Nuôi cấy mô tế bào

KHÁI NIỆMNuôi cấy mô- tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế b

KHÁI NIỆM

Nuôi cấy mô- tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh

trong ống nghiệm

CƠ SỞ SINH LÍ CỦA CÔNG NGHỆ

NUÔI CẤY MÔ- TẾ BÀO

 TÍNH TOÀN NĂNG:

Là khả năng của 1 tế bào hình thành 1 cây hòa chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, do trong tế bào

có chứa bộ AND(NST) hoàn chỉnh, chứa toàn

bộ thông tin di truyền cho 1 chu kì sống hoàn chỉnh.

AND mARN Protêin tính trạng

 Tùy từng tế bào, từng

loại mô, từng thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp hoạt động; các gen không cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của

cơ thể (do cơ chế điều hòa hoạt động của gen).

 SỰ PHÂN CHIA, PHÂN HÓA, PHẢN PHÂN HÓA

CỦA TẾ BÀO:

 Phân hóa: 1 tế bào 1khối tế bào(phân hóa) mô cơ

quan hệ cơ quan

 Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa thành các

mô chức năng riêng biệt nhưng vẫn có thể quay về

trạng thái chức năng phôi sinh ban đầu ki gặp điều

kiện thuận lợi

• Các đặc tính trên

được xác định dựa

trên cơ sở là đặc

điểm di truyền nhưng

sự thay đổi môi

trường cũng có ảnh

hưởng trực tiếp đến

các đặc tính đó

CÁC NHÂN TỐ ĐẢM BỎ THÀNH CÔNG TRONG CÔNG NGHỆ NUÔI

CẤY MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT :

 Đảm bảo điều kiện

CÁC BƯỚC TRONG KĨ THẬY NUÔI

CẤY MÔ- TẾ BÀO THỰC VẬT

 Tạo vật liệu khởi đầu: thường chọn chồi là

bộ phận nuôi cấy thích hợp nhất khử trùng

cấy trong môi trường khởi động để tái sinh

 Giai đoạn nhân nhanh: vật liệu khởi đầu được

chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung

Xitokinin để tái sinh 1 thành nhiều chồi.

 Giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh: tách riêng các chồi

cho vào môi trường tạo rể (bố sung Auxin)

mỗi chồi ra rể thành 1 cây hoàn chỉnh.

 Giai đoạn ra cây: cây trong ống nghiệm đủ

tiêu chuẩn (chiều cao, số lá, số rể) sẽ được

chuyển sang môi trường tự nhiên.

CÁC HÌNH TH C NUÔI Ứ

CÁC HÌNH TH C NUÔI Ứ

C Y MÔ Ấ

C Y MÔ Ấ

• Nuôi c y mô th c v tNuôi c y mô th c v tấấ ự ậự ậ

• Nuôi c y mô b ng t Nuôi c y mô b ng t ấấ ằằ ếế

bào tr nầ

bào tr nầ

NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

 Nuôi cấy mô của cơ

quan tách rời:

VD: củ cà rốt cắt lát tách mảnh mạch rây xử lí+ nuôi cấy mô phôi phôi nảy mầm cây non trong ống nghiệm cây trưởng thành

 Nuôi cấy từ mô hay

cơ quan:

VD: từ 1 mô lá tách

tế bào nuôi cấy trên đĩa Pêtri điều kiện thuận lợi sẽ hình

thành những cây non trồng chậu phát

triển cây trưởng thành

 Nuôi cấy đỉnh sinh

Nuôi cấy mô sẹo từ hạt phấn( Auxin rất quan trọng):

Nuôi cấy bao phấn có hạt phấn chín môi trường thuận lợi bao phấn chín

sẽ phân hóa bằng cách: nhân sinh sản sẽ tiêu biến nhân sinh dưỡng sẽ

nguyên phân tạo mô sẹo nuôi dưỡng cây đơn bội(n) xử lí cônxixin cây trưởng thành(đơn bội kép)

NUÔI CẤY MÔ BẰNG TẾ BÀO

SỰ CÔ LẬP VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN

 Sự cô lập :

Trước hết phải xử lí vật

liệu khởi đầu( lá, mô

sẹo, dịch treo tế bào…)

với enzim phân hủy

vách( Xenlulaza,

HemiXenlulaza,

Pectolyaza…).

