Nghiên cứu giải phẫu bệnh

NGHIÊN CỨU GIẢI PHẪU BỆNH VÀ HÓA MÔ MIỄN DỊCH CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG CỦA CARCINÔM TẾ BÀO GAN

-

LÊ MINH HUY

NGHIÊN CỨU GIẢI PHẪU BỆNH VÀ HÓA MÔ MIỄN DỊCH

CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG CỦA CARCINÔM TẾ BÀO GAN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

TP Hồ Chí Minh -2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

-

LÊ MINH HUY

NGHIÊN CỨU GIẢI PHẪU BỆNH VÀ HÓA MÔ MIỄN DỊCH

CÁC YẾU TỐ TIÊN LƯỢNG CỦA CARCINÔM TẾ BÀO GAN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết

quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất

kỳ công trình nào khác

Tác giả

MỤC LỤC

Trang

Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Bảng đối chiếu thuật ngữ Việt-Anh iv

Danh sách các chữ viết tắt v

Danh sách bảng vi

Danh sách biểu đồ viii

Danh sách hình viii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Mục tiêu nghiên cứu: 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Các đặc điểm có ý nghĩa tiên lượng của CTBG 3

1.2 P53 và CTBG 20

1.3 Ki-67 và CTBG 28

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Đối tượng nghiên cứu 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 31

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42

3.1 Các đặc điểm có ý nghĩa tiên lượng của CTBG 42

3.2 Biểu hiện của p53, Ki67 trên CTBG 60

3.3 Mối liên quan giữa các đặc điểm có ý nghĩa tiên lượng và biểu hiện của p53, Ki67 trên CTBG 64

CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 81

4.1 Các đặc điểm có ý nghĩa tiên lượng của CTBG 81

4.2 Biểu hiện của p53, Ki67 trên CTBG 101

4.3 Mối liên quan giữa các đặc điểm có ý nghĩa tiên lượng và biểu hiện của p53, Ki67 trên CTBG 108

KẾT LUẬN 116

KIẾN NGHỊ 118 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

BẢNG ĐỐI CHIẾU THUẬT NGỮ VIỆT – ANH

Biệt hóa vừa: moderately differentiated Biệt hóa kém: poorly differentiated Carcinôm tế bào gan: hepatocellular carcinoma

Chết tế bào theo chương trình: apoptosis

Chỉ số đánh giá hoạt tính mô học: Histological activity index

Nghịch sản tế bào gan: liver cell dysplasia

Nghịch sản loại tế bào lớn: Large cell dysplasia

Tế bào dạng phồng bào: oncocyte – like cell

Tế bào hình thoi: spindle cell

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Anti – HbcAg: Anti – Hepatitis B core Antigen

HCV: Hepatitis C virus

HbsAg: Hepatitis B surface Antigen

HAI: Histological activity index

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1: Nồng độ AFP trong huyết thanh 45

Bảng 3.2: Phân loại mô học theo cấu trúc mô học 47

Bảng 3.3: Phân loại mô học theo hình thái tế bào 50

Bảng 3.4: Phân độ biệt hóa 52

Bảng 3.5: Xâm nhập mạch máu vi thể 54

Bảng 3.6: Biểu hiện phân bào 55

Bảng 3.7: Hiện tượng hoại tử u 56

Bảng 3.8: Tương quan giữa nghịch sản với mức độ viêm gan và xơ gan 60

Bảng 3.9: Biểu hiện của p53 trong khối u 61

Bảng 3.10: Biểu hiện của Ki67 trong chủ mô và trong khối u 64

Bảng 3.11: Tương quan p53 và hoại tử u 65

Bảng 3.12: Tương quan p53 và phân bào 65

Bảng 3.13: Tương quan p53 và độ biệt hóa 66

Bảng 3.14: Tương quan p53 và xâm nhập mạch máu 67

Bảng 3.15: Tương quan p53 và Ki-67 67

Bảng 3.16: Tương quan p53 và tuổi 68

Bảng 3.17: Tương quan p53 và giới 68

Bảng 3.18: Tương quan p53 và tình trạng viêm gan siêu vi 69

Bảng 3.19: Tương quan p53 và nồng độ AFP 69

Bảng 3.20: Tương quan p53 và vị trí u 70

Bảng 3.21: Tương quan p53 và số lượng u 70

Bảng 3.22: Tương quan p53 và kích thước u 70

Bảng 3.23: Tương quan p53 và cấu trúc mô học 71

Bảng 3.24: Tương quan p53 và tình trạng hoại tử u 71

Bảng 3.25: Tương quan Ki67 trong chủ mô và tình trạng nghịch sản tế bào gan 72

Bảng 3.26: Tương quan Ki67 và phân bào 73

Bảng 3.27: Tương quan Ki67 và độ biệt hóa 73

Bảng 3.28: Tương quan Ki67 và tuổi 74

Bảng 3.29: Tương quan Ki67 và giới 74

Bảng 3.30: Tương quan Ki67 và tình trạng nhiễm siêu vi 75

Bảng 3.31: Tương quan Ki67 và nồng độ AFP 75

Bảng 3.32: Tương quan Ki67 và vị trí u 76

Bảng 3.33: Tương quan Ki67 và số lượng u 76

Bảng 3.34: Tương quan Ki67 và kích thước u 77

Bảng 3.35: Tương quan Ki67 và cấu trúc mô học 77

Bảng 3.36: Tương quan Ki67 và tình trạng xâm nhập mạch máu 77

Bảng 3.37: Tương quan Ki67 và loại tế bào u 78

Bảng 3.38: Tương quan Ki67 và tình trạng hoại tử u 79

Bảng 4.1: So sánh tuổi trung bình của bệnh nhân CTBG giữa các nghiên cứu 82

Bảng 4.2: So sánh tỷ lệ giới tính bệnh nhân CTBG với các tác giả 84

Bảng 4.3: So sánh tuổi trung bình nam, nữ với các nghiên cứu khác 85

Bảng 4.4: So sánh với các nghiên cứu khác về tỷ lệ nhiễm virút viêm gan 86

Bảng 4.5: So sánh tuổi trung bình bệnh nhân nhiễm HBV, bệnh nhân nhiễm HCV với các nghiên cứu khác 87

Bảng 4.6: So sánh kích thước u với các nghiên cứu khác 91

Bảng 4.7: So sánh cấu trúc mô học với các nghiên cứu khác 92

Bảng 4.8: So sánh độ biệt hóa với các nghiên cứu khác 94

Bảng 4.9: So sánh mức độ biểu hiện p53 trên mô u với các nghiên cứu khác 105

Bảng 4.10: So sánh tương quan giữa p53 và độ biệt hóa với các nghiên cứu khác 108 Bảng 4.11: So sánh tương quan giữa p53 và xâm nhập mạch máu với nghiên cứu khác 110

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1 Phân bố tuổi của CTBG 42

Biểu đồ 3.2: Phân bố giới & tuổi của CTBG 43

Biểu đồ 3.3: Phân bố tỷ lệ nhiễm virút viêm gan 44

Biểu đồ 3.4: Vị trí u 45

Biểu đồ 3.5: Phân bố tỷ lệ kích thước u theo nhóm 47

Biểu đồ 3.6: Tình trạng nghịch sản của mô gan xung quanh u 57

Biểu đồ 3.7: Mức độ viêm của chủ mô gan trên bệnh nhân CTBG 58

Biểu đồ 3.8: Mức độ xơ hóa của chủ mô gan trên bệnh nhân CTBG 59

Biểu đồ 3.9: Mối tương quan p53 và các yếu tố có ý nghĩa tiên lượng khác ………80

Biểu đồ 3.10: Mối tương quan Ki67 và các yếu tố có ý nghĩa tiên lượng khác………… 80

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Đại thể dạng khối 07

Hình 1.2: Đại thể dạng nốt 07

Hình 1.3: Đại thể dạng lan tỏa 07

Hình 1.4: CTBG biệt hóa rõ 10

Hình 1.5: CTBG biệt hóa vừa 11

Hình 1.6: CTBG biệt hóa kém 11

Hình 1.7: CTBG không biệt hóa 11

Hình 1.8: Tế bào u xếp dạng bè 14

Hình 1.9: Tế bào u sắp xếp cấu trúc giả tuyến 14

Hình 1.10: Tế bào u sắp xếp cấu trúc đặc 14

Hình 1.11: CTBG dạng sợi mảnh 15

Hình 1.12: Cấu trúc gen p53 19

Hình 1.13: Cấu trúc protein p53 20

Hình 1.14: Biểu hiện dương tính của p53 trên CTBG so với mô gan không u 26

Hình 1.15; 1.16, 1.17, 1.18: Biểu hiện của p53 trên tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch 27

