công nghệ DNA

• Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận thường là vi khuẩn E.coli• Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng vi khuẩn mang gene tái tổ hợp • Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra

CÔNG NGHỆ GENE (GENETICS ENGENEERING)

Nguyễn Vũ Phong

Chương II

• Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (thường là vi khuẩn E.coli)

• Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng vi khuẩn mang gene tái tổ hợp

• Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra sản phẩm

1 Enzyme

1.1 Restriction endonuclease enzyme (RE)

- 1962: hạn chế sự sinh sản của phage trong tế bào vi khuẩn

- Hệ thống hạn chế - biến đổi (restriction – modification system) giúp bảo vệ

tế bào khỏi sự xâm nhập của DNA lạ.

- Trình tự nhận biết: trình tự 4-6 cặp nu đối xứng đảo ngược (palindrom)

- Cắt tạo thành đầu so le (sticky end) hay đầu bằng (cohesive end)

- Quy tắc đặt tên: EcoRI

1 Enzyme

1.2 Enzyme nối (Ligase)

- Nối : hình thành cầu phosphodiester

AATTC

G

G CTTAA

Ligas e

G CTTAA

AATTC

G

Ec oRI EcoRI

GAATTC CTTAAG

GAATTC CTTAAG

G CTTAA AATTC

G

Ligation (ligere = latin ‘to join’)

1 DNA Ligase reacts with an AMP donor in

an ATP (or NAD + dependent manner depending on the source of ligase)  activated enzyme.

2 Activated enzyme donates AMP to free

5’-PO4= at the nick in the lower strand of the DNA duplex, creating a high-energy diphosphate group on one side of the nick.

3 Cleavage of the di-phosphate bond

liberates energy to create a new phosphodiester bond Seals the nick in the DNA.

N.B Reaction can occur on Both Strands,

allowing joining of two independent DNA molecules.

polyribonucleotide tổng hợp

• c-DNA có thể tổng hợp

thành c-DNA kép (c-DNA duplex) nhờ DNA polymerase c-DNA kép được dùng trong việc tạo dòng c-DNA

2 Các vector chuyển gene

Plasmid:

- DNA vòng tròn

- Sao chép độc lập trong tế bào

- Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein

Vector:

- Có khả năng tự tái bản

- Tồn tại độc lập trong tế bào

- Mang được gene mong muốn

Yêu cầu đối với vector chuyển gene.

- Có trình tự khởi đầu sao chép (ori)

- Trình tự nhận biết cho RE

- Trình tự điều hòa (promoter)

- Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp

- Có gene đánh dấu (marker) để dễ dàng nhận biết.

2 Các vector chuyển gene

Ứng dụng của vector chuyển gene

- Tạo dòng và khuyếch đại trình tự DNA

- Nghiên cứu sự biểu hiện của đoạn trình

2.1 Vector chuyển gene plasmid

- Plasmid của vi khuẩn và bacteriophage

- pBR322

2 Các vector chuyển gene

- Dùng lập thư viện gen

2 Các vector chuyển gene

2.4 Phagemid

2.6 Nhiễm sắc thể nhân tạo

của nấm men (YAC-yeast

3 Hệ thống tế bào chủ (Host)

Mục đích:

- Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng

- Biểu hiện gene

- Sản xuất protein tái tổ hợp

3.1 Escherichia coli (E.coli)

- Dễ nuôi cấy và nhân dòng

- Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau

- Vi khuẩn Gram-, hình que,

- Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base

3 Hệ thống tế bào chủ (Host)

3.2 Saccharomyces cerevisiae

- Đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật Eukaryote

- Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh

- Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có

đủ hoạt tính sinh học

- Sản xuất protein tái tổ hợp

- Sinh vật an toàn

3.3 Hệ thống tế bào thực vật

3.4 Hệ thống tế bào động vật

- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney)

- Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney)

- Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney

- Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary)

- Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người

- Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans

3 Hệ thống tế bào chủ (Host)

1 Lai nucleic acid

- Tách chiết và tinh sạch DNA và RNA

- Điện di trên gel

+

-Wells

Small Large

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

1 Lai nucleic acid

- Lai trên pha rắn

Southern blot, Northern blot, Western blot, Dot và slot blot

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

1 Lai nucleic acid

- Lai trên pha rắn

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

Dot và slot blot

dùng cho RNA và DNA

1 Lai nucleic acid

- Lai trên pha rắn

- Lai tại chổ

(in situ hybridisation): nghiên cứu nucleic acid tại chổ không cần phải tách chiết ra ngoài

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

2 Thu nhận gene

* Shotgun

* Ngân hàng/thư viện DNA bộ gene (Bank/Library of genomic DNA)

* Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron)

* Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

2 Thu nhận gene

* Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron)

* Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

3 Tạo plasmid tái tổ hợp

a) Dùng đầu so le

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

3 Tạo plasmid tái tổ hợp

a) Dùng đầu so le

b) Dùng các đoạn nối (linkers)

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

3 Tạo plasmid tái tổ hợp

a) Dùng đầu so le

b) Dùng các đoạn nối (linkers)

c) Dùng enzyme terminal transferase

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào

4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào

a) Hóa biến nạp

b) Điện biến nạp (electroporation)

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào

DNA coated golden particles

Gene gun

Cell division

A plant cell with

the new gene

Transgenic plant

Plant cell

Cell’s DNA

5 Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene

a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

5 Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene

a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

b) Tạo dòng

c) Sự biểu hiện của gene được tạo dòng

- Vector biểu hiện

Yêu cầu:

Số lượng hợp lý bản sao cho mỗi tế bào

Promotor biểu hiện

Trình tự bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốt

Sự ổn định lâu dài

Tránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các enzyme trong tế bào

PCR (Polymerase Chain Reaction)

2 Bắt cặp: lai giữa primers và dây

đơn DNA Nhiệt độ thay đổi tùy theo, khoảng 50 o C

3 Kéo dài : tạo dây DNA bổ sung

với tác động của polymerase

và dNTPs: 72 o C.

Lập lại chu kỳ khoảng 30-40 lần sẽ

tạo ra số lượng DNA cần khuếch đại đủ quan sát trên gel qua quá trình điện di

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Sequencing

1 Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert

Sequencing

1 Phương pháp hóa học của Maxam và Gilbert

2 Phương pháp didesoxy của F Sanger

Ứng dụng công nghệ gene

1 Khai thác DNA các bộ gene

1.1 Genomics:

- Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng

- Phát hiện, bảo tồn sự đa dạng sinh học, sử dụng chúng.

1.2 Proteomics

- Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến

đổi (modification), sự tương tác (interactions), chức năng (function)

- Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh.

1.3 Human Genome Projet

1.4 Các ngành học khác

- Cellomics

- Metabolomics

- Ionomics

* Nối các đoạn gene tạo protein dung hợp (fusion protein)

* Làm mất đoạn hoặc tăng đoạn gene

* Thay thế nucleotide

- Micro array và Biochips

5 Vi sinh vật chuyển gene

6 Thực vật chuyển gene

7 Động vật chuyển gene

1 Khai thác DNA các bộ gene

8 Công nghệ gene đối với sức khỏe con người

Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

* Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân

Hết chương II Còn 4 chương lý thuyết và 8 seminars

Hẹn tuần sau !