Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào e coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cyp264b1 để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

v nĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC ---TRẦN THỊ MAI NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERP

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ht t p : / / www lrc.tnu e du v n

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI

TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA MỘT SỐ

HỢP CHẤT SESQUITERPENE

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ht t p : / / www lrc.tnu e du v n

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ HỢP DỰA

TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60420201

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÝ THỊ BÍCH THỦY

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ht t p : / / www lrc.tnu e du v n

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây là do tôi và nhómcộng sự nghiên cứu tại phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học –Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 5 năm

2014 đến tháng 5 năm 2015

Thái Nguyên, ngày… tháng … năm 201…

Học viên

Trần Thị Mai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ht t p : / / www lrc.tnu e du v n

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN Đoàn Hữu Thanh và các cô chú, anh chị

cán bộ phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoahọc và Công Nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều

ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo trong

nhà trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Viện Côngnghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi cũng xin cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia

(NAFOSTED) đã cung cấp kinh phí để chúng tôi thực hiện nghiên cứu này trong đềtài mã số 106-NN.02-2013.57

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè nhữngngười đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập vàthực hiện luận văn này

Bằng tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày… tháng … năm 201…

Học viên

Trần Thị Mai

NMR Nuclear Magnetic Resonance

gel electrophoresis

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ht t p : / / www lrc.tnu e du v n

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC V DANH MỤC CÁC HÌNH VII DANH MỤC CÁC BẢNG IX MỞ ĐẦU

1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cytochrome P450 3

1.1.1 Định nghĩa và phân loại 3

1.1.2 Cấu trúc của cytochrome P450 5

1.1.3 Cơ chế xúc tác của cytochrome P450 8

1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450 8

1.2 Nghiên cứu về CYP264B1 10

1.3 Hợp chất sesquiterpene 13

1.3.1 Định nghĩa và nguồn gốc 13

1.3.2 Phân loại sesquiterpene 13

1.3.3 Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene 15

1.4 Hệ xúc tác tế bào E coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450 16

1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene trên thế giới và ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2 1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Vật liệu 20

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 21

2.1.3 Hóa chất 22

2.1.4 Dung dịch và đệm 22

2.1.5 Môi trường 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ht t p : / / www lrc.tnu e du v n 2.2.1 Nuôi cấy E.coli 24 2.2.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ht t p : / / www lrc.tnu e du v n

nhiệt 24

2.2.3 Kiểm tra sự có mặt của gene CYP264B1, AdR và Adx 25

2.2.4 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene 27

2.2.5 Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone

30 2.2.6 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ưu

30 2.2.7 Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

32 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Nhân dòng plasmid pETC4AA và kiểm tra sự có mặt của gene mã hóa CYP264B1, AdR và Adx 34

3.2 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene 35

3.2.1 Khả năng biểu hiện gene CYP264B1 35

3.2.2 Khả năng biểu hiện của Adx 36

3.3 Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào C43DE3/CYP264B1-AdR-Adx 38

3.4 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ưu 39

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lên khả năng chuyển hóa cơ chất 39

3.4.2 Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên khả năng chuyển hóa cơ chất

41 3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa cơ chất

42 3.4.4 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng chuyển hóa cơ chất

44 3.4.5 Lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa

45 3.5 Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

47 3.5.1 Kết quả chuyển hóa longipinene 48

3.5.2 Kết quả chuyển hóa isolongifolene 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ht t p : / / www lrc.tnu e du v n

3.5.3 Tinh sạch và nhận dạng sản phẩm chuyển hóa

51KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 60

DANH MỤC CÁC HÌNH

1.2

Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome

P450

5

1.5

Sắp xếp của gene mã hóa CYP264B1 và terpene cyclase

GeoA trên cụm 2 gene của myxobacterium Sorangium

Phân tích khả năng biểu hiện Adx với kháng thể đặc hiệu

bằng kỹ thuật Western blot

3.10 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongifolene 503.11

Sắc ký đồ sản phẩm chuyển hóa longipinene (a) và cấu

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1 Danh sách thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm 212.2 Danh sách các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm 22