Hình 3.1: CTBG với 1 khối u đơn độc trên nền mô gan không xơ 46

Hình 3.2: CTBG với 1 khối u đơn độc trên nền xơ gan 46

Hình 3.3: CTBG với 1 khối u lớn và nhiều nốt vệ tinh 46

Hình 3.4: CTBG với nhiều khối u 46

Hình 3.5: CTBG loại bè nhỏ 48

Hình 3.6: CTBG loại bè lớn 48

Hình 3.7: CTBG loại đặc 49

Hình 3.8: CTBG loại giả tuyến 49

Hình 3.9: CTBG loại xơ hóa 49

Hình 3.10: CTBG loại điển hình 50

Hình 3.11: CTBG loại tế bào sáng 51

Hình 3.12: CTBG loại tế bào hình thoi 51

Hình 3.13: CTBG loại phồng bào 51

Hình 3.14: CTBG loại hỗn hợp 52

Hình 3.15: CTBG biệt hóa rõ 53

Hình 3.16: CTBG biệt hóa vừa 53

Hình 3.17: CTBG biệt hóa kém 53

Hình 3.18: CTBG không biệt hóa 54

Hình 3.19: Xâm nhập mạch máu 55

Hình 3.20: Phân bào trong khối u 56

Hình 3.21: Hiện tượng hoại tử trong khối u 57

Hình 3.22: Nghịch sản tế bào gan ở chủ mô gan 58

Hình 3.23: Biểu hiện âm tính của p53 61

Hình 3.24: Biểu hiện dương tính 1+ của p53 62

Hình 3.25: Biểu hiện dương tính 2+ của p53 62

Hình 3.26: Biểu hiện dương tính 3+ của p53 62

Hình 3.27: Biểu hiện dương tính của Ki-67 trong chủ mô gan 64

Hình 3.28: Biểu hiện dương tính của Ki-67 ở tế bào u 64

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư gan nguyên phát là loại ung thư thường gặp, gây tử vong cao Theo

số liệu ghi nhận ung thư quần thể năm 2004, ở Tp Hồ Chí Minh trong 10 loại ung thư thường gặp nhất thì ung thư gan đứng hàng thứ nhất ở nam (xuất độ 38,2 trường hợp trên 100.000 dân mỗi năm) và đứng hàng thứ 6 ở giới nữ (xuất độ 8,3 trường hợp trên 100.000 dân mỗi năm) [3], [7] Ở Hà Nội, ung thư gan đứng hàng thứ 3 ở giới nam và hàng thứ 7 ở giới nữ trong 10 loại ung thư thường gặp nhất [1], [2] Theo nghiên cứu của Cơ quan nghiên cứu ung thư thế giới (IARC) ung thư gan đứng hàng thứ 5 trong 10 loại ung thư thường gặp nhất [53], [54] Trong ung thư gan nguyên phát, carcinôm tế bào gan (CTBG) chiếm tỉ lệ chủ yếu, từ 80-90% tùy theo các nghiên cứu khác nhau trên thế giới [137]

Nhiều yếu tố tiên lượng kinh điển như tuổi, giới, các yếu tố liên quan đến khối u như kích thước, số lượng u, mức độ hoại tử, sự xâm nhập vỏ bao, xâm nhập mạch máu,… tình trạng viêm gan, xơ hóa được y văn ghi nhận [18], [20], [35], [36], [37] Điều trị và tiên lượng của bệnh nhân phụ thuộc vào giai đoạn bệnh lúc được chẩn đoán và những đặc điểm giải phẫu bệnh của khối ung thư và chức năng phần gan còn lại [27], [29], [61], [69], [86], [90], [125] Tuy nhiên, việc tiên lượng thời gian sống của bệnh nhân và sự tái phát của khối u sẽ chính xác hơn khi phối hợp nhiều yếu tố tiên lượng khác nhau [52], [59], [63]

Những năm gần đây, một số dấu ấn sinh học cũng được sử dụng trong việc đánh giá khả năng sự tái phát và thời gian sống thêm của bệnh nhân [120], [121] Trong đó, p53, Ki67 là hai yếu tố được một số tác giả khuyến cáo sử dụng để tiên lượng cho bệnh nhân CTBG [26], [56], [59], [80], [119]

Hiện nay, ở nước ta có nhiều nghiên cứu về các dấu chứng sinh học, dựa trên hóa mô miễn dịch trên ung thư đường tiêu hóa, ung thư vú, ung thư hạch, Trong những dấu chứng sinh học được nghiên cứu trên các loại ung thư trên, p53 và Ki67 được các tác giả thấy có ý nghĩa ứng dụng nhất P53 là một gen đè nén u, khi đột

biến sẽ mất chức năng, làm tế bào rối loạn phát triển, gây ra nhiều loại ung thư khác nhau Ki67 là dấu chứng miễn dịch liên quan đến sự tăng sinh tế bào ung thư Theo nghiên cứu tại bệnh viện 108 của tác giả Trịnh Tuấn Dũng & cộng sự [1] năm 2007 thì tỉ lệ dương tính với kháng nguyên của p53 ở ung thư đại trực tràng là 54,55% Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Sào Trung và cộng sự [10] trong carcinôm ống tuyến vú xâm nhập, biểu hiện của protein p53 trên mô ung thư là 27,5% và của Ki67 là 62% Theo nghiên cứu của tác giả Văn Tần và cộng sự [11], tỉ lệ dương tính của p53 trong 96 trường hợp CTBG được tiến hành nhuộm hóa mô miễn dịch và đo nồng độ p53 trong huyết thanh ở Singapore là 54% Dựa trên các tài liệu thu thập được, đến nay trong nước chưa thấy công trình nghiên cứu nào dựa trên sự phối hợp nhiều yếu tố có giá trị tiên lượng khác nhau, vừa gồm các yếu tố kinh điển vừa có các yếu tố hóa mô miễn dịch, sinh học phân tử, vừa đánh giá tình trạng chủ mô gan

Vì vậy, nghiên cứu sự biểu hiện của các dấu chứng sinh học p53, Ki67 trên hóa mô miễn dịch ở các bệnh nhân CTBG kết hợp với việc xác định mối tương quan với các yếu tố tiên lượng kinh điển cùng với việc đánh giá gián tiếp chức năng gan của phần gan còn lại xung quanh u qua mức độ xơ hóa, viêm để áp dụng vào thực tiễn là hết sức cần thiết và bức xúc hiện nay Nghiên cứu thuộc loại nghiên cứu cơ bản này nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị và tiên lượng cho bệnh nhân ung thư tế bào gan ở Việt Nam

Mục tiêu nghiên cứu:

1 Khảo sát các đặc điểm có ý nghĩa tiên lượng của CTBG

2 Đánh giá sự biểu hiện của p53, Ki67 trên CTBG

3 Xác định mối liên quan giữa các đặc điểm có ý nghĩa tiên lượng và biểu hiện của p53, Ki67 trên CTBG

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các đặc điểm có ý nghĩa tiên lượng của CTBG

1.1.1 Tuổi

Tỉ lệ CTBG tăng theo tuổi Tuổi trung bình có khác biệt tùy theo chủng tộc

và vùng địa dư: từ 30-50 tuổi ở các nước Châu Phi, Đông Nam Á, 50-55 tuổi ở Việt Nam, 50-60 tuổi ở các nước Âu Mỹ Lứa tuổi mắc bệnh cũng có sự tương phản rõ ràng: vùng có nguy cơ thấp, bệnh thường ở độ tuổi 60 đến 70 tuổi; vùng có nguy cơ cao bệnh thường gặp ở độ tuổi 30 đến 40 tuổi Tuổi càng cao tiên lượng của bệnh nhân CTBG càng kém, nhất là khi xảy ra trên những bệnh nhân có các bệnh như tim mạch, đái tháo đường,…[8], [16], [32], [99] Theo một nghiên cứu ở Nhật, tỉ lệ CTBG cũng có xu hướng tăng dần theo thời gian [109]

1.1.2 Giới

Ở hầu hết các quốc gia trên thế giới, CTBG xảy ra ở nam chiếm đa số, tỉ lệ nam:nữ có thể thay đổi từ 2:1 đến 8:1 Nguyên nhân của tình trạng này chưa được chứng minh rõ ràng, nhưng đã được lý giải do nam giới có nhiều nguy cơ hơn như viêm gan siêu vi B, uống rượu, hút thuốc lá, và sự nhạy cảm của khối u với androgen Thụ thể androgen trên tế bào gan bình thường xung quanh u của nam cũng cao hơn nữ Tác giả Tanaka và cộng sự [142] qua nghiên cứu thấy nồng độ testosterone tăng lên và nồng độ estrogen giảm trong máu, có thể làm tăng khả năng phát triển thành CTBG trên bệnh nhân xơ gan Tỉ lệ xơ gan trên bệnh nhân nam cũng nhiều hơn nữ Nhiều nghiên cứu cho thấy nữ có tiên lượng tốt hơn nam ở cả những trường hợp u trong vỏ bao (giai đoạn đầu) và cả ở giai đoạn ung thư tiến xa

Tỉ lệ tái phát ở nữ cũng thấp hơn nam [41], [47]

