Báo cáo thực tập viện pasteur TP hồ chí minh

Báo cáo thực tập viện pasteur TP hồ chí minh

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa thực tập tốt nghiệp, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn trân

thành đến Viện Pasteur TPHCM và đặc biệt phòng Vi sinh Thực phẩm - Nước,

Khoa Xét nghiệm sinh học lâm sàn, Viện Pasteur TP HCM

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Th.S Nguyễn Thị Nguyệt – Trưởng phòng Vi

sinh Thực phẩm – Nước, người đã tạo điều kiện để tôi có thể được tham gia thực

tập trong một môi trường tốt như tại phòng Vi sinh Thực phẩm – Nước Tôi cũng

xin gửi lời cảm ơn và biết ơn sâu sắc đến các Anh (Chị), Thầy (Cô) đang làm việc

tại phòng Vi sinh Thực phẩm – Nước vì đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tôi nhiều

kiến thức trong suốt quãng thời gian thực tập tại phòng

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh

Học trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã và luôn tận tình chỉ

dạy, truyền đạt cho tôi những nền tảng kiến thức cơ bản, những định hướng nghiên

cứu mở rộng để chúng tôi có thể dễ dàng tiếp cận vấn đề

Do thời gian thực tập tại đơn vị còn hạn hẹp, kiến thức và kinh nghiệm thực

tiễn của bản thân tôi còn nhiều hạn chế nên không thể tránh khỏi những bỡ ngỡ,

thiếu sót Rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu từ các Anh (Chị),

Thầy (Cô) để tôi có thể hoàn thiện bản thân hơn

Tôi xin chân thành cảm ơn và kính chúc Anh (Chị), Thầy (Cô) có nhiều sức

khỏe và thành công trong công việc và cuộc sống

Tp, Hồ Chí Minh, Tháng 9 Năm 2017

Sinh Viên

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATVSTP An toàn vệ sinh thực phẩm

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

GIỚI THIỆU CƠ SỞ THỰC TẬP Giới thiệu

Viện Pasteur Sài Gòn nay là Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh, Viện Pasteur đã

quyết tâm xây dựng Viện thành một trung tâm y tế chuyên sâu và cơ sở y tế dự

phòng đầu ngành của khu vực phía Nam

Trong bối cảnh Việt Nam hội nhập quốc tế, phát triển nền kinh tế thị trường

theo định hướng xã hội chủ nghĩa với nhiều yếu tố, phát triển tích cực và có cả mặt

trái của nó, đồng thời trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã xuất hiện các bệnh mới

nguy hiểm như SARS, cúm A/H5N1, Nihpa virus,… Viện Pasteur TP.HCM cố

gắng hoạt động theo quan điểm y học dự phòng, với các biện pháp chủ động là

phương cách hiệu quả nhất và ít tốn kém nhất để khống chế bệnh tật và bảo vệ sức

khỏe cho một cộng đồng rộng lớn gồm số đông cá thể Như Pasteur đã nói: "Hãy

quan tâm đến ngôi đền thiêng liêng mang các tên đầy ý nghĩa, phòng thí nghiệm

Hãy yêu cầu nhân lên rất nhiều, trang trí lên thật đẹp, đây chính là ngôi đền của

tương lai, của phồn vinh, của cuộc sống yên lành Chính ở đây, loài người sẽ lớn

lên, mạnh lên và tốt lên"

Một nhiệm vụ khác mà Viện đã, đang và tiếp tục thực hiện là các hoạt động

chỉ đạo giám sát phòng chống dịch bệnh, thực hiện các chương trình mục tiêu quốc

gia như là các hoạt động về y tế công cộng và chỉ đạo tuyến Trên mọi nẻo đường,

xã, ấp của các tỉnh thành phía Nam đều in đậm dấu chân của cán bộ Viện Pasteur

TP.HCM Họ đi đến những nơi này để làm, để học, để huấn luyện, để hướng dẫn,

để tuyên truyền, để tổ chức, để chia sẻ cùng đồng nghiệp ở các tuyến, cho đến tận

nhà dân, ngày này sang tháng khác, không quản mệt nhọc đường sá xa xôi và tạm

gác công việc của gia đình để góp phần cùng cả nước đẩy lùi, khống chế các bệnh

nhiễm trùng, tạo cho Việt Nam trở thành một điểm sáng về y tế dự phòng ở khu

vực và thế giới như là thanh toán bại liệt, đẩy lùi dịch hạch, loại trừ uốn ván sơ

sinh là nơi đầu tiên khống chế thành công bệnh SARS, cúm A/H5N1…

Với sự kết hợp giữa hoạt động trong phòng thí nghiệm và ngoài cộng đồng,

Viện đã thực hiện nhiều đề tài cấp nhà nước, cấp bộ, nhiều đề tài hợp tác quốc tế

