BÁO cáo THỰC tập VI SINH CÔNG NGHỆ dược

Bài 1. Chọn lọc giống Vi sinh vật Bài 2: SINH KHỐI VI SINH VẬT Bài 3: TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINAT Bài 4: Cố định CGTase lên alginat Bài 5. Tinh chế protein bằng sắc ký ái lực Bài 6. Tinh chế lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion

BỘ MÔN VI SINH – KÝ SINH

 

BÁO CÁO THỰC TẬP

VI SINH CÔNG NGHỆ DƯỢC

Năm 2011

Bài 1 Chọn lọc giống Vi sinh vật

I.Khái quát:

Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến,

phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn và bảo quản giống

Việc phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào:

- Chất chuyển hóa tạo ra: kháng sinh, sắc tố,…

- Enzym ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường

- Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng của vi sinh vật

- Sự thay đổi hình thái

II.Nội dung thực hành:

Phân lập và phát hiện vi sinh vật có đặc tính mong muốn:

a.Amylase ngoại bào:

Môi trường phân lập

Thạch tinh bột: dùng cho vi khuẩn

Tiến hành: cho vào mẫu đất 10ml đệm PBS, vortex để phân tán vi sinh vật vào đệm.

Để khoảng 15 phút cho đất lắng xuống đáy

- Hút 100µ dịch huyền phù vi khuẩn + 900µ đệm  pha loãng 10 lần.

Trải đều lên 3 đĩa thạch tinh bột, thạch gelatin và TSA mỗi đĩa: 100µ dịch huyền phù vi

khuẩn (đã pha loãng 10 lần ở trên) + 900µ đệm  pha loãng 100 lần.

- Hút 100µ dịch huyền phù đã pha loãng 10 lần + 900µ đệm  pha loãng 100 lần.

Trải đều lên 3 đĩa thạch tinh bột, thạch gelatin và TSA mỗi đĩa: 100µ dịch huyền phù vi

khuẩn (đã pha loãng 100 lần ở trên) + 900µ đệm  pha loãng 1000 lần.

Phát hiện

Amylase ngoại bào: tráng trên bề mặt môi trường thạch tinh bột với một ít dung

dịch Lugol ( Iod ) , khi đó nền môi trường sẽ có màu tím than do màu của iod với tinhbột Nếu chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại bào thì xung quanh chỗ vi sinh vật mọc

sẽ có một vòng sáng, trong đó tinh bột đã bị thủy phân nên không tạo màu với iod.Đường kính của vòng phân giải tinh bột tỷ lệ với hoạt tính

Kết quả: Có một số khóm vi khuẩn thủy phân tinh bột môi trường xung quanh 

Các khóm này có sinh amylase ngoại bào

b.Protease ngoại bào:

Pepton 5g

Tiến hành: Tráng trên môi trường thạch gelatin một ít TCA 50% khi đó nền môi

trường sẽ đục vì gelatin bị kết tủa Nếu chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào thìxung quanh chỗ vi sinh vật mọc sẽ có vòng sáng, trong do gelatin đã bị thủy phân nênkhông bị tủa Đường kính của vòng phân giải gelatin tỷ lệ với hoạt tính

Kết quả: Vi khuẩn có thủy phân gelatin nhưng rất ít

 Khả năng sinh protease thấp

c.Kháng sinh:

Nguyên tắc: Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế tăng

trưởng của nó đối với các vi sinh vật khác

Tiến hành:

- Dùng que bông vô trùng nhúng vào huyền trọc vi khuẩn đã chuẩn bị, ép que trênthành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch Lập lại 3 lần, mỗi lầnxoay hộp 60

- Để hộp trong tủ ấm 3-5 phút cho ráo mặt

- Đục lỗ đường kính 6mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng

- Môi trường sau lọc được nhỏ vào trong lỗ khoảng 20µl

- Tiến hành song song với 1 lỗ chứng chỉ nhỏ môi trường

- Để yên khoảng 15p cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch

- Ủ hộp thạch trong tủ ấm 35-37C trong 16-18h

Kết quả: Có 2 vị trí xuất hiện vòng kháng khuẩn là B1 và B3

Bài 2: SINH KHỐI VI SINH VẬT

I KHÁI QUÁT:

Sinh khối là toàn bộ tế bào vi sinh vật thu nhận được trong quá trình lên men

II NỘI DUNG THỰC HÀNH:

1 Lên men thu sinh khối:

2 Định lượng sinh khối bằng phương pháp đo thể tích, so độ đục và đếm sống

Phân tán cắn trong nước vô trùng, đo độ đục trên máy đo quang, rồi suy ra số tế bào/

ml theo công thức : Số tế bào /ml = OD x 0,8 x 10 9

Môi trường - Nhiệt độ Điều

kiện nuôi cấy

- So sánh 2 phương pháp xác định số lượng tế bào

Đo độ đục

- Ít chính xác do ảnhhưởng yếu tố của môitrường

- Không xác định đượcchính xác số lượng vi

khuẩn còn sống nhưngnhanh

Đếm sống

- Chính xác hơn

- Thời gian lâu

- Tốn kém

 Phương pháp đo độ đục: chỉ dùng để sàng lọc sơ bộ.

So sánh 2 môi trường nuôi cấy tĩnh và lắc : sau khi định lượng sinh khối, ta có nhân xétchung là môi trường nuôi cấy có lắc thì có mật độ tế bào lớn hơn, tức sinh khối thu đượcnhiều hơn

Bài 3: TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINAT

Emzym amylase có thể thu nhận từ động vật và thực vật Tuy nhiên, emzym để

có thể ứng dụng trong y dược cần trải qua các bước tinh chế từ enzyme thô

=> Alginat là polysaccarid chiết xuất từ Tảo nâu, tạo gel khi có mặt ion hóa trị 2 Amylase hấp phụ vào mạng lưới alginate, sau đó được giải hấp phụ bằng carbohydrate (cơ chất có ái lực cao hơn với enzyme)

=> Mục đích tinh chế: tinh khiết, tăng hoạt tính của enzyme (giữ bã trong

alginate), chỉ sử dụng enzyme thô khi yêu cầu không đòi hỏi tinh khiết cao

2 LÊN MEN VÀ THU ENZYME:

2.3 Xác định hàm lượng protein bằng OD 280 :

Chuẩn bị 1 mẫu enzym thô và 1 mẫu enzym tinh chế:

- Dịch enzym thô: Cho dịch enzym thô vào eppendorf ly tâm 15000 vòng/ phút, pha loãng 10 lần Đo OD280

- Dịch enzym tinh chế

Lấy 1 ml mẫu, đo độ hấp thu ở bước sóng 280 nm

Tính tổng lượng protein trong mẫu như sau:

Protein ( A280nm) = OD280 x V (ml)

2.4 Định lượng hoạt tính amylase:

Xác định hoạt độ của amylase bằng phương pháp của Heinkel: đo mật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng màu với Iode

Một đơn vị hoạt độ tương ứng với khả năng phân giải 1mg tinh bột sau 30 phút ở

30oC

Tiến hành

Xay Khoai lang + đệm phosphate (1:1) trong 1 phút

Dịch lọc, để yên cho tinh bột lắng

xuống

Dịch lọc chứa enzyme thô

15ml dịch lọc enzyme thô + 75ml dung dịch sodium alginate

2% (trong đệm natriacetat 0,2M pH 4.8) dung đũa thủy tinh

khuấy đều trong 1 giờ

Ống thử: cho vào ống nghiệm đã sấy khô 0.1 ml dung dịch tinh bột 1%, 0.1 ml

dung dịch NaCl 0.1% và 0.2 ml dung dịch đệm phosphat 0.05M pH 6, lắc đều Thêm vàohỗn hợp 0.1ml dung dịch enzym, lắc đều Giữ ở nhiệt 300C đúng 30 phút Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ấm, cho ngay vào 0.5 ml dung dịch tricloacetic acid 5% để làm ngừng phản ứng, ly tâm 10.000 vòng/ phút trong 1 phút

 Ống thử phải còn màu xanh (để xác định thời điểm kết thúc), nếu hoạt tính quácao thì phải pha loãng

Ống kiểm tra: song song với mẫu kiểm tra cũng tương tự như trên nhưng cho

dung dịch tricloacetic acid 5% vào trước rồi mới cho dung dịch enzym vào

Lấy 0.1 ml dịch lọc của mẫu thí nghiệm cũng như mẫu kiểm tra, cho vào ống nghiệm cũng như mẫu kiểm tra, cho vào ống nghiệm khô, thêm 0.9 ml dung dịch iod phaloaxng150 lần So màu ở bước sóng 560 nm

ml nước cất đang sôi Để nguội cho vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch

Từ dung dịch nay chuẫn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8, 10mg tinh bột trong 1 ml bằng cách lấy 2/10, 4/10, 6/10, 8/10, 10/10ml dung dịch tinh bột 1% và thêm nước cất vào cho đến 1ml Lập đồ thị đường chuẩn:

Ống 1 2 3 4 5 Tinh bột (mg) 0,2 0,4 0,6 0,8 1

OD 0,038 0,09 0,135 0,174 0,218 U/ml 2 4 6 8 10

Vẽ đường chuẩn xác định hoạt tính amylase

y = 0.2204x - 0.001

R 2 = 0.9985

-0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

U/ml

Thông số quy trình tinh chế:

OD280 Enzym thô = 1,96  Protein = 0,96 x 15 x 10 = 144

OD280 Enzym tinh = 1,438  Protein = 0,438 x 30 = 13,14

Enzym thô (pha loãng 5 lần): ODKT = 0,454 , ODTN = 0,158  0,296Enzym tinh chế (không pha loãng): ODKT = 0,442 , ODTN = 0,154  0,288

Tổng protein(A280nm)

Tổng hoạt tính(U)

Hoạt tínhchuyên biệt(U/ A280nm)

Hiệu suất

chế(lần)

TổngProtein

TổngHoạttính

Bài 4: Cố định CGTase lên alginat 1.Khái quát

Cyclodextin glucanotranferase ( CGTase, EC 2.4.1.19 ) là enzym duy nhất có khảnăng chuyển hóa tinh bột và các chất tương tự thành hỗn hợp cyclodextrin với các mức

độ polyme hóa từ 6,7 và 8 đơn vị glucose ( ứng với α- CD, β- CD, γ- CD ) Việc cố định

sẽ tận dụng được khả năng tái sử dụng của các CGTase đắt tiền, và tăng cường tính ổnđịnh cũng như hoạt tính enzym

Dựa vào bản chất các liên kết giữa chất mang va enzym, người ta phân loại cácphương pháp ổn định gen như sau:

-Phương pháp vật lý : hấp phụ, liên kết ion…

-Phương pháp liên kết cộng hóa trị : dựa vào ái lực giữa enzym và chất mang đểtạo phức giữa enzym- chất mang bằng liên kết cộng hóa tri

-Phương pháp bắt giữ enzym vào khuôn gel: dựa trên nguyên tắc sự thu hút giữcủa enzym vào một mang lưới mà cơ chất và sản phẩm đi qua được nhưng không choenzym khuyếch tán vào môi trường

-Phương pháp tạo vi nang: enzym đươc giữ trong các bao vi thể có màng bánthấm dày 200 A0 ( cellulose, polysacharid)

2.Nội dung công việc

- Cố định CGTase lên chất mang

- Xác định hoạt tính CGTase cố định

3.Các bước tiến hành

a Cố định enzym CGTase lên algilase

Cách 1 : Cố định enzym bằng phương pháp bắt giữ

1.Thêm 2ml enzym vào 20 ml dung dịch alginate 2%

2.Dùng ống nhỏ giọt, nhỏ từ từ hỗn hợp enzym và alginate vào becher chứa 40mlCaCl2 0.2M (đặt trên máy khuấy từ), tạo thành những hạt gel tủa trong dung dịch

3.Những hạt gel Ca-alginate có chứa enzym được rửa 3 lần bằng đệm Tris-HCl 4.Thu tất cả dịch rửa để xác định hàm lượng enzym không cố định

Cách 2 : Cố định bằng phương pháp hấp phụ

1.Dùng ống nhỏ giọt, nhỏ từ từ alginate vào becher chứa 40ml CaCl2 0.2M (đặttrên máy khuấy từ)

2.Thu hạt gel Ca-alginate

3.Cho hạt gel vào 20 ml đệm Tris-HCl pH 8, thêm 2ml enzym CGTase vào dungdịch

4.Cố định enzym trên gel, 5-10 phút lắc đều 1 lần

5.Lọc dung dịch sau khi cố định, rửa hạt gel 3 lần với đệm Tris-HCl pH 8

6 Thu dịch rửa, xác định hàm lượng protein không cố định

b.Tính hàm lượng và hiệu suất protein cố định

Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của

thuốc nhuộm Coomasie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịchmang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm có λmax 465 nm Khi kếthợp với protein thi thuôc nhuộm có λmax 595 nm