1.1.3 Alpha-fetoprotein (AFP)

AFP tăng trong 70 – 90% CTBG, AFP phụ thuộc lectin đặc hiệu cho CTBG hơn AFP là một kháng nguyên được gan thai nhi tạo ra và giảm đi nhanh chóng sau sanh AFP có thể tăng trong một số loại u khác không phải CTBG và trong một số

bệnh lý không u AFP > 200ng/ml xảy ra trong: 75% CTBG/ gan nhiễm HBV,

HCV; 65% CTBG/ gan xơ do rượu; 33% CTBG/ gan không bị xơ; 9 – 26% CTBG

< 3cm (đường kính) AFP tăng cao (có thể > 1000ng/ml) xảy ra trong: CTBG, u

nguyên bào gan, u mầm bào có thành phần noãn hoàng Những bệnh nhân có AFP trước mổ cao có tiên lượng thời gian sống thấp hơn [35], [48] Những bệnh nhân CTBG có nồng độ AFP nhỏ hơn 200ng/ml có tỉ lệ sống 5 năm (85%) cao hơn những trường hợp có AFP lớn hơn 200ng/ml (36%) [48], [96], [114], [134]

1.1.4 Tình trạng chủ mô gan lành (không u)

Nhiều nghiên cứu cho thấy có sự liên quan giữa xơ gan và ung thư gan Ở những vùng có tỉ lệ nhiễm HBV thấp như Châu Âu, Mỹ thì 80 – 90% CTBG xuất hiện trên nền gan bị xơ, 10% còn lại thì gan không bị xơ, đặc biệt là trẻ em [8], [33] Nguyên nhân thường gặp nhất của xơ gan là viêm gan mạn do HBV vì vậy những vùng có nhiều trường hợp nhiễm HBV thì xơ gan trở thành CTBG là hơn 50%, trong khi vùng ít nhiễm HBV tỷ lệ này chỉ có từ 5 – 15% [16] Hơn 50% số trường hợp CTBG trên toàn thế giới và khoảng 70-80% bệnh nhân CTBG ở các vùng dịch

tễ của HBV có nhiễm HBV Các bệnh nhân CTBG có nhiễm HBV và HCV có thể xảy ra tình trạng bùng phát viêm gan sau khi hóa trị nếu không được đánh giá và điều trị viêm gan trước khi điều trị ung thư [11], [65], [91] Theo y văn ghi nhận, các bệnh nhân CTBG có nhiễm HBV và HCV có tiên lượng xấu hơn các bệnh nhân không nhiễm, với thời gian sống trung bình kém hơn khoảng 16 tháng Ngoài ra, nghiên cứu tại Nhật thấy các bệnh nhân CTBG nhiễm HCV (42% tái phát sau 5 năm) có tiên lượng sống tốt hơn so với các bệnh nhân CTBG nhiễm HBV (54% tái phát sau 5 năm) [93], [145]

Hầu hết các bệnh nhân CTBG chết do suy gan Tỉ lệ tử vong ở bệnh nhân CTBG không có xơ gan, viêm gan thấp hơn các bệnh nhân có CTBG xảy ra trên nền xơ gan, viêm gan Tình trạng viêm gan, xơ gan làm cho chức năng gan của bệnh nhân kém Các bệnh nhân có Child-Pugh B, C đều có tình trạng xơ hóa trên

mô gan không u ở mức độ 5-6 điểm Các trường hợp có mức độ xơ hóa 0-4 điểm đều có Child-Pugh A Các bệnh nhân có mức độ xơ hóa ít có tỉ lệ tử vong sau khi điều trị 5 năm (7%) thấp hơn các bệnh nhân có xơ hóa nhiều (58%) [32], [74], [86], [140], [145]

Ngoài ra, các bệnh nhân xơ gan còn có nguy cơ hình thành những khối ung thư mới hơn những bệnh nhân không xơ gan [86]

1.1.5 Kích thước khối u

CTBG có thể có kích thước từ 0,7 đến 25cm đường kính, trung bình là 9cm Phần lớn bệnh nhân CTBG được phát hiện ở giai đoạn trễ, khoảng 70-80% bệnh nhân được chẩn đoán lần đầu với khối u có kích thước lớn hơn 5cm Các trường hợp CTBG có khối u nhỏ, trong vỏ bao, nhất là những trường hợp có kích thước nhỏ hơn 2cm đường kính, có tiên lượng tốt hơn hẳn và tái phát chậm hơn các khối u

có kích thước lớn hơn Nhiều nghiên cứu chứng minh các khối u có đường kính nhỏ hơn 2cm và trong vỏ bao có thể điều trị triệt để (phẫu thuật) Các khối u này cũng ít

có xâm nhập mạch máu, ít di căn xa hơn các khối u lớn [60], [80], [96], [99], [108], [128], [131]

Những trường hợp CTBG có kính thước nhỏ không điều trị có thể tăng gấp đôi kích thước khối u trong 27-398 ngày, trung bình là 136 ngày Thời gian sống trung bình của bệnh nhân CTBG là từ 3-3,5 năm Trong giai đoạn đầu, hầu hết khối

u phát triển trong vỏ bao Khi các u lớn lên sẽ xâm nhập vào mô gan xung quanh và phá vỡ tất cả các vỏ bao u CTBG có thể di căn trong gan và di căn xa theo đường động mạch và tĩnh mạch cửa Ở giai đoạn tiến xa, khối u xâm nhập vào cơ hoành, túi mật, mạc nối Một số trường hợp CTBG di căn lên tâm thất phải theo đường tĩnh

mạch chủ Di căn xa xảy ra ở giai đoạn cuối của CTBG Di căn ngoài gan có trong hơn phân nửa các trường hợp CTBG qua tử thiết Di căn phổi, hạch vùng thường gặp nhất (50% trường hợp) Di căn xương, thượng thận cũng thường gặp Hầu hết các bệnh nhân CTBG chết do suy gan sau khi khối ung thư đã xâm nhập nhiều vào

mô gan bình thường [96], [99], [100], [108], [128], [131], [132], [140]

1.1.6 Đặc điểm đại thể của khối u

Hầu hết các trường hợp CTBG là những khối u có mật độ mềm, thường có những vùng hoại tử, ngoại trừ loại CTBG dạng sợi mảnh hay loại xơ hóa CTBG dạng sợi mảnh hay dạng xơ hóa thường có mật độ chắc, có thể cứng Các khối u kích thước nhỏ thường có màu xám, vàng hay trắng xám Các khối có kích thước to

có sự pha trộn nhiều màu sắc như: xanh, hồng, đen, đỏ… [8], [34] U không có hiện tượng xơ hóa ngoại trừ loại sợi mảnh mà thường biểu hiện là những vách sợi gần giống với hình ảnh của tăng sản nốt khu trú [16]

CTBG có nhiều dạng đại thể khác nhau Hiện nay, trên thế giới có nhiều bảng phân loại CTBG khác nhau dựa trên đặc điểm đại thể Tuy nhiên, thường có

ba loại tổn thương: dạng khối (hình 1.1) (một khối lớn chiếm trọn một thùy gan) (loại 1 theo Eggel), dạng nốt (hình 1.2) (dạng nhiều ổ rải rác, riêng lẻ và lan tỏa, đôi khi chiếm trọn gan) (loại 2 theo Eggel), dạng lan tỏa (hình 1.3) (nhiều nốt giống hình ảnh xơ gan) (loại 3 theo Eggel) Khối u dạng khối có tỉ lệ tái phát sau 2 năm (20%) thấp hơn nhiều so với khối u dạng lan tỏa (60%) Những bệnh nhân CTBG

có một khối u có tiên lượng sống lâu hơn các bệnh nhân có nhiều khối u [27], [29], [69], [90], [99], [102], [125], [128] Các hình thái tổn thương này thường làm gan to (3000g), bờ không đều [16], [34]

Hình 1.1: Đại thể dạng khối, với hình ảnh một khối lớn chiếm trọn một thùy gan

(Nguồn: Edward C Klatt, 2012, Webpath)

Hình 1.2: Đại thể dạng nốt, với hình ảnh nhiều ổ rải rác, riêng lẻ và lan tỏa

(Nguồn: Edward C Klatt, 2012, Webpath)

Hình 1.3: Đại thể dạng lan tỏa, với hình ảnh nhiều nốt giống hình ảnh xơ gan

(Nguồn: Edward C Klatt, 2012, Webpath)

CTBG thường xâm nhập, có khi hình thành những đám tế bào ung thư xâm nhập ngoằn ngoèo theo tĩnh mạch cửa, tĩnh mạch gan, tĩnh mạch chủ và tim phải [97] Hơn 70% CTBG có xâm nhập tĩnh mạch cửa trên các bệnh nhân được tử thiết