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Sesquiterpene là nhóm hợp chất terpene phổ biến ở thực vật, có công

dược học, tính chất hương liệu hoặc là chất trung gian để tổng hợp các hợp chất cógiá trị [11] Tuy nhiên, trong tự nhiên các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpenethường tồn tại với hàm lượng rất nhỏ so với tiền chất sesquiterpene của chúng ViệtNam là một quốc gia có hệ thực vật phong phú và đa dạng nên việc khai thácnguồn sesquiterpenes từ cây cỏ trong nước có ý nghĩa rất thiết thực

Để tạo ra những dẫn xuất oxy hóa có giá trị, phản ứng oxy hóa chọn lọc bằngcon đường hóa học thường đòi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, chi phí cao vàtạo ra nhiều chất thải độc hại ảnh hưởng đến môi trường Ngược lại, các chất xúctác sinh học, đặc biệt là enzyme cytochrome P450 (CYP/P450) có thể thực hiệnphản ứng này ở điều kiện nhẹ nhàng [47] Tuy nhiên, để thực hiện chức năng xúctác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thôngqua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện

tử, gọi là các redox partner [13] Để khắc phục điều này, xu hướng nghiên cứu gầnđây về P450 là tạo ra hệ xúc tác tế bào từ vi sinh vật tái tổ hợp mang đồng thờigene mã hóa P450 và các redox partner của nó Giải pháp này có lợi thế là có thểtận dụng nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ, các enzyme thực hiện chứcnăng chuyển hóa cơ chất trong môi trường tự nhiên nên bền vững và không đòi hỏiquá trình tinh sạch tốn k m

Trong nghiên cứu trước, CYP264B1 - một enzyme cytochrome P450 có nguồn

gốc từ vi khuẩn myxobacteria Sorangium cellulosum Soce56 đã được phát hiện có

khả năng chuyển hóa nhiều hợp chất sesquiterpenes Hệ thống vận chuyển điện

tử cho enzyme này cũng đã được xác định, bao gồm NADPH và 2 protein vậnchuyển điện tử là AdR (Adrenodoxin reductase) và Adx (Adrenodoxin) Đặc biệt,CYP264B1 có khả năng hydroxyl hoá chọn lọc một số hợp chất (nootkatone và / -ionone) ở vị trí mà cho đến nay rất khó thực hiện được bởi các quá trình chuyển

hóa sinh học khác Các dẫn xuất này đều có tính chất thú vị hơn so với các chất banđầu

như tăng hoạt tính kìm hãm sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư (dẫnxuất của nootkatone), hay có thể sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợpcarotenoids (dẫn xuất của / -ionone) [26] Vì vậy, CYP264B1 có tiềm năng rấtlớn trong việc chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene thành các dẫn xuất có đặctính sinh học mới.

Nhằm mục đích xây dựng hệ xúc tác tế bào E coli tái tổ hợp để chuyển hóa

các hợp chất sesquiterpene, nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh hóa thực vật Viện Công nghệ sinh học đã thiết kế vector tái tổ hợp chứa gene mã hóa choCYP264B1 và 2 redox partner của nó, được điều khiển bởi promoter T7 Trên cơ sở

-đó, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng h c c c i i h

ên h h ng ch n h h ch i n

2 Mục têu của đề tài

- Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống

CYP264B1

- Ứng dụng hệ xúc tác này để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu sử dụng h xúc tác t chuy n h cơ ch t

+ Nhân dòng plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene bằng kỹ thuật PCRcolony và giải trình tự gene

+ Kiểm tra khả năng biểu hiện gene bằng phương pháp đo nồng độCYP264B1 và kiểm tra khả năng biểu hiện Adx bằng phương pháp western blot.+ Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone bằng phương pháp HPLC

+ Tối ưu điều kiện chuyển hóa nootkatone

- Tách chi t và nhận dạng sản phẩm chuy n hóa

+ Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene và phân tích sản phẩmchuyển hóa bằng kỹ thuật GCMS

+ Tinh sạch sản phẩm chuyển hóa bằng sắc ký cột selicagel

+ Nhận dạng cấu trúc sản phẩm bằng kỹ thuật NMR.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cytochrome P450

