Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào e coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cyp264b1 để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC --- TRẦN THỊ MAI NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ HỢP DỰ

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-

TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI

TÁI TỔ HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA

MỘT SỐ HỢP CHẤT SESQUITERPENE

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

-

TRẦN THỊ MAI

NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG HỆ XÚC TÁC TẾ BÀO E.COLI TÁI TỔ

HỢP DỰA TRÊN HỆ THỐNG CYP264B1 ĐỂ CHUYỂN HÓA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các kết quả nghiên cứu dưới đây là do tôi và nhóm cộng sự nghiên cứu tại phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam thực hiện từ tháng 5 năm

2014 đến tháng 5 năm 2015

Thái Nguyên, ngày… tháng … năm 201…

Học viên

Trần Thị Mai

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn CN Đoàn Hữu Thanh và các cô chú, anh

chị cán bộ phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo

trong nhà trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên, các thầy cô trong Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi cũng xin cảm ơn Quỹ phát triển khoa học và công nghệ quốc gia

(NAFOSTED) đã cung cấp kinh phí để chúng tôi thực hiện nghiên cứu này trong đề tài mã số 106-NN.02-2013.57

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Bằng tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày… tháng … năm 201…

Học viên

Trần Thị Mai

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích

GCMS Gas chromatography mass spectometry

HPLC High pressure liquid chromatography

IPTG Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

KppG Kali phosphate glycerol

NMR Nuclear Magnetic Resonance

NADH Nicotinamide adenine dinucleotide

NADPH Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate PCB Polychlorinate biphenyl

PCR Polymerase chain reaction

SDS – PAGE Sodium dodecyl sulphate – polyacrylamide

gel electrophoresis

TLC Thin layer chromatography

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC V DANH MỤC CÁC HÌNH VII DANH MỤC CÁC BẢNG IX MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cytochrome P450 3

1.1.1 Định nghĩa và phân loại 3

1.1.2 Cấu trúc của cytochrome P450 5

1.1.3 Cơ chế xúc tác của cytochrome P450 8

1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450 8

1.2 Nghiên cứu về CYP264B1 10

1.3 Hợp chất sesquiterpene 13

1.3.1 Định nghĩa và nguồn gốc 13

1.3.2 Phân loại sesquiterpene 13

1.3.3 Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene 15

1.4 Hệ xúc tác tế bào E coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450 16

1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene trên thế giới và ở Việt Nam 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2 1 Vật liệu nghiên cứu 20

2.1.1 Vật liệu 20

2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 21

2.1.3 Hóa chất 22

2.1.4 Dung dịch và đệm 22

2.1.5 Môi trường 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 24

2.2.1 Nuôi cấy E.coli 24 2.2.2 Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào E.coli bằng phương pháp sốc

nhiệt 24

2.2.3 Kiểm tra sự có mặt của gene CYP264B1, AdR và Adx 25

2.2.4 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene 27

2.2.5 Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone 30

2.2.6 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ưu 30

2.2.7 Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene 32

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Nhân dòng plasmid pETC4AA và kiểm tra sự có mặt của gene mã hóa CYP264B1, AdR và Adx 34

3.2 Kiểm tra khả năng biểu hiện gene 35

3.2.1 Khả năng biểu hiện gene CYP264B1 35

3.2.2 Khả năng biểu hiện của Adx 36

3.3 Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone của hệ xúc tác tế bào C43DE3/CYP264B1-AdR-Adx 38

3.4 Xác định điều kiện chuyển hóa nootkatone tối ưu 39

3.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường lên khả năng chuyển hóa cơ chất 39

3.4.2 Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên khả năng chuyển hóa cơ chất 41

3.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng chuyển hóa cơ chất 42

3.4.4 Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng chuyển hóa cơ chất 44

3.4.5 Lựa chọn nồng độ cơ chất thích hợp để chuyển hóa 45

3.5 Sử dụng hệ xúc tác tế bào C43DE3/pETC4AA để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene 47

3.5.1 Kết quả chuyển hóa longipinene 48

3.5.2 Kết quả chuyển hóa isolongifolene 50

3.5.3 Tinh sạch và nhận dạng sản phẩm chuyển hóa 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 54

TÀI LIỆU THAM KHẢO 55

PHỤ LỤC 60

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC HÌNH

Sắp xếp của gene mã hóa CYP264B1 và terpene cyclase

GeoA trên cụm 2 gene của myxobacterium Sorangium

3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR colony 34 3.2 Cấu trúc đa gene trên vector pETC4AA 35

3.3

Phổ hấp thụ ánh sáng trong vùng 400-500 nm của dịch chiết tế bào C43DE3/pETC4AA sau 24 giờ cảm ứng

3.10 Sắc ký đồ GCMS chuyển hóa isolongifolene 50

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.3

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Sesquiterpene là nhóm hợp chất terpene phổ biến ở thực vật, có công thức phân tử là C15H24 Các dẫn xuất oxy hóa của chúng thường có hoạt tính sinh dược học, tính chất hương liệu hoặc là chất trung gian để tổng hợp các hợp chất có giá trị [11] Tuy nhiên, trong tự nhiên các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene thường tồn tại với hàm lượng rất nhỏ so với tiền chất sesquiterpene của chúng Việt Nam là một quốc gia có hệ thực vật phong phú và đa dạng nên việc khai thác nguồn sesquiterpenes từ cây cỏ trong nước có ý nghĩa rất thiết thực

Để tạo ra những dẫn xuất oxy hóa có giá trị, phản ứng oxy hóa chọn lọc bằng con đường hóa học thường đòi hỏi điều kiện phản ứng khắc nghiệt, chi phí cao và tạo ra nhiều chất thải độc hại ảnh hưởng đến môi trường Ngược lại, các chất xúc tác sinh học, đặc biệt là enzyme cytochrome P450 (CYP/P450) có thể thực hiện phản ứng này ở điều kiện nhẹ nhàng [47] Tuy nhiên, để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner [13] Để khắc phục điều này, xu hướng nghiên cứu gần đây

về P450 là tạo ra hệ xúc tác tế bào từ vi sinh vật tái tổ hợp mang đồng thời gene mã hóa P450 và các redox partner của nó Giải pháp này có lợi thế là có thể tận dụng nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ, các enzyme thực hiện chức năng chuyển hóa cơ chất trong môi trường tự nhiên nên bền vững và không đòi hỏi quá trình tinh sạch tốn k m