Tế bào ung thư lan rộng theo các nhánh tĩnh mạch cửa là nguyên nhân chính gây ra

di căn trong gan của CTBG Xâm nhập ống mật thường ít gặp, chỉ có khoảng 6% trường hợp được phát hiện qua tử thiết nhưng nếu có xâm nhập ống mật chủ, bệnh nhân thường có triệu chứng tắc mật rõ ràng Ngoài ra, các tác giả còn phân CTBG thành 2 loại chính: CTBG “trong vỏ bao” (giai đoạn ung thư sớm) và CTBG giai đoạn tiến xa (đã phá vỡ vỏ bao) CTBG “trong vỏ bao” là một dấu hiệu tiên lượng tốt CTBG “trong vỏ bao” thường hình thành trên nền xơ gan, đơn độc và phát triển chậm do có vỏ bao xơ dày hình thành từ các sẹo xơ bao xung quanh CTBG loại này thường ở giai đoạn đầu của ung thư, gần như luôn được phát hiện qua tầm soát nên thường có thể cắt bỏ hoàn toàn khối u Những khối u có cuống thường phát triển chồi ra ngoài từ bề mặt của gan cũng cho kết quả tiên lượng tốt vì có thể cắt bỏ hoàn toàn khối u [8], [33], [35], [99]

Trong những năm gần đây, nhiều tác giả qua các nghiên cứu liên quan đến ghép gan trên bệnh nhân xơ gan và CTBG đề nghị sử dụng thuật ngữ “CTBG nhỏ” cho những trường hợp u có đường kính từ 2cm trở xuống Những u nhỏ thường biệt hóa vừa hay biệt hóa rõ Nhưng ở các trường hợp có nhiều u nhỏ ít có bằng chứng cho thấy có sự khác biệt nhiều về mặt tiên lượng với các loại CTBG có độ biệt hóa

và kích thước khác Các u có kích thước nhỏ, độ biệt hóa rõ có tiên lượng tốt hơn các trường hợp có kích thước lớn hơn hay độ biệt hóa kém hơn [16], [33], [34], [35], [108], [128], [131]

1.1.7 Phân độ biệt hóa

CTBG được phân độ biệt hóa dựa trên đặc điểm nhân CTBG có nhiều cấu trúc mô học khác nhau, kể cả trên cùng một khối u duy nhất Hầu hết các khối ung thư gan có kích thước nhỏ hơn 1cm đường kính thường biệt hóa rõ và thường đồng nhất trong toàn bộ mô u Tuy nhiên, khoảng 40% các trường hợp khối u có đường kính từ 1-3cm đường kính thường có ít nhất 2 vùng mô u có các mức độ biệt hóa khác nhau Đối với những khối u này, vùng ung thư biệt hóa kém hơn thường nằm ở phía trung tâm của khối u, vùng tế bào ung thư biệt hóa rõ hơn nằm ngoại biên Vì vậy, những u có kích thước lớn cần phải chọn mẫu ở nhiều vị trí để đánh giá độ biệt hóa chính xác [8], [33], [34], [70], [93], [96], [100], [102]

Tác giả Edmondson và Steiner [33], [34], [35] chia CTBG thành 4 độ biệt hóa theo sự biệt hóa tế bào u kém dần với mức độ tăng dần theo độ dị dạng nhân, tỉ

lệ nhân trên bào tương Tuy nhiên, trong một số trường hợp CTBG biệt hóa kém vẫn có những vùng CTBG biệt hóa rõ Do hệ thống phân độ biệt hóa này không có tương quan rõ ràng với tiên lượng nên hệ thống phân độ Edmondson-Steiner được dùng hiện nay ở một số trung tâm y khoa tại Mỹ có thay đổi so với ban đầu

WHO chia CTBG thành 4 độ biệt hóa, biệt hóa rõ (hình 1.4) (tương đương với Edmondson độ 1), biệt hóa vừa (hình 1.5) (tương đương với Edmondson độ 2), biệt hóa kém (hình 1.6) (tương đương với Edmondson độ 3) và dạng không biệt hóa

(hình 1.7) (tương đương với Edmondson độ 4) Loại biệt hoá rõ (hình 1.4) thường gặp ở những trường hợp ở giai đoạn sớm của CTBG với kích thước u nhỏ hơn 2cm

Tế bào u có hình dạng tương tự tế bào gan bình thường, kích thước tế bào và nhân hơi thay đổi, hạt nhân có thể không rõ, thỉnh thoảng có phân bào Tế bào u giống tế bào u tuyến với bào tương nhiều, dị dạng nhân ít, có khi có thể vùi của sắc tố mật Các tế bào u thường sắp xếp thành dạng bè nhỏ, thỉnh thoảng có thể gặp dạng giả tuyến hay thoái hóa mỡ Một dạng hiếm gặp là dạng tế bào sáng (do bào tương chứa rất nhiều glycogen), giống carcinôm tế bào sáng ở thận Loại này có thể có những

ống mật nhỏ có vi nhung mao CTBG biệt hóa rõ trên toàn bộ khối u không thể phân biệt với u tuyến tế bào gan nếu chỉ dựa trên đặc điểm tế bào u Đối với trường hợp này việc chẩn đoán phải dựa trên cấu trúc mô học dạng bè hay giả tuyến, sự

xâm nhập mạch máu hay di căn xa Loại biệt hoá vừa (hình 1.5) là loại thường gặp

nhất ở những trường hợp khối u có kích thước lớn hơn 3cm đường kính Tế bào u dị dạng hơn loại biệt hoá rõ nhưng không quá dị dạng như loại biệt hoá kém Dạng bè

có nhiều hơn 3 lớp tế bào là loại cấu trúc mô học thường gặp ở dạng này Tế bào u

có bào tương nhiều, bắt màu hồng, nhân tròn, hạt nhân rõ Cấu trúc mô học dạng giả tuyến cũng thường gặp, thường chứa dịch mật hay dịch protein trong lòng các tuyến

giả Loại biệt hoá kém (hình 1.6) có hình thái mô học rất thay đổi với nhân dị dạng

rõ, nhân gập góc, tăng sắc, nhiều phân bào bất thường, sắp xếp hỗn loạn thành bè

xen lẫn với những vùng mô hoại tử thiếu máu Loại không biệt hoá (hình 1.7) có

hình thái mô học đa dạng có nhiều nhân quái và phân bào bất thường với các đại bào đa dạng hoặc với tế bào nhỏ không biệt hóa, hoặc với tế bào hình thoi Các tế bào hình thoi sắp xếp giống sarcôm, thường có nhiều mô đệm sợi, có khi mô đệm này có nhiều mạch máu tạo nên hình ảnh giống sarcôm mạch máu Hiếm khi có hình ảnh giống ống mật trong u Loại này thường có cấu trúc mô học dạng đặc, rất hiếm khi thấy ở các u nhỏ giai đoạn đầu ung thư [8], [16], [34], [70], [80], [96], [99]

Hình 1.4: CTBG biệt hóa rõ (dị dạng nhân độ 1) (Nguồn: Ishak KG, Goodman ZD,

Stocker JT, 2001, AFIP)

Hình 1.5: CTBG biệt hóa vừa (dị dạng nhân độ 2) (Nguồn: Ishak KG, Goodman

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh có sự tương quan chặt chẽ giữa độ biệt hóa

và tiên lượng của bệnh nhân Bệnh nhân có độ biệt hóa càng cao tiên lượng càng xấu Tuy nhiên, cũng không ít trường hợp CTBG không theo qui luật này Ở các

bệnh nhân này, tiên lượng còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác như tình trạng sức khỏe của bệnh nhân, tình trạng bệnh lý ở chủ mô gan, kích thước khối u, Do đó,

độ biệt hóa không nên sử dụng riêng lẻ để tiên lượng mà phải phối hợp nhiều yếu tố khác [27], [29], [69], [90], [99], [102], [116], [119], [125]

1.1.8 Phân loại mô học theo cấu trúc

CTBG có nhiều dạng cấu trúc mô học khác nhau Hiện nay, WHO sắp xếp

hình ảnh vi thể của CTBG theo 5 loại cấu trúc cơ bản: dạng bè, dạng đặc, dạng giả tuyến, dạng sợi mảnh, dạng xơ hóa [54] Hầu hết CTBG có cấu trúc mô học dạng bè

(hình 1.8), chiếm tỷ lệ 70-80% và có thể kết hợp với loại mô học khác trong cùng một u, nhất là ở các khối u có kích thước lớn hơn 2cm Các tế bào gan ung thư tăng sinh quá nhanh làm cho các bè tế bào gan trở nên xoắn vặn và dày hơn bình thường Các bè tế bào gan ung thư được bao quanh bởi các tế bào nội mô mạch máu, cách nhau bởi các xoang mạch với rất ít hay không có mô liên kết nâng đỡ Các xoang mạch của u cũng chứa các tế bào Kupffer, tế bào sao nhưng có rất ít hay không có sợi reticulin, màng đáy thường có thể thấy bên dưới các tế bào nội mô Các tế bào nội mô không cùng loại với các tế bào nội mô bình thường ở các xoang gan mà cùng loại với loại tế bào nội mô của hệ thống vi mạch CTBG không có mô đệm phản ứng, đây là đặc điểm giúp giải thích lý do CTBG thường có mật độ mềm hơn

so với hầu hết các trường hợp ung thư biểu mô khác

Các bè tế bào u có thể chỉ có ít lớp tế bào (bè nhỏ) hay có thể có trên 20 lớp

tế bào u (bè lớn) Một số trường hợp, ở trung tâm của các bè tế bào u có các tiểu quản mật dãn rộng hình thành cấu trúc mô học giả tuyến (hình 1.9) Loại mô học này cũng tương đối nổi trội, chiếm tỷ lệ khoảng 5-10% các trường hợp CTBG Hình ảnh này cần phân biệt với carcinôm tế bào gan – ống mật hoặc carcinôm tuyến di căn Các bè tế bào u cũng có thể phát triển mạnh, chèn ép các xoang mạch hình thành những mảng liên tục, tạo ra cấu trúc mô học dạng đặc (hình 1.10) Nhiều tác giả cho rằng dạng đặc là biến thể của dạng bè ở trên, chiếm tỷ lệ từ 5-15% của