và đã đưa vào ứng dụng Trong hội chợ khoa học công nghệ do Bộ Khoa học Công

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

nghệ và Ủy ban Nhân dân Tp Hồ Chí Minh tổ chức, Viện đã nhận được cúp vàng

hội chợ TechMart

Viện Pasteur Tp HCM còn là một đơn vị y tế dự phòng đầu tiên của cả nước

đưa tư duy kinh tế tri thức vào hoạt động thường xuyên của Viện bằng việc thực

hiện dịch vụ sinh y học kỹ thuật với gần 300 xét nghiệm các loại cho người, thực

phẩm, nước, sản phẩm công nghiệp Hàng ngày có khoảng 500 – 1000 lượt người

đến xét nghiệm các loại Hoạt động sản xuất vắc xin, sinh phẩm bắt đầu được đầu

tư, tăng cường phát triển, ngoài việc sản xuất hàng triệu liều vắc xin BCG phục vụ

chương trình Tiêm chủng mở rộng cho trẻ em, Viện còn sản xuất các loại vắc xin

và sinh phẩm chẩn đoán sốt xuất huyết, viêm não, lepto, các bệnh đường ruột, phát

hiện a-fetoprotein…

Viện luôn chú trọng đến các hợp tác quốc tế đa phương Viện là thành viên

của hệ thống các viện Pasteur trên thế giới và là ủy viên Hội đồng quản lý các viện

Pasteur trên thế giới Ngoài ra Viện còn hợp tác chặt chẽ với các viện nghiên cứu,

trường đại học của Mỹ (CDC, NIH, NAMRU…), Nhật (Đại học Nagasaki, Đại học

Tokyo, Viện quốc gia về các bệnh nhiễm trùng, NIID), với Úc (tổ chức AFAP, Đại

học Quensland,…),… và các nước láng giềng: Trung Quốc, Lào, Campuchia,…

Viện đã được Bộ Y tế phê duyệt quy hoạch phát triển Viện từ nay đến năm

2010 và định hướng đến 2020 Đó là cơ sở để Viện phát triển thành một Viện

nghiên cứu sâu về y học dự phòng, trung tâm đào tạo thực hành về y học dự phòng

và một trung tâm sản xuất vắc xin, sinh phẩm đạt trình độ khu vực và hội nhập

quốc tế, đồng thời vẫn đảm bảo là cơ quan đầu mối chỉ đạo tuyến và giám sát

phòng chống dịch cho khu vực phía Nam

Cơ cấu bộ máy tổ chức lãnh đạo.

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

MỞ ĐẦU Đặt vấn đề

Sơ đồ 1: Cơ cấu bộ máy tổ chức Viện Pasteur TP HCM.

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Nước là nguồn tài nguyên quý báu và hết sức thiết yếu đối với sự sống trên

trái đất Thực tiễn chỉ ra rằng quốc gia nào quan tâm đến công tác bảo vệ môi

trường, trong đó có việc khai thác, sử dụng hợp lý nguồn nước, thường xuyên bảo

đảm cho nguồn nước trong sạch, thì hạn chế được nhiều dịch bệnh, chất lượng

cuộc sống được nâng lên Vì vậy ở nước ta, một mặt khai thác nguồn nước sản

xuất, xây dựng, nhưng mặt khác cần coi trong việc bảo đảm nguồn nước sinh hoạt

sạch Nhà nước có chiến lược phát triển bền vững nguồn nước, nhưng mỗi tổ chức

cá nhân trong cộng đồng cần nâng cao ý thức sử dụng hợp lý và bảo vệ, giữ gìn sự

trong sạch của nguồn nước sinh hoạt, hạn chế tình trạng ô nhiễm nước, nhiễm bẩn

không đáng có Việc kiểm soát chất lượng nước ngày càng được quan tâm nhiều

hơn và là yêu cầu cần thiết để bảo vệ sức khỏe con người

Để đánh giá chất lượng nước theo chỉ tiêu vi sinh, sinh viên tiến hành thực

hiện đề tài thực tập tốt nghiệp “ Phân lập và định danh một số vi sinh vật trong

nước uống và nước sinh hoạt” Với đề tài này, tôi mong muốn sẽ phản ánh và đánh

giá một phần thực trạng chất lượng nước về mặt vi sinh học

Mục tiêu

Mục tiêu chung: Đánh giá tình hình nhiễm khuẩn của mẫu nước

Mục tiêu cụ thể:

- Phát hiện và đếm Coliforms và Escherichia coli (Phương pháp màng lọc)

- Phát hiện và đếm Pseudomonas aeruginosa (Phương pháp màng lọc)

