Báo cáo tập huấn hóa sinh - miễn dịch

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào: Cách sử dụng máy móc phòng thí nghiệm Theo phụ lục 1 Nắm vững và thành thạo được quy trình nuôi cấy tế bào: +Quy trình xử lý dụng cụ dùng trong nuôi cấy tế bào

BÁO CÁO TRƯỞNG BỘ MÔN HÓA SINH- MIỄN DỊCH V/v Kết quả học tập lớp tập huấn từ 3/4/2014 đến 3/10/2014

Mục Lục

1 Thời gian, địa điểm 2

2 Người thực hiện, người hướng dẫn 2

Phụ lục 3: Cách pha các loại môi trường nuôi cấy tế bào 14

Phụ lục 4: Quy trình mở giống tế bào 21

Phụ lục 5: Quy trình cất giống tế bào 26

Phụ lục 6: Quy trình trypsin tế bào 33

Phụ lục 7: Quy trình nuôi cấy sơ phôi một lớp (Đối với 1 phôi) 40

Phụ lục 8: Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm 47

Phụ lục 9: Quy trình phân lập virus Lở mồm long móng trên tế bào 49

Phụ lục 10: Quy trình phân lập virus Cúm lợn trên tế bào 54

Phụ lục 11: Quy trình phân lập Virus trên trứng 62

Phụ Lục 12: Quy trình nhân Virus Cúm trên tế bào MDCK chai Rouxs 69

Phụ lục 13: Quy trình nhân virus Lở mồm long móng trên tế bào 79

Phụ lục 14: Quy trình chuẩn độ virus Cúm trên đĩa tế bào 96 giếng 88

1 Thời gian, địa điểm

Thời gian: 03/04/2014 đến 03/10/2014

Địa điểm: Phòng thí nghiệm bộ môn Hóa Sinh- Miễn dịch, Viện Thú y

2 Người thực hiện, người hướng dẫn

Người thực hiện: BSTY Trần Thị Nhuận

Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Viết Không

BSTY Phạm Thị Nga

3 Nội dung học tập

- Kỹ thuật nuôi cấy tế bào

- Phân lập virus trên môi trường nuôi cấy tế bào

- Nhân giống virus trên môi trường nuôi cấy tế bào

- Xử lý mẫu bệnh phẩm

- Phân lập virus trên trứng

4 Kết quả học tập

4.1 Những việc đã làm được

a Kỹ thuật nuôi cấy tế bào:

Cách sử dụng máy móc phòng thí nghiệm (Theo phụ lục 1)

Nắm vững và thành thạo được quy trình nuôi cấy tế bào:

+Quy trình xử lý dụng cụ dùng trong nuôi cấy tế bào (Theo phụ lục 2)

+ Tự chuẩn bị được môi trường nuôi cấy tế bào: MEM1x, PBS- (Theo

phụ lục3)

+ Quy trình mở giống tế bào (Theo phụ lục 4)

+Quy trình trypsin tế bào (Theo phụ lục 5)

+ Quy trình cất giống tế bào (Theo phụ lục 6)

Thực hành nuôi cấy tế bào dòng: BHK21 ra chai T25, T75, chai Rouxs

Thực hành nuôi cấy tế bào sơ phôi trên chai T25 (Theo phụ lục 7)

Kiến tập quy trình nuôi cấy tế bào dòng: MDCK, MARC-145

b Xử lý mẫu bệnh phẩm(Theo phụ lục 8)

Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm nghi bệnh Lở mồm long móng Quy trình

xử lý mẫu bệnh phẩm Giám sát Cúm gia cầm

Quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm Cúm lợn

c Phân lập Virus trên môi trường nuôi cấy tế bào

Thực hành phân lập Virus Lở mồm long móng trên tế bào BHK21 chai

T25 từ mẫu bệnh phẩm thực địa (Theo phụ lục 9)

Kiến tập phân lập virus Cúm lợn trên tế bào MDCK điã 24 giếng từ mẫu

swab ở lò mổ Vạn Phúc (Theo phụ lục 10)

d Phân lập Virus trên trứng (Theo phụ lục 11 )