CTBG CTBG dạng sợi mảnh (hình 1.11) chiếm khoảng 1 – 5% CTBG ở Hoa Kỳ,

hiếm gặp ở trong những vùng có tần suất cao của CTBG CTBG dạng sợi mảnh có cấu trúc mô học khác so với các trường hợp CTBG khác, với hình ảnh mô đệm nhiều Tế bào u có màng tế bào rõ ràng, tỷ lệ nhân trên bào tương lớn, bào tương nhiều, bắt màu hồng, có hạt, dạng phồng bào, nhân tròn, chất nhiễm sắc thô, màng nhân dày hoặc không rõ Thường gặp ở các bệnh nhân trẻ, không xơ gan

Hiếm gặp nhất là loại CTBG có cấu trúc mô học xơ hóa, với hình ảnh mô đệm sợi dày đặc giữa các bè tế bào gan Biến thể này rất hiếm, chỉ ít hơn 1 – 2% của tất cả CTBG Trong các loại cấu trúc mô học của CTBG, loại sợi mảnh là loại có tiên lượng tốt nhất Tỉ lệ sống trên năm năm của loại này là 56% Thời gian sống lâu nhất sau phẫu thuật là 21 năm Ngoài loại sợi mảnh, loại đặc được cho là loại có

tiên lượng sống tốt hơn loại bè lớn và loại giả tuyến [8], [33], [34], [131] Một số

trường hợp CTBG có cấu trúc mô học có hình ảnh hỗn hợp giữa các loại cấu trúc

mô học khác nhau, thường gặp nhất là hỗn hợp giữa dạng bè và dạng đặc hay giữa dạng bè với dạng giả tuyến Thỉnh thoảng có trường hợp CTBG có cấu trúc mô học dạng hỗn hợp giữa bè và dạng sợi mảnh, dạng này có đặc điểm lâm sàng và tiên lượng không giống CTBG dạng sợi mảnh mà tương tự các trường hợp CTBG khác

Ngoài ra, còn có một dạng mô học hiếm gặp khác là CTBG loại xuất huyết thoái hóa, loại này thường có những khoang lớn giả mạch máu chứa đầy máu giống với hình ảnh trong viêm gan thoái hóa xuất huyết Một số trường hợp u vỡ gây xuất

huyết nội [16], [33], [34], [35], [128], [131], [140]

Hình 1.8: Tế bào u xếp dạng bè (Nguồn: Edward C Klatt, 2012, Webpath)

Hình 1.9: Tế bào u xếp dạng giả tuyến (Nguồn: Edward C Klatt, 2012, Webpath)

Hình 1.10: Tế bào u xếp dạng đặc (Nguồn: Edward C Klatt, 2012, Webpath)

Hình 1.11: CTBG dạng sợi mảnh (Nguồn: Edward C Klatt, 2012, Webpath)

1.1.9 Kiểu xâm nhập vi thể xung quanh khối u

CTBG có thể xâm nhập mô gan xung quanh theo nhiều hình thái khác nhau Dựa trên hình ảnh tương tác giữa mô u và mô gan xung quanh ở bờ khối u, các kiểu xâm nhập bao gồm dạng xoang, dạng thay thế, dạng vỏ bao giả, dạng có vỏ bao thật Các tế bào gan ung thư có thể xâm nhập vào mô gan xung quanh theo các xoang hình thành cấu trúc mô học dạng xoang Trong CTBG dạng thay thế, các tế bào u xâm nhập vào các bè tế bào gan và thay thế các tế bào gan bình thường, hình thành cấu trúc mô học đặc trưng với hình ảnh giới hạn rõ giữa tế bào u và mô gan bình thường xung quanh CTBG dạng có vỏ bao giả là loại mô học có các bó mô sợi mỏng, lỏng lẻo giữa mô u và mô gan xung quanh thường do mô sẹo xơ hóa bị xô đẩy ra xa bởi mô u CTBG dạng có vỏ bao thật có vỏ bao sợi dày vài milimet [47], [80], [96], [99], [100], [128], [131], [139], [140]

1.1.10 Phân bào

Phân bào thường gặp ở CTBG Phân bào được đánh giá ở những vùng nhiều

tế bào Các vùng xơ hóa nhiều hay hoại tử không được các tác giả tính khi đánh giá

tỉ lệ phân bào trên khối u CTBG có tỉ lệ phân bào lớn hơn 10 trên 10 quang trường phóng đại 400 lần có tiên lượng xấu Tỉ lệ phân bào cao cũng giúp dự đoán tình trạng xâm nhập tĩnh mạch cửa [80]

1.1.11 Xâm nhập mạch máu

CTBG có thể xâm nhập và di căn theo động mạch hay hệ thống tĩnh mạch cửa, một số các trường hợp còn di căn theo tĩnh mạch chủ lên đến tâm nhĩ phải và phát triển tại đó Tình trạng xâm nhập mạch máu có thể thấy qua các phương tiện chẩn đoán hình ảnh hoặc quan sát đại thể khối u sau phẫu thuật hay quan sát dưới kính hiển vi, huyết khối tĩnh mạch cửa cũng được xem là hình ảnh của tình trạng xâm nhập mạch máu quan sát được trên đại thể Huyết khối tĩnh mạch cửa và các nhánh tĩnh mạch cửa xảy ra trong khoảng 75% các trường hợp Theo tác giả Lauwers GY và cộng sự [80], ngoài xâm nhập đại thể, xâm nhập mạch máu vi thể

có trong 51,3% các trường hợp CTBG Xâm nhập tĩnh mạch gan có trong khoảng 20-25% trường hợp Theo AFIP, xâm nhập mạch máu ở mô gan xung quanh thấy trong 74% các trường hợp Những trường hợp CTBG có xâm nhập mạch máu tiên lượng sống xấu hơn và tỉ lệ tái phái, di căn cao hơn các trường hợp không có xâm nhập mạch máu [70]

1.1.12 Hoại tử u

Tình trạng hoại tử khối u cũng thường gặp, khoảng 50% bệnh nhân có hoại

tử trong khối u, trong đó chủ yếu là hoại tử nhỏ hơn 25% thể tích u Hoại tử u là một yếu tố tiên lượng xấu Những bệnh nhân có hoại tử u có tiên lượng sống ngắn hơn những bệnh nhân không có hoại tử u [80], [131], [140]

1.1.13 Dấu ấn sinh học Ki-67 và PCNA

Bên cạnh các kháng nguyên liên quan đến sự đè nén u, còn có nhiều kháng nguyên liên quan đến sự tăng sản tế bào gồm: Ki67 và PCNA Ki67 liên quan mật thiết với hình thái tăng trưởng tế bào, đặc biệt là chỉ số phân bào và độ biệt hóa của

u Những bệnh nhân ung thư có thời gian sống thêm ngắn thường có tỉ lệ Ki67 cao [100], [120], [152], [153]

Mức độ tăng sản của tế bào ung thư gan có liên quan trực tiếp với tiên lượng Phương pháp đánh giá mức độ tăng sản bằng máy đo dòng tế bào để xác định tỉ lệ pha S, vẫn được xem là phương pháp đánh giá rất hữu ích đối với lâm sàng Một số phương pháp khác dùng để ước tính tỉ lệ tăng sản trong u: đo chỉ số phân bào và dùng hoá mô miễn dịch Phương pháp hoá mô miễn dịch được thực hiện nhờ kháng thể nhận biết kháng nguyên liên quan với chu kỳ phân bào Trong số đó gồm có: Ki-

67, kháng nguyên ở nhân tế bào đang tăng sản (PCNA) và một số khác Do hầu hết các phương pháp đánh giá mức độ tăng sản đều có những hạn chế như đòi hỏi trang thiết bị đặc dụng như máy đo dòng tế bào hay các phương tiện kỹ thuật đắt tiền khác, nên các phương pháp đánh giá bằng hoá mô miễn dịch được sử dụng nhiều hơn vì có thể sử dụng bệnh phẩm đã được xử lý bằng kỹ thuật mô học thường quy

Khi so sánh các phương pháp đánh giá mức độ tăng sản bằng kỹ thuật hoá

mô miễn dịch, Ki-67 và PCNA được cho là dấu chứng sinh học tốt nhất khi sử dụng trên các mô xử lý thường quy, trong khi các kháng thể nhận biết kháng nguyên liên quan với chu kỳ phân bào khác có độ nhạy, độ đặc hiệu không cao [13], [30]