Trong nghiên cứu trước, CYP264B1 - một enzyme cytochrome P450 có nguồn

gốc từ vi khuẩn myxobacteria Sorangium cellulosum Soce56 đã được phát hiện có

khả năng chuyển hóa nhiều hợp chất sesquiterpenes Hệ thống vận chuyển điện tử cho enzyme này cũng đã được xác định, bao gồm NADPH và 2 protein vận chuyển điện tử là AdR (Adrenodoxin reductase) và Adx (Adrenodoxin) Đặc biệt, CYP264B1 có khả năng hydroxyl hoá chọn lọc một số hợp chất (nootkatone và / -ionone) ở vị trí mà cho đến nay rất khó thực hiện được bởi các quá trình chuyển hóa sinh học khác Các dẫn xuất này đều có tính chất thú vị hơn so với các chất ban đầu

như tăng hoạt tính kìm hãm sự phát triển của một số dòng tế bào ung thư (dẫn xuất của nootkatone), hay có thể sử dụng làm nguyên liệu để tổng hợp carotenoids (dẫn xuất của / -ionone) [26] Vì vậy, CYP264B1 có tiềm năng rất lớn trong việc chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene thành các dẫn xuất có đặc tính sinh học mới

Nhằm mục đích xây dựng hệ xúc tác tế bào E coli tái tổ hợp để chuyển hóa

các hợp chất sesquiterpene, nhóm nghiên cứu thuộc phòng Sinh hóa thực vật - Viện Công nghệ sinh học đã thiết kế vector tái tổ hợp chứa gene mã hóa cho CYP264B1

và 2 redox partner của nó, được điều khiển bởi promoter T7 Trên cơ sở đó, chúng

tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng h c c c i i h

ên h h ng ch n h h ch i n

2 Mục tiêu của đề tài

- Nghiên cứu sử dụng hệ xúc tác tế bào E.coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống

CYP264B1

- Ứng dụng hệ xúc tác này để chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene

3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu sử dụng h xúc tác t chuy n h cơ ch t

+ Nhân dòng plasmid và kiểm tra sự có mặt của gene bằng kỹ thuật PCR colony và giải trình tự gene

+ Kiểm tra khả năng biểu hiện gene bằng phương pháp đo nồng độ CYP264B1 và kiểm tra khả năng biểu hiện Adx bằng phương pháp western blot + Kiểm tra khả năng chuyển hóa nootkatone bằng phương pháp HPLC

+ Tối ưu điều kiện chuyển hóa nootkatone

- Tách chi t và nhận dạng sản phẩm chuy n hóa

+ Chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene và phân tích sản phẩm chuyển hóa bằng kỹ thuật GCMS

+ Tinh sạch sản phẩm chuyển hóa bằng sắc ký cột selicagel

+ Nhận dạng cấu trúc sản phẩm bằng kỹ thuật NMR

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cytochrome P450

1.1.1 Định nghĩ v hân ại

* Định nghĩ

Cytochrome P450 (thường viết tắt là CYP hay P450) thuộc họ enzyme monooxygenease có nhóm heme - thiolate trong trung tâm hoạt động, hấp thụ bước sóng cực đại rất điển hình ở 450 nm khi chúng ở trạng thái khử và tạo phức hợp với

CO (cacbon monooxit) [13]

P450 có mặt trong hầu hết các sinh vật, từ eukaryote đến prokaryote, thậm chí

cả ở virus [20] P450 xúc tác phản ứng oxy hóa khử nhiều loại hợp chất nội sinh và ngoại sinh Số lượng P450 cao nhất ở thực vật, ở người có 57 enzyme P450 [13]

E.coli không có enzyme P450 nào

Tên gọi của các enzyme cytochrome P450 được quy định bởi chữ CYP, theo sau nó là một số thứ tự Ả Rập chỉ họ gen, tiếp đó là một chữ cái viết hoa chỉ phân

họ và một số Ả Rập chỉ một gen riêng biệt Ví dụ: CYP106A2, CYP264B1, CYP260A1

Hình 1.1 Cách gọi tên enzyme P450

* Phân loại

Hiện nay đã có hơn 11000 P450 khác nhau đã được tách dòng từ động vật,

Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner Do P450 rất đa dạng trong tự nhiên nên các redox partner của chúng cũng rất phong phú

Dựa vào các kiểu redox protein tham gia vào chu i vận chuyển điện tử, Hannemann và cộng sự đã phân loại P450 thành 10 nhóm khác nhau

- Nhóm 1: bao gồm hầu hết hệ thống P450 ở vi khuẩn và ở ty thể của tế bào

nhân chuẩn Hệ thống thuộc nhóm này gồm 3 protein riêng biệt: một enzyme reductase (FdR) chứa nhóm ngoại FAD có vai trò chuyển điện tử từ NAD(P)H cho thành viên thứ 2 là một ferredoxin (Fdx) chứa cụm sắt - lưu huỳnh, đến lượt ferredoxin lại chuyển điện tử đến enzyme cytochrome P450 để enzyme này thực hiện chức năng xúc tác

- Nhóm 2: bao gồm một enzyme cytochrome P450 và một cytochrome P450

reductase (CPR) phụ thuộc NADPH của mạng lưới nội chất CPR là một enzyme chứa 2 nhóm ngoại FAD và FMN có vai trò chuyển điện tử từ NADPH tới P450

- Nhóm 3: mới chỉ tìm thấy duy nhất ở vi khuẩn Citrobacter braakii Hệ thống

này bao gồm một Flavodoxin (Fldx) chứa nhóm ngoại FMN và một enzyme cytochrome cytochrome mới là P450cin

- Nhóm 4: được tìm thấy ở vi khuẩn cổ Sulfolobus solfataricus, bao gồm một

Fdx và một enzyme có tên gọi 2-oxoacid ferredoxin oxidoreductase

- Nhóm 5: bao gồm một enzyme reductase phụ thuộc NAD(P)H và một enzyme

cytochrome P450 dung hợp với ferredoxin (Fdx-P450)