Chuẩn bị trứng, ấp trứng, soi trứng, đánh dấu buồng hơi, vị trí tiêm

Xử lý mẫu Swab Tiêm trứng Theo dõi trứng

Thu hoạch nước trứng Check HA

e Nhân giống Virus trên môi trường nuôi cấy tế bào

Kiến tập nhân virus Cúm trên Tế bào MDCK chai Rouxs.(Theo phụ lục 12) Kiến tập nhân virus Lở mồm long móng trên Tế bào BHK21 chai Rouxs (Theo

4.2 Những việc chưa làm được

Phản ứng trung hòa trên tế bào chưa được thực hành

Nhân đây, cho phép tôi gửi lời cảm ơn tới Thầy PGS.TS Nguyễn Viết

Không – người Thầy đã tận tình quan tâm, giúp đỡ, định hướng và tạo mọi điều

kiện cho nhóm chúng tôi được trau dồi kiến thức và được thực hành các kỹ thuật

cơ bản phòng thí nghiệm Cũng cho phép tôi gửi lời cảm ơn tới chị Phạm Thị

Nga – người đã trực tiếp truyền dạy cho tôi các kỹ thuật cơ bản trong đợt tập

huấn kỹ thuật và cũng xin gửi lời cảm ơn tới các anh, các chị trong bộ môn Hóasinh – Miễn dịch đã tạo mọi điều kiện và tận tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong thờigian theo học tại bộ môn

Hà Nội, ngày 7 tháng 10 năm 2014Người thực hiện

Trần Thị Nhuận

Phụ lục 1: Hướng dẫn sử dụng máy móc, thiết bị Phòng thí nghiệm

Nguyên tắc: Trước khi sử dụng quan sát tình trạng hoạt động của máy, sau khi

sử dụng máy móc ghi vào sổ theo dõi

1.Máy hấp:

Có 2 loại máy hấp:

Máy hấp sạch chuyên hấp dụng cụ đã xử lý

Máy hấp bẩn chuyên hấp dụng cụ, trang phục bảo hộ chưa qua xử lý

Cấu tạo máy hấp:

Đồng hồ chỉ thị áp suất

Van áp suất

Các nút điều chỉnh nhiệt độ, thời gian

Bình xả nước, van xả nước

Cách vệ sinh máy hấp: Sau khi hấp dụng cụ bẩn phải tiên hành rửa máy hấp.

Kiểm tra van xả áp suất Đảm bảo áp suất về 0

Tắt công tắc điện

Lấy dụng cụ bẩn vừa được hấp

Xả hết nước trong máy

Hòa nước xà phòng: dung chổi rửa rửa sạch bên trong máy Xả nước sạchcho đến khi hết xà phòng

Vệ sinh bên ngoài máy hấp

Thay nước trong bình xả nằm trong giới hạn cho phép

Thao tác sử dụng máy hấp:

Kiểm tra mực nước trong bình xả nước, giữ ở mực nước cho phép

Lắp khay, giá sắt vào trong nồi hấp, đảm bảo lượng nước ngập khay 1-2cm

Cho giỏ đựng đồ hấp: các dụng cụ hấp nên xếp tạo độ thông thoáng, dụng

cụ bao gói xếp trước, dụng cụ thủy tinh xếp lên trên

Đóng cửa nồi hấp, khóa chặt van áp suất

Bật công tắc cài đặt máy bằng các nút điều chỉnh nhiệt độ và thời gian( 1210C/30-45 phút)

mới được mở máy hấp

2 Tủ sấy

Cách sử dụng tủ sấy:

Bước 1: Trước khi mở tủ sấy phải tắt tủ sấy: ấn nút tắt công tắc máy.

Bước 2: Cho dụng cụ cần sấy vào trong tủ sấy, tùy từng dụng cụ mà sấy ở nhiệt

Bước 3: Đóng tủ sấy, bật công tắc máy và cài đặt thời gian và nhiệt độ

Cách cài đẳt thời gian:

Giữ 2 nút RAM + TIME, đèn SET hiện màu đỏ, trên đồng hồ hiển thịthời gian

Giữ RAM sau đó TIME để chỉnh giảm thời gian

Giữ RAM sau đó TEMP để tăng thời gian

Sau đó ấn RAM, thời gian đã được cài đặt

Cách cài đặt nhiệt độ:

Giữ 2 nút RAM + TEMP, đèn SET hiện màu đỏ, trên đồng hồ hiển thịnhiệt độ.