- Phát hiện và đếm khuẩn đường ruột - Liên cầu phân (Phương pháp màng

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Theo tổ chức Y tế thế giới, thì hiện nay đến 80% bệnh tật ở các quốc gia đang phát

triển có liên quan đến nguồn nước và môi trường Và tại Việt Nam, mỗi năm có

đến 9.000 trường hợp tử vong, 200.000 người mắc bệnh ung thư mà có nguyên

nhân chính bắt nguồn từ ô nhiễm nguồn nước

Việc nguồn nước gặp vấn đề không chỉ gây khó khăn, bất tiện trong sinh

hoạt hàng ngày cho người dân mà đằng sau đó còn có những hậu quả vô cùng

nghiêm trọng đến chính sức khoẻ người tiêu dùng

Bên cạnh đó, việc nguồn nước bị nhiễm khuẩn là nguyên nhân và điều kiện

thuận lợi bùng lên các dịch bệnh vô cùng nghiêm trọng, tiêu chảy, bại liệt, giun

sán, viêm não, đau mắt hột, nấm,

Hệ thống nước mặt Việt Nam với hơn 2.360 con sông, suối dài hơn 10km và

hàng nghìn hồ, ao Nguồn nước này là nơi cư trú và nguồn sống của các loài động,

thực vật và hàng triệu người Tuy nhiên, những nguồn nước này đang bị suy thoái

và phá hủy nghiêm trọng do khai thác quá mức và bị ô nhiễm với mức độ khác

nhau Thậm chí nhiều con sông, đoạn sông, ao, hồ đang “chết” Lý do vì sao chắc

bạn đã biết, với tình trạng đô thị hóa chóng mặt như hiện nay, cùng với khối lượng

khổng lồ những chất thải, rác thải , nước thải đi vào môi trường Các loại nước thải

sinh hoạt, nước thải bệnh viện, nước thải công nghiệp khi vào môi trường mà

không qua xử lý sẽ tàn phá nghiêm trọng môi trường, ảnh hướng trực tiếp tới cuộc

sống của chính con người Một số khác thì hệ thống xử lý nước thải chưa tốt, hiệu

xuất không cao, không thường xuyên bảo trì hệ thống xử lý nước thải … cũng là

nguyên nhân,

Mức độ ô nhiễm nước đang ngày càng gia tăng do không kiểm soát nguồn

gây ô nhiễm hiệu quả Tình trạng này đang gây ra những ảnh hưởng đến sức khỏe

của người, làm tăng nguy cơ ung thư, sảy thai và dị tật bẩm sinh, dẫn đến suy giảm

nòi giống Tại một số địa phương của Việt Nam, khi nghiên cứu các trường hợp

ung thư, viêm nhiễm ở phụ nữ, đã thấy 40 – 50% là do từ sử dụng nguồn nước ô

nhiễm

Thống kê và đánh giá của Bộ Y tế và Bộ Tài Nguyên môi trường trung bình

mỗi năm ở Việt Nam có khoảng 9.000 người tử vong vì nguồn nước và điều kiện

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

trong những nguyên nhân chính là sử dụng nguồn nước ô nhiễm [Bộ Y Tế và Bộ

Tài Nguyên Môi Trường]

1.2 Tổng quan về chỉ tiêu vi khuẩn trong kiểm nghiệm nước

1.2.1 Coliforms

Giới thiệu:

Coliforms là trực khuẩn hình que, Gram âm (-), không sinh bào tử, kỵ khí tùy

nghi Có khả năng phát triển ở nhiệt độ rất rộng -20C đến 500C, pH trong khoảng

4.4-9 Sinh hơi do lên men lactose ở 370C trong (25-48h)

Hình 1: Coliforms Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người và động

vật Coliforms được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị: số lượng hiện diện của chúng

trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉ thị khả năng

hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác

Đặc điểm sinh hóa:

Coliforms có khả năng lên men sinh hơi trong môi trường xanh BGBL.

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi

trong môi trường canh EC

1.2.2 Escherichia coli

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Giới thiệu

Escherichia coli (thường được viết tắt là E.coli) hay còn được gọi là vi khuẩn

đại tràng Chúng là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột

của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú) Vi khuẩn này cần thiết

trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột Sự có mặt

của E coli trong nước là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân

Hình 2: Escherichia coli

E coli thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh

vật chỉ điểm cho các nghiên cứu về ô nhiễm nguồn nước ăn uống và sinh hoạt Có

nhiều loại E coli, nhưng phần lớn chúng có thể nói là vô hại Tuy nhiên, một số E.

coli có thể gây tiêu chảy, và loại phổ biến nhất trong nhóm E coli có hại này là E.

coli O157:H7.

Đặc điểm sinh hóa

E.coli lên men sinh hơi lactose glucose, manitol, galactose, không sinh hơi

đường maltose, lên men không đều saccharose, không lên men dextrin, glycogen

E.coli không sinh H2S, không tan chảy gelatin, không phân hủy đạm, hoàn

nguyên nitrate thành nitrite

Phân biệt E.coli với các vi khuẩn đường ruột khác thông qua thử nghiệm

IMViC:++ , phản ứng Indol dương tính (+), phản ứng MR dương tính (+), phản

ứng Voges - Proskauer âm tính (-) và Citrate âm tính (-)

1.2.3 Pseudomonas aeruginosa

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Pseudomonas aeruginosa là vi khuẩn Gram âm, mảnh, thẳng hoặc hơi cong,

hai đầu tròn, kích thước 0,5-1x1,5-3µm, di động bởi một lông ở một đầu, không

sinh nha bào, có pili ở cực

Hình 3: Pseudomonas aeruginosa

Dễ dàng mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, điều kiện hiếu khí

tuyệt đối Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 370C, có thể phát triển ở nhiệt độ (5-40)0C,

pH thích hợp 7,2-7,5 nhưng phát triển được ở pH 4,5-9,0

Đặc điểm sinh hóa

Tính chất đặc trưng của Pseudomonas aeruginosa là sinh sắc tố và chất thơm.

