, còn khuẩn lạc màu vàng chanh (S citreus) hoặc màu trắng (S albus) không có độc lực, không gây bệnh.

* Với môi trường thạch máu:

Sau khi cấy 24 giờ, vi khuẩn mọc rất tốt, hình thành những khuẩn lạc dạng S Nếu

là tụ cầu gây bệnh sẽ gây hiện tượng tan máu

* Với môi trường thạch Chapman:

Nếu là vi khuẩn gây bệnh, khi cấy sẽ lên men đường mannitol làm giảm pH (6,8), môi trường trở nên vàng Nếu là tụ cầu không gây bệnh, sẽ không lên men đường Mannitol, pH = 8,4; môi trường có màu đỏ

* Với môi trường gelatin:

Cấy vi khuẩn theo đường cấy trích sâu, ở nhiệt độ 20C, sau 2 - 3 ngày, gelatin bị tan chảy trông giống dạng hình phễu

1.1.1.3 Đặc tính sinh hóa

- Chuyển hóa đường:

Tụ cầu có khả năng lên men các loại đường: glucose, lactose, levulose, mannose, mannitol, saccarose, không lên men đường galactose

Cho đến nay, người ta đã phân lập được rất nhiều phage của tụ cầu, trong đó có vài chục phage rất đặc hiệu cho phép xếp loại phần lớn các chủng tụ cầu vào một trong bốn nhóm phage chính: I, II, III và IV Các tụ cầu thuộc nhóm nào sẽ bị dung giải bởi một hoặc nhiều phage trong nhóm đó, như nhóm I là các phage 29-52-52A-79-80-81

Việc định type bằng phage có giá trị lớn về mặt dịch tễ, cho phép xác định được tất cả các chủng gây bệnh trong một vụ dịch

1.1.1.6 Các chất do tụ cầu gây bệnh tiết ra

* Các độc tố:

+ Độc tố dung huyết (haemolysin)

Có 4 loại chính:

- Dung huyết tố α: gây dung giải hồng cầu thỏ ở 37C, yếu tố này cũng gây hoại tử da và gây chết Đây là một ngoại độc tố có bản chất là protein, bền với nhiệt Là một kháng nguyên hoàn toàn, gây hình thành kháng thể kết tủa và kháng thể trung hòa dưới tác dụng của formol và nhiệt độ nó biến thành giải độc tố có thể làm vaccine

- Dung huyết tố : gây dung giải hồng cầu cừu ở 4C, kém độc hơn dung huyết tố 

- Dung huyết tố : gây dung giải hồng cầu cừu, người, thỏ, cừu, ngựa và gây hoại tử da

- Dung huyết tố : khác với các loại trên, loại này không tác động lên hồng cầu ngựa

Trong các dung huyết tố trên thì dung huyết tố  là đặc điểm cần thiết của các chủng tụ cầu có khả năng gây bệnh

+ Yếu tố diệt bạch cầu (Leucocidin)

Yếu tố này có khả năng làm mất tính di động của bạch cầu, mất hạt và nhân của bạch cầu bị phá hủy, nó giữ vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của tụ cầu

+ Độc tố đường ruột (Enterotoxin)

Chỉ một số tụ cầu tiết ra độc tố đường ruột, gây nên các bệnh đường tiêu hóa như nhiễm độc do thức ăn, viêm ruột cấp

Có 4 loại độc tố ruột, trong đó có 2 loại đã biết:

- Độc tố ruột A: tạo ra do một chủng phân lập trong quá trình nhiễm độc thức ăn

- Độc tố ruột B: tạo ra do một chủng phân lập trong các bệnh nhân viêm ruột

Độc tố ruột là những ngoại độc tố, bền với nhiệt và không bị phá hủy bởi dịch vị

* Các enzyme:

Các tụ cầu vàng sản sinh các loại enzyme ngoại bào (coagulase, fibrinolysin, hyaluronidase, protease, nuclease hay deoxyribonuclease (DNase) và ngoại độc tố (độc

tố dung huyết, độc tố đường ruột, độc tố bạch cầu, độc tố lở da) được coi là những nhân

tố hình thành bệnh từ phía vi khuẩn Coagulase còn có thể được các tụ cầu khuẩn khác

(S intermedius, S hyicus) sản sinh và là enzyme làm đông đặc (ngưng cố) huyết tương

(của người hoặc thỏ) Hyaluronidase còn gọi là yếu tố lan tỏa (spreading factor), cùng

với fibrinolysin được coi là liên quan đến sự hình thành và khuyếch đại ổ bệnh cảm nhiễm tụ cầu vàng Độc tố dung huyết phá hoại màng tế bào hồng cầu mà gây dung huyết, gồm 5 loại là α, β, γ và ε (alpha, beta, gamma và epsilon) Độc tố đường ruột (enterotoxin) là ngoại độc tố chịu nhiệt, có phân tử lượng khoảng 30.000 Da, có 5 loại từ

A đến E phân biệt nhau về mặt kháng nguyên Độc tố bạch cầu (leukocidin) là độc tố tế bào gây tổn hại các bạch huyết cầu một cách đặc hiệu Độc tố lở da (dermotoxin) có dạng A do gene plasmid chi phối và dạng B do gene nhiễm sắc thể chi phối, phá hủy các protein khớp nối (anchoring junction) và cầu sinh chất (plasmodesmodes) gắn các thành

tế bào biểu bì mà gây lở da

Coagulase (enzyme đông huyết tương) có tác dụng làm đông huyết tương của

người và thỏ, do chuyển hóa protein fibrinogen (tan) trong huyết tương thành fibrin, tạo nên các huyết khối trong huyết quản liên quan đến đặc tính gây bệnh nhiễm khuẩn huyết

ở động vật, là một protein chịu nhiệt có tính kháng nguyên yếu

Coagulase là một yếu tố cần thiết của các chủng tụ cầu gây bệnh, nó gây nên các cục huyết trong tĩnh mạch và gây nhiễm khuẩn huyết

Ngoài ra còn có coagulase cố định, nó tác động trực tiếp lên fibrinogen, chất này gắn vào vi khuẩn tạo thành một vỏ xung quanh giúp vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào

Hoạt tính fibrinolysin hay staphylokinase được thực hiện với môi trường

thạch fibrin (fibrin agar) nhưng cũng có thể tiến hành định tính với dung dịch plasma-coagulase Sau một thời gian nuôi cấy, một số chủng tụ cầu khuẩn fibrinolysin dương tính làm khối tơ huyết tan chảy

fibrinogen-Đây là một enzyme đặc trưng cho các chủng gây bệnh ở người, để có enzyme này, người ta phải nuôi lên men vi khuẩn trong vài ngày sau khi vi khuẩn đã mọc

Những chủng tụ cầu tiết ra enzyme này phát triển trong cục máu vỡ thành những mảnh nhỏ, những mảnh này dời chỗ và gây tắc mạch quản nhỏ hoặc mưng mủ, đôi khi gây ra hiện tượng nhiễm khuẩn di căn

Desoxyribonuclease: đây là men gây thủy phân acid desoxyribonucleic và gây tổn thương các tổ chức

Hyaluronidase: enzyme này có thể có ở tụ cầu gây bệnh, dưới tác dụng của penicillinase làm cho penicillin mất tác dụng.