- Nhóm 6: bao gồm một enzyme flavoprotein reductase phụ thuộc NAD(P)H và

một protein dung hợp flavodoxin-P450 (Fldx-P450)

- Nhóm 7: bao gồm một enzyme phthalate oxygenase dung hợp với P450

(PFOR-P450)

- Nhóm 8: bao gồm 1 enzyme P450 dung hợp với protein vận chuyển điện tử

tương tự ở tế bào nhân chuẩn là diflavin reductase (CPR-P450)

- Nhóm 9: bao gồm một enzyme nitric oxide reductase (P450nor) sử dụng

NADH làm chất cho điện tử P450nor xúc tác phản ứng phụ thuộc vào và không phụ thuộc vào các protein vận chuyển điện tử khác

- Nhóm 10: bao gồm các P450 không phụ thuộc vào protein vận chuyển điện

tử như: allene oxide synthase, fatty acid hydroperoxide lyase, divinyl ether synthase, prostacyclin synthase và thromboxane synthase [13]

Hình 1.2 Sơ đồ chu i vận chuyển điện tử của hệ thống cytochrome P450 ở

microsome (A),mitochondria (B), vi khuẩn (C) và (D)

Trong đó:

adrenodoxin reductase

1.1.2 c củ cytochrome P450

P450 là một họ enzyme gồm nhiều isozyme có khối lượng phân tử khoảng

45-60 kDa, trong phân tử có chứa một nhân heme ở dạng Fe protoporphyrin IX và một chu i polypeptide

Cấu trúc bậc I của P450 cho thấy trình tự amino acid trong phân tử của m i chu i isozyme thường có thể khác nhau rất nhiều (có trường hợp khác đến 70%), hơn nữa đoạn amino acid đầu N thường không giống nhau giữa các P450 Sự khác biệt về trình tự amino acid của các isozyme trong cùng loài dao động từ 30% đến hơn 95% M i isozyme được mã hóa bởi một gene riêng biệt và sự khác biệt về trình tự amino acid trong phân tử là do trình tự của các nucleotide trong gene mã hóa protein quy định [6]

Đến nay người ta đã biết được 1200 cấu trúc bậc I của P450 Các trình tự

lưu trong GenBank Trung tâm hoạt động của P450 chứa Fe protoporphyrin IX, liên kết bởi lực hydro kỵ nước Vị trí thứ 5 của vòng porphyrin liên kết với aminothiol thường của gốc cysteine Vị trí thứ 6 gắn với một phân tử nước có khả năng trao đổi Mặc dù có sự khác biệt về trình tự amino acid nhưng một số cấu trúc được bảo toàn ở tất cả các isozyme, ví dụ như gốc cysteine gắn với heme bao giờ cũng ở gần đầu carboxyl

Trong số những cytochrome đã được tách chiết, cytochrome P450cam là enzyme P450 đầu tiên được mô tả cấu trúc bậc I một cách hoàn chỉnh bởi Poulos và cộng sự [2] Hình dạng tổng thể của P450cam tương tự như một hình lăng trụ tam giác với đường kính cực đại khoảng 60 Ǻ

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của Cytochrome P450cam

Vùng liên kết hem được mô tả bằng màu đen

Một nguyên tử sắt hình cầu ở trung tâm của heme

Cấu trúc bậc II của P450 cũng đã được nghiên cứu, kết quả cho thấy cả chu i -helix và phiến β đều tồn tại trong phân tử enzyme này Sự khác biệt trong cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của P450 là nguyên nhân cho sự đặc hiệu cơ chất của các isozyme

Vào đầu những năm 1990, người ta đã xác định được cấu trúc của một số enyme cytochrome P450 gồm có P450BM3 (CYP102), P450terp (CYP108), P450eryF (CYP107) và P450nor (CYP55) [6] Cho đến nay những chuyên gia nghiên cứu cấu trúc tinh thể đã xác định được cấu trúc của một số P450 của vi khuẩn

Mặc dù sự tương đồng về trình tự của các enzyme P450 thuộc cùng một phân

họ chỉ dưới 20%, nhưng các enzyme này lại có sự tương đồng lớn về phương thức cuộn xoắn và hình học Nhìn chung, có khoảng 13 chu i xoắn và 4 phiến β trong một phân tử protein P450 Cấu trúc trung tâm bảo thủ của P450 được tạo nên bởi 1

bó gồm 4 chu i xoắn xung quanh nhân heme (3 chu i xoắn song song là D, L, helix và một chu i xoắn ngược là E-helix) Nhóm heme định vị giữa chu i I-helix

I-xa và một chu i L-helix gần và liên kết với phân tử cystein liền kề tạo thành một vùng khoanh chứa đoạn trình tự amino acid bảo thủ của P450 là FxxGx(H/R)xCxG Phân tử cystein liền kề là tuyệt đối bảo thủ và nằm trên liên kết “thứ năm” của nguyên tử sắt Đặc biệt, phân tử cysterin tạo thành 2 liên kết hydrogen với các bộ nhóm amide gần kề [9] Chu i xoắn dài I-helix tạo thành 1 bức tường giữa khoang chứa nhóm hem và trình tự amino acid tín hiệu (A/G)-Gx(E/D)T tập trung ở giữa các chu i xoắn Chu i xoắn I-helix cũng chứa phân tử threonine có tính bảo thủ cao định vị ở trung tâm hoạt động và được tin rằng có tham gia vào quá trình xúc tác [13], [29], [17] Dựa vào trình tự amino acid của các thành viên của nhóm CYP2 và P450cam, Gotoh và cộng sự đã cho rằng có 6 vùng tham gia vào việc nhận biết cơ chất Các vùng protein này được xem là rất linh hoạt và chuyển động theo sự liên kết với cơ chất trước khi sẵn sàng cho phản ứng xúc tác [36], [9]

Hình 1.4 Cấu tạo nhân heme của enzyme cytochrome P450

Trong đó: nguyên tử sắt (III) protoporphyrin-IX liên kết với một phối tử cysteine ở gần

