báo cáo thực tập chuyên ngành công nghệ sinh học y dược

KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌCBÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM... III.2.2/ Thu nhận quần th

KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH

CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

I/ Đặt vấn đề

II/ Tổng quan tài liệu

III/ Vật liệu, phương pháp

IV/ Kết quả - Giải thích

V/ Kết luận, kiến nghị

Nuôi cấy

tế bào động vật

tương tác

tế bào –tế bào.

Sản phẩm của tế bào

Mô hình thử thuốc

Phân lập

Nuôi cấy

Quan sát, đánh giá

Invitro

1) Tế bào gốc trung mô (MSC ):

• MSC là tế bào gốc đa năng, có khả năng biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào chức năng khác nhau: xương, sụn, mỡ,….

• Đặc điểm nhận dạng: MSC là tế bào bám dính, biểu hiện các marker bề mặt như: +CD73, +CD90, +105, -CD45, -CD34, -CD14, -CD79_alpha, -HLA_DR.

• MSC có thể được thu từ tủy xương, máu cuống rốn, mô mỡ.

• Trong nuôi cấy invitro, MSC được thu nhận và nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12 FBS 10%.

2) Tủy xương :

• Tủy xương là nguồn chứa MSC dồi dào.

• MSC thu từ tủy xương dễ nuôi, dễ lên hơn MSC thu từ máu cuống rốn.

3) Tế bào MCF-7 :

Là dòng tế bào ung thư vú.

III.2/ Phương pháp:

III.2.1/ Thu nhận xương đùi và cẳng chân chuột III.2.2/ Thu nhận quần thể tế bào trong tủy xương III.2.3/ Thay môi trường

III.2.4/ Cấy chuyền III.2.5/ Đông lạnh III.2.6/ Giải đông III.2.7/ Xác định mật độ, tỉ lệ sống chết của tế bào

III.2.1/ Thu mẫu sơ cấp: Thu nhận xương đùi và cẳng chân chuột

Tránh cắt phạm vào xương =>Hạn chế nhiễm

Giết chuột: kéo giãn đốt sống cổ

Sát trùng - cồn 70o

Cắt da bụng

Thu đùi, cẳng chân

Trữ mẫu trong PBS kháng sinh 5X

Sát trùng, bật đèn cồn => Đảm bảo mt

vô trùng

Đã được loại bỏ da, lông

III.2.2/ Thu nhận quần thể tế bào trong tủy xương:

Chuyển Falcon chứa mẫu vào tủ ATSH

Rửa mẫu trong PBS 2XLoại cơ trong PBS 1X

Cắt rời xương đùi và xương cẳng chân

Cắt hai đầu xương

Dùng kim tiêm 1ml, hút mt, dội rửa tủy xương => Thu tb

Đảm bảo mt vô trùng

Vừa đủ, nhanh, tránh làm vỡ xương

Rửa cả hai đầu => Thu nhiều tb

Tránh làm rớt xương => Nhiễm

Giữ kim vô trùng

Huyền phù tb, chuyển vào flask, đem đi nuôi Huyền phù kĩ, tránh tạo bọt

Cho vào Flask => Tránh chạm miệng

Cắt theo từng bó cơ => Sạch, tiết kiệm thời gian

III.2.3 Thay môi trường:

Mục đích: thay môi trường mới, giúp tb tăng sinh đủ lượng để cấy chuyền

Nhỏ lên thành, không nhỏ trực tiếp lên bề mặt

3ml => Cung cấp đủ dinh dưỡng, oxi cho tb

Hút nhả nhẹ nhàng => Tránh tạo bọt, văng ra ngoài, nhiễm

Tủ nuôi tế bào: 37 độ C, 5% CO2

III.1/ Phương pháp:

III.2.4/ Cấy chuyền:

Mục đích: Cung cấp thêm không gian, dinh dưỡng cho tế bào

Hút bỏ mt cũRửa bằng 2ml PBS-

Tạo điều kiện tối ưu cho trypsin hoạt động

Kiểm tra tế bào đã tách hết chưa?