1.1.1.8 Tính gây bệnh

Loài tụ cầu khuẩn có tính gây bệnh cao nhất là tụ cầu vàng có phản ứng coagulase dương tính, gây các chứng viêm mưng mủ, áp xe, viêm da lở biểu bì ở các loài động vật khác nhau Tuy nhiên, vi khuẩn này phân lập được khá thường xuyên từ đường ruột, da

và niêm mạc, và phân lập được với tần số cao từ bệnh phẩm như là một nguyên nhân cảm nhiễm cơ hội Gần đây, sự xuất hiện các chủng tụ cầu khuẩn đề kháng các chất kháng sinh hệ β-lactam (tụ cầu vàng đề kháng methicillin: MRSA, đề kháng vancomycin: VRSA) như là một bệnh nguyên chủ yếu làm vấn đề cảm nhiễm bệnh viện cũng như sự vô hiệu trong điều trị bệnh bằng thuốc ở người càng thêm trầm trọng

* Trong tự nhiên:

Tụ cầu thường ký sinh trên da, niêm mạc Khi sức đề kháng của cơ thể kém hoặc

tổ chức bị tổn thương, vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh Vi khuẩn có thể gây những ổ mủ ngoài da, niêm mạc và có thể vào máu gây nhiễm khuẩn hoặc nhiễm mủ huyết

Ngoài ra ở người còn thấy độc tố ruột do tụ cầu tiết ra gây nên nhiễm độc thức ăn

và viêm ruột cấp tính

Về mức độ cảm nhiễm: ở gia súc, ngựa cảm nhiễm nhất, đến chó, bò, lợn, cừu

Gà, vịt ít cảm nhiễm Người dễ cảm nhiễm với tụ cầu

* Trong phòng thí nghiệm:

Thỏ cảm nhiễm nhất Tiêm 1 2ml canh khuẩn tụ cầu vào tĩnh mạch tai, sau 36

-48 giờ thỏ chết vì chứng huyết nhiễm mủ Mổ khám thấy nhiều ổ áp xe trong phủ tạng

Nếu tiêm canh khuẩn tụ cầu dưới da cho thỏ sẽ gây áp xe dưới da.

* Kiểm tra bằng kính hiển vi:

Làm thành tiêu bản, nhuộm Gram rồi quan sát dưới kính hiển vi Nếu là tụ cầu, có hình cầu, bắt màu Gram dương, tụ lại thành từng đám như hình chùm nho

* Nuôi cấy vào môi trường thích hợp:

Bệnh phẩm được nuôi cấy vào môi trường nước thịt, thạch máu, thạch Chapman

* Tiêm động vật thí nghiệm

Dùng thỏ để gây bệnh

Để xác định tụ cầu gây bệnh phải dựa vào những tính chất sau:

- Lên men đường mannitol; Sinh sắc tố; Có dung huyết tố ; Có enzyme coagulase và một số trường hợp phát hiện desoxyribonuclease và fibrinolysin

1.1.2.1 Chẩn đoán huyết thanh học

Thường không sử dụng vì ít có giá trị thực tế

1.1.3 Phòng bệnh và trị bệnh

1.1.3.1 Phòng bệnh

- Phòng bệnh bằng vệ sinh: chủ yếu là giữ vệ sinh chung, trong các thao tác sản khoa, ngoại khoa phải đảm bảo vô trùng, những vết thương phải điều trị kịp thời tránh để trở thành chỗ xâm nhập của vi khuẩn gây nên nhiễm trùng nặng

- Phòng bệnh bằng vaccine

1.1.3.2 Trị bệnh

- Điều trị bằng kháng sinh: do đặc điểm của tụ cầu rất dễ kháng thuốc, hoặc có thể gặp phải chúng kháng kháng sinh, vì vậy nên làm kháng sinh đồ

Những loại kháng sinh thường dùng là:

+ Nhóm -lactamin: penicillin, methicillin, oxacillin Những thuốc này bị mất tác dụng khi tụ cầu có penicillinase

+ Nhóm aminosit, trong đó thường dùng kanamycin và gentamycin

- Chữa bệnh bằng vaccine: trong những trường hợp vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh, người ta có thể dùng vaccine để điều trị, thường dùng là vaccine tự liệu hoặc vaccine trị liệu

Vaccine tự liệu là loại vaccine lấy chính chủng tụ cầu gây bệnh ở đàn gia súc đó

để sản xuất vaccine điều trị cho đàn gia súc đó

Vaccine trị liệu là loại dùng tụ cầu của nhiều chủng khác nhau để chế vaccine

1.2 Giống liên cầu khuẩn Streptococcus

1.2.1 Đặc tính sinh học của Streptococcus

Streptococcus là những vi khuẩn hình cầu hoặc hình bầu dục, bắt màu Gram

dương, đường kính 0,6 - 1,0 μm, thường xếp thành chuỗi dài hoặc ngắn, nhưng cũng có thể có dạng song cầu tùy thuộc loài Không hình thành nha bào, một số hình thành giáp

mô, cũng có ít loài có lông, không di động Chiều dài của chuỗi tùy thuộc vào điều kiện môi trường khác nhau:

- Ở bệnh phẩm liên cầu hình thành chuỗi ngắn từ 6 - 8 đơn vị, có khi dưới hình thái song cầu

- Ở môi trường lỏng, liên cầu có chuỗi dài như Streptococcus agalactiae và S equi có

chuỗi từ 10 - 100 đơn vị

Hình 1.3 Liên cầu khi bắt màu Gram dương

Hình 1.4 Liên cầu khi dưới kính hiển vi điện tử

1.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy

Streptococcus là những vi khuẩn hiếu khí hoặc yếm khí tùy tiện, phát triển tốt ở

tất cả các môi trường, môi trường thạch máu, môi trường có huyết thanh nhưng đòi hỏi chất dinh dưỡng nghiêm ngặt, phát triển rất kém trên môi trường thạch thường Không phát triển ở các môi trường có thêm 6,5% NaCl Phần lớn các liên cầu gây bệnh ở 37C

* Môi trường nước thịt:

Vi khuẩn hình thành hạt hoặc những bông, rồi lắng xuống đáy ống Vì vậy say 24 giờ nuôi cấy, môi trường trong, đáy ống có cặn

* Môi trường thạch thường:

Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc dạng S, khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám Khi làm tiêu bản, liên cầu không xếp thành hình chuỗi dài mà thường hình thành chuỗi ngắn

* Môi trường thạch máu:

Máu thỏ là tốt nhất để chế môi trường, ngoài ra có thể dùng máu cừu, ngựa Trên môi trường này dựa vào tính chất dung huyết, người ta thấy liên cầu có 3 type khuẩn lạc khi quan sát ở độ phóng đại gấp 60 lần:

Có loại tạo vòng dung huyết đặc xung quanh khuẩn lạc khi phát triển trên môi trường thạch máu Tính dung huyết có thể khác nhau, một số chủng có tính dung huyết

ẩn tính, thường được phát hiện bởi thử nghiệm CAMP

+ Type dung huyết alpha, vòng dung huyết hơi trong bao quanh vòng màu xanh lục sát khuẩn lạc (liên cầu khuẩn α), xa khuẩn lạc một chút có vòng tan máu Độc lực của nhóm này không cao

+ Type dung huyết hoàn toàn beta, vòng dung huyết trong suốt không màu, có bờ

rõ ràng (liên cầu khuẩn β), nhóm này có độc lực cao

+ Type gamma hoàn toàn không dung huyết (liên cầu khuẩn γ), xung quanh khuẩn lạc không có sự thay đổi nào, hồng cầu trong thạch vẫn giữ màu hồng nhạt, nhóm này thường là những vi khuẩn không làm tan máu, không gây bệnh

1.2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên

Liên cầu có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp Người ta đã tìm thấy rất nhiều loại kháng nguyên ở liên cầu:

- Kháng nguyên polyozit hay chất "C":

Kháng nguyên này do Lancefield phát hiện năm 1928, đây là một kháng nguyên thân.Những liên cầu khác nhau có cấu tạo chất "C" khác nhau, đây là cơ sở để phân loại liên cầu thành các nhóm A, B, C, D, , R Trong đó nhóm A thuộc loại tan máu type β, có khả năng gây bệnh rất lớn ở người như: Eczema, nhiễm khuẩn vết thương, viêm họng

Liên cầu nhóm B, trong đó có Steptococcus agalactiae gây viêm buồng sữa ở trâu

bò, thuộc loại tan máu type β

Các chất này giúp cho liên cầu có sức chịu đựng tốt hơn và có khả năng gây độc

1.2.1.5 Các chất do Streptococcus gây bệnh tiết ra

* Độc tố:

- Liên cầu nhóm A có khả năng sản sinh ra độc tố có bản chất là protein, tạo nên các nốt ban đỏ Tuy nhiên nhóm B, C ít khi có độc tố này

- Dung huyết tố: có 2 loại đã biết

+ Streptolysin O: Hầu hết các loại liên cầu làm tan máu đều có khả năng sản sinh Streptolysin O Dung huyết tố này hoạt động trong điều kiện không có oxy, dễ bị mất hoạt tính bởi oxy

Đây là một kháng nguyên mạnh, kích thích cơ thể hình thành kháng thể antistreptolysin