1.Xây dựng đường chuẩn

2.Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm

- Pha loãng chế phẩm CGTase 100 lần

-Hút 0.8 ml chế phẩm trên cho vào 0.2 ml thuốc thử Bradford 5, đo OD 595

-Tính hàm lượng protein trong chế phẩm

3.Xác định hàm lượng protein cố định

-Hút 0.8 ml thu được, cho vào 0.8 ml thuốc thử Bradford, đo OD 595 nm

-Tính hàm lượng protein không cố định, suy ra hàm lượng protein cố định

c Xác định hoạt tính CGTase cố định

Nguyên tắc: Hoạt tính của CGTase được đánh giá thông qua lương cyclodextrin

do CGTase tạo ra từ malatosedextrin trong điều kiện xác định Dựa vào khả năng hấpphụ và làm mất màu phenolphtalein của cyclodextrin, ta có xác định được cyclodextrintạo thành từ maltosedextrin dựa trêm cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗnhợp phản ứng với phenolphtalein

1.Xây dựng đường chuẩn β-CDCD

-Pha dung dịch β-CD 1% : Lấy 1g β-CD hòa vào khoảng 80ml đệm Tris- HCl,cho vào bình định mức và thêm vừa đủ 100ml Từ dung dịch β-CD pha thành các giaimẫu

-Mẫu trắng để chỉnh máy về 0: 0.4 ml dung dich NaOH + 1 ml Tris- HCl 50 Nm

và 0.1 ml nước cất

-Từ giá trị OD xây dưng đường chuẩn và phương trình hồi quy

ΔOD = a × β-CD + b (mg)OD = a × β-CD + b (mg)

2.Xác định hoạt tính enzym ban đầu

- Pha loãng enzym ban đầu 15 lần

- Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chứng trong 2 ependorf sạch và khô theo thứ tự nhưsau:

- Chuẩn bị mẫu thử và mẫu chứng trong 2 Falcon 15 ml sạch và khô theo thứ tựnhư sau:

Khối lượng của hạt gel: m = 14,19g

2.Xác định hàm lượng protein trong chế phẩm CGTase và protein cố định

a.Xây dựng đường chuẩn định lương protein

Vẽ đường chuẩn định lượng protein theo phương pháp Bradford

b.Tính hàm lượng protein trong chế phẩm

3.Kết quả xác định hoạt tính enzym trong chế phẩm và hoạt tính enzym cố định

a.Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin

Vẽ đường chuẩn dựa vào OD hàm lượng phenophtalein còn lại

Ta có phương trình hồi quy : 0,816 - ΔOD = a × β-CD + b (mg)OD = 0,121 × β-CD – 0,119

b.Xác định hoạt tính của CGTase

OD thử = 0,126 OD chứng = 0,711ΔOD = a × β-CD + b (mg)OD550 nm β-CD (mg/ml) Hoạt tính của CGTase (U/

Trả lời câu hỏi:

1.Nguyên tắc xác định hoạt tính CTGase:

Hoạt tính của CGTase được đánh giá thông qua lương cyclodextrin do CGTasetạo ra từ malatosedextrin trong điều kiện xác định Dựa vào khả năng hấp phụ và làmmất màu phenolphtalein của cyclodextrin, ta có xác định được cyclodextrintaoj thành từmaltosedextrin dựa trêm cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phảnứng với phenolphtalein

2.Vẽ sơ đồ quy trình cố định CTGase bằng phương pháp hấp phụ:

-o0o -Bài 6 Tinh chế protein bằng sắc ký ái lực

I.Nguyên tắc

Dựa vào sự gắn thuận nghịch của 1 nhóm chức năng trên protein với một nhóm chức

năng của pha tĩnh sắc ký Như vậy chỉ có protein đích mang nhóm chức năng đặc hiệu

mới gắn vào pha tĩnh, còn các protein khác thì đi ra khỏi cột protein đích sau đó được

thôi ra bằng cạnh tranh với nó

Hình 1 :Nguyên tắc của sắc ký ái lực

Đây là phương pháp cho phép tinh sạch nhanh chóng hợp chất cần quan tâm

DD CaCl2 0,2M

Nhỏ từ từ alginate 2%

Bỏ dịch lọc Hạt Gel Ca-alginat

20ml đệm Tris-HCl pH=8 2ml enzyme CGTase

ắc 10 lần/phút

Dịch rửa

Hạt gel chứa enzyme

Rửa hạt gel 3 lần với đệm Tris-HCl pH=8

Đây là kỹ thuật sắc ký đơn giản và hiệu quả nhất để tinh chế protein Tuy nhiên,

nó có nhược điểm là đòi hỏi protein đích phải có 1 nhóm chức năng nào đó, mà khôngphải lúc nào cũng có được