1.1.3 ơ ch c c củ cytochrome P450

Có hơn 20 phản ứng khác nhau được xúc tác bởi các enzyme P450 như phản ứng hydroxyl hóa liên kết C-H, N-dealkyl hóa, N-hydroxyl hóa, O-dealkyl hóa, S-oxy hóa và epoxy hóa Trong đó, phản ứng phổ biến nhất được thực hiện bởi các enzyme này là phản ứng monooxy hóa: một nguyên tử oxy được chuyển vào cơ chất (RH) và nguyên tử oxy còn lại được khử thành nước [28]

RH + O 2 + NAD(P)H + H + → ROH + H 2 O + NAD(P) +

Ngoài phân tử oxi, hệ thống enzyme này còn cần có NAD(P)H cung cấp H2cho phản ứng Cơ chế của phản ứng này được Coon và cộng sự đã tìm ra và mô tả chi tiết vào năm 1979 [29]

Cơ chất muốn chuyển hóa được cần phải gắn vào enzyme P450 (ở dạng oxi hóa) tạo thành một h n hợp enzyme - cơ chất Sau đó một điện tử từ pyridine nucleotide dạng khử được chuyển đến hợp chất này nhờ phân tử cytochrome P450 – reductase Phức hệ enzyme cơ chất bị khử này lại gắn với một phân tử oxi và tiếp nhận điện tử thứ hai Qua sự chuyển điện tử (e-) nội phân tử, phân tử oxi được hoạt hóa sau khi một phân tử nước tách ra thì nguyên tử oxi thứ hai được gắn vào cơ chất Sau đó là sự tái lập lại cytochrome P450 dạng oxi hóa

1.1.4 Ứng dụng của cytochrome P450

Hiện nay, các enzyme P450 được sử dụng trong các nghiên cứu về nhiều lĩnh vực: hóa sinh, y dược học, sinh lý học, hóa học nội bào, công nghệ sinh học và môi trường

Bộ gen của con người có 57 gen mã hóa cho P450, trong đó hơn một phần

tư các enzyme này tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất xenobiotics, P450 còn tham gia vào quá trình tổng hợp sterol, vitamin, acid béo và eicosanoids Chính vì vậy, P450 có vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp dược phẩm đặc biệt là trong nghiên cứu chế tạo thuốc chữa bệnh Ngoài ra, P450 còn xúc tác cho phản ứng hydroxyl hóa các hydrocarbon béo, các hợp chất có khối lượng phân tử lớn hơn và phức tạp hơn như hydrocarbons polyaromatic (PAHs); các hợp chất halogen như polychlorinated biphenyls

(PCBs), chất thải từ thuốc nổ quân sự và thuốc diệt cỏ [45] Nhiều loại P450 còn được nghiên cứu phục vụ cho các ứng dụng xử lý sinh học

Do khả năng thực hiện nhiều phản ứng khác nhau trên nhiều nhóm cơ chất khác nhau, đặc biệt là khả năng oxy hóa chọn lọc ở các vị trí allyl, liên kết đôi hoặc thậm chí cả ở liên kết C-H không được hoạt hóa và rất khó thực hiện bởi xúc tác hóa học, nên cytochrome P450 có tiềm năng ứng dụng to lớn trong việc chuyển hóa các hợp chất tự nhiên thành các sản phẩm có giá trị [7] Ngoài ra, P450 có thể ứng dụng trong xử lý môi trường để chuyển hóa các chất độc hại thành các chất thân thiện hơn hay ứng dụng để tạo các biosensor nhằm phát hiện sự có mặt của một chất nào đó trong mẫu nghiên cứu Trên thực tế, P450 được ứng dụng nhiều nhất để sản xuất thuốc, vitamin, hương liệu, nước hoa hay thuốc trừ sâu Chẳng hạn, P450 đã được ứng dụng thành công ở qui mô công nghiệp trong việc sản xuất pravastatin - thuốc có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cholesterol, dùng để điều trị cho những bệnh nhân bị xơ vữa động mạnh Pravastatin được chuyển hóa từ compactin bởi CYP105A3 thông qua sự hydroxyl hóa carbon ở vị trí 6β Một ví dụ khác nữa là ứng dụng của P450 trong sản xuất cortisol từ 11-deoxycortisol bởi P450 qua phản ứng hydroxyl hóa ở vị trí 11-β, đã được sản xuất bởi công ty Schering AG (Germany) ở qui mô công nghiệp [39]

Trong chuyển hóa các hợp chất terpene, sự thêm vào bộ khung carbon một hoặc một vài nhóm hydroxyl làm thay đổi đáng kể các tính chất như khả năng hòa tan, hoạt tính sinh học hay tăng đặc tính mùi của hợp chất đó Chẳng hạn một dạng đột biến của P450cam có thể xúc tác phản ứng oxi hóa monoterpene (þ)-a-pinene thành (þ)-cis-verbenol hoặc h n hợp của (þ)-verbenone và (þ)-cis-verbenol Verbenol và verbenone là các pheromones hoạt động chống lại rất nhiều loại bọ cánh cứng do đó có thể sử dụng trong chế phẩm sinh học phục vụ nông nghiệp Sinh tổng hợp sesquiterpene albaflavenone có hoạt tính kháng sinh được thực hiện bởi (CYP170A1) qua hai bước oxy hóa allyl hợp chất epi-isozizaene [51] Sự hydroxyl hóa chọn lọc „regio‟ valencene ở vị trí allyl C2 bởi CYP109B1 tạo ra nootkatone, một hợp chất có giá trị trong công nghiệp thực phẩm và hương liệu

1.2 Nghiên cứu về CYP264B1

CYP264B1 là một enzyme cytochrome P450 có trọng lượng phân tử xấp xỉ 47

kDa, có nguồn gốc từ vi khuẩn myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56

Năm 2007, trình tự toàn bộ genome của vi khuẩn này được công bố Thông tin trình

tự đã chỉ ra rằng, vi khuẩn này có tất cả 21 P450s Sau đó, gene mã hóa cho toàn bộ các enzyme P450 này, trong đó có CYP264B1, đã được tách dòng bởi nhóm nghiên cứu của GS Rita Bernhardt trường đại học Tổng hợp Saarland

Trên genome của myxobacterium Soce, gene mã hóa cho CYP264B1 nằm ở vị trí locus sce8551 ngay tiếp sau gene mã hóa cho một enzyme terpene cyclase GeoA ở vị trí locus sce8552 (NCBI) Khoảng cách giữa 2 gene này rất gần, chỉ là