Có khả năng tiết ra nhiều loại sắc tố, 2 loại chính:

- Pyocyanin: có màu xanh lá cây, tan trong nước và cloroform, khuếch tán ra

môi trường làm môi trường màu xanh

- Pyoverdin: loại sắc tố huỳnh quang, tan trong nước nhưng không tan trong

cloroform, phát màu xanh khi chiếu tia cực tím

Sử dụng một số loại đường bằng hình thức oxy hóa như: glucose, mannitol,

arabinose, galactose, fructose

Phản ứng (+) oxydase, di dộng, citrate cimmons, acetamide

Phản ứng (-) indol, urease(-/+), H2S, ONPG, LDC, ODC

1.2.4 Streptococcus faecal (Liên cầu phân)

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Giới thiệu

Streptococcus faecal là những cầu khuẩn bắt màu gram dương, đường kính

khoảng (0,6-0,8)µm, xếp liên tiếp với nhau thành từng chuỗi, dài ngắn khác nhau

và có thể đứng với nhau thành từng đôi hoặc từng đám Liên cầu phân có lông,

không di động, không sinh nha bào và một số loài có vỏ

Hình 4: Streptococcus faecal (liên cầu phân)

Liên cầu phân hiếu khí kỵ khí tùy nghi và thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy

có nhiều chất dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường,… Vi khuẩn phát triển tốt

hơn ở điều kiện kỵ khí môi trường có thêm (5-10)% CO2 Nhiệt độ nuôi cấy thích

hợp là 370C, một số phát triển được ở (10-40)0C như liên cầu đường ruột

Đặc điểm sinh hóa

Liên cầu phân không có enzyme catalase, không có các cytochrome nên thử

nghiệm oxidase âm tính

Liên cầu phân không bị phân giải bởi muối mật, tức là:

- Thử nghiệm optochin âm tính

- Thử nghiệm ly giải bởi muối mật âm tính

Ngoài ra, chúng còn có khả năng sinh acid từ mannitol và sucrose, nhưng không

lên men được sorbose và arabinose, có khả năng chuyển hóa một số acid amin

thành dạng pyruvate và phân giải được arginine

1.2.5 Vi khuẩn kỵ khí khử sunphit – Clostridia

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Clostridia là các vi sinh vật kỵ khí có khả năng hình thành các bào tử, khử

sunphit, nó thuộc họ Bacillaceae và giống Clostridia.

Hình 5: Vi khuẩn kỵ khí khử sunphit – Clostridia

Trực khuẩn thằng dài từ (4-8) pm, hai đầu tròn, không có vỏ, có lông và di

động chậm Nha bào của trực khuẩn trứng

Kỵ khí tuyệt đối, nhiệt độ thích hợp từ (24-33)0C với pH 7, sự phát triển tốt

nhất khi có CO2 Trong môi trường lỏng, trực khuẩn phát triển mạnh, sinh H2S,

sinh hơi, có mùi khó chịu, trong thạch sâu, khuẩn lạc nhỏ thường làm nứt thạch

Đặc điểm sinh hóa

Trực khuẩn làm hóa lỏng nhanh gelatin, đông và tiêu sữa chậm Không sinh

indol nhưng sinh H2S và NH3 Lên men sinh acid và hơi đối với adonitol, dextrin,

galactose, glyserol, lactose, levulose, maltose và salixin, gây tan máu hoàn toàn

1.3 Một số thử nghiệm sinh hóa và thử nghiệm đặc trưng

1.3.1 Thử nghiệm oxidase

Phát hiện khả năng sinh enzyme cytochrom oxidase của vi khuẩn Hệ thống

cytochrom có ở vi khuẩn hiếu khí, hiếu kỵ khí tùy nghi Hệ thống này hoạt động

như chất liên kết trong quá trình hô hấp, vận chuyển H+ → O2 tạo thành nước Phản

ứng sử dụng thuốc thử tetramethyl p-phenylenediamine dihydrochloride

Cơ sở sinh hóa:

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

1.3.2 Thử nghiệm indol

Vi khuẩn có enzyme trytophanase có khả năng thủy phân acid amin

trytophan sinh indol, acid pyruvic và NH3+ Indol sinh ra kết hợp với nhóm (CHO)

của p-dimethylaminobenzaldehyd có trong thuốc thử Kovac’s hình thành nên phức

hợp màu đỏ

Cơ sở sinh hóa:

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Thời gian, địa điểm thực hiện

