Kĩ thuật di truyền Thầy TKQ

– Kỹ thuật gene Gene engineering hay Công nghệ gene Genetic technology hay gentech KỸ KỸ THUẬT THUẬT DI DI TRUYỀN TRUYỀN – Thao tác gene Gene manipulation – Tạo dòng phân tử Molecular cl

Các tên gọi khác:

– Kỹ thuật tái tổ hợp DNA (DNA recombinant technology).

– Kỹ thuật di truyền (Genetic engeneering). 

– Kỹ thuật gene (Gene engineering) hay Công nghệ gene (Genetic technology hay gentech)

KỸ

KỸ THUẬT THUẬT DI DI TRUYỀN TRUYỀN

– Thao tác gene (Gene manipulation) – Tạo dòng phân tử (Molecular cloning) 

NGHIÊN

NGHIÊN CỨU CỨU VÀ VÀ ỨNG ỨNG DỤNG DỤNG KTDT KTDT

‐Trong lĩnh vực y tế:

+ Chẩn đoán các rối loạn di truyền (trên nhiễm sắc thể)

+ Phát hiện các tác nhân ngoại lai (vi khuẩn, virus lây nhiễm…)

‐Trong nông nghiệp

+ Cấy ghép gene quý vào thực vật: tăng khả năng chống chịu, tăng năng suất

+ Chọn lọc, lai tạo giống động vật, thực vật…

SƠ

SƠ LƯỢC LƯỢC LỊCH LỊCH SỬ SỬ PHÁT PHÁT TRIỂN TRIỂN

Di truyền học cổ điển ra đời từ các nghiên cứu của Mendel

về các hiện tượng lai có kiểm tra

Thời gian nghiên cứu: 7 năm (1856-1863)

Đối tượng nghiên cứu: đậu Hà Lan (Pissum sativum)

Cỡ ẫ 37 000 â đậ à 300 000 h t đậ 1865

Cỡ mẫu: ~37.000 cây đậu và 300.000 hạt đậu

7 cặp tính trạng nghiên cứu:

SƠ

SƠ LƯỢC LƯỢC LỊCH LỊCH SỬ SỬ PHÁT PHÁT TRIỂN TRIỂN

1865

Mỗi cây bố mẹ luôn mang 2 “nhân tố”, nhưng ở mỗi bố

mẹ, chỉ có 1 trong 2 “nhân tố” được truyền cho thế hệ

con

“Nhân tố” của Mendel: “gene” ngày nay

SƠ

SƠ LƯỢC LƯỢC LỊCH LỊCH SỬ SỬ PHÁT PHÁT TRIỂN TRIỂN

Drosophila melanogaster‐ Thomas Hunt Morgan: tính trạng liên kết giới tính 1908

SƠ LƯỢC LƯỢC LỊCH LỊCH SỬ SỬ PHÁT PHÁT TRIỂN TRIỂN

James D Watson và Francis H.C.Crick

‐DNA được di truyền trong gia đình  quan hệ huyết thống

‐ Làm thế nào để chứng minh một bệnh là do di truyềnCác nghiên cứu về con song sinh  tìm hiểu về sự biểu hiện gene và

‐ Các nghiên cứu về con song sinh  tìm hiểu về sự biểu hiện gene vàtương tác giữa gene với môi trường

‐ Xác định các gene liên quan đến bệnh

NGHIÊN

NGHIÊN CỨU CỨU DNA DNA Ở Ở NGƯỜI NGƯỜI

‐ Bác sĩ, các nhà khoa học đọc thông tin về DNA, nghiên cứu, thay đổi, 

chỉnh sửa DNA

 Giới hạn đến đâu?