Bất hoạt Trypsin

Không đổ trực tiếp, phải dùng pipette để hút

III.2.5/ Đông lạnh:

Hút bỏ mt cũRửa bằng 2ml PBS-

Thêm từ từ 1 ml mt đông lạnh

Huyền phù nhẹ nhàng

Mục đích: Tránh phơi nhiễm khi cấy chuyền, tiết kiệm mt nuôi, trữ tế bào cho những nghiên cứu sâu

Cho mt đông lạnh vào từ từ => Tránh shock tế bào

Môi trường đông lạnh: 2X -> Sử dụng ở nồng độ 1X

Môi trường đông lạnh chứa DMSO, Glycerol

Quy trình đông lạnh: 4 độ -30’ => -20 độ - 1h => -80 độ - 16 h => -196 độ - dài hạn

Ly tâm 1100 rpm, 5’

Thu cặn 1ml mt nuôi, huyền phù đều

Chuyển vào flask có sẵn 2ml mt

Thao tác nhẹ nhàng, không cần huyền phù, tránh thao tác nhiều => Tế bào yếu

Cho nhẹ nhàng, từ từ, huyền phù trên mặt

III.2.7/ Xác định tỷ lệ sống chết của tế bào:

Chuẩn bị buồng đếm của tế bào

Pha loãng tế bào bằng PBS

Trộn tế bào với Trypan blue: 1/1

Rửa và lau khô => Đếm chính xác

Chuyển tế bào lên buồng đếm

Xác định mật độ, tỷ lệ sống chết

Nguyên tắc: Trypan blue bắt màu tế bào chết, không bắt màu tế bào sống

Tế bào sống: sáng, không bắt màu xanh

Tế bào chết: bắt màu xanh

Thu mMSC từ tủy xương chuột

Thu mẫu sơ cấp

 Cắt phạm đầu sụn của xương đùi => Nguy cơ nhiễm.

 Cắt đầu xương: mẻ một đầu xương

• Thu được xương đùi, xương cẳng chân

• Thu được hỗn hợp tế bào từ tủy xương chuột

Hình 1: Hình tế bào nuôi sơ cấp ở vật kính 5X, 10X, 20X (từ trái sang)

Số thứ tự Kích thước Hình dạng Loại tế bào dự đoán

Hình 2: Hình tế bào nuôi sơ cấp trước khi thay môi trường ở vật kính 5X, 10X, 20X.

→ Màu mt: đỏ -> vàng cam, trong

=> CO2 ↑, pH giảm, Phenol red đổi màu; không nhiễm.

→ Có tế bào không bám, bám (trải, chưa trải).

→ Tế bào phân

bố không đều.

→ Vẫn còn một

số tế bào không bám.

→ Màu môi trường: vàng cam.

→ Tế bào bám, mọc thành cụm, mọc chồng lên nhau => Không xác định được mật độ

→ Hình dạng: polygonal

Hình 4: Hình tế bào MCF7 trước khi cấy chuyền ở vật kính 5X, 10X, 20X

1) Kết luận:

 Qua thu mẫu sơ cấp, thứ cấp quần thể tế bào từ tủy xương => Thu được tế bào nghi ngờ là tbg trung mô

 Vì lần đầu tiên làm, có nhiều thiếu sót nên số lượng tế bào thu được không nhiều, không đủ để thực hiện cấy chuyền (bằng cell scrapper), đông lạnh dòng tế bào này.

 Nắm được các thao tác cấy chuyền (bằng trypsin), đông lạnh bảo quản, hoạt hóa trên dòng tế bào MCF7 Sau hoạt hóa, tế bào MCF7 vẫn sống với tỉ lệ lên đến 90.08%.

 Trong cả khóa thực tập, không ghi nhận trường hợp nhiễm.

 Nhận diện được hình dạng của các dòng tế bào khác nhau: MSC (giống nguyên bào sợi), MCF7(hình Polygonal)

2) Kiến nghị:

 Phương pháp xa hơn để xác nhận MSC: marker bề mặt (+CD73, +CD90, +105, CD45, CD34, CD14, CD79_alpha, -HLA_DR), cho biệt hóa thành xương, sụn, mỡ,…

- Cẩn thận hơn trong thao tác thu tế bào để thu được nhiều tế bào hơn.

 Nâng cao kĩ thuật đếm tế bào.

 Được cấy chuyền dòng MSC tự thu.

II/ Mẫu vật

Nắm được: Các thao tác trên giao tử đực và cái.

Phương pháp thụ tinh trong ống nghiệm.

Quá trình phát triển của phôi.

Chuột nhắt trắng 6-8 tuần, 18-22g

1 Tiêm chuột

a) Tiêm hoormon:

- Cầm chuột ngửa, dốc ngược chuột xuống => tránh tiêm vào nội tạng.

- Tiêm vào khoang bụng tại vị trí: giao điểm của hai đường chéo nối 2 cặp vú dưới.

- 5h45’ 03/11 tiêm PMSG: 0.1ml (100IU/ml) Sau 46-48h 17h15’ tiêm hCG: 0.1 ml

(100IU/ml).

b) Tiêm thuốc mê Ketamin:

- Tiêm vào bó cơ đùi.

- Mũi kim song song với xương đùi.