O Việc định lượng kháng thể này có giá trị trong chẩn đoán bệnh do liên cầu gây ra

+ Streptolysin S: Nhiều chủng liên cầu sản sinh loại dung huyết tố này, chất này không

bị mất hoạt tính bởi oxy, có khả năng làm tan máu ở trên cả bề mặt môi trường, dung huyết tố này có tính kháng nguyên yếu nên không có giá trị trong chẩn đoán bệnh

Hai loại dung huyết tố này khi làm tinh khiết, chỉ cần tiêm cho gia súc với liều thấp cũng đủ gây chết vì có khả năng gây độc với tim và não

* Các enzyme:

Các liên cầu khuẩn hóa mủ sản sinh các loại enzyme ngoại bào (fibrinolysin, hyaluronidase, DNase, ) và các độc tố ngoại bào (streptolysine O, streptolysine S, ) khác nhau Các độc tố ngoại bào giúp vi khuẩn xâm nhập vào tổ chức Ngoài ra, trên bề mặt liên cầu khuẩn tồn tại chất gọi là protein M liên quan đến sự đề kháng quá trình thực bào của bạch cầu trung tính

- Enzyme làm tan tơ huyết (Streptokinase)

Enzyme này thường do các liên cầu nhóm A, C, G sinh ra, có tác dụng làm tan tơ huyết Enzyme này có tính kháng nguyên cao, kích thích cơ thể hình thành kháng thể antistreptokinase

Người ta có thể điều chế kháng nguyên này từ nhóm liên cầu C và ứng dụng trong điều trị các bệnh fibrin trong máu do có khả năng phá hủy fibrin

- Proteinase: có tác dụng thủy phân protein, khi tiêm với liều cao cho động gây các tổn thương ở tim.

1.2.1.6 Sức đề kháng

Liên cầu có sức đề kháng với nhiệt độ và hóa chất:

- Ở 70ºC, liên cầu chết trong 35 - 40 phút, ở 100ºC chết trong 1 phút

- Các chất sát trùng thường dễ dàng tiêu diệt được liên cầu

Ở ngựa, liên cầu gây bệnh viêm hạch truyền nhiễm Adenitis equorum.

Ở bò, liên cầu gây bệnh viêm buồng vú truyền nhiễm ở bò sữa, bệnh bại huyết ở bê

Ở dê, liên cầu gây chứng mưng mủ, viêm vú, viêm phổi và viêm ngoại tâm mạc

* Trong phòng thí nghiệm

Thỏ là động vật thí nghiệm dễ cảm thụ nhất Nếu tiêm liên cầu vào dưới da thỏ sẽ gây apxe tại nơi tiêm, còn tiêm vào tĩnh mạch hay phúc mạc thì thỏ chết nhanh do nhiễm khuẩn huyết

Ngoài ra có thể dùng chuột nhắt để gây bệnh thí nghiệm

* Kiểm tra bằng kính hiển vi

Làm tiêu bản đem nhuộm Gram, rồi quan sát dưới kính hiển vi, nếu là liên cầu bắt màu Gram dương, có hình cầu và xếp thành chuỗi

* Nuôi cấy vào môi trường thích hợp

Bệnh phẩm được nuôi cấy vào môi trường nước thịt, môi trường thạch máu Theo dõi tính chất mọc, sự hình thành khuẩn lạc, type tan máu

* Tiêm động vật thí nghiệm

Dùng thỏ để gây bệnh rồi quan sát triệu chứng lâm sàng và bệnh tích tùy theo phương pháp tiêm

1.1.2.2 Chẩn đoán huyết thanh học

Có thể dùng phản ứng huyết thanh học như phản ứng ngưng kết, phản ứng kết hợp bổ thể để chẩn đoán

Chương 2 Họ Corynebacteriaceae

Giống Erysipelothrix

Gồm những trực khuẩn nhỏ, thẳng hoặc hơi cong, có khuynh hướng hình thành sợi dài và phân nhánh, không hình thành nha bào và giáp mô, sống hiếu khí, bắt màu

Gram dương Trong thú y có vi khuẩn đóng dấu lợn (Erysipelothrix rhusiopathiae).

2.1 Trực khuẩn đóng dấu lợn E rhusiopathiae

Vi khuẩn gây xuất huyết, viêm da, ruột, thận, màng tương dịch và niêm mạc, lách sưng to và bại huyết toàn thân

Trực khuẩn được Pasteur và Thuilier phát hiện năm 1882

Vi khuẩn thường ký sinh ở cơ thể lợn khỏe, một số loài động vật mang vi khuẩn như: bồ câu, gà, chuột, quạ, loài nhai lại nhỏ Ngoài ra người ta còn tìm thấy vi khuẩn trong cá, ếch, cua, tôm, côn trùng, sâu, bọ

Vi khuẩn có ở khắp nơi trong đất, nước, chỗ ẩm ướt, thiếu ánh sáng, nơi sình lầy đọng nước, đất có nhiều chất hữu cơ, thậm chí trong đất sét ướt

Khi sức đề kháng của lợn giảm sút, vi khuẩn xâm nhập qua vết thương, qua đường tiêu hóa vào máu và gây bệnh

2.1.1 Đặc tính sinh học

2.1.1.1 Hình thái

E rhusiopathiae là trực khuẩn nhỏ, thẳng, có khi hơi cong, kích thước

1-1,5×0,2-0,4µm Vi khuẩn không có lông, không di động, không hình thành nha bào và giáp mô, sản sinh theo phương thức trực phân, sống hiếu khí Khi làm tiêu bản từ canh khuẩn già hoặc từ bệnh phẩm lợn mắc bệnh mạn tính thường thấy vi khuẩn có hình sợi tơ dài, cong queo Còn khi làm tiêu bản trong bệnh phẩm của lợn mắc bệnh cấp tính thì thấy vi khuẩn đứng riêng lẻ hay thành từng đôi, có khi thấy vi khuẩn nằm trong bạch cầu

Trực khuẩn đóng dấu lợn bắt màu Gram dương, có thể nhuộm với tất cả các thuốc nhuộm kiềm Anilin Nếu làm tiêu bản từ phủ tạng lợn bệnh hoặc từ thể dịch và nhuộm Wright thì quan sát vi khuẩn rõ hơn

Hình 2.1 Trực khuẩn đóng dấu lợn bắt màu Gram dương khi nhuộm

Hình 2.2 Trực khuẩn đóng dấu lợn dưới kính hiển vi điện tử

2.1.1.2 Đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn sống hiếu khí nhưng cũng có thể sinh trưởng trong môi trường yếm khí, nhiệt độ thích hợp 37ºC, pH thích hợp 7,2-7,6

* Môi trường nước thịt

Sau khi cấy 24 giờ, môi trường hơi đục rồi trong, lắc lên thì có vẩn như mây bay rồi trở lại trong như cũ, đáy ống nghiệm có một ít cặn trắng nhày màu tro Nếu thêm đường glucose và 10% huyết thanh vào môi trường thì rất tốt cho vi khuẩn mọc

Tùy theo giống khác nhau, có giống nuôi lâu thì nước thịt trong ra, có giống lại

* Môi trường thạch thường

Nuôi cấy sau 24 giờ, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc rất nhỏ, bóng láng dạng S hình tròn, rìa gọn, trong như giọt sương

* Môi trường thạch máu

Vi khuẩn không gây tam máu Sau 24 - 48 giờ nuôi cấy thấy xuất hiện những khuẩn lạc nhỏ, tròn óng ánh như hạt sương

* Môi trường thạch huyết thanh 10%

Vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc nhỏ li ti, như hạt sương, màu xanh lơ nhạt, những hạt khuẩn lạc to nhìn qua ánh sáng sẽ có màu xanh lơ rõ So với khuẩn lạc của

Pasteurella boviseptica thì khuẩn lạc của E rhusiopathiae có ít ánh vàng hơn.