1.1.1 Định nghĩ v hân ại

* Định nghĩ

Cytochrome P450 (thường viết tắt là CYP hay P450) thuộc họ enzymemonooxygenease có nhóm heme - thiolate trong trung tâm hoạt động, hấp thụbước sóng cực đại rất điển hình ở 450 nm khi chúng ở trạng thái khử và tạo phứchợp với CO (cacbon monooxit) [13]

P450 có mặt trong hầu hết các sinh vật, từ eukaryote đến prokaryote, thậmchí cả ở virus [20] P450 xúc tác phản ứng oxy hóa khử nhiều loại hợp chất nội sinh

và ngoại sinh Số lượng P450 cao nhất ở thực vật, ở người có 57 enzyme P450

[13] E.coli không có enzyme P450 nào.

Tên gọi của các enzyme cytochrome P450 được quy định bởi chữ CYP, theosau nó là một số thứ tự Ả Rập chỉ họ gen, tiếp đó là một chữ cái viết hoa chỉ phân

họ và một số Ả Rập chỉ một gen riêng biệt Ví dụ: CYP106A2, CYP264B1,CYP260A1

Hình 1.1 Cách gọi tên enzyme P450

* Phân loại

Hiện nay đã có hơn 11000 P450 khác nhau đã được tách dòng từ độngvật, thực vật, vi nấm, vi khuẩn và những động vật bậc cao khác [33]

Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồnđiện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặcmột vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner Do P450 rất đa dạngtrong tự nhiên nên các redox partner của chúng cũng rất phong phú.

Dựa vào các kiểu redox protein tham gia vào chu i vận chuyển điện tử,Hannemann và cộng sự đã phân loại P450 thành 10 nhóm khác nhau

- Nhóm 1: bao gồm hầu hết hệ thống P450 ở vi khuẩn và ở ty thể của tế

bào nhân chuẩn Hệ thống thuộc nhóm này gồm 3 protein riêng biệt: một enzymereductase (FdR) chứa nhóm ngoại FAD có vai trò chuyển điện tử từ NAD(P)H chothành viên thứ 2 là một ferredoxin (Fdx) chứa cụm sắt - lưu huỳnh, đến lượtferredoxin lại chuyển điện tử đến enzyme cytochrome P450 để enzyme nàythực hiện chức năng xúc tác

- Nhóm 2: bao gồm một enzyme cytochrome P450 và một cytochrome P450

reductase (CPR) phụ thuộc NADPH của mạng lưới nội chất CPR là một enzymechứa 2 nhóm ngoại FAD và FMN có vai trò chuyển điện tử từ NADPH tới P450

- Nhóm 3: mới chỉ tìm thấy duy nhất ở vi khuẩn Citrobacter braakii Hệ thống

này bao gồm một Flavodoxin (Fldx) chứa nhóm ngoại FMN và một enzymecytochrome cytochrome mới là P450cin

- Nhóm 4: được tìm thấy ở vi khuẩn cổ Sulfolobus solfataricus, bao gồm một

Fdx và một enzyme có tên gọi 2-oxoacid ferredoxin oxidoreductase

- Nhóm 5: bao gồm một enzyme reductase phụ thuộc NAD(P)H và một enzyme

cytochrome P450 dung hợp với ferredoxin (Fdx-P450)

- Nhóm 6: bao gồm một enzyme flavoprotein reductase phụ thuộc NAD(P)H và

một protein dung hợp flavodoxin-P450 (Fldx-P450)

- Nhóm 7: bao gồm một enzyme phthalate oxygenase dung hợp với P450

(PFOR-P450)

- Nhóm 8: bao gồm 1 enzyme P450 dung hợp với protein vận chuyển điện tử

tương tự ở tế bào nhân chuẩn là diflavin reductase (CPR-P450)

- Nhóm 9: bao gồm một enzyme nitric oxide reductase (P450nor) sử dụng

NADH làm chất cho điện tử P450nor xúc tác phản ứng phụ thuộc vào và không

phụ thuộc vào các protein vận chuyển điện tử khác.