Giữ RAM sau đó TIME để chỉnh giảm nhiệt độ

Giữ RAM sau đó TEMP để tăng nhiệt độ

Sau đó ấn RAM, nhiệt độ đã được cài đặt

Bước 4: tủ sấy đã hoạt động, đèn ở chế độ heater.

Chú ý:

cung như tránh hỏng tủ sấy

Trước khi cho đồ vào sấy phải kiểm tra nhiệt độ và thời gian, để quá trìnhhấp được đảm bảo và an toàn cho dụng cụ khi sấy khô

3 Cân chân không

Cách sử dụng:

Bước 1: Cắm nguồn điện.

Bước 2: Cân hóa chất:

Mở cửa cân, đưa máng vào để đựng vật cần cân Sau đó đóng cửa, ấnTARE, để đồng hồ chỉ thị 0.000 g Cân đủ lượng cần lấy, thao tác cẩn thận, cânchính xác số lượng cần dùng

Bước 3: Tắt cân

Ấn nút OFF để tắt máy

Bước 4: Vệ sinh cân:

Sau khi cân nguyên liệu xong cần vệ sinh cân sạch sẽ Lau bề mặt cân

Bước 5: Rút nguồn điện Để cân về trạng thái nghỉ.

4 Kính hiển vi soi ngược

Bước 1: Cắm nguồn điện

Sử dụng nguồn điện 110V, cắm vào nguồn điện 110V, không cắm trực tiếpvào nguồn điện 220V sẽ gây hỏng máy, qua bộ đổi điện

Bước 2: Khởi động máy

Bật công tắc đưa máy về chế độ hoạt động

Xoay ốc điều chỉnh độ sáng của đèn lên tối đa Điều chỉnh độ sang củađèn thông qua núm điều chỉnh nguồn sáng

Bước 3: Soi kính

Đặt chai nuôi tế bào hoặc buồng đếm tế bào lên khu vực soi

Điều chỉnh ốc vĩ cấp lấy hình ảnh Sau đó điều chỉnh ốc vi cấp để chỉnhảnh rõ nét

5 Máy Ly tâm

Cấu tạo:

Có 2 Roto

Roto 15ml với tốc độ ly tâm 3500 vòng/ phút

Roto 50ml với tốc độ ly tâm vòng/phút

Nút điều chỉnh thời gian

Cách sử dụng: Máy ly tâm hoạt động dựa trên nguyên lý cân bằng

Bước 1: Cắm điện nguồn điện 220V.

Bước 2: Xếp mẫu vào các ROTO

Khi xếp mẫu phải đảm bảo các mẫu cần ly tâm ở dạng đối xứng và cânbằng Dùng cân tiểu ly khi cần thiết

Bước 3: Khởi động máy

Đóng nắp máy ly tâm

Ấn MAIN cho máy hoạt động

Cài đặt vòng quay và thời gian: Nếu ly tâm <2.500 vòng ấn nút LOW nếu

ly tâm > 2.500 vòng ấn HIGHT

Điều chỉnh số vòng quay vặn nút speed, quan sát trên đồng hồ chỉ thị sốvòng trong khoảng cần ly tâm

Điều chỉnh thời gian: vặn nút TIME chỉ thị trên máy, chỉnh thời gian cần

Vô trùng cabinet 15 phút trước khi sử dụng:

Vặn chìa khóa tủ ở số 2, ấn nút UV lamp

Đèn tử ngoại sáng, đồng thời xuất hiện tiếng kêu

Để tắt tiếng kêu, ta ấn nút Stop Vô trùng tủ trong 15 phút

Sau 15 phút tắt đèn tử ngoại bằng cách ấn nút UV lamp và chìa khóacabinet ở vị trí số 0

Cách sử dụng cabinet:

Mở cánh cửa tủ cabinet

Vặn chìa khóa tủ về vị trí số 1, núm quạt gió sẽ tự động hoạt động (khôngcần ấn nút FAN) Khi quạt gió hoạt động ấn nút biểu tượng đèn (bên cạnh númFAN) Tủ cấy có 2 màng lọc khí: khí qua màng lọc thì đèn sẽ bật xanh Chỉ đượclàm việc khi cả 2 đèn đều xanh

Quá trình thao tác trong cabinet phải nhẹ nhàng, tránh đưa luồng khôngkhí từ ngoài vào sẽ gây tạp nhiễm

Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng:

Thu dọn sạch sẽ, không được để lại bất cứ dụng cụ thí nghiệm trongcabinet Tắt quạt gió và AS, vặn chìa khóa cabinet về vị trí 0

Đậy cánh cửa cabinet lại, vô trùng cabinet 15 phút (giống như các bước ởtrên).