Thực hiện từ 1/8/2017 đến 1/9/2017 tại phòng Vi sinh thực phẩm – nước,

Khoa Xét nghiệm sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP HCM

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Mẫu nước uống và mẫu nước sinh hoạt do khách hàng mang đến kiểm nghiệm tại

Viện Pasteur TP HCM từ 1/8/2017-1/9/2017

Mẫu nước được phân thành 2 loại nước chính là nước uống và sinh hoạt:

- Nước uống: Các loại nước đóng chai, nước uống trực tiếp đã qua xử lý

( nước uống tại trường học, bệnh viện, công ty, xưởng,…)

- Nước sinh hoạt: Theo QCVN của Bộ Y Tế chia làm 3 loại:

ST

T

2 Nước sinh hoạt ( Nước giếng đã qua

- Thiết bị lọc nước - Kẹp

- Bình ủ kỵ khí - Đĩa petri

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Kết quả phân tích được đánh giá đạt hay không đạt tiêu chuẩn vi sinh theo

Quy chuẩn Việt Nam: QCVN 6-1:2010/BYT đối với mẫu nước uống; QCVN

01:2009/BYT và QCVN 02:2009/BYT đối với mẫu nước sinh hoạt

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu được lấy vào trong các dụng cụ lấy mẫu, không được lấy đầy chai mà

phải lấy chừa một khoảng không trong chai chứa mẫu để đảm bảo mẫu được trộn

đều bằng cách lắc trước khi phân tích Mẫu được lấy phải đại diện cho nước được

thử nghiệm, phải sử dụng các các biện pháp vô trùng để tránh các trường hợp mẫu

bị nhiễm từ bên ngoài hay nhiễm chéo giữa các mẫu với nhau Trong quá trình lấy

mẫu, giữ chặt chai cho đến khi nước đầy chai, giữ các nút hay nắp chai không được

nhiễm trong quá trình lấy mẫu Sau khi lấy đầy mẫu phải đậy miệng chai ngay

Nếu có thể, phân tích các chỉ tiêu ngay sau khi lấy mẫu Nếu mẫu không thể

phân tích ngay trong vòng 1 giờ sau khi lấy mẫu, phải bảo quản trong các thùng đá

trước khi vận chuyển đến các phòng thí nghiệm Nhiệt độ bảo quản là dưới 40C và

thời gian vận chuyển là không quá 6 giờ

2.2.2 Phương pháp thử nghiệm vi sinh vật

2.2.2.1 Phát hiện và đếm Coliforms- Phương pháp màng lọc

Áp dụng theo TCVN 6187-1:2009, ISO 9308-1:2000

Nguyên tắc

Lọc một lượng mẫu thử qua màng lọc để giữ lại các vi khuẩn, đặt màng lọc

trên môi trường nuôi cấy thạch lactose chọn lọc Nuôi cấy màng lọc trong (24-48)

giờ ở 370C để phát hiện Coliforms Đếm những khuẩn lạc đặc trưng trên màng.

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Thử khẳng định sinh hóa để xác định Coliforms.

Môi trường nuôi cấy:

- Môi trường phân lập: Lactose TTC + Natri heptadecylsunphat

- Thạch dinh dưỡng (GO)

- Thuốc thử: Giấy thử oxidase dùng cho phép thử oxidase

Cách tiến hành:

- Lọc 100 ml mẫu nước sinh hoạt ( hoặc 250 ml cho nước uống ) Đặt màng

lọc lên môi trường thạch Lactose TTC+Natri heptadecylsunphat, đảm bảo

không có không khí ở phía dưới

- Ủ (36±2)0C trong (18-24)h Kiểm tra các khuẩn lạc đặc trưng – khuẩn lạc có

màu vàng, da cam hoặc đỏ gạch Đếm tất cả số khuẩn lạc này

- Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyền sang môi trường thạch dinh dưỡng

(GO) ủ 36 ± 20C/(18-24)h để phục hồi lại các đặc tính của vi khuẩn bị ức chế

hay suy giảm khi nuôi cấy ở môi trường phân lập Dùng que cấy lấy một

phần khuẩn lạc vi khuẩn lên giấy thử oxidase Màu xanh đậm xuất hiện

trong 30s là phản ứng dương tính Nếu oxidase âm tính thì kết luận mẫu xét

nghiệm có Coliforms

Sơ đồ

Lọc lượng mẫu thử qua màng lọc (0,45µm)(250ml đối với nước uống; 100ml đối với nước sinh hoạt)

Rồi đặt màng lọc lên đĩa thạch

Lactose TTC+Natri Heptadecylsunphit

Ủ (36±2) 0 C/(18-24)h

Ủ tiếp (36±2) 0 C/(18-24)h

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Đếm các khuẩn lạc đặc trưng (Màu vàng, da cam hoặc đỏ gạch)Chọn khuẩn lạc điển hình, mỗi khuẩn lạc cấy sang môi trường xác định