- Nhóm 10: bao gồm các P450 không phụ thuộc vào protein vận chuyển điện

tử như: allene oxide synthase, fatty acid hydroperoxide lyase, divinyl ethersynthase, prostacyclin synthase và thromboxane synthase [13]

Hình 1.2 Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome P450 ở

microsome (A),mitochondria (B), vi khuẩn (C) và (D)

Trong đó:

CPR: NADPH-P450 reductase FDX: ferredoxin

FDR:NAD(P)H-ferredoxin ADX: Adrenodoxin

reductase RH: Cơ chất

ADR: NADPH - ROH: Sản phẩm

adrenodoxin reductase

1.1.2 c củ cytochrome P450

P450 là một họ enzyme gồm nhiều isozyme có khối lượng phân tử khoảng

45-60 kDa, trong phân tử có chứa một nhân heme ở dạng Fe protoporphyrin IX và một chu i polypeptide

Cấu trúc bậc I của P450 cho thấy trình tự amino acid trong phân tử của m ichu i isozyme thường có thể khác nhau rất nhiều (có trường hợp khác đến 70%),hơn nữa đoạn amino acid đầu N thường không giống nhau giữa các P450 Sự khácbiệt về trình tự amino acid của các isozyme trong cùng loài dao động từ 30% đếnhơn 95% M i isozyme được mã hóa bởi một gene riêng biệt và sự khác biệt vềtrình tự amino acid trong phân tử là do trình tự của các nucleotide trong gene

mã hóa protein quy định [6]

Đến nay người ta đã biết được 1200 cấu trúc bậc I của P450 Các trình tự

amino acid của các P450 cũng như trình tự của các nucleotide mã hóa chúng được

lưu trong GenBank Trung tâm hoạt động của P450 chứa Fe protoporphyrin IX, liênkết bởi lực hydro kỵ nước Vị trí thứ 5 của vòng porphyrin liên kết với aminothiolthường của gốc cysteine Vị trí thứ 6 gắn với một phân tử nước có khả năng traođổi Mặc dù có sự khác biệt về trình tự amino acid nhưng một số cấu trúc được bảotoàn ở tất cả các isozyme, ví dụ như gốc cysteine gắn với heme bao giờ cũng ở gầnđầu carboxyl.

enzyme P450 đầu tiên được mô tả cấu trúc bậc I một cách hoàn chỉnh bởi Poulos và

tam giác với đường kính cực đại khoảng 60 Ǻ

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam

Vùng liên kết hem được mô tả bằng màu đen

Một nguyên tử sắt hình cầu ở trung tâm của

heme

Cấu trúc bậc II của P450 cũng đã được nghiên cứu, kết quả cho thấy cả chu i-helix và phiến β đều tồn tại trong phân tử enzyme này Sự khác biệt trong cấutrúc không gian của trung tâm hoạt động của P450 là nguyên nhân cho sự đặc hiệu

cơ chất của các isozyme

Vào đầu những năm 1990, người ta đã xác định được cấu trúc của một sốenyme cytochrome P450 gồm có P450BM3 (CYP102), P450terp (CYP108), P450eryF(CYP107) và P450nor (CYP55) [6] Cho đến nay những chuyên gia nghiên cứu cấutrúc tinh thể đã xác định được cấu trúc của một số P450 của vi khuẩn

Mặc dù sự tương đồng về trình tự của các enzyme P450 thuộc cùng một phân

họ chỉ dưới 20%, nhưng các enzyme này lại có sự tương đồng lớn về phương thứccuộn xoắn và hình học Nhìn chung, có khoảng 13 chu i xoắn và 4 phiến β trongmột phân tử protein P450 Cấu trúc trung tâm bảo thủ của P450 được tạo nên bởi

1 bó gồm 4 chu i xoắn xung quanh nhân heme (3 chu i xoắn song song là D, L, helix và một chu i xoắn ngược là E-helix) Nhóm heme định vị giữa chu i I-helix xa