* Môi trường Parker

Là môi trường tốt nhất dùng để phân lập vi khuẩn này, đó là môi trường thạch máu có chứa 1/1000 natri azit, 1/100.000 tím kết tinh (Violet de gentiane) và 5% máu, điều chỉnh pH = 6,8 Vi khuẩn được cấy, để tủ ấm 37ºC có 10% CO2 Vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc rất nhỏ mịn, dạng S hoặc những khuẩn lạc dạng R, to hơn, bề mặt không đều và đục

* Môi trường thạch lỏng

Vi khuẩn phát triển rất tốt, không di động

* Môi trường gelatin

Cấy chích sâu ở nhiệt độ 28ºC, sau 5 ngày vi khuẩn mọc theo đường cấy hình thành những lông nhỏ màu xanh tro mọc ngang ra giống hình bàn chải rửa ống nghiệm Gelatin không tan chảy, để lâu, mặt gelatin ở xung quanh vết cấy vẫn khô

Chú ý: trên môi trường nuôi cấy có thể phân lập ra 2 loại khuẩn lạc biến dị là khuẩn lạc dạng S - với các chủng có độc lực cao và khuẩn lạc dạng R - với các chủng vi khuẩn có độc lực thấp hơn

2.1.1.3 Đặc tính sinh hóa

- Chuyển hóa đường: tùy theo chủng vi khuẩn khác nhau mà đặc tính lên men đường cũng khác nhau Phần lớn vi khuẩn lên men đường glucose, galactose, levulose,

mannose Không lên men đường saccarose, maltose, arabinose, xylose, dectrin, mannitol, sorbitol, dunxitol, glyxerol, inositiol, trihalose, inulin, salixin.

Phản ứng thử trong môi trường có 10% huyết thanh và chỉ thị màu anhydrat hoặc xanh bromothymol

- Các phản ứng sinh hóa: Phản ứng VP (Voges Proskauer): âm tính; Phản ứng MR (Methyl Red): âm tính; Phản ứng sinh indol: âm tính; Phản ứng sinh H2S: dương tính

Ngoài ra vi khuẩn không sinh ure, không làm đông sữa (catalase âm tính) và không gây tan máu

Vi khuẩn mẫn cảm với nhiệt độ cao: trong canh khuẩn, đun 70ºC, vi khuẩn chết sau 5 phút, 100ºC chết ngay Tuy nhiên trong thịt có vi khuẩn, nếu độ dày thịt 15 cm thì phải đun sôi 100ºC trong 2 giờ 30 phút vẫn chưa diệt được vi khuẩn

Các chất sát trùng: chlorua vôi 1%, NaOH 5%, acid phenic 1% đều có thể diệt vi khuẩn nhanh chóng

2.1.1.5 Tính gây bệnh

* Trong tự nhiên

Lợn 3 - 4 tháng cho đến 1 năm tuổi rất mẫn cảm Loài chim cũng cảm thụ ở mức

độ nặng nhẹ theo thứ tự: bồ câu, gà, vịt, ngan, ngỗng, vẹt, sáo, chim sẻ Ở chim thường thấy triệu chứng mào tái, suy nhược, ỉa chảy Bệnh tích thấy xuất huyết niêm mạc và bắp thịt, gan lách tụ máu, sưng to

Trâu, bò, dê cừu và chó cũng mắc,

Người cũng mắc bệnh này, với các biểu hiện: sốt cao, da mẩn đỏ, sưng đầu các khớp xương và hạch

* Trong phòng thí nghiệm

+ Chuột bạch: là loài cảm thụ nhất nên được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh Tiêm dưới da chuột bạch canh khuẩn, sau 24 giờ với liều 0,3 - 0,4 ml; sau 2 - 6 ngày chuột bạch bị bại huyết và chết, trước đó có biểu hiện sợ ánh sáng, viêm sưng giác mạc Bệnh tích mổ khám thấy phổi sưng, tụ máu, lách sưng, gan màu tro, nát

+ Bồ cầu: cũng là loài mẫn cảm, tiêm canh khuẩn 24 giờ với liều 1 ml vào bắp thịt hoặc dưới da Sau 3 - 4 ngày bồ câu chết Trước khi chết có biểu hiện 2 chân bại, thở khó Mổ khám có bệnh tích, chỗ tiêm sưng, tụ máu, tim sưng, niêm mạc tụ máu, viêm tích nước ngoại tâm mạc, gan thận viêm tụ máu Theo Pasteur có thể tăng độc lực của vi khuẩn bằng cách tiêm truyền nhiều lần qua bồ câu Từ đó có thể tạo ra "giống vi khuẩn thông qua bồ câu có độc lực cao"

+ Thỏ: cảm thụ kém, nếu tiêm vi khuẩn vào tĩnh mạch, thỏ chết sau 3 - 6 ngày, tuy nhiên kết quả không chắc chắn

2.1.2 Chẩn đoán

2.1.2.1 Chẩn đoán vi khuẩn học

Bệnh ở thể cấp tính và mãn tính nên dùng bệnh phẩm là máu tim và lách, nếu bại huyết thì dùng gan, thận Trường hợp mắc bệnh cấp tính hoặc bại huyết mà không chết, chuyển sang thể mãn thì lấy tủy xương (tốt nhất ở đốt sống 3 - 5)

* Kiểm tra hình thái

Lấy bệnh phẩm làm tiêu bản rồi nhuộm Gram hoặc Wright, quan sát hình thái, vk ngắn nhỏ, tập trung nhiều trong bạch cầu

Ở lợn mắc bệnh mãn tính thì vi khuẩn có hình sợi dài

* Nuôi cấy phân lập

Tốt nhất là dùng bệnh phẩm cấy vào môi trường Parker

Nếu là bệnh phẩm đã thối đem nghiền với nước sinh lý tiêm dưới da cho bồ câu (lưu ý không tiêm bắp), sau đó phân lập vi khuẩn lấy từ máu tim hoặc gan của bồ câu chết, đem nuôi cấy vào môi trường rồi quan sát tính chất mọc, thử các phản ứng sinh hóa: VP, MR, Indol, H2S

Cần chẩn đoán phân biệt với các loài vi khuẩn cùng họ, đặc biệt là Listeria qua

những chỉ tiêu phân biệt sau:

Bảng 2.1 Chẩn đoán phân biệt vi khuẩn đóng dấu lợn với các loài cùng họ

Chỉ tiêu phân biệt E rhusiopathiae Listeria

2.1.2.2 Chẩn đoán huyết thanh học

Lợn mắc bệnh ở thể thứ cấp hay mãn tính nên dùng huyết thanh để chẩn đoán, mắc ở thể quá cấp hoặc thể cấp tính thì không áp dụng được bởi cơ thể chưa đủ thời gian sản sinh kháng thể đặc hiệu

Người ta thường tiến hành phản ứng ngưng kết

* Phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính

Các bước tiến hành:

- Chuẩn bị kháng nguyên: kháng nguyên đã biết là vi khuẩn đóng dấu lợn nuôi 24 - 48 giờ, đây là kháng nguyên sống

- Chuẩn bị huyết thanh nghi: lấy máu lợn nghi mắc bệnh chắt lấy huyết thanh, đem pha loãng thành 4 nồng độ khác nhau với nước sinh lý: huyết thanh nguyên; 1/4; 1/8 và 1/16.

- Cách tiến hành: dùng phiến kính chuyên dụng có 5 lỗ lõm và 5 lamel để úp vào 5 lỗ đó

Nhỏ lên 4 lamel, mỗi lamel 1 giọt huyết thanh ở các nồng độ pha loãng như trên, còn lamel thứ 5 nhỏ 1 giọt nước sinh lý làm đối chứng âm (-)

Nhỏ lên trên các giọt huyết thanh ở mỗi lamel 1 giọt kháng nguyên sống, trộn đều Bôi vaselin lên bờ các lỗ lõm rồi lật úp các lamel vào lỗ lõm Để tủ ấm 37C/15 phút, lấy ra đọc kết quả trên kính hiển vi với vật kính có số bội giác thấp

ở đáy ống pha với nước sinh lý có formol 1% thành huyễn dịch sao cho đậm độ vi khuẩn

là 3108/ml (dùng phương pháp đo độ đục của Marfarland)

Phương pháp Marfarland: nếu cho BaCl2 tác động với H2SO4 sẽ tạo ra BaSO4 kết tủa, tùy theo chất này có nhiều hay trong nước mà độ đục của nước khác nhau Căn cứ vào độ đục này mà đo số lượng vi khuẩn trong một hỗn dịch bằng cách so sánh:

H2SO4 + BaCl2  BaSO4 + 2HCl

- Cách tiến hành: dùng 10 ống nghiệm sạch, trong, có kích thước bằng nhau Đổ BaCl21% vào từng ống nghiệm theo thứ tự từ 1 đến 10 (ống 1: 0,1 ml; ống 2: 0,2 ml và cứ như vậy cho đến ống 10, mỗi ống hơn nhau 0,1 ml)

Sau đó đổ vào mỗi ống vừa đủ 10 ml dung dịch H2SO4 1% rồi hàn miệng lại

Số lượng vi khuẩn sẽ tương đương với độ đục của các ống theo bảng dưới đây:

Bảng 2.2 Kết quả so màu đánh giá số lượng vi khuẩn theo Marfarland

Số TT ống Số vi khuẩn/ml

Số vi khuẩn/ml (triệu)

- Chế huyết thanh: được lấy từ máu lợn nghi bệnh

- Cách tiến hành: dùng 6 ống nghiệm, cho vào ống 1 với lượng 1,92 ml kháng nguyên, các ống còn lại cho 1 ml

Cho 0,08 ml huyết thanh vào ống 1, như vậy huyết thanh pha loãng ở nồng độ 1/25 Trộn đều, hút 1 ml chuyển sang ống 2, trộn đều, ống này có độ pha loãng là 1/50

Cứ như vậy trộn tiếp đến ống 5 rồi hút bỏ đi 1 ml Như vậy, các ống nghiệm đều chứa 1

ml hỗn dịch kháng nguyên và huyết thanh pha loãng từ 1/25 đến 1/400; ống thứ 6 chỉ có

1 ml kháng nguyên và 1 ml nước sinh lý (đối chứng âm)

Toàn bộ để tủ ấm 37C, đọc kết quả sau 24 giờ

Nếu hiện tượng ngưng kết xảy ra đến ống 3 hoặc ống 4 là phản ứng (+), lợn bị bệnh đóng dấu

Phản ứng nghi ngờ: ngưng kết không rõ ở hiệu giá huyết thanh từ 1/25 - 1/50.Phản ứng (-): giống ống đối chứng

* Phản ứng ngưng kết nhanh với máu

- Chế kháng nguyên: nuôi cấy vào môi trường chủng vi khuẩn tiêu chuẩn sau 24 giờ, ly tâm lấy cặn, pha thành nồng độ 15109 vi khuẩn/ml (so độ đục Marfarland) với nước sinh lý có 1% formol Để tủ lạnh 1 tuần, rút 20% nước trong, bổ sung 20% glyxerin rồi nhuộm bằng dung dịch tím gentian bão hòa (98 ml nước và 2 g tím gentian), cứ 10 ml huyễn dịch vi khuẩn có glyxerin thì cho thêm 0,2 ml dung dịch tím gentian để nhuộm

- Máu lợn nghi: lấy máu tai, nếu cần gửi đi xa thì chống đông bằng citrate natri.

- Cách tiến hành: dùng phiến kính trong sạch, nhỏ mỗi đầu 1 giọt kháng nguyên (0,05ml) nhỏ vào giọt kháng nguyên thứ nhất 1 giọt nước sinh lý làm đối chứng Nhỏ lên giọt kháng nguyên thứ hai 1 giọt máu lợn nghi Dùng que cấy trộn đều, để 1 - 2 phút rồi đọc kết quả

Phản ứng (+): vi khuẩn tập trung từng đám lợn cợn ở xung quanh giọt, hỗn dịch ở giữa trong, lợn bị bệnh đóng dấu

Phản ứng (-): hỗn dịch đều như giọt đối chứng

2.1.3 Phòng và trị bệnh

2.1.3.1 Phòng bệnh bằng vaccine

* Vaccine formol có keo phèn

Cấy vi khuẩn giống chuẩn vào nước thịt VF, bồi dưỡng ở 37C trong 24 giờ, thu hoạch hỗn dịch, cho formol vào để giết vi khuẩn, cho thêm keo phèn là chất bổ trợ miễn dịch để có vaccine chết formol keo phèn Khi dùng tiêm dưới da với liều 5ml/con, miễn dịch được 5 - 6 tháng

* Vaccine đóng dấu lợn nhược độc

Đây là loại vaccine đang được sử dụng rộng rãi, là loại vaccine đóng dấu lợn nhược độc chủng VR2 thuộc type N, được cấy trên môi trường thạch lỏng (bán cố thể)

Ưu điểm của loại vaccine này là an toàn, có tính miễn dịch cao cho lợn, chống lại bệnh gây ra bởi các vi khuẩn đóng dấu lợn cường độc thuộc nhiều type A, B, C, D, E Trong 1 ml vaccine có 1.310.000 UI

Vaccine được tiêm vào dưới da cho lợn từ 2 tháng tuổi trở lên (cần thiết có thể dùng tiêm cho lợn 1,5 tháng) Sau khi tiêm 9 ngày bắt đầu có miễn dịch và sau 14 ngày

có miễn dịch hoàn toàn vững chắc Thời gian miễn dịch từ 7 - 9 tháng và có thể dài hơn nếu tiêm nhắc lại

Vaccine có thể tiêm cùng một lúc với vaccine nhược độc dịch tả lợn, vaccine tụ huyết trùng lợn mà không bị ảnh hưởng xấu đến tính miễn dịch của nó

Do có tính chất gây miễn dịch mạnh nên vaccine có thể tiêm ngay vào vùng dịch

để bao vây, dập tắt dịch có hiệu quả Vaccine này không tiêm cho lợn đnag ốm, lợn sắp

đẻ hay lợn con mới đẻ

Liều dùng 0,5 ml cho lợn dưới 30kg, 1 ml cho lợn trên 30kg, bảo quản vaccine trong tủ lạnh

2.1.3.2 Trị bệnh

- Kháng huyết thanh được chế từ ngựa hoặc bò đã được miễn dịch cao độ với vi khuẩn cường độc đóng dấu lợn, trong huyết thanh có chứa nhiều kháng thể đặc hiệu của bệnh đóng dấu lợn, được bảo quản bằng phenol

Kháng huyết thanh dùng tiêm dưới da hay bắp thịt để chữa hoặc phòng bệnh đóng dấu lợn, sau khi tiêm 24 giờ có miễn dịch và miễn dịch kéo dài 3 tuần Được dùng theo liều lượng như sau:

Liều phòng bệnh (ml) Liều chữa bệnh (ml)

Chương 3 Họ Parvobacteriaceae

3.1 Giống Pasteurella

Giống Pasteurella có nhiều loại, căn cứ vào tính chất gây bệnh cho các loài được chia thành 3 loại:

- Loại gây bệnh bại huyết, xuất huyết gồm có P multocida, P hemolytica

- Loại gây bệnh truyền nhiễm cho loài gặm nhấm, có thể truyền sang người gồm có P

pestis, P tularensis.

- Loại gây bệnh truyền nhiễm mạn tính cho loài gặm nhấm gồm có P

pseudotuberculosis.

Hiện nay P pestis và P pseudotuberculosis được xếp vào giống Yersinia, P

tularensis được xếp vào giống Francisella.

Trong giống này hay gặp nhất là P multocida.

Giống (Genus) : Pasteurella

Loài (Species) : Pasteurella multocida

P multocida gây bệnh bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm, thường gọi là

bệnh tụ huyết trùng (Pasteurellosis)

P multocida còn có tên P septica, gây bệnh tụ huyết trùng ở gà được Tousain tìm

thầy năm 1879, Pasteur và Thuilier đã nghiên cứu chế được vaccine giảm độc đầu tiên

Tất cả các loại Pasteurella gây bệnh cho gia súc, gia cầm đều thuộc một giống duy nhất, có đặc tính căn bản giống nhau về hình thái, nuôi cấy, nhưng chỉ khác nhau ở tính

thích nghi gây bệnh với các loài khác nhau Trên cơ sở đó người ta chia P multocida

thành các loại sau:

- P aviseptica gây bệnh tụ huyết trùng gà.

- P boviseptica gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò.

- P suiseptica gây bệnh tụ huyết trùng lợn.

- P oviseptica gây bệnh tụ huyết trùng cừu

P multocida tồn tại trong thiên nhiên rộng rãi, trong đất, nước, cây cỏ Trên cơ

thể động vật, vi khuẩn sống ký sinh ở đường hô hấp trên, đường tiêu hóa, đây là nguồn mang vi khuẩn; ở lợn có 40% mang vi khuẩn, ở bò 80%, cừu 50%, ngựa 60%, chó 30%.Những vi khuẩn này ký sinh không gây bệnh, tuy nhiên khi sức đề kháng cơ thể bị giảm sút thì vi khuẩn thừa cơ phát bệnh

3.1.2 Đặc tính sinh học

3.1.2.1 Hình thái và tính chất bắt màu

Hình 3.1 P multocida bắt màu Gram âm khi nhuộm

Hình 3.2 P multocida dưới kính hiển vi điện tử

Tất cả các loại Pasteurella đều có hình thái giống nhau, là loại cầu trực khuẩn

nhỏ, hình trứng hoặc hình dầu dục, hai đầu tròn, kích thước 0,25 - 0,4 × 0,4 1,5 m, không lông, không di động, không hình thành nha bào, bắt màu Gram âm Trong cơ thể gia súc mắc bệnh có hình thành giáp mô nhưng khi nhuộm thì khó quan sát được

Trong cơ thể gia súc mắc bệnh, vi khuẩn Pasteurella khi nhuộm màu có hiện

tượng bắt màu sẫm ở hai đầu, còn ở giữa bắt màu nhạt hơn hoặc không bắt màu, vì vậy còn gọi đây là vi khuẩn lưỡng cực Nguyên nhân này là do nguyên sinh chất của vi khuẩn dung giải dồn về hai đầu

Trong canh khuẩn thường thấy vi khuẩn hình trứng, hình cầu đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Trong canh khuẩn già vi khuẩn yếu, biến dạng, thay đổi hình thái như hình gậy dài, dùi cui hoặc hình quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường có khi dài 2 -3m hoặc dài hơn

Theo Carter (1967) cho rằng tính đa dạng của vi khuẩn Pasteurella multocida có

liên quan đến sự phát triển của vi khuẩn này trong điều kiện thiếu oxy

Pasteurella nhuộm dễ với các loại thuốc nhuộm anilin, tốt nhất dùng xanh

methylen, fucshine hoặc giemsa

- Trong môi trường nước thịt:

Sau khi cấy 24 giờ, canh khuẩn đục vừa, lắc có hiện tượng vẩn như sương mù rồi lóa mắt, đáy ống có cặn nhầy, có khi sinh ra một màng mỏng trên mặt môi trường Môi trường có mùi đặc biệt giống mùi tanh của nước dãi khô Vi khuẩn mọc tốt hơn nếu cho thêm vào môi trường vài giọt huyết thanh

- Trong môi trường thạch thường:

Vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng S, khuẩn lạc nhỏ, trong suốt long lanh như hạt sương, mặt khuẩn lạc vồng Nuôi lâu khuẩn lạc có màu trắng ngà dính vào môi trường

Trong môi trường này P multocida phát triển thành những dạng khuẩn lạc sau:

+ Dạng S (smooth): dạng khuẩn lạc trơn, bóng láng, long lanh, mặt vồng, có dung quang sắc cầu vồng, là dạng khuẩn lạc có độc lực mạnh,vi khuẩn thuộc dạng khuẩn lạc này thường tạo thành lớp giác mô nhiều hơn loại khuẩn lạc xù xì

+ Dạng R (Rough) khuẩn lạc thường dẹt, có dìa nhám xù xì, trơn nhám, có dung quang màu xanh, dạng khuẩn lạc này có độc lực yếu hơn

+ Dạng M (Mucoid): khuẩn lạc nhày ướt, có kích thước to nhất, có rìa nhẵn, dung quang sắc cầu vồng yếu hơn dạng S

Hình dạng khuẩn lạc cũng có thể thay đổi, nếu nuôi cấy lâu ngày thì kích thước khuẩn lạc lớn hơn, nhớt và dính chặt vào mặt thạch, còn khi cấy chuyển nhiều lần giáp

mô bị mất, kích thước của khuẩn lạc sẽ nhỏ lại, không màu và trong suốt

Những vi khuẩn có giáp mô lớn là những vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc dạng nhày, ít phát quang, có bờ tròn gọn, những vi khuẩn có giác mô nhỏ hơn là những vi khuẩn tạo nên khuẩn lạc trơn bóng láng

- Trong môi trường thạch máu:

Vi khuẩn phát triển tốt hơn trên môi trường thạch thường Vi khuẩn không làm tan máu, kích thước khuẩn lạc to hơn khuẩn lạc trên môi trường thạch thường Môi trường

- Môi trường nước thịt pepton:

Sau khi cấy 24 giờ vi khuẩn làm đục môi trường, vài ngày sau môi trường trở nên trong, dưới đáy có cặn nhày, lắc khó tan

Theo Namioka và Murata (1961), môi trường nuôi cấy tốt nhất cho vi khuẩn này

là môi trường YPC (Yeast extract pepton – L Cystin) có thêm sucrose và sodium sulfite Đây là môi trường giúp cho sự tái tạo giáp mô của vi khuẩn và cũng là môi trường phân lập, giữ giống và phân giống

- Trong môi trường thạch có huyết thanh và huyết cầu tố:

Đây là môi trường đặc biệt dùng để giám định, phân lập và xác định độc lực của vi khuẩn Pasteurella

Trên môi trường này, vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc đặc biệt: có hiện tượng phát huỳnh quang khi xem khuẩn lạc bằng kính hiển vi có 2 thị kính với độ phóng đại thấp (độ 20 lần) và góc chiếu phản quang của ánh đèn điện là 45

Tùy theo độc lực của vi khuẩn mà màu sắc huỳnh quang của khuẩn lạc khác nhau:

- Nếu vi khuẩn có độc lực cao, thì khuẩn lạc của chúng quan sát thấy: màu xanh lơ, xanh lá mạ chiếm 2/3 diện tích khuẩn lạc về phía đèn, còn 1/3 khuẩn lạc là màu vàng kim loại, vàng da cam, khuẩn lạc này gọi là Fg (Greenish Fluorescent).

- Nếu vi khuẩn có độc lực vừa, khuẩn lạc của chúng quan sát thấy: màu xanh lơ ít hơn diện tích màu da cam, khuẩn lạc này là Fo (Orange Fluorescent).

- Nếu vi khuẩn có độc lực yếu, khuẩn lạc của chúng không có hiện tượng phát huỳnh quang, không màu gọi là loại Nt (Not Fluorescent) Khuẩn lạc nhỏ, tròn trong

Hiện tượng phát huỳnh quang của khuẩn lạc xem rõ khi nuôi cấy sau 24 giờ Nếu

để sau 72 giờ thì huỳnh quang sẽ mất đi

Cách xem màu sắc của khuẩn lạc trên đây chỉ áp dụng cho chủng vi khuẩn P

multocida gây bệnh ở lợn và trâu bò, không áp dụng cho chủng gây bệnh ở gia cầm Đối

với chủng gây bệnh ở gia cầm, loại có độc lực mạnh thì khuẩn lạc của chúng thuộc loại

F0

- Môi trường gelatin:

Cấy theo đường cấy trích sâu, vi khuẩn mọc dọc theo đường cấy thành những khuẩn lạc mịn, hình hạt, không làm tan chảy gelatin

3.1.2.3 Đặc tính sinh hóa

- Chuyển hóa đường:

P multocida có khả năng lên men nhưng không sinh hơi đường: glucose,

saccarose, mannitol, sorbitol, xylose Không lên men đường lactose, maltose, arabinose,rammose, salixin, dunxid, adonit

- Các phản ứng sinh hóa khác: + Indol: âm tính; + VP: âm tính; + MR: âm tính; + H2S: lúc có lúc không; + Catalase: dương tính; + Oxydase: dương tính; Rosenbush và

Merchant (1939) đã chia P multocida thành 3 nhóm:

+ Nhóm 1: gồm các chủng P multocida phân lập từ gia cầm, nhóm này phân giải

arabinose, dunxid, không phân giải xylose

+ Nhóm 2: gồm các chủng P multocida phân lập từ động vật có vú, chủng này phân giải

xylose, không phân giải arabinose và dunxid

+ Nhóm 3: gồm tất cả các chủng phân giải cả arabinose, dunxid và xylose

3.1.2.4 Cấu trúc kháng nguyên và các type huyết thanh học

* Cấu trúc kháng nguyên

Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn tương đối phức tạp, cấu trúc từng loại kháng nguyên luôn thay đổi Vi khuẩn có một kháng nguyên O là glucid - lipid - protein, độc đối với chuột nhắt và gây được miễn dịch Những chủng độc có một kháng nguyên phụ

là kháng nguyên vỏ có bản chất là polysaccarid - một bán kháng nguyên, che lớp kháng nguyên O Trong nghiên cứu vaccine tụ huyết trùng, việc tách bộc lộ kháng nguyên O để tạo miễn dịch tốt hơn là hết sức quan trọng giúp nâng cao hiệu quả vaccine

P multocida có tính kháng nguyên giao hỗ (miễn dịch chéo) giữa các chủng và ít

hay nhiều tùy thuộc từng chủng Để thử tính miễn dịch chéo này, lấy vi khuẩn chế vaccine đem tiêm cho thỏ rồi lấy vi khuẩn của các chủng khác thử, nếu thỏ không chết là

có tính miễn dịc chéo

Robert (1947) bằng phương pháp bảo hộ chéo trên chuột bạch đã xác định được P

multocida có 4 loại kháng nguyên vỏ gồm I, II, III và IV Tuy nhiên phương pháp này ít

được sử dụng vì khó khăn, tốn kém và mất nhiều thời gian Các chủng phân lập được từ trâu bò thuộc type I

Carter (1955) sử dụng phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu (Indirect Haemagglutination Test - IHA) và cũng xác định có 4 nhóm kháng nguyên K được ký hiệu: A, B, C và D.

Năm 1961, Carter bằng phản ứng ngưng kết đã xác định thêm type mới đặt tên là E, năm 1963, ông đề nghị bỏ type C, đưa thêm type F Phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp là thích hợp cho việc định type theo kháng nguyên K mà hiện nay vẫn được ứng dụng rộng rãi

Nhiều thực nghiệm đã chứng minh được mối quan hệ giữa hai hệ thống phân typecủa Robert và Carter như sau:

Type A tương ứng với Type II, III, IV

Type E không tương ứng với type nào

- Các kháng nguyên vỏ K bao quanh thân vi khuẩn che chở kháng nguyên O khỏi bị các phage tác dụng nhưng đồng thời cũng ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O và kháng thể O Do vậy, muốn phát hiện kháng nguyên O phải phá hủy kháng nguyên K hoặc dùng phương pháp nuôi cấy không cho vi khuẩn hình thành kháng nguyên giáp mô.Kháng nguyên K chỉ có ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S, không có ở dạng M và R Kháng nguyên này nhận được bằng cách cho canh khuẩn mới nuôi cấy vào nước cất và chiết xuất trong vòng 5 phút ở 37C Kháng nguyên K có 2 thành phần là α và , chúng được cấu tạo từ protein và polysaccarid, ngoài ra còn có một số ít các lipo-polysaccarid.Kháng nguyên O có hai nhóm: đặc hiệu và không đặc hiệu, các chủng khác nhau sẽ khác nhau về kháng nguyên thân Chỉ có serotype B hầu như đồng nhất thuộc một nhóm kháng nguyên O Cũng có 2 hệ thống phân loại kháng nguyên này:

+ Theo Namioka và Murata (1961) gồm 12 yếu tố

+ Theo Heddleston (1972) gồm 16 yếu tố

Kháng nguyên O là một phức hợp protein - lipid - polysaccarid, chiết xuất được nhờ acid trichloacetic, dung dịch phenol và siêu âm Về đặc điểm sinh học, các kháng nguyên

O của P multocida không khác với kháng nguyên O của các vi khuẩn khác Kháng

nguyên này độc với thỏ tuy nhiên độc lực không lớn lắm Trong các phản ứng huyết

thanh, kháng nguyên O có đặc tính loài rất cao, tuy vậy nó cũng tạo thành phản ứng chéo

với các huyết thanh kháng các vi khuẩn Gram âm khác như P pseudotuberculosis, P

haemolytica.

Hiện nay nhiều thực nghiệm đã công nhận kháng nguyên O đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành miễn dịch, song kháng nguyên K cũng đóng vai trò không nhỏ.Carter và Chengapa (1981) cho rằng cần phải kết hợp hai phản ứng là ngưng kết hồng cầu gián tiếp và kết tủa khuếch tán trên thạch đê xác định serotype của vi khuẩn

Theo quy định của FAO, để xác định serotype của P multocida cần kết hợp hai hệ

thống định type kháng nguyên: định type kháng nguyên giáp mô và định type kháng nguyên thân Hiện nay hai hệ thống định type được dùng phổ biến là:

- Namioka (1961) - Carter (1955)

- Carter (1955) - Heddleston (1972), hệ thống này được dùng phổ biến hơn

Bảng 3.1 Mối quan hệ giữa kháng nguyên và bệnh ở gia súc

A:4; A:5; A:67-10 A:7, 8, 9, 1012-15 A:12, 13, 14, 15

xuất huyết

xuất huyết

3.1.2.5 Sức đề kháng

Vi khuẩn P multocida có sức đề kháng kém với ngoại cảnh Vi khuẩn dễ dàng bị

tiêu diệt bởi sức nóng 58C chết trong vòng 20 phút Còn 100C vi khuẩn chết tức khắc

Vi khuẩn sống khá lâu trong đất ẩm, trong nền chuồng và đồng cỏ nơi có dịch

Trong phân : Vi khuẩn có thể sống được 14 ngày.

Các chất sát trùng đều có thể diệt nhanh vi khuẩn P multocida nhanh chóng: AgCl2 1/5000 và acid phenic 5% diệt trong 1 phút, formol 1%, nước vôi 10 %, creolin 3%, crezyl diệt vi khuẩn trong 3 - 5 phút Vi khuẩn sống khá lâu trong và sản sinh trong đất

ẩm có nhiều nitrat và thiếu ánh sáng Trong chuồng, trên đồng cỏ, đất có thể sống hàng tháng, có khi hàng năm

3.1.2.6 Tính gây bệnh

- Tính gây bệnh trong tự nhiên

Trong thiên nhiên vi khuẩn P multocida được xác định là gây bệnh cho hầu hết các

loài gia súc - gia cầm, loài có vú hoang dã, chim muông và cả con người, gây triệu chứng bại huyết kèm theo tụ huyết, xuất huyết ở các tổ chức, niêm mạc và phủ tạng

Vi khuẩn P multocida gây ra nhiều thể bệnh trên nhiều loài động vật khác nhau.

Bảng 3.2: Tính gây bệnh của vi khuẩn Pasteurella multocida trên các loài

Sốt vận chuyểnViêm phổi

Trâu, bò

Viêm vúViêm phổiCừu

Theo một số tác giả, người có thể bị nhiễm P multocida do súc vật cắn gây nhiễm

trùng vết thương cục bộ, với các biểu hiện phù tại chỗ, đau nhiều và đau xuất hiện sớm, có

những triệu chứng toàn thân Sự cảm nhiễm ở người ngoài P multocida còn có vai trò bội

nhiễm của các vi khuẩn khác làm tăng biểu hiện của bệnh như: viêm hạch, viêm phế quản, viêm hệ thần kinh, hệ sinh dục (Miller:, 1966; Hubbert và Rosen, 1970; Anon, 1972).

Loài P boviseptica gây bệnh chủ yếu cho trâu bò với những triệu chứng như viêm

ruột, viêm phổi, thủy thũng ở hạch và da (thường hay sưng hạch hầu) Bệnh từ trâu bò có thể lây sang lợn, ngựa Chim bồ câu, chim sẻ và các loại thú rừng như bò rừng, hươu, nai, sơn dương, lợn rừng, thỏ rừng cũng mắc bệnh, ngan, ngỗng không mắc bệnh Ở nước ta trâu thường mắc nặng hơn bò

Loài P aviseptica gây bệnh cho gia cầm, gà vịt thường bị bệnh nặng và thường xảy

ra các vụ dịch lớn, gây thiệt hại đáng kể, với các bệnh tích chủ yếu: viêm ngoại tâm mạc, tim sưng, bao tim trương to chứa dịch thẩm xuất màu vàng, gan hơi sưng, có nhứng nốt hoại tử màu vàng nhạt bằng đầu đinh ghim ở bề mặt gan

Loài P suiseptica gây bệnh cho tụ huyết trùng cho lợn Lợn 3 - 6 tháng tuổi mắc

nhiều nhất, thường có bệnh tích phổi viêm, có nhiều vùng gan hóa, viêm ngoại tâm mạc thấm tương dịch, viêm hầu thủy thũng Bệnh có thể lan sang trâu, bò, gà

- Tính gây bệnh trong phòng thí nghiệm

Theo nghiên cứu của một số tác giả trước đây mức độ nhạy cảm nhất của vi khuẩn

P multocida đối với động vật thí nghiệm là thỏ rồi tới chuột bạch, chỉ cần một vài vi

và phổi xuất huyết thành chấm đỏ nhỏ

+ Thỏ: tiêm vi khuẩn vào dưới da, phúc mạc hay tĩnh mạch, nếu vi khuẩn có độc lực cao thì sau 1 - 2 ngày thỏ chết với bệnh tích giống chuột bạch Đặc biệt có điểm xuất huyết theo khí quản

+ Bồ câu: tiêm vi khuẩn vào bắp thịt, dưới da hay phúc mạc Vi khuẩn có độc lực cao thì sau 1 - 2 ngày bồ câu chết, nếu độc lực yếu thì bệnh kéo dài hơn

3.1.3 Chẩn đoán

- Chẩn đoán vi khuẩn học

Có thể lấy máu tim, gan, lách, tủy xương, phổi, dịch thủy thũng

+ Kiểm tra bằng kính hiển vi

Lấy bệnh phẩm, làm thành tiêu bản, nhuộm Gram Nếu có P multocida, vi khuẩn

nhỏ, ngắn hình trứng bắt màu thẫm ở hai đầu, Gram âm không nha bào, không có lông,

có giáp mô nhưng khó phát hiện thấy khi xem nhuộm Trong trường hợp bệnh mãn tính hay bệnh phẩm thối thì khó phát hiện vi khuẩn trong kính hiển vi, cần đem bồi dưỡng trong các môi trường và tiêm động vật thí nghiệm

+ Nuôi cấy vào môi trường thích hợp

Cấy vào môi trường thạch máu, quan sát tính chất mọc, khả năng không dung huyết rồi làm tiêu bản kiểm tra trong kính hiển vi

+ Tiêm động vật thí nghiệm

Dùng thỏ hay chuột bạch để tiêm Nếu bệnh phẩm có vi khuẩn P multocida, sau khi tiêm

24 - 48 giờ vào dưới da hay phúc mạc, động vật sẽ chết với bệnh tích tụ huyết, xuất huyết

- Chẩn đoán huyết thanh học

Có thể dùng phản ứng ngưng kết để chẩn đoán, nhưng kết quả thường kém chính xác nên không được sử dụng

2 Nhốt riêng lợn mới mua về trong 2 tuần lễ Cách con vật ốm

3 Tiêu độc chuồng và dụng cụ chăn nuôi nhiễm khuẩn bằng các chất hóa học sát trùng thông thường, ủ nóng phân

- Phòng bệnh bằng vaccine

+ Đối với trâu, bò: Vaccine được chế từ canh khuẩn lên men nhanh, dùng tiêm dưới

da cho trâu, bò với liều 2 - 3 ml/con, sau 14 - 21 ngày trâu bò được tiêm vaccine có miễn dịch và kéo dài 6 tháng Vaccine có thể gây đáp ứng cục bộ ở nơi tiêm như hơi sưng, nóng và sẽ tự mất đi sau vài ngày Không tiêm cho trâu, bò ốm yếu, gần đẻ hoặc mới đẻ

Hiện nay có các loại vaccine tụ huyết trùng trâu bò sau: loại chế từ chủng Iran dùng cho các tỉnh duyên hải miền Trung và Tây Nguyên, loại chế từ chủng Robert I dùng cho các tỉnh phía Nam, ngoài ra có chủng chế từ chủng P52 của Ấn Độ, vaccine tụ huyết trùng trâu, bò nhũ hóa.

+ Với lợn: vaccine được chế từ canh khuẩn lên men nhanh, ít độc tố lại nhiều kháng nguyên của vi khuẩn type B được chọn lọc, giàu tính miễn dịch và tưng đối ổn định, vaccine rất an toàn cho mọi loại lứa tuổi lợn

Nơi có dịch tụ huyết trùng lợn xảy ra thì nên tiêm phòng 2 lần, cách nhau 3 - 4 tuần, tiêm toàn đàn đặc biệt chú ý những con mới tách mẹ Ngoài ra có vaccine tụ - dấu

+ Với gà: Vaccine được chế từ canh khuẩn tụ huyết trùng gà được vô hoạt bằng formol và có keo phèn làm chất bổ trợ miễn dịch, dùng tiêm dưới da với liều 1 ml/con

3.1.4.1 Chữa bệnh

+ Dùng kháng huyết thanh

Kháng huyết thanh đa giá dùng chống tụ huyết trùng trâu, bò, lợn, gà được chế từ

bò bằng phương pháp tối miễn dịch với nhiều chủng vi khuẩn tụ huyết trùng trong huyết thanh chứa nhiều kháng thể đặc hiệu đa giá có hiệu lực cao đối với bệnh tụ huyết trùng

Có thể dùng kháng huyết thanh này để phòng và chữa bệnh cho trâu, bò, lợn, gà Sau khi tiêm 24 giờ, con vật có miễn dịch đặc hiệu và kéo dài khoảng 2 - 3 tuần Phương này có tác dụng phòng và chữa bệnh nhanh, bao vây và dập tắt ổ dịch, phòng cho gia súc phải vận chuyển qua vùng có dịch

+ Dùng kháng sinh: các loại kháng sinh có hiệu quả cao như: gentamycin, kanamycin, ampicillin streptomycin , với liều 10 - 20 mg/kgP

Hình 3.3 Vi khuẩn Brucella bắt màu Gram âm khi nhuộm

Hình 3.4 Vi khuẩn Brucella dưới kính hiển vi điện tử

3.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy

Là loại vi khuẩn hiếu khí, nhiệt độ thích hợp 37C, pH 6,8 - 7,4

Vi khuẩn mọc chậm trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nếu môi trường cho thêm huyết thanh, máu hay gan thì vi khuẩn mọc tốt hơn

Một số type của Brucella abortus khi mới phân lập cần phải có môi trường không

khí chứa 10% CO2 Thường khi mới phân lập, vi khuẩn phát triển chậm, phải sau 40 - 48 giờ trở đi tới 10 ngày mới nhìn thấy khuẩn lạc mọc

- Môi trường nước thịt: đục đều, có váng nhỏ trên mặt, sau lắng cặn lầy nhầy ở đáy

- Môi trường thạch nước gan: hình thành khuẩn lạc như hạt sương, tròn, lồi, hơi ướt, không màu

- Môi trường thạch huyết thanh đứng: cấy vi khuẩn theo đường cấy trích sâu, sau 3 - 6 ngày cách mặt thạch 0,5 cm xuống vi khuẩn mọc theo đường cấy 1 - 2cm, khuẩn lạc màu trắng hoặc trắng xám

- Môi trường khoai tây: sau khi cấy 40 giờ vi khuẩn mọc thành những khuẩn lạc màu nâu

- Môi trường gelatin: không làm tan chảy gelatin

3.2.1.3 Đặc tính sinh hóa

- Không lên men đường

- Có khả năng phân giải ure nhờ men urease

- Có khả năng sản sinh H2S, dựa vào khả năng này và tính chất ức chế sự phát triển của

vi khuẩn bởi một số thuốc đặc biệt là thionin và fucsin để phân biệt loại Brucella

Sinh H2S trongLoại vi

khuẩn

Môi trường không có

CO2 1 ngày 2 ngày 4 ngày Thionin Fucsin

3.2.1.4 Cấu trúc kháng nguyên

Tất cả các loại Brucella đều có hai phức hợp kháng nguyên là A và M, giữa các

type có hiện tượng ngưng kết chéo

* Khả năng miễn dịch

Brucellosis có khả năng miễn dịch, khi gia súc và người đã mắc bệnh qua khỏi thì