ĐẠO ĐẠO ĐỨC ĐỨC TRONG TRONG NGHIÊN NGHIÊN CỨU CỨU VÀ VÀ ỨNG ỨNG DỤNG DỤNG

do sự bất thường ở vật liệu di truyền, thừa một

2 Nếu có, các gánh nặng xã hội và bản thân sẽ được giải quyết như thế nào

3 Nếu không, cần quyết định ở thời điểm nào?

ĐẠO ĐẠO ĐỨC ĐỨC TRONG TRONG NGHIÊN NGHIÊN CỨU CỨU VÀ VÀ ỨNG ỨNG DỤNG DỤNG

Ông của bạn mất khi bạn còn nhỏ vì bệnh huntington Đây là

bệnh di truyền, và bạn cũng có khả năng mang bệnh Bạn

- Thường xảy ra ở người Tây Âu hơn là ở châu Á hoặc Phi

- Chưa có biện pháp chữa trị

Bệnh Huntington

ĐẠO ĐỨC ĐỨC TRONG TRONG NGHIÊN NGHIÊN CỨU CỨU VÀ VÀ ỨNG ỨNG DỤNG DỤNG

KỸ

KỸ THUẬT THUẬT DI DI TRUYỀN TRUYỀN

Tình huống 5: Người dân

Chính phủ đưa ra dự luật yêu cầu mọi người dân phải đến các

cơ sở y tế, “nộp” vài ml máu của mình để lập ra cơ sở dữ

liệu di truyền trên toàn quốc nhằm kiểm soát vấn đề tội

phạm và là một trong các biện pháp rà soát, loại trừ các án

oan Bạn sẽ bỏ phiếu thuận hay phiếu chống?

- Đối với những bệnh không thể chữa trị và có thời gian biểu hiện bệnh lâu, kỹ thuật chẩn đoán sẽ không được áp dụng

- Đối với chẩn đoán trước sinh, những rối loạn di truyền nghiêm trọng và không thể chữa trị sẽ được chỉ định ngưng thai kỳ

ĐẠO ĐẠO ĐỨC ĐỨC TRONG TRONG NGHIÊN NGHIÊN CỨU CỨU VÀ VÀ ỨNG ỨNG DỤNG DỤNG

KỸ

KỸ THUẬT THUẬT DI DI TRUYỀN TRUYỀN

chẩn đoán sẽ không được áp dụng

Đối với những thai nhi được xác định có mang bất thường dù rất nhỏ, nó có thể được loại bỏ không?

- Các biến đổi di truyền trên tế bào sinh dục không được chấp nhận.

- Gene bệnh không phải là gene trội so với gene được ghép

- Biểu hiện của gene phải ổn định, có tính đặc hiệu tế bào, tế bào chuyển gene

phải tồn tại trong cơ thể ghép

- Phải được thử nghiệm lâm sàng và được chứng thực trước khi đưa vào sử

Y học trị liệu: Liệu pháp gene

Y học trị liệu: Liệu pháp gene

dụng trên người.

- Tránh được sự tương tác có thể xuất hiện giữa tế bào được ghép và tế bào

sinh dục

- Là liệu pháp được sử dụng sau cùng khi không có biện pháp xử lý khác.

- Phải được một Ủy ban đặc biệt (về đạo lý sinh-y học) chấp nhận.

=> Rất ít các liệu pháp gene được ứng dụng trong chữa trị bệnh

Con người xã hội và kiểu gene

‐ Kỹ thuật gene có thể giúp xác định giới tính phôi thai từ rất sớm => mất cân bằng tỷ lệ trẻ

sơ sinh nam nữ và vi phạm trầm trọng đến quyền được sống của mọi con người.

‐ Hầu hết các đặc điểm của một cá nhân đều được quy định từ gene, nhiễm sắc thể => ý  tưởng quản lí mọi công dân thông qua kiểu gen của họ giống như các đặc tính về vân tay,  chiều cao, màu mắt

+ Vào năm 1979, hàng ngàn người Nga đã bị tử vong do nhiễm vi khuẩn bệnh

than (Bacillus anthracis) Nguyên nhân được cho là do sự bất cẩn trong khâu bảo quản

vi khuẩn này

Ứng dụng công nghệ gene trong công nghiệp

Vào năm 1925, Hiệp định Geneve nghiêm cấm việc sử dụng vũ khí hóa học và sinh học, nhiều quốc gia đã tham gia đạo luật này (Hoa Kỳ và Nhật Bản chỉ tham gia 50 năm sau).

Hiệp định không cấm các nghiên cứu về biện pháp chống lại vũ khí hóa học, sinh học

1 Hiệp định về vũ khí sinh học có được nghiêm chỉnh chấp hành không?

2 Việc bảo quản vũ khí sinh học được tiến hành như thế nào

Ứng dụng công nghệ gene ở các nước đang phát triển

Công nghệ gene có tác động lớn đến sự tiến bộ của loài người

Ưu điểm:

- Nâng cao chất lượng sức khỏe của con người

- Nâng cao chất lượng môi trường sống

- Nâng cao năng suất và chất lượng của vật nuôi, cây trồng

Ứng dụng công nghệ gene ở các nước đang phát triển

Khuyết điểm:

- Tăng sự phân hóa giàu nghèo

- Tăng sự phân hóa giữa người thụ hưởng và người không được thụ hưởng

(các biện pháp chẩn đoán, điều trị )

- Các nước đang phát triển chịu hậu quả (nếu có) nặng hơn do không đủ năng

lực để kiểm soát.