I-và một chu i L-helix gần I-và liên kết với phân tử cystein liền kề tạo thành một vùngkhoanh chứa đoạn trình tự amino acid bảo thủ của P450 là FxxGx(H/R)xCxG Phân

tử cystein liền kề là tuyệt đối bảo thủ và nằm trên liên kết “thứ năm” của nguyên

tử sắt Đặc biệt, phân tử cysterin tạo thành 2 liên kết hydrogen với các bộ nhómamide gần kề [9] Chu i xoắn dài I-helix tạo thành 1 bức tường giữa khoang chứanhóm hem và trình tự amino acid tín hiệu (A/G)-Gx(E/D)T tập trung ở giữa cácchu i xoắn Chu i xoắn I-helix cũng chứa phân tử threonine có tính bảo thủ caođịnh vị ở trung tâm hoạt động và được tin rằng có tham gia vào quá trình xúc tác[13], [29], [17] Dựa vào trình tự amino acid của các thành viên của nhóm CYP2 và

chất Các vùng protein này được xem là rất linh hoạt và chuyển động theo sự liênkết với cơ chất trước khi sẵn sàng cho phản ứng xúc tác [36], [9]

Hình 1.4 Cấu tạo nhân heme của enzyme cytochrome P450

Trong đó: nguyên tử sắt (III) protoporphyrin-IXliên kết với một phối tử cysteine ở gần

1.1.3 ơ ch c c củ cytochrome P450

Có hơn 20 phản ứng khác nhau được xúc tác bởi các enzyme P450 như phảnứng hydroxyl hóa liên kết C-H, N-dealkyl hóa, N-hydroxyl hóa, O-dealkyl hóa, S-oxy hóa và epoxy hóa Trong đó, phản ứng phổ biến nhất được thực hiện bởi cácenzyme này là phản ứng monooxy hóa: một nguyên tử oxy được chuyển vào cơchất (RH) và nguyên tử oxy còn lại được khử thành nước [28]

RH + O 2 + NAD(P)H + H + → ROH + H 2 O + NAD(P) +

cho phản ứng Cơ chế của phản ứng này được Coon và cộng sự đã tìm ra và mô tảchi tiết vào năm 1979 [29]

Cơ chất muốn chuyển hóa được cần phải gắn vào enzyme P450 (ở dạng oxihóa) tạo thành một h n hợp enzyme - cơ chất Sau đó một điện tử từpyridine nucleotide dạng khử được chuyển đến hợp chất này nhờ phân tửcytochrome P450 – reductase Phức hệ enzyme cơ chất bị khử này lại gắn với một

phân tử oxi được hoạt hóa sau khi một phân tử nước tách ra thì nguyên tử oxithứ hai được gắn vào cơ chất Sau đó là sự tái lập lại cytochrome P450 dạng oxihóa

1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450

Hiện nay, các enzyme P450 được sử dụng trong các nghiên cứu về nhiềulĩnh vực: hóa sinh, y dược học, sinh lý học, hóa học nội bào, công nghệ sinhhọc và môi trường

Bộ gen của con người có 57 gen mã hóa cho P450, trong đó hơn một phần

tư các enzyme này tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất xenobiotics,P450 còn tham gia vào quá trình tổng hợp sterol, vitamin, acid béo vàeicosanoids Chính vì vậy, P450 có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệpdược phẩm đặc biệt là trong nghiên cứu chế tạo thuốc chữa bệnh Ngoài

ra, P450 còn xúc tác cho phản ứng hydroxyl hóa các hydrocarbon béo, các

hợp chất có khối lượng phân tử lớn hơn và phức tạp hơn như hydrocarbonspolyaromatic (PAHs); các hợp chất halogen như polychlorinated biphenyls

(PCBs), chất thải từ thuốc nổ quân sự và thuốc diệt cỏ [45] Nhiều loại P450còn được nghiên cứu phục vụ cho các ứng dụng xử lý sinh học.

Do khả năng thực hiện nhiều phản ứng khác nhau trên nhiều nhóm cơchất khác nhau, đặc biệt là khả năng oxy hóa chọn lọc ở các vị trí allyl, liên kết đôihoặc thậm chí cả ở liên kết C-H không được hoạt hóa và rất khó thực hiện bởixúc tác hóa học, nên cytochrome P450 có tiềm năng ứng dụng to lớn trong việcchuyển hóa các hợp chất tự nhiên thành các sản phẩm có giá trị [7] Ngoài ra, P450