Ki-67 là kháng thể đơn dòng nhận biết đặc hiệu kháng nguyên trong nhân của tế bào đang phân bào (tế bào ở pha G1, S, G2, và các kỳ của pha M), không có ở thời kỳ nghỉ (G0) Ki-67 là kháng thể đánh giá sự tăng sản tế bào hiện được sử dụng nhiều nhất Mức độ biểu hiện của Ki-67 và PCNA có tương quan trực tiếp với kích thước u nguyên phát, độ biệt hóa, tình trạng xâm nhập mạch máu và di căn hạch Đến nay, trên thế giới đã có các nghiên cứu cho thấy có mối liên quan có ý nghĩa giữa kết quả nhuộm Ki-67 và tiên lượng Đặc biệt, nguy cơ tái phát của ung thư tế bào gan tăng ở những bệnh nhân có biểu hiện Ki-67 và PCNA ở mức độ cao [43], [121], [133]

1.1.14 P53

P53 là một gen đè nén u, có vai trò làm ngừng lại sự phân chia tế bào Khi gen đè nén u bị đột biến, khiếm khuyết DNA có thể được di truyền qua tế bào mầm

P53 là một gen đè nén u được tìm thấy tại cánh ngắn đoạn 13 thuộc nhiễm sắc thể

17 (ký hiệu 17p13) và mã hoá tổng hợp một protein thuộc nhân có trọng lượng phân

tử 53kd với vai trò là yếu tố sao chép đảm nhận nhiều chức năng, đặc biệt làm tiến trình phân bào dừng lại Gen đè nén u ở thể lặn, nên khi đột biến hoàn toàn cả 2 bản sao của gen mới không ngăn cản được sự tăng trưởng tế bào bị thương tổn Gen p53 đóng vai trò then chốt, được xem là bước cuối cùng của sự sinh ung Gen p53 tham gia vào các điểm kiểm soát chu kỳ tế bào: làm dừng tế bào lại ở pha G1 hay làm chết tế bào theo lập trình Đột biến gây bất hoạt gen p53 thường gặp trong nhiều loại ung thư ở người (50%) Ngày nay, dựa vào protein p53, sản phẩm của gen p53, người ta có thể nhận biết kháng nguyên u qua các kỹ thuật nhuộm hoá mô miễn dịch [85]

Đột biến gen p53 có thể gặp ở nhiều loại ung thư khác nhau, trong đó có CTBG Loại đột biến phổ biến nhất là đột biến điểm trên những đoạn gen, tạo ra những phân tử protein không có chức năng nhưng có tính ổn định và tích tụ trong nhân tế bào Vì vậy, dựa vào protein p53, sản phẩm của gen p53, người ta có thể nhận biết kháng nguyên u qua các kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch Khảo sát các protein đột biến này tương đối dễ dàng và chính xác bằng phương pháp hoá mô miễn dịch với độ nhạy khoảng 80% và có thể nhận biết hầu hết các protein đột biến khác nhau [85]

1.2 P53 và CTBG

1.2.1 Cấu trúc của gen p53

Hiện nay người ta biết đến nhiều gen đè nén u gồm APC, BRCA1, BRCA2, NF1, NF2, WT1, VHL, nhưng chỉ gen RB và p53 có ảnh hưởng đặc biệt đến bộ máy chu kỳ tế bào Trong đó, đột biến gen trên p53 chiếm tỉ lệ khoảng 50% các trường hợp ung thư [136]

Gen p53 gồm 11 exon (exon đầu tiên không mã hóa), nằm trên cánh ngắn nhiễm sắc thể số 17 (17p13) (Hình 1.12) Phiên bản RNA thông tin dài khoảng 3kb, bao gồm 1179 khung đọc mở (ORF)[66] Theo Bourdon và c.s [19], gen p53 có 2 vùng bắt đầu phiên mã ở exon 1, và vùng cắt intron khác có thể xuất hiện ở intron 2

và giữa exon 9 và exon 10 Gen này cũng gồm một vùng khởi động nội sinh và vùng bắt đầu phiên mã ở intron 4

Hình 1.12: Cấu trúc gen p53 [135]

1.2.2 Protein p53

Protein p53 gồm có 393 acid amin, có khối lượng phân tử là 53kD, là protein

có hàng loạt các biến đổi sau dịch mã như phosphoryl hóa, acetyl hóa, ubiquitin hóa, sumoy hóa, neddy hóa Protein p53 được chia thành 3 phần chính gồm đầu amino, vùng trung tâm p53, đầu cacboxyl (Hình 1.13) Đầu amino có hai vùng chính là vùng kích hoạt phiên mã TAD1 từ acid amin thứ 1- 42 và TAD2 gồm các acid amin từ 43-63 và một vùng khác là vùng giàu Proline từ acid amin 64-93 [25] Vùng trung tâm p53 là vùng gắn kết DNA đặc hiệu (DBD) từ vị trí acid amin 102-

292 [110], [113] Đầu cacboxyl của p53 bao gồm 3 vùng tín hiệu định vị nhân (NLS), vùng tetramer hóa từ acid amin 325-355 có chứa vùng tín hiệu rời nhân (NES), và vùng điều hòa âm tính [123]

Hình 1.13: Cấu trúc protein p53 [135]

1.2.3 Hoạt động của p53

Gen p53 hoạt động dựa trên hoạt động của nhiều gen khác nhau và các sản phẩm gen của nó nhằm đáp ứng lại các tín hiệu stress đa dạng bao gồm apoptosis,

sự lão hóa tế bào, hay sự ngừng chu kỳ tế bào Các gen điều hòa p53 cũng sản xuất

ra các protein truyền tải các tín hiệu stress này đến các tế bào lân cận, ngăn cản hoặc sửa chữa các DNA bị sai hỏng và tạo ra vòng đáp ứng ngược giúp tăng cường hay làm giảm hoạt tính của p53 [83], [84], [87]

Khi nhận các thông báo từ các nhân tố trung gian và trung tâm điều hòa của chuỗi tương tác p53 Có vài dạng tín hiệu stress được tế bào nhận diện rồi truyền tải đến protein p53 và các thành phần trong trung tâm điều hòa chức năng p53 thông qua các nhân tố trung gian Vài tín hiệu stress làm cho protein MDM-2 (gen MDM-

2 là gen điều hòa phiên mã âm tính chủ yếu của p53 trong tế bào) bị phân hủy và kéo theo làm tăng số lượng và hoạt tính của protein p53 Mức độ protein MDM-2 sau đó được phục hồi nhờ các phiên bản ức chế p53 của gen MDM-2 Khi lượng p53 tăng lên sẽ làm tăng lượng MDM-2, lúc đó, lượng p53 lại bị giảm xuống Các tương tác xuôi dòng của một loạt gen và các sản phẩm gen được điều hòa bởi protein p53, đa số bằng hoạt tính phiên mã nhưng trong một vài trường hợp bằng tương tác protein-protein Các gen được p53 điều hòa khác có chức năng truyền tải tín hiệu trả lời đến các tế bào lân cận, sửa chữa DNA hoặc cài đặt vòng điều hòa ngược âm tính hay dương tính, làm tăng cường hay giảm chức năng của protein p53

Vùng kích

hoạt phiên

mã (TAD)

Vùng giàu Proline

Vùng kết hợp DNA đặc hiệu (DBD)

Vùng tetramer hóa (TET)

Vùng điều hòa âm tính (REG)

và kết hợp các đáp ứng stress với những chuỗi tương tác các tín hiệu biểu hiện tính trạng khác Các đáp ứng tế bào của những tương tác xuôi dòng, bao gồm sự ngừng chu kỳ tế bào, sự lão hóa tế bào hay apoptosis và thường hình thành hệ thống thông tin rộng lớn với những chuỗi tương tác các tín hiệu biểu hiện tính trạng khác Protein p53 được xem như là nhân tố kích hoạt phiên mã của các gen được p53 điều hòa [83], [84]

Các đáp ứng p53 nhạy với sự kích hoạt đột biến của các oncogene và thường thay đổi các biểu hiện đáp ứng xuôi dòng của chuỗi tương tác p53 từ sự ngừng chu

kỳ tế bào thành apoptosis Các tín hiệu stress nội bào đa dạng đều tác động vào trung tâm điều hòa và các nút tương tác đơn lẻ để đáp ứng lại các stress tương ứng Các stress này được xem là tín hiệu xấu của cả hệ thống có thể dễ dàng làm tổn thương, làm mất đi các nút tương tác trung tâm đơn lẻ [148] Vì tất cả các stress đều tạo ra sự thiếu chính xác trong quá trình tự nhân đôi, dẫn đến bệnh ung thư, nên protein p53 được xem là một thành phần trung tâm quyết định sự sinh trưởng hoặc

sự sinh sản của tế bào [83], [84]