Thạch dinh dưỡng

Môi trường Lactose TTC + Natri heptadecylsunphat có Natri heptadecyl

sunphat là chất ức chế các vi khuẩn gram dương, đồng thời vi khuẩn sử dụng

lactose trong môi trường là chất dinh dưỡng cho quá trình lên men tạo acid làm

giảm pH môi trường Bomothymol blue là chất chỉ thị màu làm môi trường chuyển

sang màu vàng hoặc tạo vòng màu vàng xung quanh khuẩn lạc khi pH<6 Nếu

trong mẫu có lượng vi khuẩn Coliforms đủ nhiều, chúng có thể làm đổi màu môi

trường, môi trường khi đó sẽ chuyển sang màu vàng

Tính kết quả:

Ủ (36±2) 0 C/(18-24)h

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

C=NxAxVs BxVtxFTrong đó:

- C là tổng số vi khuẩn được xác định

- N là số vi khuẩn đặc trưng trên màng

- A là số vi khuẩn được khẳng định dương tính

- B là số vi khuẩn được thử khẳng định

- Vt là thể tích mẫu được lọc

- Vs là thể tích chuẩn để tính kết quả (100ml hoặc 250ml)

- F là hệ số pha loãng

2.2.2.2 Phát hiện và đếm Escherichia coli – phương pháp màng lọc

Áp dụng theo TCVN 6187-1:2009, ISO 9308-1:2000

Nguyên tắc:

Lọc một lượng mẫu thử qua màng lọc để giữ lại các vi khuẩn, đặt màng lọc

trên môi trường nuôi cấy thạch lactose chọn lọc Nuôi cấy màng lọc trong (24-48)

giờ ở 440C để phát hiện E.coli Đếm những khuẩn lạc đặc trưng trên màng.

Những khuẩn lạc trên màng thử nghiệm oxydase, indol và β-glucuronidase Khẳng

định E.coli.

Môi trường nuôi cấy:

- Môi trường phân lập: Lactose TTC + Natri heptadecylsunphat

- Môi trường khẳng định: Canh trypton (môi trường để kiểm tra sự sinh indol)

- Thuốc thử: Thuốc thử Kovac’s để thử indol, giấy thử oxidase dùng trong

phép thử oxidase

Cách tiến hành:

- Lọc 100ml mẫu nước sinh hoạt (hoặc 250ml cho nước uống) Đặt màng lọc

lên môi trường thạch Lactose TTC+Natri heptadecylsunphat, đảm bảo không

có không khí ở phía dưới

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

- Ủ (44 ± 0,5)0C trong (18-24)h Kiểm tra các khuẩn lạc đặc trưng – khuẩn lạc

có màu vàng, da cam và đỏ gạch Các khuẩn lạc có màu vàng, lồi, bóng, rìa

trơn là các khuẩn lạc E.coli nghi ngờ Đếm tất cả số khuẩn lạc này.

- Kéo dài thời gian ủ đến (44±4)h có thể cho độ nhạy của phép thử cao hơn và

nhất là với những đĩa không hiện rõ các khuẩn lạc điển hình sau 24h

- Chọn 5 khuẩn lạc nghi ngờ cấy chuyển sang môi trường thạch dinh dưỡng

(GO) và canh trypton, ủ (44±0,5)0C/(18-24)h

- Dùng que cấy lấy một phần khuẩn lạc vi khuẩn lên giấy thử oxidase Màu

xanh đậm xuất hiện trong 30s là phản ứng dương tính Đồng thời tiến hành

thử phản ứng indol bằng cách nhỏ thuốc thử Kovac’s vào canh trypton và

quan sát có vòng màu đỏ xuất hiện (dương tính)

- Những khuẩn lạc cho kết quả thử oxidase (-) và indol (+) được cấy khẳng

định sang môi trường TBX và ủ ở (44 ± 0,5) 0C/(18 - 24)h Kết quả thử

nghiệm β-glucuronidase dương tính khi có sự xuất hiện của khuẩn lạc màu

xanh Khi đó kết luận mãu có sự hiện diện của E.coli.

Rồi đặt màng lọc lên đĩa thạch

Lactose TTC+Natri Heptadecylsunphit

Đếm các khuẩn lạc đặc trưng(Màu vàng, da cam hoặc đỏ gạch)Chọn khuẩn lạc điển hình, mỗi khuẩn lạc cấy sang môi trường xác định

Nước Tryptophan (Sinh Indol) Thạch dinh dưỡng (Thử Oxydase)

Thử Oxydase (-) Indol (+) TBX (Thử β-glucuronidase)

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

- Vai trò của môi trường thạch Lactose TTC+Natri heptadecylsunphat trong

quy trình phát hiện và đếm E.coli tương tự trong quy trình đếm và phát hiện

Coliforms Môi trường có Natri heptadecylsunphat là chất ức chế các vi

khuẩn Gram dương, đồng thời vi khuẩn sử dụng lactose trong môi trường là

chất dinh dưỡng cho quá trình lên men tạo acid làm giảm pH môi trường

Bomothymol blue là chất chỉ thị màu làm môi trường chuyển sang màu vàng

hoặc tạo vòng màu vàng xung quanh khuẩn lạc khi pH<6

- Trong môi trường tryptophan, vi khuẩn sinh enzyme tryptophanase phân giải

tryptophan tạo indol, indol phản ứng với p-dymethylaminobenzaldehyde có

trong thuốc thử Kovac’s tạo phức quinon màu đỏ (+)

- Môi trường TBX có pepton làm chất dinh dưỡng cho vi sinh vật, muối mật

ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gram dương Cơ chất

5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide có trong môi trường sẽ bị phân giải bởi

enzyme β-glucuronidase E.coli tiết ra tạo khuẩn lạc màu xanh.