có thể ứng dụng trong xử lý môi trường để chuyển hóa các chất độc hại thànhcác chất thân thiện hơn hay ứng dụng để tạo các biosensor nhằm phát hiện sự cómặt của một chất nào đó trong mẫu nghiên cứu Trên thực tế, P450 được ứng dụngnhiều nhất để sản xuất thuốc, vitamin, hương liệu, nước hoa hay thuốc trừ sâu.Chẳng hạn, P450 đã được ứng dụng thành công ở qui mô công nghiệp trong việcsản xuất pravastatin - thuốc có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol, dùng đểđiều trị cho những bệnh nhân bị xơ vữa động mạnh Pravastatin được chuyểnhóa từ compactin bởi CYP105A3 thông qua sự hydroxyl hóa carbon ở vị trí 6β.Một ví dụ khác nữa là ứng dụng của P450 trong sản xuất cortisol từ 11-deoxycortisol bởi P450 qua phản ứng hydroxyl hóa ở vị trí 11-β, đã được sảnxuất bởi công ty Schering AG (Germany) ở qui mô công nghiệp [39]

Trong chuyển hóa các hợp chất terpene, sự thêm vào bộ khung carbon mộthoặc một vài nhóm hydroxyl làm thay đổi đáng kể các tính chất như khả năng hòatan, hoạt tính sinh học hay tăng đặc tính mùi của hợp chất đó Chẳng hạn một

(þ)-a-pinene thành verbenol hoặc h n hợp của (þ)-verbenone và verbenol Verbenol và verbenone là các pheromones hoạt động chống lại rấtnhiều loại bọ cánh cứng do đó có thể sử dụng trong chế phẩm sinh học phục

(þ)-cis-vụ nông nghiệp Sinh tổng hợp sesquiterpene albaflavenone có hoạt tính khángsinh được thực hiện bởi (CYP170A1) qua hai bước oxy hóa allyl hợp chất epi-isozizaene [51] Sự hydroxyl hóa chọn lọc „regio‟ valencene ở vị trí allyl C2 bởiCYP109B1 tạo ra nootkatone, một hợp chất có giá trị trong công nghiệp thực phẩm

và hương liệu.

1.2 Nghiên cứu về CYP264B1

CYP264B1 là một enzyme cytochrome P450 có trọng lượng phân tử xấp xỉ 47

kDa, có nguồn gốc từ vi khuẩn myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56.

Năm 2007, trình tự toàn bộ genome của vi khuẩn này được công bố Thông tintrình tự đã chỉ ra rằng, vi khuẩn này có tất cả 21 P450s Sau đó, gene mã hóa chotoàn bộ các enzyme P450 này, trong đó có CYP264B1, đã được tách dòng bởi nhómnghiên cứu của GS Rita Bernhardt trường đại học Tổng hợp Saarland

Trên genome của myxobacterium Soce, gene mã hóa cho CYP264B1 nằm ở vịtrí locus sce8551 ngay tiếp sau gene mã hóa cho một enzyme terpene cyclaseGeoA ở vị trí locus sce8552 (NCBI) Khoảng cách giữa 2 gene này rất gần, chỉ là

63 bp Khoảng cách này gợi ý rằng 2 gene CYP264B1 và terpene cyclase GeoAdường như nằm trên cùng 1 operon và cùng nhau tham gia vào quá trình tổng hợpterpenoid trong So ce65 [16]

Hình 1.5 Sắp xếp của gene mã hóa CYP264B1 và terpene cyclase GeoA trên cụm

2 gene của myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56

 Hệ thống chuyển điện tử cho CYP264B1

Hầu hết các P450 đều cần điện tử từ NADPH hoặc NADH và nhận điện tửgián tiếp thông qua các đối tác vận chuyển điện tử (gọi là các redox partner) –thường có bản chất protein [13] Các đối tác vận chuyển điện tử có thể cùng nguồngốc (autologous electron transfer) với enzyme P450 hoặc khác nguồn gốc