63 bp Khoảng cách này gợi ý rằng 2 gene CYP264B1 và terpene cyclase GeoA dường như nằm trên cùng 1 operon và cùng nhau tham gia vào quá trình tổng hợp terpenoid trong So ce65 [16]

Hình 1.5 Sắp xếp của gene mã hóa CYP264B1 và terpene cyclase GeoA trên cụm

2 gene của myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56

 Hệ thống chuyển điện tử cho CYP264B1

Hầu hết các P450 đều cần điện tử từ NADPH hoặc NADH và nhận điện tử gián tiếp thông qua các đối tác vận chuyển điện tử (gọi là các redox partner) – thường có bản chất protein [13] Các đối tác vận chuyển điện tử có thể cùng nguồn gốc (autologous electron transfer) với enzyme P450 hoặc khác nguồn gốc (heterologous electron transfer ) với enzyme P450 Trong nghiên cứu trước, khả

năng chuyển điện tử cho CYP264B1 bởi các redox protein có cùng nguồn gốc myxobacterium So ce56 (bao gồm 8 ferredoxin (Fdx) và 2 feredoxin reductase (FdR) đã được thử nghiệm [10] Kết quả là đã tìm ra 2 cặp redox protein có thể chuyển điện tử cho CYP264B1 là Fdx2-FdR_B và Fdx8-FdR_B Tuy nhiên, khi thử khả năng chuyển điện tử của các redox protein có nguồn gốc từ tuyến thượng thận

bò là Adx (Adrenal ferredoxin) và AdR (Adrenodoxin reductase) cho CYP264B1,

TS Lý Thị Bích Thủy và cộng sự đã nhận thấy rằng khả năng vận chuyển điện tử của cặp protein này hiệu quả hơn nhiều Chính vì vậy, Adx và AdR đã được sử dụng làm đối tác vận chuyển điện tử cho CYP264B1 [26]

Adx có 128 amino acid, thuộc nhóm protein ferredoxin chứa nhóm sắt-lưu

huỳnh (2Fe-2S), có khả năng vận chuyển điện tử từ NADPH tới enzyme cytochrom P450 và thông qua một enzyme ferredoxin reductase Trong nghiên cứu về CYP264B1, Adx được sử dụng ở dạng đã được cắt ngắn bớt (truncated protein) 3 amino acid ở đầu N và 19 amino acid đầu C, là dạng bền vững hơn nhưng vẫn giữ nguyên hoạt tính so với dạng nguyên bản

Hình 1.6 Cấu trúc của nhóm sắt-lưu huỳnh [33]

AdR có 492 amino acid, là một enzyme thuộc nhóm mitochondrial

flavoprotein, có coenzyme là FAD Enzyme này là protein chuyển điện tử đầu tiên trong hệ thống mitochrondrial P450 Nhóm FAD coenzyme nhận 2 electron từ NADPH và chuyển cùng một lúc hai điện tử này cho protein vận chuyển điện tử tiếp theo là Adx [34]

Hình 1.7 Cấu trúc nhóm FAD [34]

M t s ặc tính thú vị của CYP264B1:

Do gene mã hóa cho CYP264B1 nằm thành cụm với enzyme terpene cyclase nên enzyme này đã đƣợc dự đoán là có khả năng chuyển hóa một nhóm hợp chất terpenoid nào đó Sau khi sàng lọc một số nhóm terpenoid khác nhau nhƣ: monoterpene, sesquiterpene, diterpene, steroid, ketone và aroma, các tác giả đã xác định đƣợc CYP264B1 có khả năng hydroxy hóa nhiều hợp chất thuộc nhóm sesquiterpene và sesquiterpenoid (nhƣ nootkatone, valencene, -longipinene, clovene, humulene, isolongifolene-9-one) và norisoprenoids (nhƣ -ionone và β-

ionone) Hơn nữa, CYP264B1 có khả năng hydroxyl hóa cơ chất rất chọn lọc chỉ ở

một vị trí Cụ thể, khi chuyển hóa ionone (β và -ionone), CYP264B1 chỉ hydroxyl hóa ở vị trí là nguyên tử C3, tạo thành 3-OH-ionone Sản phẩm 3-OH-ionone có thể

sử dụng làm chất trung gian để tổng hợp các carotenoid nhƣ astaxanthin, zeaxanthin hay axit deoxyabscisic [24] Khi chuyển hóa nootkatone, CYP264B1 tác động chủ yếu tới vị trí C13 để tạo thành 13-OH-nootkatone Đây là sản phẩm đƣợc xác định là làm tăng khả năng kìm hãm một số dòng tế bào ung thƣ so với cơ chất ban đầu của

nó là nootkatone.Trong tổng hợp hóa học, phản ứng oxi hóa chọn lọc rất quan trọng

do loại bỏ đƣợc khả năng hình thành các sản phẩm phụ Đặc biệt, CYP264B1 có

khả năng hydroxyl hóa ở vị trí mới Cụ thể, sản phẩm hydroxyl hóa của CYP264B1

là 3-OH-β-ionone và 13-OH-nootkatone chưa được quan sát thấy ở bất kỳ hệ thống

chuyển hóa sinh học nào [26]

Hình 1.8 Một số sesquiterpene phổ biến

1.3.2 hân ại sesquiterpene

Mặc dù cơ sở hóa học của sequiterpene đã có từ thế kỷ 19, nhưng những nghiên cứu hóa học về sesquiterpene chỉ được thực sự thúc đẩy với tốc độ nhanh chóng bởi những công trình đầu tiên của Wallach, Semmler và nhất là của Ruzicka song song với sự phát triển của các phương pháp hiện đại để tách chiết, tinh chế, xác định cấu trúc và tổng hợp [4]

Có khoảng 1000 sequiterpene thuộc khoảng 100 khung Với số lượng chiếm

sesquiterpene là nhóm chất terpenoid lớn nhất Ở đây ta chỉ đề cập đến những khung chính hoặc những loại chất lý thú về phương diện thực tiễn [15]