Tính kết quả:

C=NxAxVs BxVtxFTrong đó:

- C là tổng số vi khuẩn được xác định

- N là số vi khuẩn đặc trưng trên màng

- A là số vi khuẩn được khẳng định dương tính

- B là số vi khuẩn được thử khẳng định

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Áp dụng theo ISO 16266:2006 (E)

Nguyên tắc:

Lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua một màng lọc có kích thước lỗ

(0,45µm) thích hợp để giữ lại các vi khuẩn Màng lọc được đặt trong môi trường

chọn lọc và được ủ trong các điều kiện đã qui định đối với môi trường

Sau khi ủ, đếm số khuẩn lạc P aeruginosa giả định trên màng lọc Các khuẩn lạc

tạo sắc tố pyocyanin có màu xanh da trời hoặc màu xanh lá cây được khẳng định là

P.aeruginosa, nhưng các khuẩn lạc phát huỳnh quang hoặc có màu nâu đỏ cần

phép thử khẳng định

Môi trường nuôi cấy:

- Môi trường phân lập: Thạch Pseudomonas/ thạch CN

- Môi trường khẳng định:

+ Môi trường King’s B

+ Canh thang Acetamide

+ Thạch dinh dưỡng

- Thuốc thử:

+ Thuốc thử Oxidase

+ Thuốc thử Nessler

Cách tiến hành:

- Lọc 250ml mẫu nước qua một màng lọc 0,45µm Đặt mỗi màng lên đĩa

thạch CN, bảo đảm không có bọt khí ở dưới màng

- Ủ đĩa petri ở (36±2)0C trong (44±4)h Kiểm tra sự phát triển của khuẩn lạc

trên màng lọc sau (22±2)h và (44±4)h

- Đếm tất cả các khuẩn lạc: tạo màu xanh/xanh lục (pyocyanin) khẳng định

Pseudomonas aeruginosa.

- Trong trường hợp khuẩn lạc không tạo pyocyanin, kiểm tra màng dưới bức

xạ UV ( có 2 trường hợp: khuẩn lạc không tạo sắc tố pyocyanin nhưng phát

huỳnh quang, khuẩn lạc có màu nâu đỏ nhưng không phát huỳnh quang)

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Cần chú ý tránh kéo dài thời gian chiếu UV vì các khuẩn lạc có thể bị chết

và không phát triển được trên môi trường khẳng định

- Đếm tất cả các khuẩn lạc: không tạo pyocyanin mà phát huỳnh quang là

Pseudomonas aeruginosa giả định và khẳng định nhận dạng của chúng bằng

cách sử dụng môi trường Acetamide broth Cấy khuẩn lạc phát huỳnh quang

vào ống nghiệm canh Acetamide và ủ ở (36±2)0C/(22±2)h

- Đếm tất cả các khuẩn lạc: có màu nâu đỏ mà không phát huỳnh quang

là Pseudomonas aeruginosa giả định và dùng phép thử phản ứng của

oxidaza, môi trường Acetamide broth, và môi trường King’s B để khẳng

định nhận dạng chúng

+ Thạch dinh dưỡng để thử Oxidase: dùng que cấy lấy khuẩn lạc chấm lên giấy

test oxydase → giấy chuyển sang màu xanh tím ( dương tính )

+ Canh Acetamide để thử khả năng sinh NH 3: nhỏ thuốc thử Nessler, môi

trường chuyển từ màu vàng đến nâu đỏ (dương tính)

+ King’s B để thử khả năng tạo sắc tố pyocyanin: khuẩn lạc phát huỳnh quang

dưới đèn UV

→ Khẳng định có sự hiện diện của Pseudomonas aeruginosa.