Tắt cabinet hoàn toàn ( chìa khóa ở vị trí 0)

Ngâm các dụng cụ trên vào dung dịch NaOH 4% trong 24 giờ

Vớt ra rửa nước thường 3- 5 lần

Bước 2:

Chuyển sang ngâm trong dung dịch HCl 2% trong 24 giờ

Vớt ra rửa nước thường 3- 5 lần

Dùng chổi rửa chuyên dụng và vải gạc rửa sạch các dụng cụ

Tráng nước thường nhiều lần (3- 5 lần, riêng chai schoot phải tráng 15 –

20 lần bằng nước thường)

Bước 3:

Tráng nước cất 1X tất cả các dụng cụ trên rồi xếp vào giá phải úp ngượccác dụng cụ xuống cho khô và tránh buị rơi vào

Chuyển tất cả các dụng cụ trên vào tủ sấy: Sấy ở 900C -1000C.

2.2 Xử lý quần áo, mũ

- Quần áo: đem giặt bằng xà phòng thật sạch, phơi khô

- Bao gói quần áo riêng bằng giấy, dán băng dính

- Bao gói mũ bằng túi giấy dập gim,dán băng dính

- Dán chỉ thị sterlize tất cả các dụng cụ đã bao gói trên, dùng bút dạ ghitên dụng cụ, ngày hấp, người dùng, phòng dùng

- Hấp 1210C/30 phút

- Sấy 700C/3-4 giờ

Phụ lục 3: Cách pha các loại môi trường nuôi cấy tế bào

1 Quy trình chuẩn bị nước cất 2x

Bước 2: Nối hệ thống lọc với máy hút chân không

Dùng dây gắn hệ thống lọc với đầu vào INLET của máy hút chân không.Dùng máy hút chân không hút hết không khí trong bình, khi đó tạo ra sự chênhlệch áp suất  nước sẽ đi từ nơi có áp suất cao đến nơi có áp suất thấp

Sau khi hấp, nước cất 2x được bảo quản ở nhiệt độ phòng.

2 Quy trình chuẩn bị PBS

-2.1 Mục đích: Là môi trường để rửa tế bào chết trong nuôi cấy tế bào

2.2 Nguyên vật liệu pha PBS- 1 lít

Bước 1: Chuẩn bị nước cất

Lấy 1 lượng nước cất 2x vô trùng 200- 300ml

Bước 2: Cân PBS

Bước 4: Kiểm tra pH

Có thể sử dụng máy đo pH hoặc giấy đo pH

Dùng pipet hút 1 ít dung dịch nhỏ lên giấy rồi đo pH Dùng NaOH 1Nhoặc HCl 1N để điều chỉnh pH của môi trường (pH = 7,2 – 7,4)

Bước 5: Bảo quản

3 Quy trình chuẩn bị môi trường MEM1x

3.1 Mục đích: Là môi trường để tế bào sinh trưởng và phát triển

3.2 Nguyên vật liệu pha MEM 1x 1 lít

Bước 1: Lấy 1 lượng nước cất 2x vô trùng 200- 300ml

Bước 2: Cân hoá chất

Dùng máng để cân hóa chất, trước khi cân nên lau sạch máng

Cân MEM bột 9,53g cho vào bình đã có sẵn ít nước Không được lắcngay sẽ đông vón

Tráng máng  lắc đều với cục khuấy từ

Dùng máng khác cân NaHCO3: 2,2 gam cho tiếp vào bình, tráng mánglắc đều

Bước 3: Bổ sung lượng nước sao cho đủ thể tích 1 lít.

