công nghệ sản xuất insulin

Insulin và trao đổi hydratcacbon - Insulin tuần hoàn trong máu, khi gắn với thụ thể trên màng tế bào tạo ra phức hợp thụ thể - insulin làm phát tín hiệu truyền thông tin chuyển glucoz ra

C¸n bé HDKH: TS §µo Xu©n t©n Häc viªn: §µo thÞ ngäc anh

K11- Sinh häc thùc nghiÖm

1.1 Cấu trúc phân tử insulin

Insulin là một hoocmon protein do tế bào tuyến tụy sinh ra Phân tử protein insulin có khối lượng khoảng 6000da Cấu tạo bởi hai chuỗi

polypeptit A và B Các chuỗi A và B liên kết với nhau bằng hai cầu nói đisulfua Hầu hết các loài chuỗi A gồm 21aa; chuỗi B có 30aa.

Hình 1: Cấu trúc phân tử insulin

1.2 Vai trò sinh học của insulin

Insulin là một trong những hoocmon điều hoà nồng độ glucoz trong máu

1.2.1 Insulin và trao đổi hydratcacbon

- Insulin tuần hoàn trong máu, khi gắn với thụ thể trên màng tế bào tạo ra phức hợp thụ thể - insulin làm phát tín hiệu truyền thông tin chuyển glucoz ra khỏi huyết

tương.

Hình 2:Insulin gắn với thụ thể trên màng tế bào và tuần hoàn trong máu

- Insulin thúc đẩy gan dự trữ glucoz ở dạng

glycogen Glucoz bị photphoryl hoá nhờ enzym hexokinase nhờ đó glucoz bị bẫy vào trong tế

bào.

- Insulin ức chế hoạt động của glucoz - 6

photphatase Khi không có mặt insulin, quá trình tổng hợp glycogen bị dừng lại và các enzym

phân huỷ glycogen hoạt động.

Insulin ngăn cản lượng đường

quá cao trong máu nên

không được có quá nhiều

insulin, do đó enzym

insulinase kiểm soát mức

độ insulin

Khi lượng insulin quá cao

enzym insulinase sẽ phân

huỷ hoocmon này với thời

gian 6 phút

Quá trình này đảm bảo cho

hàm lượng insulin được ổn

định trong máu và lượng

glucoz không bị giảm

xuống mức nguy hiểm. Hình 3: insulin điều hoà glucoz trong máu

 1.2.2 Insulin và trao đổi lipit

a- Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp các axit béo trong gan

Khi lượng glycogen trong gan quá cao (> 5% lượng thô của gan) thì quá trình tổng hợp bị ức chế Lượng glucoz hấp thụ vào tế

bào gan chuyển sang tổng hợp axit béo và chuyển khỏi gan ở

dạng lipoprotein

do cho các mô khác như mô mỡ để tổng hợp triglyxerit

b- Insulin ức chế phân huỷ chất béo trong mô mỡ: bằng cách ức chế quá trình thuỷ phân triglyxerit thành glixerol và axit béo tự do

Enzym nhạy cảm với hoocmon này trở nên hoạt động được khi

photphoryl hoá Insulin làm ngăn cản sự kết hợp với thụ thể trên màng tế bào Do đó làm tăng sự tích tụ triglyxerit trong tế bào các mô mỡ

1.2.3 Những tác động khác của insulin

hấp thụ của các axitamin.

thấm các ion kali, magie và

photphat vô cơ tạo điều

kiện cho quá trình

photphoryl hoá và sử dụng

glucoz.

Hình 4: Insulin làm tăng tính thấm các ion kali,

magie và photphat vô cơ

1.3 Tổng hợp insulin trong cơ thể

Insulin được tổng hợp trong tế bào β của tuyến tụy

Insulin được tạo ra từ một phần của một protein lớn hơn để

đảm bảo sự gấp nếp đúng.

mARN dịch mã protein preproinsulin Preproinsulin gồm một trình tự đầu aa để tiền chất này đi qua lưới nội chất tham gia vào quá trình sau dịch mã.