Ví dụ: phương pháp tạo tế bào trần từ lá:

Lá làm sạch lá bằng Clorox 10% rửa lại lá 3 lần bằng

nước cất tiệt trùng tách lớp biểu bì dưới của lá+ gây

co nguyên sinh 1h bằng Mannitol 10% enzim thu được

tế bào trần

 Sức trương tế bào

bình thường thì được cân bằng với sức ép

cơ học của vách vách mất, để tế bào không

bị vỡ thì cho vào

những chất gây co

nguyên sinh

(CaCl2,KCl,Mannitol…) hòa tan trong Enzim

khi xử lí

SỰ NUƠI CẤY

Thành phần của mơi

trường nuơi cấy lỏng

hay đặc tùy thuộc vào

vật liệu thực vật.Mơi

trường này cĩ thêm

Auxin và Xitokinin để

giúp sự tái tạo vách

và các lần phân cia

đầu tiên

• Trong lần tự nhân đôi đầu tiên, môi trường

cách pha loãng môi

trường để giúp cho sự tăng trưởng tế bào

 Khi mô sẹo được hình thành cần chuyển

chúng vào trong môi trường rắn chứa

Auxin ở nồng độ thấp hơn và Xitokinin cao hơn

 Sau cùng kích thích

ra rễ cần loại

Xitokinin, tăng nồng

độ Auxin

• Thuận lợi cho sự

nghiên cứu về sinh

lí tế bào: tính thấm của màng, vận

chuyển các chất hòa tan, ion, cơ chế

hoạt động của

hoocmon thực

vật…

• Tế bào trần có thể

chịu các xử lí gây đột biến và được dùng để tạo ra các dòng tế

kĩ thuật chuyển

gen( bơm AND, hóa

thẩm, điện thẩm…)

MỞ RỘNG NUÔI CẤY MÔ

BẰNG KĨ THUẬT DUNG HỢP

TẾ BÀO TRẦN VÀ KĨ THUẬT

CHUYỂN GEN

SỰ LAI THỂ HỆ BẰNG KĨ THUẬT DUNG HỢP TẾ BÀO

bào trần tiếp xúc từ từ với các giọt PEG 25- 50%

• Điện dung hợp (tốtnhất): Khi đặt hỗn hợp 2 loại

tế bào trần trong 1

điện trường, các tế bào trần sẽ di chuyển, tiếp xúc nhau và xếp thành

1 chuỗi dài dưới lực

điện trường

Sau đó dùng xung điện ngắn đẻ tạo vết đứt ở màng, sự dung hợp sẽ xảy ra tại nơi tiếp xúc.

NHỮNG BIẾN ĐỔI CỦA TẾ

BÀO

• Phần lớn tế bào lai có bộ NST không bền, nhất là từ cha mẹ xa nhau, 1 vài NST bị hủy bỏ sau 1 vài lần phân bào Tính bền chỉ thấy được sau nhiều lần

nhân đôi

• Dung hợp tế bào trần có thể theo 2 kiểu:

 Dung hợp nhân 1 phần hay toàn phần: hình thành tế bào lai.

 1 trong 2 nhân cha mẹ được giữ: tế bào chất lai

Cả 2 đều mang gen trong tế bào chất

ÍCH LỢI VÀ TRỞ NGẠI CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO TRẦN

• Ích lợi: giúp loại trừ tính bất thụ hửu tính, tạo cây lai hữu thụ; Giúp chuyển những đặc tính có lợi vào cây trồng, ít đòi hỏi phương tiện phức tạp; Không cần hiểu biết chính xác về sự liên hệ giữa các gen,

S CHUY N GEN Ự Ể

CÁC KHÁI NIỆM VỀ KĨ THUẬT

DI TRUYỀN

Là sự dung hợp hai phân tử ADN có nguồn

gốc khác nhau hình thành một phân tử ADN lai( ADN tái tổ hợp) hoặc hình thành một

phân tử ADN lai gồm hai mạch: một mạch

là chuỗi PolyNu, mạch đối xứng là chuỗi

PolyRinu

Công nghệ di truyền (ứng dụng của

kĩ thuật di truyền) :

Là quy trình sử dụng kĩ thuật di truyền để sản xuất sản phẩm sinh học trên quy mô

công ngiệp để đáp ứng nhu cầu cho con

người Là quá trình có tính toán đến sản

phẩm, giá thành, kinh tế.

• Các Enzym công cụ :

Enzym cắt(restriction Enzym ): có khả năng nhận biết và cắt ADNsợi kép ở bhững vị trí rất chính xác.

Ligaza : nối liền 2 đoạn ADN bắng cách tạo các mối liên kết P dieste liên kết các Nu.

Véc tơ truyề n: Phân tử ADN nhỏ được dùng

để ghép đoạn ADN cần nghiên cứu gọi là véctơ truyền.

Thường dùng là Plasmid vi

khuẩn hay ADN virut.

Sự tạo dòng gen: Là quá trình cô lập và thu nhận nhiều bản sao giống nhau của

1 gen hay 1 đoạn gen dựa trên khả năng

tự nhân đôi của ADN Đây là cơ sở cho

sự tăng bội đoạn ADN cần nghiên cứu.

Sự sàng lọc và dò phân tử: Sự sàng lọc

là quá trình tuyển chọn các Vectơ

chứa đoạn ADN cần nghiên cứu Sự tuyển chọn thực hiện nhờ lai phân tử kết hợp với 1 dò phân tử

đánh dấu phóng xạ và có tính bổ sung và đối song với 1 vùng củ đoạn A.Nu cần nhận biết

S CHUY N GEN GIÁN TI P B I Ự Ể Ế Ở

AGROBACTERIUM

S CHUY N GEN TR C Ự Ể Ự

Hoá th m ẩ : dùng PEG và dùng t bào ế

Điện thẩm : dùng xung điện cao áp và tế bào trần.

Cơ sở củ điện thẩm là khi tế bào chịu sự tác động của xung điện cao áp, các lổ nhỏ tạm thời được tạo thành trên màng trở nên thấm, ADN vào tế bào được theo khuynh hướng nồng độ Tuy nhiên số lổ được tạo thành tăng theo điện thế cho tới 1 giá trị tới hạn( quá điểm này màng sẽ bị tổn thương không hoàn nghịch).

Sự thành lập các lỗ nhỏ có thể do:

Điện trường làm thay đổi cân bằng điện tích lớp P lipit màng

Tính lỏng tạo nên những chổ yếu tạm thời dễ bị đứt dưới ảnh hưởng của điện trường.

KĨ THUẬT BẮN ADN

• Các Plasmid có mang các gen lạ được cố đinh trên các hạt kim loại( vàng hay tungsten) có

đường kính 0.000006m nhờ lực hút tĩnh điện Các hạt kim loại- Plasmid này được bắn với

vận tốc lớn để xuyên qua vách, màng và xen vào bộ gen nhân tế bào đích

Màng tế bào có 1 tính dẻo hoàn hảo nên dễ dàng sửa chữa sau khi bị tổn thương

Các phân tử ADN tách khỏi hạt kim loại sau khi vào nhân tế bào gia nhập vào ADN NST của tế bào.

Ưu điểm : Nhanh, dễ thực hiện, ít công

đoạn, hiệu quả kinh tế cao không chuyên

biệt cho loài

Không đòi hỏi cô lập và nuôi cấy

tế bào trần.

Dễ phát hiện các tế bào có

mang gen được chuyển.

Tần số chuyển gen thấp.

• Cả phương pháp gián tiếp và trực tiếp: sau khi

tế bào thực vật đã mang gen đặc tính, chúng sẽ nguyên phân nhiều lần tạo ra1 khối tế bào phân hoá tạo mô cơ quan cây trưởng thành

• Thành tựu – ứng dụng của kĩ thuật

nuôi cấy mô bằng tế bào trần

và kĩ thuật chuyển gen

Bằng phương pháp dung hợp tế bào

trần và áp dụng kĩ thuật chuyển gen các nhà khoa học đã vượt qua mọi rào cản sinh học trong tự nhiên để tạo các tế bào lai và các giống thực vật mang các gen mong muốn Góp phần quan

trọng trong việc cải tiến giống cây

trồng, tăng năng suất

 Tăng tính chống chịu với các điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng bất lợi

cánh cứng (bằng cách chuyển gen mã hoá tổng hợp

thuốc trừ sâu trong cây thực vật)

 Tăng khả năng phòng trừ bệnh cây

 Tăng năng suất cây trồng

 Tạo thức ăn chứa kháng thể đặc hiệu cho gia súc

Tuy nhiên cũng có một số hạn chế

 Ảnh hưởng sức khoẻ cộng đồng

 Ảnh hưởng môi trường sinh thái

 Aûnh hưởng kinh tế chính trị xã hội