 Sesquiterpene đa vòng

Một hợp chất rất lý thú, phổ biến khá rộng và biến hóa bất thường là caryophyllen Người ta đặt tên cho nó là chất „tung hứng‟ vì phải tốn rất nhiều công sức để xác định được cấu trúc của nó Isocaryophyllen chiếm 19,22 % trong tinh dầu ngải cứu [51] Ngoài ra, nhóm này còn có rất nhiều hợp chất quan trọng như: isolongifolene, cadinene, selinene…

Hình 1.11 Một số sesquiterpene đa vòng

1.3.3 Vai trò và ứng dụng của sesquiterpene

Sesquiterpene là những hợp chất thuộc nhóm terpene chứa 3 đơn vị isoprene với công thức phân tử là C15H24 Đây là nhóm hợp chất phổ biến trong tinh dầu thực vật được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau như thuốc, gia vị, nước hoa và hương liệu [11], [8] Ở thực vật, các sesquiterpene bảo vệ thực vật khỏi sự tấn công của côn trùng, vi khuẩn, nấm, giúp chữa lành vết thương, tạo hương thơm để hấp dẫn côn trùng đến thụ phấn [31] Rất nhiều cây cỏ là thảo dược chứa sesquiterpene

đã được khai thác từ lâu trong y học như tinh dầu gừng (sesquiterpene: zingiberene), tinh dầu Rái (sesquiterpene: germacrene D, caryophyllene) [1] Một số

sesquiterpene có tác dụng kháng ung thư, kháng khuẩn, chống viêm, chống oxi hóa như: β-elemene (từ cây R.zedoariae), β-caryophyllene (có mặt trong tinh dầu nhiều cây thực vật bậc cao) [23], [22]

Các dẫn xuất oxy hóa của sesquiterpene thường có hoạt tính sinh dược học bao gồm kháng sinh, kháng nấm, kháng virus, ung thư Trong số các hợp chất sesquiterpene, albaflavenone và punctantins B có tính kháng sinh mạnh phổ rộng, solavetivone và rufuslactone có khả năng kháng nấm, zerumbone và costunolide có khả năng ức chế sự phát triển của virus, zerumbone có khả năng ức chế sự phát triển của khối u và tế bào ung thư [51], [44], [25], [50] Nhiều dẫn xuất của sesquiterpene như norpatchoulenol, nootkatone được sử dụng làm hương liệu, công nghiệp thực phẩm và nước hoa Do tương đồng về cấu trúc của bộ khung carbon, các dẫn xuất hydroxyl hóa của sesquiterpene có nhiều giá trị vì chúng có thể được dùng làm chất trung gian để tổng hợp các dẫn xuất hoặc hợp chất mới có giá trị cao, chẳng hạn như sesquiterpene lactone Costunolide được tổng hợp từ gemarcrene A thông qua dẫn xuất hydroxyl hóa hợp chất này Costunolide lại là chất trung gian để tổng hợp parthenolide, một chất được sử dụng rộng rãi để chữa chứng đau nửa đầu và chống viêm khớp [23]

1.4 Hệ xúc tác tế bào E coli tái tổ hợp dựa trên hệ thống cytochrome P450

Để thực hiện chức năng xúc tác, đại đa số các enzyme P450 sử dụng nguồn điện tử từ cofactor NAD(P)H thông qua chu i vận chuyển điện tử, gồm có một hoặc một vài protein vận chuyển điện tử, gọi là các redox partner

Như vậy, hầu hết các P450 không thể độc lập thực hiện chức năng xúc tác mà cần phải đi cùng với một chu i vận chuyển điện tử Đây chính hạn chế lớn nhất cản trở việc ứng dụng P450 trong thực tế Thứ nhất, NAD(P)H là những chất có giá thành cao; thứ hai, việc chuyển hóa cơ chất cần đồng thời cả P450 và các redox partner của nó vì vậy việc ứng dụng ở qui mô lớn là không khả thi Mặc dù các nhà nghiên cứu đã cố gắng tìm kiếm giải pháp thay thế NAD(P)H bằng nguồn điện tử khác, như sử dụng peroxide H2O2 Tuy nhiên, phương pháp đó ít có ý nghĩa ứng dụng thực tế do enzyme không bền và hiệu quả truyền điện tử k m [46], [39] Cũng

chính vì sự phụ thuộc vào cofactor này của P450s mà cho đến nay ứng dụng của P450 trong công nghiệp thường được thực hiện thông qua hệ thống chuyển hóa tế bào, thường là các chủng vi sinh vật tự nhiên Chẳng hạn, việc chuyển hóa compactin thành pravastatin bởi CYP105A3 được thực hiện thông qua quá trình lên men chủng Streptomyces carbophilus hay sản xuất cortisol từ 11-deoxycortisol bởi P450lun nhờ lên men chủng Curvularia lunata [39]

Để mở rộng hơn khả năng ứng dụng của P450, sử dụng hệ xúc tác tế bào vi sinh vật tái tổ hợp biểu hiện đồng thời gene mã hóa cho P450 và các redox partner của nó, là một giải pháp thường được lựa chọn hiện nay [46] Giải pháp này có lợi thế là có thể tận dụng nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ, các enzyme thực hiện chức năng chuyển hóa cơ chất trong môi trường tự nhiên nên bền vững và không đòi hỏi quá trình tinh sạch tốn k m Trong số các vi sinh vật hay được sử dụng

trong công nghiệp, E coli là vật chủ được sử dụng nhiều nhất do chúng có thời gian

sinh trưởng ngắn, năng suất biểu hiện cao, chi phí cho sản xuất thấp và dễ dàng thao tác điều khiển

Để đồng biểu hiện, gene mã hóa P450 và các redox partner có thể đưa m i

gene này vào một vector riêng rồi biến nạp vào E coli Các vector này cần chứa

gene kháng kháng sinh khác nhau và vùng khởi đầu sao ch p tương thích với nhau

để có thể cùng tồn tại trong tế bào chủ Hannermann và công sự đã thiết kế hệ thống

chuyển hóa steroid nhờ E coli Trong nghiên cứu này, vector pACYC FHH2 mang

gene mã hóa CYP106A2 từ Bacillus megaterium ATCC 13368 được đồng biến nạp

với vector pBAR Twin chứa gene mã hóa cho AdR và Adx vào E coli JM109, sau

đó đồng biểu hiện để chuyển hóa 11 -deoxycorticosterone thành deoxycorticosterone [13]