Tiếp tục cho lên máy khuấy từ, lắc đều, cho đến khi tan hoàn toàn

Bước 4: Lọc

Lọc qua màng lọc 0,22µm bằng hệ thống lọc chân không đã được hấp vôtrùng

Bước 5: Bổ sung Gentamycin

Dùng pipet hút 50µg/ 1ml cho vào dung dịch

Bước 6: Điều chỉnh pH

Dùng 6ml HCl 1N để điều chỉnh pH về 7,2- 7,5

Bước 7: Bảo quản

4 Huyết thanh bào thai bò (FBS)

Bảo quản ở -200C cho đến khi sử dụng

5 Trypsin- EDTA

Trypsin bảo quản ở -200C

Đông tan trypsin

Chia 10ml/ ống ly tâm 15ml

6 Pha Hepes 1M

Bước 1: Pha NaOH 5N

Cân NaOH 5g hòa tan trong 1 ít nước cất 2x vô trùng Sau đó cho đủ nướccất 2x sao cho đủ 25ml

Bước 2:Pha Hepes 1M

Cân 23,8 g Hepes bột cho vào 40ml nước cất 2x đã lọc, hấp vô trùng Lắc cho tan hết Dùng NaOH 5N để điều chỉnh đưa pH dung dịch Hepes về khoảng 7,3-7,5 (Khoảng 5ml NaOH 5N cho 100ml Hepes) Sau đó, bổ sung nước cất 2x

đã lọc, hấp vô trùng sao cho đủ l00ml dung dịch Sau đó tiến hành lọc qua màng

Bước 3: Bảo quản

Hepes được bảo quản ở 40C.

7 Môi trường bảo quản mẫu swab để phân lập virus- Môi trường VTM (Virus transport medium).

2 lít

Phụ lục 4: Quy trình mở giống tế bào

1.Nguyên vật liệu

a Tế bào đã được cất giống trước đó

b Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:

Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng

Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet trong 15 phút

Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:

Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gâychết tế bào

ngoài để tan đông

Bước 2: Giải đông tế bào cất giống

Mục đích: đưa tế bào về trạng thái hoạt động

Cách tiến hành:

Chuẩn bị ống môi trường 5ml MEM10% để cân bằng môi trường tế bào

Thấy môi trường chuyển màu đậm hơn

Khi môi trường đồng nhất, chuyển ống môi trường vào Cabinet

Bước 3: Cân bằng môi trường

Mục đích: Cân bằng môi trường nuôi cấy tế bào

Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700v/phút trong 10 phút

Ly tâm xong, dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào.Đánh tan cặn tế bào bằng cách: Rà mạnh đáy ống vào Cabinet hoặc dùngpipet đảo đều

Chú ý:

Trước khi ly tâm, các ống ly tâm phải được đóng chặt nút và bao dán bằngparaffin

Khi hút bỏ môi trường, tránh để đầu type chạm vào cặn tế bào

Bước 5: Hòa tan trong môi trường nuôi cấy tế bào

Mục đích: Hòa tan huyễn dịch tế bào trong môi trường nuôi cấy

Cách tiến hành:

Cho 6ml môi trường MEM10% vào ống ly tâm có chứa cặn tế bào

Dùng pipet đảo đều

Bước 6: Cấy tế bào vào chai nuôi

Mục đích: cung cấp chất dinh dưỡng cho tế bào phát triển

Cách tiến hành:

Ghi thông tin lên chai nuôi về ngày mở giống, dòng tế bào, đời tế bào,người thực hiện

Dùng pipet chuyển hết lượng huyễn dịch tế bào vừa được đánh tan cặn có

bổ sung 6ml MEM 10% vào chai nuôi T25

Lắc nhẹ nhàng chai nuôi

Bước 7: Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng

Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet

Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet

Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút

Bước 8: Theo dõi sự phát triển của tế bào

Nuôi tế bào 370C, 5%CO2 Hàng ngày theo dõi tế bào trên kính hiển visoi ngược.

Phụ lục 5: Quy trình cất giống tế bào

1 Nguyên vật liệu

a Tế bào đã phát triển, tỷ lệ bám đáy 100% (Thường sau 2-3 ngày trypsin)

b Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:

Nước cất vô trùng vừa đủ …….1 lít

Pha dung dịch cất giống

Lượng dung dịch cất giống chiếm 50% cần pha 5ml dung dịch cấtgiống sau khi đã qua màng lọc

Cách pha 6ml dung dịch cất giống 20% PBS, 20% DMSO:

Lấy 1 ống fancol 50ml vô trùng

Dùng pipet hút 3,6 ml MEM10%

Thay đầu type, hút tiếp 1,2ml FBS cho vào ống

Cho tiếp vào ống 1,2ml DMSO

Dùng xilanh, kim tiêm vô trùng hút hết dung dịch cất giống ở ống fancol,lắp xilanh vào đầu lọc 0.45, bơm qua lọc cho vào ống fancol mới

Chú ý : không được cho PBS sau khi cho DMSO, sẽ gây kết tủa

Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng

Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet trong 15 phút

Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:

Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gâychết tế bào

Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông

Bước 2: Quan sát tế bào

Mục đích: quan sát mức độ phát triển của tê bào, tỷ lệ tế bào bám đáy

Cách tiến hành:

Khi tế bào phát triển tốt, tỉ lệ bám đáy 100%

Bước 3:Loại bỏ môi trường đang nuôi:

Mục đích: loại bỏ tế bào chết

Cách tiến hành:

Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai

Mở nắp chai, nghiêng chai về mặt không có tế bào

Dùng pipet lắp đầu type 5ml hút bỏ môi trường vào cốc thủy tinh đựngrác

Bước 5: Trypsin tế bào

Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy bình

Bước 6: Trung hòa trypsin

Bước 7: Ly tâm và đánh tan cặn

Pha loãng tế bào 10 lần với MEM10%FBS : Hút 900µl môi trườngMEM10% cho vào ống eppendorf Cho vào 100µl huyễn dịch tế bào vào trộnđều.

Pha loãng huyễn dịch tế bào với thuốc nhuộm trypan blue theo hệ số phaloãng 2: cho vào ống eppendorf 100µl huyễn dịch tế bào vừa pha loãng 10 lầnvới 100µl trypan blue

Dùng pipet hút 1 lượng huyễn dịch tế bào sau khi nhuộm nhỏ từ từ vàobuồng đếm tế bào

Đếm sô tế bào trên buồng đếm:

Đếm tế bào ở 4 góc, trong mỗi góc có 16 ô vuông nhỏ, đếm số tế bào nằmtrong khung 16 ô vuông nhỏ

Đếm từng tế bào riêng lẻ trong đám tế bào

Đếm theo hình zic zắc

Đếm các tế bào có kích thước tương đồng nhau

Không đếm các tế bào chết bắt màu xanh, chỉ đếm các tế bào còn sống

Ước lượng số tế bào trong 1ml:

số tế bào/1ml = (số tế bào đếm được trong 4góc/4 )x 2 x độ pha loãng tế bào x

104

Bước 9: Ra chai và cất giống tế bào:

Mục đích: Lưu giữ giống tế bào (106 cell/ tube)

Cách tiến hành:

Dùng pipet hút 1,5 ml huyễn dịch tế bào + 3,5 ml môi trường MEM10%FBS cho vào ống fancol chứa dung dịch cất giống vừa lọc

Dùng pipet trộn đều môi trường, chia vào ống cất giống,mỗi ống cất 1ml

Bước 10: Bảo quản tế bào

Giữ ống giống trong hộp đá

Sau đó chuyển sang tủ lạnh -200 C/ 2-3 giờ

Chuyển sang tủ -800 C

Chuyển vào nitơ khi cần thiết

Bước 11: Vệ sinh Cabinet sau khi sử dụng

Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet

Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet

Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút

Phụ lục 6: Quy trình trypsin tế bào

1 Nguyên vật liệu

a Tế bào đã phát triển, tỷ lệ bám đáy 90-100%

b Môi trường, hóa chất, sinh phẩm:

Bước 1: Chuẩn bị Cabinet và đưa môi trường về nhiệt độ phòng

Chuẩn bị Cabinet: Vô trùng Cabinet trong 15 phút

Chuyển môi trường về nhiệt độ phòng:

Mục đích: không làm ảnh hưởng tế bào vì nếu để nhiệt độ quá thấp sẽ gâychết tế bào.