Ngày nay, với kỹ thuật tái tổ hợp, người ta có thể them vào một gen đích mộtđoạn acid nucleic mã hóa cho đoạn peptid mang chức năng này để sau đó có thể táchchiết protein đích, đoạn peptid sau đó có thể loại bỏ bằng một peptase

Một số thí dụ

-Trong sắc ký ái lực ion kim loại IMAC (ion metal affinity chromatography),nhựa sắc ký được gắn các ion kim loại( hóa trị II: Cu,Ni,…), các ion này có ái lực vớicác đoạn peptid có nhiều histidine, đặc biệt là 6-10 histidine Chất dung để thôi protein làimidazole nồng độ > 100 mM

-GST: nhựa có ái lực với enzyme Glutathione-S-Tranferase Protein đích được thôibằng glutathione dạng khử có nồng độ > 20 mM

II Nội dung thực hành:

1 Chuẩn bị cột sắc ký

2 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp siêu âm (protien đích là sản phẩm nội bào)

3 Tiến hành tinh chế His-tag protein (như hình 1)

 Rửa cột với đệm chạy và đệm rửa(*)

 Tiến hành rửa giải bằng đệm thôi H 1X(*)

 Phục hồi cột băng đệm chạy H(*)

4 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

(*) Thành phần của các đệm đã sử dụng và vai trò của các thành phần chính trong đệm

Đệm chạy H 8X (binding buffer)

- NaCl giúp tạo lực ion vừa phải

Đệm thôi H 4X ( elution buffer)

- 400mM imidazole

2M NaCl

- 80mM Tris-HCl pH 7.9

→ đệm thôi H 1X: Nồng độ imidazole = 100mM dùng để thôi protein đích., tăng

ái lực với Ni → đẩy His-tag ra ngoài

Đệm ion 8X ( charge buffer)

Quan sát: dung dịch E Coli đục, sau khi phá hủy tế bào thì dịch trong trở lại.

Kết quả đo quang:

Hiệu suất chiết tách đạt 1,716 khá thấp do thao tác kĩ thuật chưa chính xác

 Trường hợp không có His-tag:

- Pha sai: Nồng độ Imidazol không đủ đẩy His-tag

- Chủng E.Coli không có His-tag

- Do lượng mẫu nạp vào cột quá lớn

=> Ở đây ta không định lượng bằng phương pháp Bradford vì có Urê làm ảnh hưởngđến kết quả (Urê cũng tạo màu với thuốc thử)

Bài 7 Tinh chế lysozyme bằng sắc ký trao đổi ion

I.Tổng quan:

1.Nguyên tắc

- Mỗi dung dịch protein tùy theo pH sẽ được tích điện khác nhau Mỗi protein cómột giá trị pH mà tại đó tổng điện tích âm và dương của nó bằng nhau, hay nói cáchkhác là có điện tích bằng o, pH này được gọi là pI ( điểm đẳng điện) Khi pH của dungdịch lớn hơn pI protein sẽ tích điện âm và ngược lại

- Nhựa sắc ký trao đổi ion gồm một chất nền rắn không tan được gắn các nhómmang điện tích bằng liên kết cộng hóa trị , các nhóm tích điện này sẽ liên kết với các đốiion có điện tích trái dấu một cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện

- Sắc ký trao đổi ion dựa vào sự trao

đổi thuận nghịch của các điện tích trên

protein với các điện tích trái dấu của

pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân bằng ion

và pH trong dung dịch mà protein sẽ

được gắn vào nhựa hay bị đẩy ra khỏi

nhựa

1 Các lọai nhựa trao đổi ion

- Theo lọai điện tích được trao đổi

nhựa được chia làm 2 lọai cation và

anion

- Theo độ mạnh của nhóm mang

điện tích trên nhựa thì có 2 lọai mạnh

và yếu khái niệm mạnh hay yếu là do

mức độ biến động của sự ion hóa theo

pH chứ không phải độ mạnh của liên

kết Nhựa trao đổi mạnh có khả năng họat động trong dãi pH rộng hơn và ít bị ảnhhưởng bởi pH môi trường và ngược lại

- Theo bản chất của vật liệu mang : vật liệu mang (matrix) thường là các lọai polymer

tự nhiên hay tổng hợp như dextran (sephadex), agarose (sepharose), cellulose(sephacel)

… vật liệu mang quyết định độ bền, khả năng chịu đựng tác động hóa học, vật lý,độ thânnước và khả năng thấm của các phân tử vào bên trong và do đó tốc độ và mức độ traođổi có thể diễn ra