15β-hydroxy-11-Gần đây, thay vì đưa vào các vector độc lập, người ta chỉ sử dụng một vector trong đó gene mã hóa P450 và các redox protein được sắp xếp dưới dạng cấu trúc multicistronic Ưu điểm của phương pháp này là đảm bảo tất cả các gene được đồng biểu hiện trong cùng một tế bào, giảm chi phí nghiên cứu và tạo được dòng tế bào bền vững Girhard và cộng sự đã thành công trong việc xây dựng hệ xúc tác tế bào

E coli tái tổ hợp với multicistronic vector, biểu hiện CYP109B1 và các redox

partner của nó để chuyển hóa valencene thành nootkatone Chuyển hóa camphor

thành dẫn xuất 5-exo-hydroxycamphor cũng được thực hiện nhờ tế bào E coli tái tổ

hợp chứa cấu trúc tricistronic của P450cam - putidaredoxin (Pd)-putidaredoxin

reductase (PdR) Trong một nghiên cứu khác, E.coli tái tổ hợp chứa cấu trúc

tristronic của CYP27A1- Adrenodoxin reductase - Adrenodoxin cũng được xây dựng để chuyển hóa cholesterol và vitamin D3 Nghiên cứu gần đây của Ringle và

cộng sự cũng xây dựng hệ xúc tác E coli tái tổ hợp với multicistronic vector chứa gene mã hóa CYP264A1 từ myxobacterium Sorangium cellulosum So ce56 với redox partner là Adrenodoxin và E coli reductase Hệ thống này được áp dụng

thành công để chuyển hóa 4-methyl-3-phenyl-coumarin thành phenyl-coumarin [37]

4-hydroxymethyl-3-M t s ư i m và hạn ch của h xúc tác t bào:

Ưu điểm:

- Có thể thực hiện phản ứng xúc tác ở điều kiện nhẹ nhàng trong khi các phản ứng chuyển hóa bằng con đường hóa học lại đòi hỏi điều kiện khắc nghiệt, chi phí cao và tạo ra nhiều chất thải độc hại làm ảnh hưởng đến môi trường

- Enzyme thực hiện chức năng chuyển hóa trong môi trường tự nhiên nên bền vững và không đòi hỏi quá trình tinh sạch tốn kém (tinh sạch 3 protein)

- Không cần cung cấp các cofactor từ bên ngoài cho phản ứng oxi hóa khử khử

mà sử dụng luôn nguồn cofactor nội sinh của tế bào chủ

- So với các phương pháp sử dụng enzyme cố định trên giá thể thì việc sử dụng hệ xúc tác tế bào có ý nghĩa vượt trội về độ bền vững và giá thành

- So với phương pháp hóa học thì hệ xúc tác sinh học dựa trên hệ thống P450

có nhiều khả năng tạo ra những dẫn xuất mới hơn

Hạn chế:

- Quy trình phức tạp hơn việc sử dụng enzyme xúc tác

- Xuất hiện các khả năng và sản phẩm không mong muốn do có nhiều loại enzyme khác có mặt trong hệ xúc tác [26]

1.5 Tình hình nghiên cứu ứng dụng hệ xúc tác tế bào để chuyển hóa sesquiterpene trên thế giới và ở Việt Nam

 Tình hình nghiên cứu trên th giới

Cho đến nay, ngoài CYP264B1, mới chỉ có premnaspirodiene oxygenease là một enzyme cytochrome P450 từ cây Hyoscyamus muticus được biết đến có khả năng chuyển hóa một số hợp chất sesquiterpene [44] Tuy nhiên việc sử dụng enzyme P450 có nguồn gốc vi khuẩn s có nhiều lợi thế hơn các enzyme có nguồn gốc thực vật do chúng thường có hoạt tính cao hơn và không liên kết màng [45]

CYP264B1 là loại P450 có nguồn gốc từ vi khuẩn myxobacteria Chính vì vậy,

CYP264B1 có ưu thế lớn trong việc chuyển hóa các hợp chất sesquiterpene

 Tình hình nghiên cứu tại Vi t Nam

Ở nước ta, việc chuyển hóa hợp chất sesquiterpene đã được nghiên cứu từ trước tuy nhiên các nghiên cứu này thường tập trung vào chuyển hóa bằng con đường hóa học, chưa có nghiên cứu nào sử dụng chất xúc tác sinh học mà đặc biệt

là các enzyme cytochrome P450 Nghiên cứu về P450 ở trong nước mới chỉ tập trung vào: tách chiết P450, nghiên cứu về ảnh hưởng của thuốc, chất độc hại, dịch chiết thảo dược lên hệ thống cytochrome P450 ở người và động vật thực nghiệm hay nghiên cứu về phát hiện đột biến một số gene CYP gây rối loạn chuyển hóa steroid hormone ở người [3]

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2 1 Vật liệu nghiên cứu

Vậ i

- Plasmid biểu hiện pETC4AA được cung cấp bởi phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Plasmid pETC4AA được xây dựng dựa trên vector pET17b (phụ lục I), chứa gene

mã hóa CYP264B1, gene mã hóa Adrenodoxin (Adx) và gene mã hóa Adrenodoxin

reductase (AdR)

Hình 2.1 Plasmid pET C4AA

- Chủng E.coli TOP10F‟để nhân dòng gene

- Chủng E.coli C43DE3 để biểu hiện gene từ hãng Invitrogen

- Cặp mồi sử dụng để đọc trình tự gene và PCR colony

Mồi C4-F (18nu) atatacatatgactcgac Mồi C4-R (16 nu) acaaaagcttctagt Mồi AdR-F (18 nu) atataccatgggcactca

Mồi Adx-R (18 nu) tgcagaattcttaaggta

- Các sesquiterpene: longipinene, isolongifolene và nootkatone được đặt mua từ hãng Sigma-Aldrich

- Sản phẩm chuyển hóa in vitro các sesquiterpene bởi CYP264B1 được cung

cấp bởi phòng Sinh hóa thực vật – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Kháng thể đặc hiệu của Adx được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu của GS Rita Bernhardt - Trường Đại học Tổng hợp Saarland, CHLB Đức

Thi ị hí nghi

Bảng 2.1 Danh sách thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm

Bể ổn nhiệt VS-1205CW Trung Quốc

Bốc cấy vi sinh vật Laminar LB-1234 Sartorius (Thụy Sỹ)