Ứng dụng công nghệ gene ở các nước đang phát triển

- Công nghệ sinh học là công cụ quan trọng để cải thiện việc bảo toàn nguồn tài nguyên di truyền thực vật Nếu được sử dụng phù hợp, nền nông nghiệp ở các nước này sẽ phát triển tốt.

- Việc ứng dụng công nghệ sinh học ở các nước phát triển có thể gây thiệt hại cho ngành sản xuất các sản phẩm tương tự ở các nước đang phát triển: đường, vanilla,

- Các sáng chế ở các nước đang phát triển cần phải được ghi nhận vào bảo vệ bản quyền

Ứng dụng công nghệ gene ở các nước đang phát triển

quyền.

- Các nước đang phát triển có nguy cơ là nơi thử nghiệm các nghiên cứu vốn không được phép ở các nước phát triển.

Hội nghị quốc tế về công nghệ sinh học thực vật do TCA, FAO tổ chức tại Luxembourg (1989)

CNSH ở nước ta đã có những bước phát triển nhất định trong lĩnh vực y tế và trong

công – nông nghiệp.

- Sự phát triển CNSH phải phù hợp với sự phát triển của đất nước và xu thế chung của

thế giới

- Không sao chép các sách lược của các nước công nghiệp hóa.

Sự ứng dụng các kỹ thuật mới cần đi song song với biện pháp kiểm soát

Ứng dụng công nghệ gene ở nước ta

- Sự ứng dụng các kỹ thuật mới cần đi song song với biện pháp kiểm soát.

- Cần đưa ra và nghiêm chỉnh tuân theo các luật lệ liên quan đến lĩnh vực này.

Các nhân tố di truyền

Là các cấu trúc mang thông tin di truyền

‐ Nhiễm sắc thể mang thông tin di truyền thiết yếu của sự sống

‐ Các nhân tố không phải nhiễm sắc thể: ty thể, sắc lạp, plasmid, virus…

‐ Ty thể và lục lạp chứa DNA, không tồn tại độc lập

‐ Plasmid: DNA dạng vòng, có thể thể được nhân đôiđộc lập

‐ Virus: mang thông tin di truyền, không có cấu trúc tếbào

Nucleic acid – cấu trúc DNA ở tế bào eukaryote

Cuộn chặt: không phải là quá trình nén nhỏ ngẫu nhiên mà là hình thành những cấu trúc

phức tạp

31

Nucleosome: - đoạn DNA gồm 147 bp cuộn quanh lõi gồm 8 protein Histone

- đoạn linker dài ~80 bp

- đường kính chuỗi nucleosome khoảng 100 Å

Nucleic acid – cấu trúc DNA ở tế bào eukaryote

32

Sợi solenoid: đường kính 300 Å

Nucleic acid – cấu trúc DNA ở tế bào eukaryote

Trong nhân, các sợi solenoid tiếp tục kết hợp với các protein khác và cả RNA tạo

nên các cấu trúc cuộn xoắn cao với đường kính có thể lên đến 7000 Å: chromatine

Nucleic acid – cấu trúc DNA ở tế bào eukaryote

DNA được cuộn xoắn cực đại, trở thành nhiễm sắc thể, đường kính lên đến 14000 Å 

(nhiễm sắc thể ở trung kỳ, được nhân đôi gồm 2 nhiễm sắc tử dính nhau ở tâm động)

 tế bào phân chia

Nucleic acid – cấu trúc DNA ở tế bào eukaryote

37

Nucleic acid – trình tự DNA

- Kích thước DNA ở eukaryote không phản ánh kích thước và mức độ tiến hóa của sinh vật

- DNA ở prokaryote thường có dạng vòng, toàn bộ DNA đều mang thông tin di truyền

- DNA ở eukaryote bao gồm các trình tự mã hóa (exon) xen kẽ với các trình tự không

‐ DNA barcode

‐ Realtime PCR

‐ SSCP (Single stranded conformational polymorphism)

‐ LAMP (Loop‐Mediated Isothermal Amplification)

‐ Giải trình tự DNA thế hệ mới

Một số kỹ thuật thao tác trên gene

‐ Multiplex PCR

TKQuân và nnk(2004). Phát hiện các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não mủ bằng kỹ

thuật PCR mutiplex. Y học TpHCM, 8(1):58‐61

‐ Các kỹ thuật cơ bản: tách chiết DNA, Southern blot, xác định nồng độ

kháng sinh ức chế tối thiểu…)

Nuesch‐inderbinen M.T et al (1997). Survey and Molecular Genetics of SHV b‐

Lactamases in Enterobacteriaceae in Switzerland: Two Novel Enzymes, SHV‐11 and 

Một số kỹ thuật thao tác trên gene

‐ Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới: Next‐generation Sequencing

TÁCH CHIẾT DNA BẰNG PHƯƠNG PHÁP BOOM

Nguyên tắc:

Dựa vào đặc tính liên kết với nucleic acid của hạt silica trong môi

trường có Guanidinium thiocyanate (hiệu ứng Chaotropic)

Các bước tiến hành:

ớ 1 iải ế bà ới á biế í h i

Boom R. et al. (1990). Rapid and simple method for purification of Nucleic acid. Journal of clinical microbiology. 28(3):495‐503.