(heterologous electron transfer ) với enzyme P450 Trong nghiên cứu trước, khả

năng chuyển điện tử cho CYP264B1 bởi các redox protein có cùng nguồn gốcmyxobacterium So ce56 (bao gồm 8 ferredoxin (Fdx) và 2 feredoxin reductase(FdR) đã được thử nghiệm [10] Kết quả là đã tìm ra 2 cặp redox protein có thểchuyển điện tử cho CYP264B1 là Fdx2-FdR_B và Fdx8-FdR_B Tuy nhiên, khi thử khảnăng chuyển điện tử của các redox protein có nguồn gốc từ tuyến thượng thận bò

là Adx (Adrenal ferredoxin) và AdR (Adrenodoxin reductase) cho CYP264B1, TS LýThị Bích Thủy và cộng sự đã nhận thấy rằng khả năng vận chuyển điện tử của cặpprotein này hiệu quả hơn nhiều Chính vì vậy, Adx và AdR đã được sử dụng làmđối tác vận chuyển điện tử cho CYP264B1 [26]

Adx có 128 amino acid, thuộc nhóm protein ferredoxin chứa nhóm sắt-lưu

huỳnh (2Fe-2S), có khả năng vận chuyển điện tử từ NADPH tới enzyme cytochromP450 và thông qua một enzyme ferredoxin reductase Trong nghiên cứu vềCYP264B1, Adx được sử dụng ở dạng đã được cắt ngắn bớt (truncated protein) 3amino acid ở đầu N và 19 amino acid đầu C, là dạng bền vững hơn nhưng vẫn giữnguyên hoạt tính so với dạng nguyên bản

Hình 1.6 Cấu trúc của nhóm sắt-lưu huỳnh [33]

AdR có 492 amino acid, là một enzyme thuộc nhóm mitochondrial

flavoprotein, có coenzyme là FAD Enzyme này là protein chuyển điện tử đầu tiêntrong hệ thống mitochrondrial P450 Nhóm FAD coenzyme nhận 2 electron từNADPH và chuyển cùng một lúc hai điện tử này cho protein vận chuyển điện tửtiếp theo là Adx [34]

Hình 1.7 Cấu trúc nhóm FAD [34]

M t s ặc tính thú vị của CYP264B1:

Do gene mã hóa cho CYP264B1 nằm thành cụm với enzyme terpene cyclasenên enzyme này đã được dự đoán là có khả năng chuyển hóa một nhóm hợpchất terpenoid nào đó Sau khi sàng lọc một số nhóm terpenoid khác nhau như:monoterpene, sesquiterpene, diterpene, steroid, ketone và aroma, các tác giả đãxác định được CYP264B1 có khả năng hydroxy hóa nhiều hợp chất thuộcnhóm sesquiterpene và sesquiterpenoid (như nootkatone, valencene,-longipinene, clovene, humulene, isolongifolene-9-one) và norisoprenoids (như-ionone và β- ionone) Hơn nữa, CYP264B1 có khả năng hydroxyl hóa cơ chất rấtchọn lọc chỉ ở một vị trí Cụ thể, khi chuyển hóa ionone (β và -ionone), CYP264B1

3-OH-ionone có thể sử dụng làm chất trung gian để tổng hợp các carotenoid nhưastaxanthin, zeaxanthin hay axit deoxyabscisic [24] Khi chuyển hóa nootkatone,

sản phẩm được xác định là làm tăng khả năng kìm hãm một số dòng tế bào ung thư

so với cơ chất ban đầu của nó là nootkatone.Trong tổng hợp hóa học, phản ứng oxihóa chọn lọc rất quan trọng do loại bỏ được khả năng hình thành các sản phẩmphụ Đặc biệt, CYP264B1 có khả năng hydroxyl hóa ở vị trí mới Cụ thể, sản phẩm

hydroxyl hóa của CYP264B1

là 3-OH-β-ionone và 13-OH-nootkatone chưa được quan sát thấy ở bất kỳ hệ thống chuyển hóa sinh học nào [26].