Cân phân tích BL150S Wealtec (Đài Loan)

Hệ thống chụp ảnh gel Dolphin-Doc CCD

CAMERA 201

Đài Loan

Hệ thống điện di đứng Biometra (Đức)

Hệ thống điện di ngang Mupid Nhật

Máy ly tâm lạnh MIKRO22 Hettich (Đức)

Máy nuôi lắc Certomat® HK Sartorius (Đức)

Máy PCR Thermocycler Personal Eppendorf (Đức)

Máy lắc ổn nhiệt ProvocellTM Esco (Mỹ)

Máy quang phổ UV2500 Labomed (Mỹ)

Nồi khử trùng ES-315 Tomy (Nhật)

8%β-mercaptoethanol; 0.1% bromphenol blue Lysis buffer 1M kali phosphate, pH 7,4; 10% glycerol; 0.1 mM

PMSF; 300 mM NaCl Đệm TBS 50 mM Tris–HCl pH 7.4; 200 mM NaCl; 0.1%

Tween 20 Đệm PBS 10 mM potassium phosphatebuffer pH 7.4; 150

mM NaCl Đệm Kpp 50mM ; pH 7,4; 4% glycerol

Dung dịch A Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8

Dung dịch APS 10% ammonium persulfate

Dung dịch B Đệm 0,5 M Tris-HCl; pH 6,8

Dung dịch C 30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide

Dung dịch D 10% SDS

Dung dịch nhuộm PAGE 0,1% (w/v) coomassie brilliant blue, 30% (v/v)

methanol, 10% (v/v) acetic acid

Dung dịch tẩy PAGE 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) acetic acid

5 Môi ường

Bảng 2.4 Danh sách các môi trường sử dụng trong thí nghiệm

Môi trường Thành phần

LB lỏng 1% (w/v) tryptone; 0,5% (w/v) yeast extract; 1% NaCl

LB rắn 1% (w/v) tryptone; 0,5% (w/v) yeast extract; 1% NaCl; 1,5%

(w/v) agar

TB 1,2% (w/v) tryptone; 2,4% (w/v) yeast extract; 0,4% (v/v)

glycerol ; 0,17M KH2PO4; 0,72M K2HPO4.3H2O KppG 0,17M KH2PO4; 0,72M K2HPO4.3H2O; 4% glycerol

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài được tiến hành theo sơ đồ nghiên cứu sau :

Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu đề tài

2.2.1 N ôi c c i

E.coli bảo quản ở -84oC được cấy vạch trên đĩa môi trường LB đặc để hoạt hóa, ủ ở 37oC qua đêm Một khuẩn lạc riêng r trên đĩa thạch được nuôi trong môi trường LB lỏng, lắc 200 v/p ở 37o

C qua đêm Các chủng tái tổ hợp được nuôi trong môi trường LB có chứa 100 µg/ml ampicillin

2.2.2 i n nạ i i h v E.coli ằng hương h c nhi

Chuẩn bị tế bào khả biến:

Khuẩn lạc E coli được cấy chuyển vào 3 ml môi trường LB lỏng, lắc 200 v/p

ở 37oC qua đêm Sau đó, tiếp giống 1% dịch tế bào nuôi cấy qua đêm vào môi trường LB lỏng mới, nuôi lắc 200 v/p ở 37o

C Khi mật độ quang của dịch nuôi

OD600nm đạt 0,4 - 0,7, dịch nuôi cấy được đặt trong đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 4000 v/p ở 4oC trong 5 phút để thu tế bào Tế bào được rửa lần 1 trong dung dịch 100

mM CaCl2 lạnh và vô trùng, ủ đá lạnh 15 phút và ly tâm 4000 v/p ở 4oC trong 5 phút thu tế bào Tiếp theo tế bào được rửa lần 2 trong dung dịch 100 mM CaCl2lạnh và vô trùng, ủ đá lạnh khoảng 1 giờ và ly tâm 4000 v/p ở 4oC trong 5 phút Cuối cùng, tế bào đã qua xử lý được hòa trong dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô trùng có chứa 15% glycerol Dịch h n hợp tế bào và glycerol được chia nhỏ ra các ống 50 µl/ống eppendorf, dùng biến nạp ngay hoặc bảo quản ở trong tủ -80o

C có thể

sử dụng trong 1 đến 3 tháng

Biến nạp plasmid vào E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt:

Lấy tế bào khả biến tươi hoặc từ -80oC được giã đông từ từ trong đá khoảng

30 phút Bổ sung 1 µl plasmid tái tổ hợp vào ống eppendorf chứa 50 µl dịch tế bào khả biến, đảo nhẹ nhàng, ủ trong đá khoảng 30 phút H n hợp được sốc nhiệt ở

42oC trong 45 giây, lấy mẫu ra và đặt ngay vào trong đá lạnh khoảng 10 phút Bổ sung 250 µl LB lỏng, nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1 giờ Cấy trải 100 µl dịch biến nạp trên đĩa thạch LB có bổ sung 100µg/ml ampicillin, ủ ở 37oC qua đêm

2.2.3 Ki c ặ củ g n CYP264B1, AdR và Adx

Sự có mặt của gene CYP264B1 được kiểm tra bằng phương pháp PCR colony, sau đó giải trình tự để khẳng định chắc chắn sự có mặt của cả 3 gene CYP264B1, AdR và Adx

* hương h R colony

Chuẩn bị thành phần phản ứng PCR như bảng 2.5, đặt trong đá Tiếp theo

dùng đầu pipet nhỏ (hoặc tăm đã khử trùng) chạm vào khuẩn lạc E coli rồi nhúng

vào ống PCR đã chứa các thành phần phản ứng Lúc này trong thành phần phản ứng

đã có thêm một số tế bào E coli Ống phản ứng được đưa vào máy PCR và bắt đầu chu trình nhiệt như ở bảng 2.6 Khi nhiệt độ đạt 94ºC, tế bào E coli bị phá vỡ và

giải phóng DNA Dưới nhiệt độ này, DNA bị biến tính và tháo xoắn, tạo điều kiện cho việc tiếp xúc với mồi để có thể sao ch p gene đích