Bước 1: Ly giải tế bào với các enzyme biến tính protein

Bước 2: Thêm hạt silica bead và GuSCN vào dịch chiết

Bước 3: Thu silica có gắn DNA

Bước 4: Dung giải DNA ra khỏi hạt silica

Bước 5: Thu nhận DNA

MULTIPLEX PCR Nguyên tắc: nhân đôi DNA trong ống nghiệm sử dụng

Multiplex PCR sử dụng nhiều mồi để khuếch đại nhiều trình tựDNA khác nhau trong cùng một ống nghiệm

MULTIPLEX PCR Các lưu ý:

- Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR

- Tm của các mồi

- Kích thước của các sản phẩm PCR

NESTED PCR

- Là phương pháp cải biên từ PCR truyền thống để làm giảm thiểu sự tạo

thành các sản phẩm không mong muốn do sự bắt cặp không đặc hiệu của

Bacterial mating hay

Bacterial mating hay kỹ kỹ thuật thuật tiếp tiếp hợp hợp vi vi khuẩn khuẩn

Định nghĩa:

là kỹ thuật chuyển vật liệu di truyền giữa các tế bào vi khuẩn dựa

trên sự tiếp xúc trực tiếp hoặc thông qua cầu nối giữa 2 tế bào

Đặc điểm:

h ờ đ h là “ i ” i h ả h í h ì ó liê

-Thường được xem như là “mating”, sinh sản hữu tính vì có liên quan

đến trao đổi vật liệu di truyền

- Tế bào cho thường cung cấp các nhân tố di truyền di động: plasmid,

transposon Các plasmid này thường có hệ thống đảm bảo rằng tế bào

nhận không có nhưng nhân tố tương tự

- Vật liệu di truyền mới chuyển thường có lợi cho tế bào nhận, thường là

các đặc tính kháng kháng sinh, hoặc khả năng sử dụng một sản phẩm

trao đổi chất mới…

Bacterial mating hay Bacterial mating hay kỹ kỹ thuật thuật tiếp tiếp hợp hợp vi vi khuẩn khuẩn

Cơ chế:

Bacterial mating hay

Bacterial mating hay kỹ kỹ thuật thuật tiếp tiếp hợp hợp vi vi khuẩn khuẩn

là nồng độ thấp nhất của kháng sinh có thể ngăn chặn sự pháttriển của vi khuẩn

MIC

MIC –– Minimum inhibitory Concentration Minimum inhibitory Concentration MIC MIC –– Minimum inhibitory Concentration Minimum inhibitory Concentration

MIC

MIC –– Minimum inhibitory Concentration Minimum inhibitory Concentration MIC MIC –– Minimum inhibitory Concentration Minimum inhibitory Concentration

RFLP

RFLP –– ĐA HÌNH VỀ KÍCH THƯỚC CỦA CÁC ĐOẠN ĐA HÌNH VỀ KÍCH THƯỚC CỦA CÁC ĐOẠN

TRÌNH TỰ BỊ CẮT BỞI ENZYME CẮT GIỚI HẠN

Nguyên tắc:

Phân biệt các trình tự DNA tương đồng dựa trên sự đa hình về

kích thước của các đoạn trình tự DNA được hình thành do khác nhau vị

trí nhận biết và cắt của các enzyme cắt giới hạn. 