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Lọc lượng mẫu thử qua màng lọc (0,45µm)(Có thể thay đổi tùy theo loại nước)Rồi đặt màng lọc lên đĩa thạch

Thạch CN

Khuẩn lạc tạo màu xanh da trời/

màu xanh lá cây (pyocyanin)

Canh thang Acetrimide King’s B

Kiểm tra dưới đèn UV

Khuẩn lạc không tạo màu xanh

Khuẩn lạc không tạo sắc tố pyocyanin phát huỳnh quang

Khuẩn lạc màu nâu

đỏ không phát huỳnh quang

Khẳng định

P aeruginosa

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

- Môi trường thạch CN là môi trường chọn lọc chứa Potassium sulphate

(K2SO4), cùng với Magnesium chloride (MgCl2) kích thích sự sản sinh sắc tố

pyocianin tạo màu xanh

- Môi trường King’s B có các thành phần như K2HPO4 và MgSO 4 sẽ kích

thích sự sản sinh sắc tố fluorescein phát huỳnh quang dưới tia UV

- Trong môi trường canh thang Acetamide, P.aeruginosa có khả năng khử

amin các acetamide giải phóng amoniac nhờ vào hoạt động của enzyme

acrylamidase và được phát hiện thông qua việc sử dụng thuốc thử Nessler

Thuốc thử Nessler chính là K2HgI4 trong dung dịch kiềm, phản ứng với

amoniac tạo thành phức kết tủa HgO.Hg(NH2)I có màu từ vàng đến nâu tùy

thuộc vào hàm lượng amoniac có trong môi trường

Tính kết quả

C=P+F(nf cf)+R ( cr

nr)V

Trong đó:

- P là số khuẩn lạc có màu xanh da trời/màu xanh lá cây, tất cả được đếm

- F là số khuẩn lạc phát huỳnh quang

- R là số khuẩn lạc có màu nâu đỏ

- nf là số khuẩn lạc phát huỳnh quang được kiểm tra khả năng sinh amoniac

- cf là số khuẩn lạc phát huỳnh quang sinh amoniac (dương tính)

- nr là số khuẩn lạc màu nâu đỏ được kiểm tra các phản ứng sinh amoniac, thử

oxidase, phát huỳnh quang trên King’s B

- cr là số khuẩn lạc màu nâu đỏ cho kết quả dương tính trong các phản ứng:

sinh amoniac, thử oxidase, phát huỳnh quang trên King’s B

- V là thể tích của mẫu được phân tích (250ml)

- C là tổng số vi khuẩn được khẳng định

2.2.2.4 Phát hiện và đếm khuẩn đường ruột ( Liên cầu phân – Streptococcus

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Áp dụng TCVN 6189-2:2009; ISO 7899-2:2000

Nguyên tắc:

Đếm liên cầu phân dựa trên việc lọc một thể tích xác định của mẫu nước qua

một màng lọc có kích thước lỗ (0,45µm) thích hợp để giữa lại các vi khuẩn

Màng lọc được đặt vào môi trường đặc chọn lọc Slantz&Bartley Sau khi

nuôi cấy, tất cả các khuẩn lạc đã mọc sẽ cho màu đỏ, màu hồng từ trung tâm hoặc

toàn bộ khuẩn lạc, tất cả các khuẩn lạc được đếm là liên cầu phân giả định

Môi trường khẳng định, thạch- Mật Asculin- Nitrua, được nuôi trong 48 giờ

ở nhiệt độ 440C Liên cầu phân phát triển tạo chất màu nâu tới đen và khuếch tán

trong môi trường

Môi trường nuôi cấy:

- Môi trường phân lập: Slantz & Bartley

- Môi trường khẳng định: Thạch-Mật Aesculin-Azid (BEA)

Cách tiến hành:

Lọc 250ml mẫu nước uống qua màng lọc 0,45µm Đặt màng lọc trong môi

trường thạch Slantz & Bartley ủ (36±2)0C/(44±4)h Sau khi nuôi cấy, tất cả các

khuẩn lạc đã mọc cho màu đỏ, màu hồng từ trung tâm hay toàn bộ khuẩn lạc được

đếm là liên cầu phân giả định

Dùng kẹp chuyển giấy lọc có khuẩn lạc điểm hình chuyển sang môi trường

thạch mật BEA, ủ ở (44±0,5)0C/2h

Đếm tất cả khuẩn lạc có màu từ nâu đến đen hoặc môi trường bao quanh có

màu nâu hay đen như là loại cho phản ứng dương tính Khẳng định có sự hiện diện

của S fecalis.

Sơ đồ:

Lọc lượng mẫu thử nhất định (250ml)

qua màng lọc (0,45µm)

Báo cáo thực tập tốt nghiệp

Rồi đặt màng lọc lên đĩa thạch

SLANTZ & BARTLEY

Đếm khuẩn lạc màu nâu đỏ hoặc màu hồng

từ trung tâm hoặc toàn bộ khuẩn lạc và chuyển màng lọc sang môi trường Thạch –

Mật Aesculin – Azid (BEA)

Xuất hiện khuẩn lạc

có màu từ nâu đến đen ở môi trường xung quanh

Khuẩn đường ruột

(Liên Cầu Phân)

Sơ đồ 5: Phát hiện và đếm khuẩn lạc liên cầu phân - Streptococcus fealis

Ghi chú:

- Môi trường Slanetz & Bartley có NaN3 là chất ức chế vi khuẩn gram âm Vi

khuẩn khử thuốc nhuộm 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) không

màu thành formazan màu đỏ, khuẩn lạc có màu nâu đỏ hoặc hồng

Ủ (36±2) 0 C/(44±4)h

Ủ (44±0,5) 0 C/2 giờ