- Liều: 0.1 ml

2 Lọc dầu khoáng:

- Giữ màng lọc vô trùng.

- Hút dầu khoáng ở lớp trên (vì lớp dưới là nước).

- Khi bơm dầu khoáng qua màng lọc, bơm từ từ.

3 Tạo vi giọt:

• Các vi giọt không được chạm vào nhau, không chạm vào thành.

• Dầu khoáng phải phủ kín vi giọt => Tránh nhiễm, tránh thay đổi nồng

• Kim đầu lớn: kéo chậm, đoạn kéo ngắn, góc kéo 135o

• Kim đầu nhỏ: kéo nhanh, đoạn kéo dài, góc kéo 135o

• Mài nhẹ, cách đầu kim khoảng 3cm, tránh để mẻ đầu kim.

1 Thu giao tử cái:

• Thu buồng trứng, ống dẫn trứng và một phần tử cung.

• Thu cụm trứng tại đoạn bóng: 4-5 trứng, các tế bào trứng trong suốt, dính với nhau bao quanh bởi các tế bào cumulus.

• Chuyển cụm trứng sang giọt hyaluronidase để tách riêng và loại bớt cumulus.

• Trong quá trình chuyển trứng sau đó làm mất trứng do thao tác không cẩn thận.

2 Thu giao tử đực:

• Thu nhận mào tinh và ống dẫn tinh.

• Thu tinh dịch tại khúc gấp đầu ống dẫn tinh.

• Swim-up và thu nhận 0,3ml dd đem đi đánh giá.

Số lượng

(25 ô)

Sống + di động Sống + không di động Chết Độ di động Tỉ lệ sống Mật độ

V fer (2.5 x10 6 tt/ml)

So với nhóm 8:

Mật độ tinh trùng là 0,74 x 106 (tt/ml).

% tinh trùng sống: 91,9%.

• Đánh giá trứng:

1) Trước khi thụ tinh.

2) Sau khi thụ tinh.

3) Đánh giá tỷ lệ phôi sống chết sau thụ tinh:

Hình 1: Hình của trứng trước khi thụ tinh của nhóm 5.

• Màng tế bào tròn đều rõ

• Màng zona nguyên vẹn

• Có thể cực thứ nhất.

 Màng tế bào còn nguyên

 Có 1 thể cực

 Tế bào chất co lại => trứng chết (do không thụ tinh được)

Hình 2: Hình của trứng sau khi thụ tinh của nhóm 5.

Hình 3: Kết quả nhuộm huỳnh quang miễn dịch: không nhuộm, nhuộm

Hoechst, nhuộm PI (từ trái sang) của nhóm 5.

 Nhuộm Hoechst: Sáng

 Nhuộm PI: Sáng

=> Trứng chết (vì chưa được thụ tinh)

1 Phân biệt và nhận biết chính xác các cơ quan sinh sản của chuột đực và chuột cái Tránh cắt sai, nhầm lẫn với cơ quan khác.

• Mổ chuột cái thu buồng trứng và một phần ống dẫn trứng: mổ phần ½ dưới nửa thân dưới của chuột cái.

• Mổ chuột đực thu mào tinh và một phần ống dẫn tinh: phần ½ trên nửa thân dưới của chuột đực.

• Thao tác mổ chuột nhanh, chính xác, tránh nhiễm trùng, khâu vết thương chặt và đúng phương pháp.

2 Thu giao tử cái cần đúng thời gian.

3 Hiểu rõ nguyên tắc của các thí nghiệm, các bước tiến hành trước khi thao tác.

4 Khi đếm tinh trùng trên buồng đếm hồng cầu: phân biệt được tinh trùng và các loại tế bào bị trộn lẫn vào.

5 Phân biệt được các hình thái của trứng tốt, trứng xấu, trứng trưởng thành, trứng đã thụ tinh, phôi sống, phôi chết.

6 Theo dõi quan sát hình thái của phôi liên tục để nhận biết những thay đổi kịp thời.

1) Kết luận :

• Xác định được cơ quan sinh sản đực và cái ở chuột=> thu được giao tử đực và cụm trứng- cumulus.

• Không thu được trứng => thao tác sai dẫn tới mất trứng.

• Tạo vi giọt thụ tinh và nuôi phôi Không thực hiện thụ tinh và nuôi phôi do không có trứng (mất trong quá trình thao tác).

• Biết được hình thái phát triển phôi qua các giai đoạn (theo dõi kết quả của nhóm

1 Giáo trình thực tập chuyên ngành Công nghệ sinh học Y dược.

2 Sách Công nghệ Tế bào gốc

3 Sách Công nghệ hỗ trợ sinh sản

4 Sách Công nghệ sinh học trên người và động vật