1.2.4 Các phương pháp phân tích sự biến đổi gen p53 trong ung thư

1.2.4.1.Phân tích di truyền phân tử

Đối với gen p53, giải trình tự trực tiếp sau khi PCR khuếch đại gen là một

“Tiêu chuẩn vàng” trong các phương pháp phân tích di truyền phân tử Vì gen p53

có 10 exon mã hóa có kích thước nhỏ hơn 350 cặp base, nên các trình tự ngắn này được khuếch đại và giải trình tự một cách dễ dàng Thêm vào đó, đột biến gen p53 chủ yếu là các đột biến điểm, còn các đột biến mất một phần hay toàn phần gen thường ít xảy ra Tuy nhiên, tính chính xác và độ nhạy của phương pháp này còn phụ thuộc vào loại khối u và tỉ lệ gây nhiễm mẫu [135]

Ngoài việc sử dụng DNA làm đối tượng nghiên cứu, một số tác giả cũng nhận diện các đột biến di truyền trên RNA, cDNA, đặc biệt là với các loại ung thư

máu Ở gen p53, việc sử dụng RNA làm vật liệu để phân tích các đột biến có những

ưu thế sau: (1) vùng mã hóa của gen p53 khá nhỏ, chỉ khoảng 1,200 cặp base nên dễ dàng phân tích trọn vẹn gen; (2) nhận diện đột biến trên RNA nhạy hơn trên DNA; (3) khi dùng RNA, có thể nhận diện được các đột biến xảy ra ở các vị trí cắt intron

mà khi dùng DNA không thể nào nhận diện được Trong khi hiện nay, việc đánh giá tần số xuất hiện của dạng đột biến này còn rất hạn chế

Hiện nay, một cách tiếp cận mới phát triển từ phương pháp giải trình tự của Sanger là phương pháp giải trình tự do nhiệt (pyrosequencing), không cần sử dụng bước điện di Đây là phương pháp phân tích đột biến trên p53 khá thành công, tuy nhiên vẫn còn một số nhược điểm, đặc biệt là các đột biến dịch khung được nhận diện chưa đáng tin cậy và các đoạn DNA phân tích phải có kích thước nhỏ hơn 100 cặp base [135]

1.2.4.2.Thử nghiệm chức năng FASAY (Thử nghiệm chức năng ở nấm men)

Ban đầu, thử nghiệm này dùng để xác nhận đột biến giao tử, sau đó được cải tiến và hiện nay, độ nhạy của phương pháp này thích hợp để nhận diện mọi đột biến trên các mẫu mô ung thư Trong phương pháp này, cDNA li trích từ mẫu mô ung thư được khuếch đại vùng codon 52 đến 364 (68% vùng exon 4 đến 10) bằng PCR, sau đó cho biến nạp các gen này vào nấm men Trong nấm men, đoạn gen này được tái tổ hợp vào hệ gen nấm men và được biểu hiện nhờ vector biểu hiện Các khuẩn lạc nấm men có chứa các gen p53 bị đột biến sẽ có màu đỏ trên môi trường, trong khi các khuẩn lạc trắng cho thấy cấu trúc gen p53 bình thường Đoạn gen khuếch đại mang đến 95% các đột biến, làm cho thử nghiệm FASAY trở thành phương pháp phân tích p53 hữu hiệu, đặc biệt là đối với các đột biến ở vùng cắt intron Ngoài ra, để thử nghiệm này thành công, chỉ cần có khoảng 5% tế bào ung thư trong mẫu mô, và thường để nhận diện các đột biến không thể nhận diện được qua giải trình tự trực tiếp Tuy nhiên, phương pháp này lại không cho biết thông tin cụ thể về dạng đột biến nào đã xảy ra Thêm vào đó, các thể đột biến p53 rất nhạy với sự biến

đổi nhiệt độ và sự biểu hiện các đột biến giống nhau lại rất khác nhau, phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường sống và chất cảm ứng có trong môi trường nuôi cấy [135]

1.2.4.3 Phân tích huyết thanh các biến đổi gen p53

Trong khoảng thập niên 80, nhiều nghiên cứu xác nhận sự xuất hiện kháng thể đặc hiệu với protein p53 trong huyết thanh của các bệnh nhân ung thư với nhiều loại ung thư khác nhau Đa số các bệnh nhân có kháng thể p53 này đều có các đột biến trên p53 làm cho protein p53 được tích lũy trong nhân tế bào, kéo theo sự xuất hiện các đáp ứng miễn dịch giữa kháng thể và p53 Tuy nhiên, chỉ có 30-40% bệnh nhân ung thư có xảy ra sự biến đổi trên p53 có kháng thể này Các kháng thể này có thể gắn kết đặc hiệu lên vùng đầu amino và đầu cacboxyl của protein p53, là vùng không chứa các trình tự các điểm nhạy của đột biến [135]

Đến nay, vẫn còn nhiều tranh cãi xung quanh việc xác định giá trị lâm sàng của các kháng thể này Tuy nhiên, với các thử nghiệm xác định biểu hiện của kháng thể trong trị liệu, các nghiên cứu đều nhận thấy có sự mất đi và giảm lượng kháng thể này một cách đáng kể sau khi có điều trị Vì vậy, kháng thể p53 được xem là công cụ xác định hữu hiệu các đáp ứng của liệu pháp điều trị và nhân tố cho thấy sự tái phát sớm các ung thư [135]

Sự xuất hiện của các kháng thể p53 này trong huyết thanh là dấu hiệu đầu tiên cho phép liên tưởng đến các đột biến p53 xảy ra trong quá trình hình thành khối

u, vì thế phương pháp này thường được dùng để nhận diện sớm các ung thư Tuy nhiên, các kháng thể p53 này chỉ thường xuất hiện nhiều trong các cá thể có nguy

cơ cao như bệnh nhân ung thư phổi và có dùng nhiều thuốc lá Vì thế, độ nhạy của phương pháp phân tích huyết thanh nói chung cho tất cả các loại ung thư được xem

là còn thấp [124], [135], [144]

1.2.4.4 Phân tích hóa mô miễn dịch

Phương pháp hóa mô miễn dịch xác định định tính protêin p53 tích tụ trong nhân tế bào, là hậu quả của đột biến gen gây ra Nghiên cứu của tác giả Lunn [92]

và cộng sự cho thấy, độ nhạy của phương pháp hóa mô miễn dịch cao hơn các phương pháp khác như PCR-SSCP, giải trình tự gen trong việc phát hiện đột biến p53 trên CTBG Hiện nay, nhuộm hóa mô miễn dịch là phương pháp phổ biến để nhận diện các tế bào bất thường dựa vào sự biểu hiện vượt mức protein p53 Nguyên tắc chủ yếu của phương pháp này là dựa trên tính gắn kết đặc hiệu giữa các epitop của protein p53 và các paratop của các kháng thể p53 có đánh dấu chất bắt màu Trong tế bào bất thường, protein p53 thường tập trung biểu hiện ở trong nhân

tế bào, vì thế khi nhuộm hóa mô miễn dịch thì nhân tế bào sẽ bắt màu, trong khi ở các tế bào bình thường, lượng protein p53 biểu hiện ít nên không cho thấy sự bắt màu đặc trưng Như vậy các tế bào bắt màu với màu nhuộm trong các phân tích hóa

mô miễn dịch là các tế bào bất thường phải có các đặc điểm: (1) có sự biểu hiện vượt mức protein p53; (2) protein p53 biểu hiện phải được tích lũy trong nhân tế bào; (3) không có đột biến và không có sự biến đổi cấu trúc không gian protein tại

vị trí epitop gắn đặc hiệu trên p53 [135]

Vì có đến 80% các đột biến nhầm nghĩa tạo ra các protein p53 đột biến được tích lũy trong nhân nên phương pháp này được xem là phương pháp nhận diện trực tiếp protein đột biến có độ tin cậy cao Tuy nhiên, các đột biến vô nghĩa và đột biến dịch khung lại thường không tạo ra các protein được tích lũy trong nhân Vì thế, các kháng thể đánh dấu không thể gắn được vào epitop của các protein đột biến [135]

Ngoài ra, phương pháp này sử dụng một số các kháng thể đặc hiệu với p53, nhưng không phải tất cả các đột biến đều được nhận diện bởi những kháng thể này [135]

1.2.5 Biểu hiện và ý nghĩa của p53 trên CTBG

Trong những năm gần đây, đột biến gen liên quan đến CTBG, cũng như nhiều loại ung thư khác, được quan tâm nhiều nhất là p53 Các khối u có độ biệt hóa khác nhau có kiểu đột biến và vị trí đột biến khác nhau Đột biến p53 ở CTBG có thể xảy ra ở nhiều codon khác nhau, những vị trí đột biến được ghi nhận gồm codon

158, 175, 213, 249, 245 Một số kiểu đột biến đặc trưng cho vùng dịch tễ, tùy thuộc vào các tác nhân đột biến trong môi trường sống Điển hình cho cơ chế này là mối liên quan giữa Aflatoxin B1 và CTBG ở Châu Á Aflatoxin B1 được chứng minh là một đồng tác nhân sinh ung quan trọng trong ung thư gan, thường liên quan đến sự đột biến gen p53