Chuyển môi trường đang bảo quản trong tủ lạnh đưa ra ngoài để tan đông

Bước 2: Quan sát tế bào

Mục đích:

Quan sát mức độ phát triển của tế bào, tỷ lệ bám đáy

Cách quan sát:

Quan sát màu sắc môi trường, độ đục trong, tỷ lệ tế bào bám đáy

Khi quan sát trên kính hiển vi thấy tế bào bám đáy 90 – 100% thì tiếnhành trypsin tế bào

Bước 3: Loại bỏ môi trường đang nuôi tế bào

Mục đích: loại bỏ tế bào chết

Cách tiến hành:

Lắc nhẹ chai nuôi, lắc ngang chai

Mở nắp chai, nghiêng chai về mặt không có tế bào

Dùng pipet lắp đầu type 5ml hút bỏ môi trường vào cốc thủy tinh đựngrác

Bước 4: Rửa tế bào

Mục đích: loại bỏ tế bào chết, huyết thanh và môi trường còn sót lại

Cách tiến hành:

Cho vào chai nuôi tế bào 1 lượng PBS- để rửa tế bào (15ml PBS- vào chainuôi T75, 5ml PBS- vào chai nuôi T25)

Lắc ngang chai nuôi, cầm nghiêng chai, hút bỏ PBS- vừa rửa

Rửa tiếp chai nuôi tế bào bằng PBS- một lần nữa

Chú ý :

cho vào mặt không có tế bào bám dính, đầu pipet không được chạm vào thànhchai

Bước 5: Trypsin tế bào

Mục đích: tách tế bào ra khỏi đáy bình

Cách tiến hành:

Dùng pipet hút 3ml trypsin 1x cho vào chai T75, 1ml trypsin cho vào chaiT25

Cho trypsin vào mặt chai không có tế bào, nghiêng chai nhẹ nhàng để các

tế bào đồng pha cùng tách nhau Thời gian trypsin từ 5 -45 phút

Chú ý : Không được lắc chai nuôi TB

Bước 6: Trung hòa trypsin

Chuyển hết huyễn dịch vào ống fancol 50ml (chú ý khi mở nắp ống khôngchạm tay vào miệng ống fancol) Đậy nắp, Bao dán paraffin, lắc nhẹ, đem lytâm.

Bước 7: Ly tâm

Mục đích: thu cặn tế bào

Cách tiến hành:

Cho ống fancol chứa huyễn dịch đem ly tâm 700v/phút trong 10 phút

Ly tâm xong, dùng pipet hút hết dung dịch ở phía trên, giữ lại cặn tế bào.Đánh tan cặn tế bào bằng cách: Rà mạnh đáy ống vào Cabinet hoặc dùngpipet đảo đều

Chú ý:

Trước khi ly tâm, các ống ly tâm phải được đóng chặt nút và bao dán bằngparaffin

Khi hút bỏ môi trường, tránh để đầu type chạm vào cặn tế bào

Bước 8: Cân bằng môi trường

Mục đích: Đánh tan cặn tế bào

Cách tiến hành:

Dùng pipet hút 7ml môi trường MEM10% cho vào ống fancol vừa ly tâm

để đánh tan cặn tế bào.

Dùng pipet đảo đều hoặc rà mạnh vào cabinet

Bước 9: Tráng sạch chai nuôi tế bào

Mục đích: loại bỏ các tế bào, môi trường còn sót lại, tránh sự tạp nhiễm, chốngnấm phát triển

Cách tiến hành:

Lắc mạnh, rửa sạch chai

Bước 10: Ra chai nuôi

Mục đích: Tiếp tục nuôi tế bào, để tế bào nhân lên

Cách tiến hành:

Dùng pipet hút 6ml MEM10% cho vào T25, 20ml MEM10% cho vàochai T75

Dùng pipet lấy 1ml huyễn dịch cho vào chai nuôi

Lắc nhẹ nhàng để tế bào được trải đều khắp mặt đáy chai nuôi

Bước 11: Vệ sinh cabinet sau khi sử dụng

Thu dọn rác, Chuyển các dụng cụ vừa thao tác ra khỏi cabinet

Dùng giấy lau xịt cồn lau sạch Cabinet

Đóng cửa Cabinet, bật UV trong 30 phút

Bước 12: Theo dõi sự phát triển của tế bào

Hằng ngày quan sát tế bào phát triển ở đáy chai nuôi trên kính hiển vi soingược

Phụ lục 7: Quy trình nuôi cấy sơ phôi một lớp (Đối với 1 phôi)

1.Nguyên vật liệu

a.Trứng gà có phôi: 10-11 ngày tuổi Phôi khỏe mạnh, có nhiều mạch máu

b Môi trường, hóa chất, sinh phẩm: