Công nghệ sinh học

Quá trình này bao gồm sự kết hợp lại của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững.. - Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau của acid nucleic có thể trộn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN : CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Lớp : DHO4SH

BÀI THUYẾT TRÌNH

LAI PHÂN TỬ

(DNA Hybridization)

1 Lê Duy Hoàng Chương

DÀN BÀI CHUNG

I-Lịch sử lai phân tử

II–Cơ sở của sự lai phân tử III-Các phương pháp lai phân tử IV-Ứng dụng của lai phân tử

Tài liệu tham khảo

I-Lịch sử lai phân tử:

- 1960 Julius Marmur và những đồng nghiệp của ông quản lý, ngành học tại đại học Harvard

đã khám phá ra quá trình ủ lại (reannealing)

Quá trình này bao gồm sự kết hợp lại của những mạch đơn thành các phân tử 2 mạch đôi bền vững Từ sự khám phá ra quá trình reannealing, phương pháp lai các sour nucleic được phát triển

- Sử dụng kỹ thuật những mạch bổ sung từ các nguồn khác nhau của acid nucleic có thể trộn lẫn thành dạng phân tử 2 mạch đôi được đặt tên

Sử dụng lai DNA như một kỹ thuật

so sánh dùng cặp base bổ sung để đối chiếu bộ gene chứa toàn bộ nội dung di truyền của 2 loài khác nhau và đánh giá những điểm tương đồng giữa chúng

 Mục đích :

Từ sự phát triển đó, việc lai phân tử mở rộng ra nhiều kỹ thuật khác nhau và được dùng vào những mục đích đa dạng

Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá

“nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hydro nối liền hai mạch.

II–Cơ sở của sự lai phân tử :

1–Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy “ của DNA :

Đường cong Tm

- Ảnh hưởng của các thành phần base trong phân tử DNA

- Ảnh hưởng của độ dài đoạn DNA

- Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch)

- Ảnh hưởng của môi trường phản ứng

2–Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ

nóng chảy” của DNA :

- Sau khi hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột

- Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình không gian vô trật tự Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được gíảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch sẽ bắt cặp trở lại

 Hiện tượng này được gọi là sự lai phân

tử (molecular hybridization).

3-Khái niệm về lai phân tử :

 Đặc hiệu tuyệt đối : sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn

bổ sung

 Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA

 Đặc điểm :

- Nồng độ DNA, nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất tiếp xúc với nhau càng tăng ;

 tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên

- Thời gian phản ứng càng dài thì xác suất tiếp xúc càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn

bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp

4-Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử :

4-1 Nồng độ DNA và thời gian phản

ứng

Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5 -10 lần Nồng độ NaCl > 1,2M lại hoàn toàn không còn tác dụng

4-2 Nhiệt độ

Thông thường tốc độ phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%

4-3 Độ dài của các trình tự

Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận với căn bậc hai của độ dài các trình tự bổ sung

4-4 Lực ion

III-Các phương pháp lai phân tử :

Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, cơ bản có thể chia thành 3 nhóm lớn :

- Lai trong pha lỏng

- Lai trên pha rắn

- Lai tại chỗ (in situ hybridization)

1-Lai trong pha lỏng :

- Các mạch đơn nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm

- Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ

1-1 Nguyên tắc :

1-2 Phân tích định lượng các phân tử lai :

- Phương pháp dùng quang phổ kế

- Phương pháp sử dụng nuclease S1

- Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

3 phương pháp thường được sử dụng:

- Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là hiệu ứng siêu sắc

(hyperchromic effect)

Hiệu ứng siêu sắc :

Nhuộm tím phân tử DNA , nếu đem chúng đun nóng lên và làm lạnh từ từ thì kết quả là các phân tử DNA sẽ trở nên tím đậm hơn lúc đầu một chút Nếu

hạ nhiệt độ một cách đột ngột thì chúng sẽ trở nên rất đậm Đó là do hiện tượng các mạch đơn DNA hấp thu tia UV mạnh hơn

- Nuclease S1 là enzyme thủy giải các nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong một số điều kiện thực nghiệm

- Dung dịch phản ứng lai được trích ra một phần, đem xử lí với nuclease S1

- Các mạch đơn sẽ bị thủy giải, các nucleic acid còn lại tương ứng với các phân tử lai được thu nhận qua phương pháp tủa rồi đem định lượng

ii Phương pháp sử dụng nuclease S1

iii.Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite

- Hydroxylapatite là những tinh thể phosphat

calci

-Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu

(đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với ADN,ARN hoặc với các protein ở trong các tế bào mà không cần tách chiết.

- Sau khi các hỗn hợp bị đốt nóng, chúng

được làm lạnh để những mạch đơn va chạm ngẫu nhiên Các hỗn hợp được ủ khoảng 120h ở 60 0 C trong một dung dịch đệm Natri

- Nhiệt độ này rất quan trọng bởi vì ở nhiệt

độ thấp, sự bắt cặp sai lệch sẽ thường xuyên hơn Tại 60 0 C, DNA chỉ bắt cặp với mạch bổ sung của nó vì đa số các base đủ cho mạch kép bền vững ở nhiệt độ này.

- Kế tiếp, 1 mẫu của mỗi thể lai mạch đôi

khác nhau tạo thành sẽ được đặt vào cột của hydroxylapatite đã được dìm trong chậu nước 55 0 C Khi mỗi thể lai tan chảy, nó được rửa sạch cho vào lọ nhỏ và năng lực phóng xạ của mỗi lọ được xác định Cuối cùng, 1 đường cong tan chảy sẽ được vẽ với những kết quả của thí nghiệm này.

1-3 Các ứng dụng của phương pháp lai trong pha lỏng :

Việc lai DNA có thể đo mức độ tương đồng về DNA của các loài khác nhau Những DNA lai tương đồng nhiều hơn sẽ tan chảy ở nhiệt độ cao hơn Kỹ thuật này cho thấy rằng người và tinh tinh mang DNA giống nhau nhiều hơn

so với DNA của đười ươi hay khỉ đột

a.Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở hai loài :

- Trong một trình tự DNA, một trình tự lặp lại nhiếu lần sẽ có nhiều cơ may gặp mạch bổ sung hơn so với một trình tự duy nhất

- Bộ gen của Eucaryote có trình tự lặp lại cao hơn ở Procaryote

b.Phân tích các trình tự lặp lại :

2-Lai trên pha rắn :

- Cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng

- Điểm khác biệt là 1 trong 2 trình tự bổ sung

Hình - Các bước lai trên pha rắn

+ Phân tích định lượng các phân tử lai kém chính xác.

+ Hiệu quả thấp

+ Vận tốc lai trên pha rắn <10 lần so với vận tốc lai trên pha lỏng do một phần các nucleic acid được cố định trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung

Khuyết điểm :

2-3 Ứng dụng của các phương pháp lai

trên pha rắn:

- Lai trên pha rắn có rất nhiều ứng dụng, hiện nay có 4 phương pháp cơ bản đó là:

Southern blot

 Northern blot

 Western blot

 Dot (slot) blot

- Nổi bật lên 3 phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất là phương pháp Southern, Northern và Dot blot

Southern Blot Northern Blot Western Blot

dùng agarose)

3) Chạy trên gel (thường dùng polyacrylamide gọi là

Northern Blot Western Blot

nitrocellulose ( thường bằng họat động mao dẫn

4) Chuyển lên màng

nitrocellulose ( thường do

chạy điện di)

5) Tắc nghẽn

với DNA dư

với DNA dư với RNA dư 5) Tắc nghẽn với RNA dư với protein dư 5) Tắc nghẽn với protein dư

6) Lai với mẫu

6) Lai với mẫu

dò kháng thể được đánh dấu

Hình – Chuyển DNA

từ gel lên màng lai

sự kiểm soát nghiêm ngặt)

7) Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết

8) Phóng xạ

tự ghi 8) Phóng xạ tự ghi 8) Phóng xạ tự ghi hay thể hiện

rõ với chất nền

có màu

Western blot

Những đặc tính quan trọng của 3 phương pháp :

RNA bị làm biến tính với formaldehyde

Protein bị làm biến tính với SDS

gene X có tính phóng xạ

DNA mang gene X có tính phóng xạ

Kháng thể chống lại protein X đã được đánh dấu phóng xạ hay enzyme

Southern Northern Western

biến mất đoạn, điểm hay tái tổ hợp trên 1 gen.

- Bao nhiêu mRNA của gene X hiện diện?

- Độ dài mRNA của gene X?

- Bao nhiêu protein X hiện diện ?

- Độ lớn của protein X?

 Dot blot:

- Cho phép định lượng tương đối một DNA hay RNA đặc trưng trong một hỗn hợp mà không cần phải tách chúng ra

- Kỹ thuật Dot (dot là khe) đơn giản hơn

nhiều so với các phương pháp khác vì:

 Không cần giai đoạn cắt bởi những

enzyme cắt giới hạn

 Không cần chạy điện di

- Kỹ thuật dot được dùng trong nghiên cứu những đoạn DNA ngắn

3-Lai tại chỗ :

3-1 Nguyên tắc :

- Lai tại chỗ được phát triển từ phép lai

Southern blot

- Kỹ thuật này sử dụng các mồi đánh dấu

(đoạn nucleotide hoặc kháng thể ) để lai với ADN, ARN hoặc với các protein ơ trong các tế bào mà không cần tách chiết

 Ứng dụng : định vị gen trên NST, phát

hiện dòng vi khuẩn tái tổ hợp, nghiên cứu

một RNA chuyên biệt trong tế bào và mô

3-2 Lai trên khuẩn lạc :

3-2 Lai trên nhiễm sắc thể :

- PP này cung cấp thông tin chính xác về vị

trí và sự phân bố của một trình tự DNA cần

tìm trên NST nhờ mẫu dò chuyên biệt

- Khi nghiên cứu với ARN, NST không được

ủ ở pH cao, do đó, chúng giữ nguyên ở

trạng thái sợi kép và không lai được với mồi

- Nhờ phương pháp này mà cơ chế hoạt

động của gien có thể quan sát được trong trong tổ chức mô

3-3 Lai trên tế bào và mô :

-Trong tế bào và mô, các mRNA có sự phân bố

không gian xác định Điều này có liên quan đến chức năng, sự điều hòa biểu hiện cũng như tương tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô.

-Nghiên cứu trên RNA đã tách chiết và tinh sạch

không cho phép thu nhận các thông tin vừa kể

→ sử dụng pp lai trên tế bào và mô.

- Mô được xử lí bằng các pp mô học (cố định, khử nước, tẩm parafin, cắt những lát mỏng (7-10µm), trải trên lam) Kết quả đọc trực tiếp

 Ứng dụng:

- Đối tượng có tổ chức phức tạp (não bộ), pp này giúp định vị chính xác vị trí và sự phân bố của một mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức

- Khi phối hợp pp miễn dịch tế bào và lai tại chỗ, giúp phát hiện đồng thời mRNA và protein của

nó → xác định được mối tương qua giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen

- Bằng cách lai nhiều lát cắt có cấu trúc gần như đồng nhất với nhiều mẫu dò khác nhau

→ xác định vị trí, sự phân bố và tương tác giữa các mRNA tham gia vào 1 quá trình sống.

IV-Ứng dụng của lai phân tử :

1)Một con thoi sinh học

động quay trở lại nhân nơi

mà chúng được sinh ra

- Các tác giả sử dụng kỹ thuật lai tại chỗ có sự hỗ trợ chất phát hùynh quang (fluorescence in situ

- Trong lĩnh vực y học, dùng

pp này với những con thú cần để thực thử nghiệm việc trị bệnh cho người Nếu một loài thú được tìm thấy có sự di truyền tương đồng với người qua việc lai DNA, có khả năng rằng những phương pháp chữa bệnh cho người được khám phá bởi việc thực hiện những cuộc phẫu thuật dựa trên kinh nghiệm về những loài thú.

2) Y học:

3) Chăn nuôi :

Trong ngành

Trong ngành thủy sản, dùng pp lai tại chỗ (in situ

tại chỗ (in situ hybridization) để

hybridization) để chẩn đoán bệnh

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu trong nước:

cơ bản trong CNSH

Tài liệu trên mạng:

1 Cac file lai PT qtrong\Bio-Strand 3D microarray for DNA, PCR hybridization.htm.

DNA hybridization.htm.

3 Cac file lai PT qtrong\Southerns, Northerns, Westerns, & Cloning Molecular Searching Techniques.htm

4.Cac file lai PT qtrong\Western Blot Method.htm 5.Cac file lai PT qtrong\Southern blotting.htm.

6.Sinh học Việt Nam Tin tức Một con thoi sinh học mới – tRNA_files.

7.Western Blot Activity_files.

8.History Genetic Similarities, Page 2 of 3.htm.

9.Isolation of DNA from Agarose and

Polyacrylamide Gels.htm.

10.Immunohistochemistry - In Situ

Hybridization.htm