Trong một nghiên cứu trên các bệnh nhân CTBG ở Địa Trung Hải, tất cả các trường hợp CTBG loại sợi mảnh và CTBG không xảy ra trên nền xơ gan hay xơ gan

do rượu đều không có đột biến p53 Đột biến gen p53 chủ yếu xảy ra trên bệnh nhân CTBG xảy ra trên nền xơ gan liên quan đến tình trạng viêm gan siêu vi Một số ít các CTBG loại sarcôm có đột biến gen p53 Thời gian sống trung bình của các trường hợp CTBG có đột biến p53 là 43 tháng Qua nghiên cứu này các tác giả cũng chứng minh được p53 có liên quan đến tiên lượng xấu của các bệnh nhân CTBG Hầu hết các nghiên cứu đều không thấy sự biểu hiện của p53 trên mô gan xung quanh khối u Theo nghiên cứu của tác giả Caruso MI và cs [20] trên 193 trường hợp CTBG, tỉ lệ dương tính của p53 trên HMMD ở CTBG (Hình 1.14) là 15% Nồng độ AFP trong máu cao cũng có liên quan đến sự biểu hiện của p53 Tần suất biểu hiện của p53 trên các bệnh nhân CTBG có nhiễm HCV (36%) cao hơn các bệnh nhân không nhiễm HCV (13%) Tuổi, giới, tình trạng nhiễm HBV không có mối liên quan với biểu hiện của p53 trên CTBG Các khối u có độ biệt hóa càng kém càng có tỉ lệ biểu hiện p53 cao Tuy nhiên theo nghiên cứu của một số tác giả khác, đột biến p53 (đặc biệt ở codon 249) được xem là yếu tố sinh ung kết hợp với HBx (là yếu tố sinh ung được chứng minh có liên quan đến HBV) gây ra CTBG [68], [122]

Những bệnh nhân CTBG có biểu hiện dương tính của p53, Ki-67 cùng với nồng độ AFP cao được thấy có tiên lượng xấu và dự đoán sẽ tái phát sớm Kích thước u càng lớn tỉ lệ tái phát sớm càng tăng lên [52]

Tác giả Cohen và De Rosa [30] nghiên cứu thấy có khác biệt về biểu hiện p53 trên bệnh nhân CTBG so với các trường hợp nghịch sản tế bào gan P53 dương tính trong 48% các trường hợp CTBG, trong khi đó chỉ có 3% trường hợp nghịch sản tế bào gan Theo tác giả Lee và cộng sự [81], tốc độ tăng sản tế bào của nghịch sản tế bào gan thấp (Ki-67 và PCNA) nhưng tỉ lệ chết tế bào theo chương trình của các trường hợp nghịch sản tế bào gan loại tế bào lớn (LCD) cao hơn tế bào gan bình thường

Hình 1.14: Biểu hiện dương tính mạnh của p53 trên CTBG so với mô gan không u

Dựa vào biểu hiện của p53 trên hóa mô miễn dịch có thể tiên lượng cho các bệnh nhân CTBG Hầu hết các nghiên cứu chúng tôi có được đến nay cho thấy có khoảng 22,5%-27% các trường hợp CTBG tìm thấy protein p53 bằng phương pháp hoá mô miễn dịch Trong một số nghiên cứu khác, các trường hợp có biểu hiện p53 dương tính lên đến 50% các trường hợp Kích thước u càng lớn tỉ lệ này càng tăng lên Tỉ lệ biểu hiện của p53 trong huyết thanh của các trường hợp CTBG theo nghiên cứu của tác giả Ryder và cộng sự [4] thực hiện tại Viện nghiên cứu về gan tại Luân đôn cũng lên đến 50% Tỉ lệ biểu hiện của p53 cũng thay đổi nhiều tùy theo nhiều nghiên cứu tại các nơi khác nhau trên thế giới, có thể từ 0% đến 75% Tỉ

lệ p53 ở Nigeria là 12,2% theo nghiên cứu của tác giả Akere A [12] , khác biệt

nhiều so với các nghiên cứu của các tác giả Charukuks [22] (18,4%), Raedle [122] (22,7%), Shiota [129] (32%) Sự khác biệt này được các tác giả lý giải là do sự khác nhau về vùng dịch tễ với các yếu tố nguy cơ đi kèm như sự phơi nhiễm với Aflatoxin B1, HBV, HCV,…[5], [6], [7], [118]

Theo nghiên cứu của các tác giả Nhật Bản, các trường hợp CTBG có tỉ lệ p53 (+) lần lượt là 25%, 45,5% đối với các khối u có kích thước 2-5cm và >5cm [99], [100] Tỉ lệ dương tính của p53 càng tăng khi kích thước u của khối u càng lớn Theo tác giả Lun-xiu Qin và cộng sự [119], tỉ lệ p53 dương tính càng cao tiên lượng càng xấu Tác giả này chia sự biểu hiện dương tính của p53 trên nhân tế bào thành các mức độ sau: 0 khi dương tính <10% (Hình 1.15), 1+ khi tỉ lệ dương tính 10-30% (hình 1.16), 2+ khi tỉ lệ dương tính 31-50% (Hình 1.17), 3+ khi tỉ lệ dương tính >50% (Hình 1.18) Trong nghiên cứu này, tỉ lệ sống thêm 1 năm và 3 năm của các bệnh nhân có p53 dương tính 3+ là thấp nhất với tỉ lệ lần lượt là 38,5%, 12,3% Đối với các bệnh nhân có p53 dương tính 2+, có đến 60% sống thêm 1 năm và 46,7% bệnh nhân sống thêm 3 năm Các bệnh nhân có p53 dương tính 1+, có đến 83,5% sống thêm 1 năm và 57,3% bệnh nhân sống thêm 3 năm Tỉ lệ bệnh nhân sống thêm 3-5 năm có biểu hiện dương tính p53 thấp hơn nhiều so với các bệnh nhân âm tính với p53 Các tác giả này đề nghị sử dụng dấu chứng p53 thường qui cho việc tiên lượng CTBG

1.3 Ki-67 và CTBG

Ki67 liên quan mật thiết với hình thái tăng trưởng tế bào, đặc biệt là chỉ số phân bào và độ biệt hóa của u Những bệnh nhân ung thư có thời gian sống thêm ngắn thường có tỉ lệ Ki67 cao Biểu hiện dương tính mạnh của Ki67 là một yếu tố nguy cơ cho thấy khả năng tái phát cao, tiên lượng xấu [138] Theo tác giả Tomoki Nakajama và cộng sự [100], tất cả các trường hợp CTBG biệt hóa rõ và tiến triển bệnh chậm đều có biểu hiện dương tính trên Ki67 <10% Các trường hợp có tốc độ tiến triển bệnh trung bình có biểu hiện dương tính trên Ki67 từ 10-20% Các trường hợp lớn hơn 20% đều có tiến triển bệnh nhanh, tiên lượng xấu Các nghiên cứu về các dấu ấn miễn dịch liên quan đến sự tăng sinh tế bào hầu hết đều cho thấy các trường hợp có các dấu ấn miễn dịch liên quan đến sự tăng sinh tế bào dương tính mạnh đều có tiên lượng xấu, với thời gian sống ngắn và tái phát sớm sau điều trị [100], [120], [152], [153] Ngoài ra, biểu hiện Ki67 dương tính cao trên mô u xung

quanh cũng là dấu hiệu có liên quan đến hiện tượng nghịch sản tế bào gan Một số nghiên cứu cho thấy Ki-67 có biểu hiện dương tính cao ở những trường hợp nghịch sản tế bào gan có khả năng diễn tiến thành CTBG [42], [75]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Quần thể nghiên cứu

Bệnh nhân Việt Nam mắc bệnh CTBG

2.1.2 Quần thể đích

Tất cả bệnh nhân CTBG được điều trị tại bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 4 năm 2004 đến tháng 6 năm 2010

2.1.3 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu gồm 313 bệnh nhân CTBG được chẩn đoán xác định

và mổ cắt gan bằng phương pháp mổ mở tại bệnh viện Đại học Y dược Thành phố

Hồ Chí Minh từ tháng 4 năm 2004 đến tháng 6 năm 2010, được chọn lựa theo các tiêu chuẩn sau:

* Tiêu chuẩn chọn mẫu

- Những trường hợp CTBG được mổ cắt gan bằng phương pháp mổ mở

- Có hồ sơ bệnh án đầy đủ các xét nghiệm HBsAg, antiHCV, AFP

- Có đủ mô lành để đánh giá mức độ viêm và xơ hóa của chủ mô gan cách

mô u tối thiểu 1cm

* Tiêu chuẩn loại trừ

- Các trường hợp CTBG mổ cắt gan bằng nội soi (do mô gan qua phẫu thuật nội soi đã bị cắt vụn không thể đánh giá bờ phẫu thuật chính xác, không thể đánh giá được mô gan lành kèm theo có cách mô u đủ xa hơn 1cm hay không)