Tại quá trình sau dịch mã preproinsulin bị thuỷ phân tạo thành dạng proinsulin Sau khi hình thành 3 cầu đisulfua một

số peptitdaza cắt proinsulin thành insulin hoàn chỉnh và hoạt động

Insulin được đóng gói và chứa trong các hạt tiết tích tụ

Hình 5: Tổng hợp insulin trong cơ thể

Hình 6 : Các bước cải biến sau dịch mã của phân tử insulin

Hiện nay công nghệ ADN tái tổ hợp được sử dụng để sản xuất.

2.1 Phương pháp 1

chất chuỗi đơn proinsulin người, sau đó phân cắt để tạo thành

insulin hoàn chỉnh

tử tách được gen mã hoá proinsulin người trên nhiễm sắc thể

số 11

của người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để

khuếch đại gen Do hầu hết các mARN của người đều có đuôi polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với đuôi polyA đó

quá trình dịch mã; còn lại loại bỏ ADN và các ARN khác

Hình 7: Tách mARN của gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ của người

Bước 2: Tách và thiết kế plasmit tái tổ hợp.

- Cắt gen mã hoá proinsulin và plasmit bằng một loại enzym giới hạn Nối bằng ADN ligase của phageT4

-Thiết kế các trình tự mã hoá cho các protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin ra ngoài tế bào chất

+Nếu sử dụng mARN tách được từ trên tiến hành như sau:

- Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược và nhờ các dNTP (trong phản ứng RT - PCR)

- Cài đoạn cADN mã hoá insulin hoàn chỉnh vào plasmit đứng sau một

Bước 3: Biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli nhờ phương pháp trộn với dung dịch ion Ca hoặc tạo lỗ xung điện Sau quá trình biến nạp, cần

chọn lọc được những dòng vi khuẩn mang gen mong muốn

Hình 8: Tách và biến nạp plasmit tái tổ hợp vào E.coli

Bước 4: Các vi khuẩn chuyển gen sau đó được đưa vào lên

men.

Nuôi chúng trong nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, các chất dinh dưỡng được bổ xung thường xuyên để đảm bảo sự tăng trưởng của vi khuẩn theo hàm số mũ

Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩn được nhân lên qua nguyên phân Chỉ sau một thời gian ngắn, sinh khối tăng lên rất nhanh và gen insulin được tổng hợp

vào nồi lên men.

 Bước 5 : Tiền tinh sạch

Sau khi lên men cần tách tế bào và khử trùng

Bước 6: Hoạt hoá.

Do hệ thống E.coli có khả năng biểu hiện gen insulin

nhưng không có khả n ă ng hoạt hoá insulin

Hoạt hoá proinsulin invitro bằng cách xử lý dung dịch

đệm, giúp nó đạt cấu trúc bậc 4, sau đó dùng enzym

đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi đó sản phẩm

thu được mới có hoạt tính cần thiết

H ình 11: Hoạt hoá proinsulin thành insulin hoàn chỉnh

được đánh giá qua mỗi

giai đoạn trung gian của

quá trình sản xuất nhờ

phòng thí nghiệm chuyên

hoá Cuối cùng insulin

được tinh thể hoá.

Hình 12: Các tinh thể insulin

2.2 Phương pháp 2

- Xác định trình tự ADN để sản xuất chuỗi A và B Qua đó

tổng hợp và tách hai dòng gen này

- Mỗi ADN được chèn vào plasmit Sau đó sản xuất tương tự như sản xuất proinsulin.

- Cuối cùng hai chuỗi A và B được trộn với nhau và hình

thành cầu nối đisulfua qua phản ứng tái oxi hoá khử nhờ một chất oxi hoá nhất định

Ngày nay, nấm men cũng được sử dụng để sản xuất insulin

Có nhiều ưu điểm: tế bào nấm men tạo phân tử insulin người gần như hoàn chỉnh với cấu trúc không gian hoàn hảo

Điều đó làm giảm tối đa tính phức tạp và giá thành của các

giai đoạn tinh sạch.

Hình 13: Sản xuất insulin bằng cách tổng hợp riêng rẽ hai chuỗi A và B.