Hình 1.8 Một số sesquiterpene phổ biến

1.3.2 hân ại sesquiterpene

Mặc dù cơ sở hóa học của sequiterpene đã có từ thế kỷ 19, nhưngnhững nghiên cứu hóa học về sesquiterpene chỉ được thực sự thúc đẩy với tốc

độ nhanh chóng bởi những công trình đầu tiên của Wallach, Semmler và nhất làcủa Ruzicka song song với sự phát triển của các phương pháp hiện đại để táchchiết, tinh chế, xác định cấu trúc và tổng hợp [4]

Có khoảng 1000 sequiterpene thuộc khoảng 100 khung Với số lượng chiếm

khoảng một phần tư tổng số các chất terpenoid tự nhiên mà ta biết ngày nay,các

sesquiterpene là nhóm chất terpenoid lớn nhất Ở đây ta chỉ đề cập đến những khung chính hoặc những loại chất lý thú về phương diện thực tiễn [15].

 Sesquiterpene đa vòng

Một hợp chất rất lý thú, phổ biến khá rộng và biến hóa bất thường làcaryophyllen Người ta đặt tên cho nó là chất „tung hứng‟ vì phải tốn rất nhiềucông sức để xác định được cấu trúc của nó Isocaryophyllen chiếm 19,22 % trongtinh dầu ngải cứu [51] Ngoài ra, nhóm này còn có rất nhiều hợp chất quan trọngnhư: isolongifolene, cadinene, selinene…

Hình 1.11 Một số sesquiterpene đa vòng

1.3.3 Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene

Sesquiterpene là những hợp chất thuộc nhóm terpene chứa 3 đơn vị

dầu thực vật được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau như thuốc, gia vị,nước hoa và hương liệu [11], [8] Ở thực vật, các sesquiterpene bảo vệ thực vậtkhỏi sự tấn công của côn trùng, vi khuẩn, nấm, giúp chữa lành vết thương, tạohương thơm để hấp dẫn côn trùng đến thụ phấn [31] Rất nhiều cây cỏ là thảodược chứa sesquiterpene đã được khai thác từ lâu trong y học như tinhdầu gừng (sesquiterpene: zingiberene), tinh dầu Rái (sesquiterpene: germacrene

D, caryophyllene) [1] Một số

sesquiterpene có tác dụng kháng ung thư, kháng khuẩn, chống viêm, chống oxi hóanhư: β-elemene (từ cây R.zedoariae), β-caryophyllene (có mặt trong tinh dầunhiều cây thực vật bậc cao) [23], [22].

Các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene thường có hoạt tính sinh dượchọc bao gồm kháng sinh, kháng nấm, kháng virus, ung thư Trong số các hợpchất sesquiterpene, albaflavenone và punctantins B có tính kháng sinh mạnh phổrộng, solavetivone và rufuslactone có khả năng kháng nấm, zerumbone vàcostunolide có khả năng ức chế sự phát triển của virus, zerumbone có khả năng ứcchế sự phát triển của khối u và tế bào ung thư [51], [44], [25], [50] Nhiều dẫn xuấtcủa sesquiterpene như norpatchoulenol, nootkatone được sử dụng làm hươngliệu, công nghiệp thực phẩm và nước hoa Do tương đồng về cấu trúc của bộkhung carbon, các dẫn xuất hydroxyl hóa của sesquiterpene có nhiều giá trị vìchúng có thể được dùng làm chất trung gian để tổng hợp các dẫn xuất hoặc hợpchất mới có giá trị cao, chẳng hạn như sesquiterpene lactone Costunolide đượctổng hợp từ gemarcrene A thông qua dẫn xuất hydroxyl hóa hợp chất này.Costunolide lại là chất trung gian để tổng hợp parthenolide, một chất được sửdụng rộng rãi để chữa chứng đau nửa đầu và chống viêm khớp [23]

1.4 Hệ xúc tác tế bào E coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450

Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồnđiện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặcmột vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner

Như vậy, hầu hết các P450 không thể độc lập thực hiện chức năng xúc tác màcần phải đi cùng với một chu i vận chuyển điện tử Đây chính hạn chế lớn nhất cảntrở việc ứng dụng P450 trong thực tế Thứ nhất, NAD(P)H là những chất có giáthành cao; thứ hai, việc chuyển hóa cơ chất cần đồng thời cả P450 và các redoxpartner của nó vì vậy việc ứng dụng ở qui mô lớn là không khả thi Mặc dù các nhànghiên cứu đã cố gắng tìm kiếm giải pháp thay thế NAD(P)H bằng nguồn điện tử