RFLP RFLP –– ĐA HÌNH VỀ KÍCH THƯỚC CỦA CÁC ĐOẠN ĐA HÌNH VỀ KÍCH THƯỚC CỦA CÁC ĐOẠN TRÌNH TỰ BỊ CẮT BỞI ENZYME CẮT GIỚI HẠN

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

1 Tách chiết DNA mẫu cần phân tích

2 Cắt DNA bằng các enzyme cắt giới hạn chọn lọc

3 Điện di để phân tách các đoạn trình tự đã được cắt

4 Chuyển lên màng lai – lai Southern Blot với mẫu dò đặc hiệu với các

trình tự marker

5 Phân tích sự đa hình của các tín hiệu lai (các đoạn DNA), phân biệt

dựa vào kích thước các đoạn trình tự giới hạn

VÍ DỤ VỀ ỨNG DỤNG RFLP

Terminal RFLP (T

Terminal RFLP (T RFLP) RFLP)

DNA BARCODE

DNA barcoding là phương pháp phân loại sử dụng một trình tự DNA

ngắn đặc trưng của sinh vật làm đặc điểm nhận diện sinh vật

DNA BARCODE DNA BARCODE vs vs PHYLOGENY PHYLOGENY

Xác định một taxon chưa biết Xác định mối quan hệ giữa các

taxon

D à ột t ì h t /đặ điể Tí h t á ứ độ iố hDựa vào một trình tự/đặc điểm

đặc trưng của trình tự DNA của các taxon làm đặc điểmnhận diện

Tính toán mức độ giống nhaugiữa các taxon

QUY TRÌNH

1 Xác định trình tự DNA marker có thể thể hiện đặc trưng của các

taxon cần xác định

+ Động vật và nhiều eukaryote khác: gene mã hóa Cytochrome

Oxydase I (COI) trong mtDNA

+ Thực vật: gene rbcL and matK

+ Nấm: Vùng ITS (internal transcribed spacer)

SSCP

SSCP –– Single strand conformation polymorphism Single strand conformation polymorphism

Nguyên tắc:

Dựa trên sự đa hình về cấu trúc của các mạch đơn DNA có thành

phần nucleotide khác nhau Sự di chuyển với vận tốc khác nhau của các

cấu trúc khác nhau này qua quá trình điện di giúp phân biệt các trình tự

DNA khác nhau, dù chỉ 1 nucleotide

SSCP

Cơ sở khoa học:

Sự biến đổi của 1 nucleotide trong DNA mạch đôi không thể pháthiện được thông qua quá trình điện di, vì các tính chất vật lý của mạchđôi hầu như giống nhau giữa các allele

ấDNA mạch đơn trong môi trường thường cuộn lại tạo các cấutrúc bậc cao hơn Về mặt lý thuyết, các trình tự DNA khác nhau dù chỉ 1 nucleotide, sẽ hình thành các cấu trúc bậc cao khác nhau Sự khác nhau

về hình dạng của các trình tự DNA mạch đơn làm cho sự di chuyển củachúng trong gel qua quá trình điện di cũng sẽ khác nhau

Quy trình:

1 Tách chiết DNA nguyên liệu

2 Dùng kỹ thuật PCR, khuếch đại đoạn trình tự DNA mục tiêu

3 Biến tính DNA

4 Điện di trên gel biến tính (thường là gel polyacrylamide)

5 Nhuộm bạc, xác định các băng DNA

6 Phân tích, so sánh vị trí các vạch DNA

LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION

Nguyên tắc:

Dựa trên sự hoạt động của DNA polymerase và 4 mồi riêng biệt

để khuếch đại một trình tự DNA ở một nhiệt độ nhất định

LOOP LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION Các đặc điểm:

- Không cần bước biến tính DNA (tách DNA mạch đôi thànhmạch đơn)

- Toàn bộ phản ứng khuếch đại diễn ra liên tục ở một nhiệt độnhất định

- Hiệu quả khuếch đại cao

- Với 4 mồi có thể bắt cặp lên 6 trình tự xác định, kỹ thuật LAMP

có tính đặc hiệu cao

- Không đòi hỏi thiết bị hay hóa chất đặc biệt

- Sản phẩm khuếch đại bao gồm các đoạn trình tự lặp lại ngượcnhau xen kẽ nhau

- Có thể sử dụng RNA làm nguyên liệu (cần RTase)

LOOP

LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION

Đặc điểm các mồi và vị trí bắt cặp

LOOP LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION

- Chiều dài đoạn trình tự (khoảng cách F2 và B2) từ 120 – 180 bp

- Mồi FIP có thể bám lên mạch bổ sung (đang ở dạng mạch đôi,

liên kết lỏng lẻo nhau ở nhiệt độ khoảng 65oC)

- DNA polymerase bắt đầu kéo dài mạch, với hoạt tính

polymerase và thay thế mạch

LOOP LOOP MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION MEDIATED ISOTHERMAL AMPLIFICATION

Bước 3:

- Mồi F3 bám lên vùng F3c của DNA mạch khuôn, ngoài FIP, bắtđầu tổng hợp mạch bổ sung với mạch khuôn (giống như mạch bắt đầubằng FIP)