Luận án nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp

Luận án Tiến Sĩ đề tài Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp của tác giả Hoàng Văn Quốc Chương Đại học khoa học tự nhiên, đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.Người ta đã nhận thấy rằng bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe doạ nghiêm trọng đến sức khỏe của con người. Năm 2000, con số những người mắc bệnh tiểu đường trên thế giới ước tính khoảng từ 151 đến 171 triệu, và dự kiến đến năm 2010 con số này sẽ là 221 triệu và đến năm 2030 sẽ lên đến 366 triệu người. Và đương nhiên, việc gia tăng số người mắc bệnh tiểu đường sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn bệnh này như thần kinh, xơ vữa động mạch…Theo ước tính, số người tử vong trên thế giới do bệnh tiểu đường trong năm 2000 là 2,9 triệu và con số này sẽ còn tiếp tục tăng theo từng năm.Bệnh tiểu đường là một căn bệnh chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Tiểu đường gây ra do tác động phức tạp giữa gene và các yếu tố môi trường, từ đó dẫn đến bất bình thường trong quá trình điều hoà lượng Glucose trong cơ thể liên quan tới những vấn đề về hormon Insulin.Insulin là một hormon được ra bởi tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tuỵ. Đây là hormon quan trọng nhất cho quá trình lưu trữ, sử dụng đường, acid amin và acid béo và duy trì lượng đường trong máu.

HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ

SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010

HOÀNG VĂN QUỐC CHƯƠNG

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ

SẢN XUẤT INSULIN TÁI TỔ HỢP

Chuyên ngành: Vi sinh học Mã số: 1.05.12

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS TRẦN LINH THƯỚC

Thành phố Hồ Chí Minh - Năm 2010

Luận án Tiến sĩ Lời cảm ơn

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, em xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến Phó giáo

sư, Tiến sĩ Trần Linh Thước Thầy đã tận tụy hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá

trình học tập, tạo điều kiện tốt nhất cho em để hoàn thành luận án Không có sự hỗ trợ của Thầy, em không thể hoàn thành được luận án này Xin trân trọng cảm

ơn Thầy!

Em xin cảm ơn PGS.TS Phạm Thành Hổ, đã thường xuyên quan tâm,

động viên và cung cấp những thông tin quí báu cho em trong quá trình học tập và thực hiện luận án

Xin gởi lời cảm ơn đến PGS.TS Phan Văn Chi, Phó viện trưởng Viện khoa

học Công nghệ Việt Nam, đã giúp đỡ chúng tôi phân tích trình tự mini-proinsulin

Xin cảm ơn TS Peer Nobert Jorgensen, công ty Norvonordisk, Đan Mạch,

đã cung cấp cho chúng tôi các kháng thể sử dụng trong quá trình nghiên cứu

Em xin gởi lời cảm ơn đến tất cả quí Thầy Cô trong Khoa sinh học, Trường

Đại học khoa học tự nhiên thành phố Hồ Chí minh, đã cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt quá trình học tập ở Trường

Xin cảm ơn tất cả các bạn, các em trong phòng thí nghiệm công nghệ sinh

học phân tử (Lab A) ĐH KHTN tp HCM Cảm ơn các bạn Hoàng, Trang, Thảo, Trí… cảm ơn các em Nam, Nhung, Nghĩa, Đạt, Đức, Trâm, Ngân… đặc biệt cảm

ơn Hoa, đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện luận án Không có sự

giúp đỡ của các bạn, các em, tôi không thể hoàn thành được luận án này

Cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án

Và trên hết, xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Đặc biệt cảm ơn Vợ và các con đã mang lại cho tôi niềm hạnh phúc, sự yên tâm trong quá trình thực hiện luận án

Tp Hồ Chí Minh, Tháng 01 năm 2010

Luận án Tiến sĩ Mục lục

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC HÌNH viii

DANH MỤC BẢNG xi

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 5

1.1 Insulin và vai trò đối với cơ thể 5

1.2 Bệnh tiểu đường 8

1.3 Các phương pháp sản xuất insulin 10

1.3.1 Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật 10

1.3.2 Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA 12

1.4 Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E coli 18

1.4.1 Đặc điểm của E coli trong sản xuất protein tái tổ hợp 18

1.4.2 Các chủng E coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp 20

1.5 Các hệ thống vector biểu hiện trong E coli 24

1.5.1 Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST 24

1.5.2 Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis 25

1.5.3 Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL 27

1.5.4 Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP 27

1.6 Phương pháp lên men vi sinh vật 28

1.6.1 Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp 28

1.6.2 Đặc điểm lên men mẻ 29

1.6.3 Đặc điểm lên men liên tục 32

1.6.4 Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung 32

1.6.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến lên men mẻ-bổ sung chủng E coli để sản xuất protein tái tổ hợp 34

1.7 Các bước xử lý sau lên men để thu nhận mini-proinsulin và insulin có hoạt tính 39

1.7.1 Thu nhận và làm tan thể vùi chứa mini-proinsulin 39

1.7.2 Tái gấp cuộn mini-proinsulin tái tổ hợp 40

1.7.3 Cắt loại đoạn peptide C để thu nhận insulin có hoạt tính 43

1.7.4 Các bước xử lý để thu nhận protein mục tiêu từ protein dung hợp 44

Luận án Tiến sĩ Mục lục

1.7.5 Các phương pháp tinh chế trung gian và tinh chế hoàn tất trong sản xuất

insulin từ mini-proinsulin 45

1.8 Qui trình sản xuất insulin tái tổ hợp theo mô hình mini-proinsulin 47

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 49

2.1 Dụng cụ và thiết bị 49

2.1.1 Thiết bị chính dùng trong sinh học phân tử 49

2.1.2 Thiết bị dùng trong thao tác nuôi cấy vi sinh 49

2.1.3 Thiết bị dùng cho tinh chế protein 49

2.1.4 Thiết bị dùng xác định hàm lượng đường huyết 50

2.2 Hóa chất và môi trường 50

2.2.1 Hóa chất 50

2.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh 55

2.3 Nguyên vật liệu 55

2.3.1 Chủng vi sinh vật 55

2.3.2 Plasmid 56

2.3.3 Mồi dùng cho tổng hợp gen, tạo dòng và giải trình tự 56

2.3.4 Thang phân tử lượng dùng trong điện di 57

2.3.5 Các kháng thể sử dụng cho Western Blot và ELISA 57

2.4 Phương pháp 58

2.4.1 Thiết kế, tổng hợp gen mpi mã hóa 6xHis-MPI trong E coli bằng phương pháp PCR tái tổ hợp 58

2.4.2 Tạo dòng gen mpi trong plasmid pBlue (pBIns) 61

2.4.3 Tái tạo dòng gen mpi vào vector biểu hiện pET-43.1a 62

2.4.4 Cảm ứng biểu hiện và xác nhận sự biểu hiện của 6xHis-MPI 63

2.4.5 Hoạt hóa chủng E coli BL21(DE3)/pET43Ins 66

2.4.6 Khảo sát các điều kiện cảm ứng tối ưu sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E coli BL21(DE3)/pET43Ins 66

2.4.7 Khảo sát thay thế trypton bằng pepton trong môi trường LB nuôi cấy E coli BL21(DE3)/pET43Ins 68

2.4.8 Khảo sát sự biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E coli BL21(DE3)/ pET43Ins được nuôi cấy trong môi trường LBp và LB 68

2.4.9 Khảo sát điều kiện nuôi cấy E coli BL21(DE3)/ pET43Ins mật độ cao bằng phương pháp mẻ-bổ sung ở qui mô phòng thí nghiệm 69

2.4.10 Khảo sát điều kiện lên men E coli BL21(DE3)/ pET43Ins bằng nuôi cấy mẻ-bổ sung ở qui mô pilot 30L 70

2.4.11 Phương pháp thu sinh khối và đồng nhất tế bào 71

2.4.12 Thu nhận và làm tan thể vùi chứa 6xHis-MPI 72

2.4.13 Thu nhận và tinh chế sơ bộ 6xHis-MPI bằng sắc ký cột Ni-NTA 72

2.4.14 Phương pháp cắt loại bỏ 6xHis bằng CNBr để thu nhận MPI 72

Luận án Tiến sĩ Mục lục

2.4.15 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng lên sự tái gấp cuộn của MPI 73

2.4.16 Tủa mini-proinsulin và insulin bằng ion kẽm kim loại 75

2.4.17 Phương pháp xử lý MPI bằng trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận insulin có hoạt tính 75

2.4.18 Kiểm tra cấu hình của MPI và insulin bằng phương pháp ELISA 76

2.4.19 Phân tích MPI và insulin bằng sắc ký RP-HPLC 77

2.4.20 Giải trình tự amino acid của MPI bằng khối phổ 77

2.4.21 Phương pháp định lượng protein 77

2.4.22 Phương pháp xác định tính hoạt tính của insulin tái tổ hợp 79

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 80

3.1 Tạo dòng tế bào E coli có khả năng biểu hiện mini-proinsulin dung hợp với 6xHis (6xHis-MPI) 80

3.1.1 Tổng hợp gen mpi mã hóa mini-proinsulin biểu hiện trong E coli 80

3.1.2 Tạo dòng gen mpi vào plasmid pBlue 81

3.1.3 Tạo dòng tế bào E coli BL21(DE3)/pET43Ins biểu hiện MPI ở dạng dung hợp 6xHis-MPI 83

3.1.4 Kiểm tra trình tự amino acid của 6xHis-MPI 87

3.2 Lên men E coli BL21(DE3)/pET43Ins tổng hợp 6xHis-MPI tái tổ hợp ở qui mô phòng thí nghiệm và qui mô pilot 89

3.2.1 Hoạt hóa, nhân giống và kiểm tra khả năng biểu hiện 6xHis-MPI của chủng E coli BL21(DE3)/pET43Ins 89

3.2.2 Khảo sát các điều kiện biểu hiện tối ưu 6xHis-MPI của E coli BL21(DE3)/pET43Ins 91

3.2.3 Xác định điều kiện nuôi cấy mật độ cao chủng E coli BL21(DE3)/ pET43Ins ở qui mô phòng thí nghiệm 95

3.2.4 Nuôi cấy E coli BL21(DE3)/pET43Ins theo phương thức mẻ- bổ sung ở qui mô 30 L để tổng hợp 6xHis-MPI 101

3.3 Thu nhận MPI có cấu hình tự nhiên 104

3.3.1 Thu nhận thể vùi chứa 6xHis-MPI 104

3.3.2 Thu nhận 6xHis-MPI từ thể vùi 105

3.3.3 Thu nhận MPI từ 6xHis-MPI 107

3.4 Thu nhận insulin từ MPI 111

3.4.1 Tái gấp cuộn MPI 111

3.4.2 Cắt loại peptide C bằng trypsin 116

3.5 Kiểm tra hoạt tính của insulin tái tổ hợp trên chuột 118

3.6 Sơ đồ qui trình công nghệ sản xuất insulin ở qui mô pilot 119

KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 122

Luận án Tiến sĩ Mục lục

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 124TÀI LIỆU THAM KHẢO 125PHỤ LỤC 132

Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề

ĐẶT VẤN ĐỀ

“Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)” Nhận xét này của nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang trở thành hiện thực với những con số cụ thể Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2008) [77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5% dân số thế giới Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái tháo đường bị cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do biến chứng mắt của bệnh Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS [1] Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xã hội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trị bệnh, nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí khổng lồ về kinh tế có thể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tật gây ra Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từ lớp trẻ [1]

Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớn tỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000 Số người mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới [1]

Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hoặc do cơ thể người bệnh kháng insulin Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào β của tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu Phương

Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề

pháp điều trị BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin định kỳ cho người bệnh Do số lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn Ở châu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007 Theo ước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong năm 2007 lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thị trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ kim [41]

Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học Genetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu

hiện trong E coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản

xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin Năm 1982, Humulin đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … với nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau Công nghệ sản xuất insulin hiện nay thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide và phương pháp hai chuỗi polypeptide Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản Đầu tiên là

bước tạo dòng chủng chủ (thường là E coli) có khả năng mang gen ngoại tổng

hợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin) Đây là khâu then chốt quyết định sự thành công của công nghệ do cần phải biến đổi các codon thích hợp để tăng cường hiệu quả biểu hiện Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu nhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin Protein được biểu hiện dưới dạng thể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần phải biến tính để làm tan, sau đó tiến hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên Proinsulin tái gấp cuộn được xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu insulin có hoạt tính Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide,

Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề

trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2 chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B) Sau đó tinh chế thu nhận các chuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu nhận insulin có hoạt tính

Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồn insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốn kém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trị kịp thời cho bệnh nhân Để đảm bảo cho điều trị toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày [78], thì Việt Nam cần phải nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg insulin/ năm (100U =3,5 mg) Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần giải quyết khó khăn trên

Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầu đặt ra

Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trị bệnh đái tháo đường”, mã số

Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề

KC.04.09/06-10 Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong nội dung của đề tài cấp nhà nước này

Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide

trong E coli bao gồm tạo dòng E coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên

men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính Ý nghĩa thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trị bệnh tiểu đường

Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau:

- Tạo chủng E coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái

tổ hợp của người

- Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E coli tái tổ hợp biểu hiện

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

1.1 Insulin và vai trò đối với cơ thể

Bệnh tiểu đường được mô tả lần đầu tiên và được ghi lại trên bia mộ của

Thebes (Ai cập) từ khoảng năm 3000-1500 trước công nguyên Năm 1893

Hédon đã chứng minh vai trò quan trọng của tuyến tụy trong BTĐ Năm 1901,

Opie chứng minh được mối liên hệ trực tiếp giữa BTĐ và sự hư hỏng tiểu phần

Langerhans trên tụy tạng, củng cố giả thuyết cho rằng có sự tiết nội tiết bởi tiểu

phần Langerhans của tụy tạng có chức năng ngăn ngừa BTĐ Từ đó nhiều nhà

khoa học đã cố gắng phân lập những hợp chất từ tụy tạng có khả năng trị được

BTĐ Năm 1922, Macleod chính thức công bố sự khám phá ra insulin Năm

1955, Fredick Sanger xác định trình tự amino acid của insulin Năm 1979, insulin

được sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp và được thương mại hóa vào năm

1982, trở thành protein tái tổ hợp đầu tiên được sản xuất bằng phương pháp này

và được sử dụng cho mục đích trị liệu [35],[54]

Hình 1.1 Cấu trúc của insulin

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

Insulin là một hormone dạng polypeptide gồm hai chuỗi polypeptide nối

cộng hóa trị với nhau bằng 3 cầu nối disulfide: chuỗi A có 21 amino acid và

chuỗi B có 30 amino acid Ba cầu nối disulfide (S-S) nối hai chuỗi A và B là

A7-B7, A20-B19 và A6-A11 (Hình 1.1) Insulin có công thức phân tử chung là

C257H383N65O77S6, phân tử lượng 5,8 kDa Điểm đẳng điện pI là 5,5 [14],[22],

[74]

Ở động vật, ban đầu insulin được tạo ra từ tế bào β của tụy tạng ở dạng

preproinsulin chứa tổng cộng 109 amino acid, trong đó đoạn peptide tín hiệu

gồm 23 amino acid còn lại là proinsulin gồm 86 amino acid được cấu tạo theo

thứ tự từ đầu N như sau: chuỗi B 30 amino acid, chuỗi C 35 amino acid và chuỗi

A 21 amino acid (Hình 1.2) Đoạn peptide tín hiệu gồm 23 amino acid có vai trò

trong sự vận chuyển proinsulin qua màng lưới nội chất đi vào khoang bên trong

Đoạn peptide này sau đó bị cắt rời bởi một peptidase đặc trưng và tạo nên

proinsulin Proinsulin tồn tại trong lưới nội chất và sau đó liên kết với các thể

Golgi tạo thành các thể tiết Quá trình hình thành insulin diễn ra trong các thể

này nhờ sự thủy phân bởi protease để loại bỏ đoạn peptide C tạo phân tử insulin

có hoạt tính Insulin được tích lũy trong tế bào β của tụy tạng dưới dạng

hexamer, gồm sáu phân tử insulin được ổn định nhờ gắn với 2 nguyên tử kẽm

Thể tiết sẽ tiết insulin vào máu khi nồng độ glucose trong máu cao [27]

Hầu hết insulin ở các loài có trình tự amino acid tương tự nhau nhưng

không hoàn toàn giống nhau Insulin của chuột và của thỏ khác nhau một số

amino acid Insulin của heo khác insulin của người chỉ một amino acid ở đầu C

của chuỗi B Insulin của bò khác của người ba amino acid trong khi đó của cừu

thì khác bốn amino acid Sự khác biệt trong cấu trúc của insulin người và insulin

của bò là ở các vị trí A8, A10, và B30 (insulin người ở các vị trí này là Thr, Ile

và Thr) [21]

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

Hình 1.2 Các bước tạo insulin in vivo ở người

Insulin có vai trò trung tâm trong cơ chế điều hòa sự biến dưỡng

carbohydrate, protein và lipid Mức độ tiết của insulin từ các tế bào β được quyết

định bởi nồng độ glucose trong máu Nồng độ glucose trong máu cao sẽ cảm ứng

sự tiết insulin nhằm thúc đẩy sự hấp thụ glucose trong máu bởi các mô cơ quan

khác nhau, đặc biệt là gan và cơ Điều này giúp làm giảm lượng glucose trong

máu đến mức bình thường, sau đó sự tiết insulin bị giảm (Hình 1.3)

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

Hình 1.3 Cơ chế điều hòa hàm lượng đường trong máu

Insulin có ảnh hưởng lớn đối với hoạt động của nhiều cơ quan trong cơ

thể như tăng cường sự hấp thụ glucose trong máu và chuyển thành glucogen bởi

tế bào gan, làm giảm hàm lượng glucose trong máu Tăng cường hấp thu amino

acid từ máu và chuyển thành protein Chuyển glucose thành glucogen ở cơ vân

Tăng cường sự tổng hợp mỡ bởi tế bào mỡ Các ảnh hưởng này có thể giúp cơ

thể tích lũy được các chất dinh dưỡng hòa tan được hấp thụ từ ruột non thành

dạng dự trữ giàu năng lượng như glycogen, protein, mỡ đồng thời làm giảm hàm

lượng glucose trong máu [3]

1.2 Bệnh tiểu đường

Bệnh tiểu đường là tình trạng lâm sàng diễn ra khi tuyến tụy không sản

xuất đủ insulin hoặc cơ thể sử dụng không hiệu quả insulin đã được tiết ra Hậu

quả là hàm lượng đường huyết cao và gây nên các rối loạn liên quan trong trao

đổi chất, dẫn đến sự hư hỏng nghiêm trọng của nhiều cơ quan trong cơ thể đặc

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

biệt là thần kinh và tim mạch [76] Bệnh tiểu đường được Tổ chức Y tế Thế giới

(WHO) [2] phân loại như sau:

- Bệnh tiểu đường type I (BTĐ phụ thuộc insulin): Do cơ thể không thể

sản xuất đủ insulin, phần lớn xảy ra ở trẻ em và người trẻ tuổi và thường có yếu

tố tự miễn, chiếm từ 5-10% tổng số bệnh nhân mắc BTĐ Ở Việt nam, tỷ lệ này

chiếm khoảng 7%

- Bệnh tiểu đường type II (BTĐ không phụ thuộc insulin): Do cơ thể

kháng insulin đi kèm với sự thiếu hụt insulin tương đối, thường gặp ở lứa tuổi

trên 40, gần đây xuất hiện ở lứa tuổi 30, thậm chí cả ở lứa tuổi thanh thiếu niên,

chiếm xấp xỉ 90%-95% trong các trường hợp BTĐ Ở Việt nam, tỷ lệ này chiếm

khoảng 91,2%

- Bệnh tiểu đường thai nghén: là trường hợp rối loạn dung nạp glucose

được chẩn đoán lần đầu tiên khi có thai Mặc dù trong đa số các trường hợp khả

năng dung nạp glucose có cải thiện sau thời gian mang thai, nhưng vẫn có sự gia

tăng đáng kể nguy cơ phát triển thành BTĐ type II về sau này

- Các thể BTĐ khác: nhóm này bao gồm tất cả các nguyên nhân khác

hiếm gặp hơn, có thể gây BTĐ bao gồm tiểu đường là triệu chứng do bệnh lý

của hệ thống nội tiết, các bệnh về tụy, các hình thái di truyền của BTĐ hoặc tiểu

đường do thuốc và hóa chất

Hiện nay trên thế giới có khoảng 180 triệu người mắc BTĐ, số người mắc

BTĐ ngày càng tăng cao và theo dự đoán thì năm 2030 có ít nhất là 366 triệu

người bị mắc BTĐ [70] Ở một số nước, tiểu đường được xem như là một căn

bệnh xã hội Tỷ lệ mắc BTĐ loại II: ở Israel: 6,7%, ở Mỹ: 6,6%, ở Saudi Arabia:

6,6%, ở Nam Italia: 6,5% [71],[77]

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

Ở Việt Nam, bệnh tiểu đường phát triển rất nhanh Năm 1990 tỷ lệ mắc

bệnh tiểu đường chỉ ở mức từ 0,96%( Huế) cho đến 2,52%( thành phố Hồ Chí

Minh), nhưng chỉ sau 10 năm, năm 2001 tỷ lệ này ở các thành phố lớn đã là

4,1%, năm 2002 tăng lên 4,4%, với mức tính ở cả cộng đồng là 2,7% dân số; nếu

tính ở nhóm người có yếu tố nguy cơ mắc bệnh cao thì tỷ lệ bệnh đã tăng trên

10% Theo thống kê năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường trong cả nước là trên

5% (khoảng 4,5 triệu người), tại các thành phố lớn và khu công nghiệp có tỷ lệ

từ 7,0 đến 10% [1]

1.3 Các phương pháp sản xuất insulin

1.3.1 Sản xuất insulin từ tụy tạng động vật

Trước đây người ta thường sử dụng insulin chiết tách từ tụy tạng động vật

như heo, cừu, bò để điều trị BTĐ Tuy nhiên insulin heo thường được ưa dùng

hơn của bò do có trình tự amino acid gần với insulin của người, chỉ khác một

amino acid là alanine ở đầu C của chuỗi B trong khi insulin người là threonine

và ít gây các phản ứng miễn dịch (Hình 1.4)

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của insulin heo (bên trái), của người (bên phải)

Chế phẩm insulin tinh sạch đầu tiên dùng cho trị liệu vào những năm

1920 được chiết từ tụy tạng của heo hoặc bò bằng kỹ thuật tủa protein nhờ

acid-Luận án Tiến sĩ Tổng quan

alcohol, do vậy độ tinh sạch của chế phẩm không cao Năm 1926, các nhà khoa

học đã kết tinh thành công tinh thể insulin từ các dịch chiết insulin thô Năm

1934, người ta phát hiện rằng kẽm kim loại có khả năng tăng cường sự kết tinh

của insulin từ các dịch chiết thô này Từ đó có thể sản xuất insulin thương mại

dạng tinh thể và được coi là insulin truyền thống dù độ tinh sạch chưa cao [35]

Qua nhiều thập niên, các nhà khoa học đã phát triển nhiều phương pháp

khác nhau để sản xuất insulin với số lượng lớn đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày

càng cao của con người Một trong những phương pháp được sử dụng trong một

thời gian dài là phương pháp biến đổi enzyme của insulin heo bằng cách thủy

phân bởi trypsin ở vị trí amino acid 22- 23 và ở vị trí 29-30 của chuỗi B, loại bỏ

một đoạn peptide có 8 đơn phân ra khỏi chuỗi này (Hình 1.5) Sau đó tổng hợp

đoạn peptide gồm 8 amino acid tương đồng với đoạn cuối của insulin người, thực

hiện kết gắn đoạn này vào vị trí đã xử lý bằng trypsin trước đó (Hình 1.5) [27]

Hình 1.5 Biến đổi insulin heo thành insulin người

(a) Xử lý insulin heo bằng trypsin sẽ cắt bỏ đoạn gồm 8 amino acid đầu

C (b) Tổng hợp đoạn peptide 8 amino acid cuối cùng của insulin người

và gắn vào (a)

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

Kỹ thuật này giúp tạo ra được chế phẩm insulin người và được sử dụng

rộng rãi trong nhiều năm Tuy nhiên phương pháp này cũng chưa đáp ứng được

nhu cầu insulin do số người mắc BTĐ ngày một tăng cao Do vậy, người ta đã

phát triển phương pháp sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA và

đã được chấp nhận sử dụng từ năm 1982

1.3.2 Sản xuất insulin người bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA

Insulin người tái tổ hợp được sản xuất theo hai phương án: (1) Biểu hiện

hai chuỗi A, B độc lập sau đó thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide hình

thành phân tử insulin (phương án hai chuỗi); (2) Sản xuất proinsulin tái tổ hợp

sau đó dùng enzyme đặc hiệu (trypsin/carboxypeptidase) cắt bỏ đoạn peptide C

tạo insulin có hoạt tính (phương án một chuỗi) Gần đây, thay cho proinsulin

trong phương án một chuỗi, người ta biểu hiện mini-proinsulin (có đoạn C ngắn

hơn so với trường hợp proinsulin) để sản xuất insulin

1.3.2.1 Sản xuất insulin tái tổ hợp bằng phương án hai chuỗi

Chế phẩm insulin tái tổ hợp của người đầu tiên được thu nhận bằng cách

gắn hai đoạn cDNA mã hóa cho chuỗi A và chuỗi B vào plasmid, dòng hóa vào

các tế bào E coli khác nhau (chủng K12) và biểu hiện hai chuỗi A, B tái tổ hợp

riêng rẽ Hai chuỗi peptide A, B sau đó được tinh sạch tạo các cầu nối disulfide

để hình thành insulin có hoạt tính Năm 1999, Michael Schmidt và cộng sự công

bố một nghiên cứu về “Sản xuất insulin người bằng E.coli tái tổ hợp với cảm

ứng nhiệt” theo phương án hai chuỗi Hai chuỗi A, B được tổng hợp riêng rẽ trên

hai hệ thống biểu hiện sử dụng promotor của phage lamda (λ-PL), cảm ứng biểu

hiện bằng nhiệt độ Tiến hành tinh chế hai chuỗi này khỏi các thể vùi, sau đó

cho thực hiện đúng cầu nối disulfide nhờ các dẫn xuất của S-sulfonate để hình

thành insulin có hoạt tính với hiệu suất biểu hiện của chuỗi A, B đạt tương ứng

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

là 600 mg/L và 800 mg/L môi trường nuôi cấy Ưu điểm của phương án hai chuỗi

so với phương án một chuỗi là không cần phải dùng các enzyme để cắt bỏ đoạn

peptide trung gian Tuy nhiên phương án này có một số nhược điểm là cần có hai

hệ thống biểu hiện và tinh chế độc lập cho hai chuỗi A, B; hiệu suất và độ chính

xác của quá trình tạo cầu nối disulfide không cao [27],[57]

1.3.2.2 Sản xuất insulin dạng proinsulin tái tổ hợp (phương án một chuỗi)

Proinsulin được thiết kế theo nguyên tắc là dung hợp với một

protein/peptide nhằm mục đích tăng cường biểu hiện và giữ được cấu trúc của

proinsulin ổn định sau dịch mã Trong trình tự này thường có một đoạn peptide

hỗ trợ việc tinh chế (ví dụ 6xHis) chèn thêm một amino acid vào đầu N của

proinsulin là Arg hoặc Lys để tạo vị trí cần cho việc cắt bỏ đoạn protein dung

hợp (fusion protein) ra khỏi insulin sau này Do vậy, cấu trúc phức hợp này

thường là Met-peptide/protein dung hợp-Arg/Lys- Proinsulin Sau đây là một số

hướng tiếp cận trong sản xuất insulin người tái tổ hợp theo phương án một chuỗi

- Biểu hiện proinsulin tái tổ hợp trong tế bào chất

Preproinsulin được biểu hiện ở dạng thể vùi không tan trong tế bào chất

trong E coli bởi hệ thống vector pGEX-6T ở dạng dung hợp

6xHis-GST-preproinsulin, dưới sự kiểm soát của promotor Ptac với chất cảm ứng là IPTG

Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp sau 24 giờ, sự biểu hiện của preproinsulin có

thể đạt đến 20% của tổng protein của tế bào Protein dung hợp này sau đó được

thu hồi và tinh chế bằng sắc ký ái lực dựa trên thẻ 6xHis Sử dụng enterokinase

để cắt bỏ đoạn protein dung hợp ra khỏi preproinsulin với trình tự nhận biết được

thiết kế là VDDDDKG chèn vào giữa GST và preproinsulin [13]

Met-Lys-Proinsulin được biểu hiện trong E coli với promotor được kiểm

soát bằng nhiệt độ với hiệu suất có thể đạt 20-30% Sau quá trình tinh chế đơn

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

giản bằng Sephadex G50, khoảng 150mg Met-Lys-proinsulin tái tổ hợp được thu

nhận với độ tinh khiết đạt 90% từ 1 lít dịch lên men Sử dụng cặp enzyme

trypsin/carboxypeptidase B để xử lý chuyển proinsulin thành insulin Hiệu suất

thu nhận là 50 mg/L môi trường lên men [17]

Met-Arg-proinsulin-GFP được biểu hiện trong tế bào chủng E.coli

BL21(DE3) khi cảm ứng bởi IPTG đến mức 20-25%, khoảng 140mg/L môi

trường lên men Met-Arg-proinsulin được xử lý bởi trypsin và carboxypeptidase

B thành insulin người [17],[21]

ZZ-Arg-Proinsulin với đoạn ZZ được nhận diện và gắn bởi kháng thể IgG

được biểu hiện trong E coli ở mức khoảng 25% tổng protein tế bào và khoảng 3

g/L môi trường nuôi cấy Phức hợp protein tinh chế thông qua sắc ký ái lực với

IgG để thu nhận proinsulin dung hợp tinh khiết và được xử lý bằng

trypsin/carboxypeptidase B để thu nhận insulin có hoạt tính [31],[49]

- Biểu hiện proinsulin tái tổ hợp trong chu chất

Việc biểu hiện proinsulin trong tế bào chất E coli thường tạo thành các

thể vùi chứa proinsulin không tan Proinsulin không tan trong thể vùi cần được

làm tan bằng các muối có nồng độ cao, sau đó cần được tái gấp cuộn để có cấu

hình tự nhiên trước khi xử lý bằng protease để thu được insulin có hoạt tính Để

tránh các bước phức tạp nêu trên, một phương án được tiếp cận nghiên cứu là

biểu hiện proinsulin tan trong chu chất (periplasm) của E coli Để proinsulin

được vận chuyển qua màng tế bào chất của E coli đi vào chu chất thì cần phải

gắn thêm vào đầu N của proinsulin một trình tự mã hóa một đoạn peptide tín

hiệu (signal peptide) có vai trò hướng proinsulin ra chu chất Sau đây là một số

công trình nghiên cứu theo hướng này đã được công bố

Peptide tín hiệu của β-lactamase từ Staphylococcus aureus với trình tự

amino acid MKKLIFLIVALVLSACNSN-SHA::KE được gắn vào đầu N của

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

proinsulin Sự biểu hiện có thể đạt 27 phân tử proinsulin ở trong chu chất trong 1

tế bào E.coli [60]

Một cách tiếp cận khác để tạo proinsulin tái tổ hợp dạng tan có cấu hình

tái gấp cuộn tự nhiên trong chu chất của E coli là dung hợp với DsbA, một

enzyme xúc tác sự hình thành cầu nối disulfide Tính ổn định của protein tái tổ

hợp được sản xuất trong tế bào E coli phụ thuộc chặt chẽ vào hiệu quả gấp cuộn

trong in vivo Do vậy, khoang chu chất của tế bào vi khuẩn là nơi thích hợp cho

sự biểu hiện của proinsulin Chu chất tạo ra môi trường có điều kiện ôxi hóa và

các protein thuộc nhóm Dsb* (DsbA, DsbC và DsbG) xúc tác cho sự thành lập

các cầu nối disulfide trong chu chất DsbA là oxydase quan trọng nhất của nhóm

sulhydryl trong chu chất, hỗ trợ tạo cầu nối disulfide của các protein trong in

vitro rất hiệu quả Trong cách tiếp cận này DsbA cùng với peptide tín hiệu vốn

có của protein này được dung hợp vào đầu N của proinsulin để tạo ra

pre-DsbA-proinsulin Phức hợp này được vận chuyển qua màng tế bào chất vào chu chất

thành DsbA-proinsulin DsbA sẽ giúp ổn định nội phân tử proinsulin chưa gấp

khúc thông qua các điểm liên kết polypeptide và tạo các cầu nối disulfide Hiệu

suất tối đa của proinsulin người thu nhận được từ phần hòa tan trong chu chất sau

khi cắt loại bỏ DsbA là 9,2 mg/g protein chu chất, tương đương 1,8% tổng lượng

protein tế bào [73]

- Biểu hiện proinsulin tái tổ hợp tiết ra môi trường

Một số chủng vi sinh vật khác được sử dụng cho việc biểu hiện proinsulin

tái tổ hợp dạng tiết ra môi trường [64] Sau đây là một vài công trình tiêu biểu

cho hướng nghiên cứu này

Nấm men Pichia pastoris và Sacchromyces cerevisiae có các đặc điểm rất

giống nhau về việc tiết insulin ra môi trường Tương tự như E coli, sự vận

chuyển của protein qua màng và tiết ra môi trường cần có peptide được nhận

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

diện bởi hệ thống tiết của tế bào Ở P pastoris, prepro-leader peptide giúp sự

tiết ngoại bào của proinsulin Ngoài ra, trình tự peptide này dùng làm đoạn nối

(spacer) giữa prepro-leader peptide và proinsulin cùng ảnh hưởng đến hiệu suất

tạo và tiết proinsulin trong P pastoris [36],[53]

Trong một nghiên cứu dùng S cerevisiae làm chủng chủ biểu hiện và tiết

proinsulin Proinsulin được dung hợp ở đầu N với nhân tố α, một peptide tín hiệu

làm nhiệm vụ tiết ra protein dung hợp ra ngoài Protein dung hợp sau đó được

biểu hiện và tiết ra môi trường nuôi cấy với hiệu suất có thể đạt 41,1mg/L môi

trường [37]

Một cách tiếp cận khác để tạo proinsulin tiết vào môi trường là sử dụng

Bacillus subtilis làm chủng chủ Trong trường hợp này trình tự peptide tín hiệu

aprE từ B subtilis được dung hợp với đầu N của proinsulin để giúp vận chuyển

proinsulin qua màng tế bào vào môi trường (B subtilis là vi khuẩn gram dương

chỉ có màng tế bào chất, không có màng ngoài như trong trường hợp của E coli)

Hiệu suất tạo proinsulin là 1 g/L môi trường nuôi cấy và 90% lượng biểu hiện

này được tiết ra môi trường nuôi cấy 1 giờ sau pha ổn định [52]

1.3.2.3 Sản xuất insulin bằng phương án một chuỗi dạng mini-proinsulin tái

tổ hợp

Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thay đoạn peptide C có chứa 35 amino

acid bằng một đoạn peptide ngắn hơn cũng tạo được dạng tiền thân của insulin,

gọi là mini-proinsulin (MPI), có cấu hình tự nhiên giống proinsulin nhưng có

hiệu suất gấp cuộn cao hơn Lars Thim và cộng sự (1987) [53] đã tiếp cận

nghiên cứu sản xuất insulin thông qua mô hình mini-proinsulin với đoạn mini-C

là 6 amino acid (Arg-Arg-Leu-Gln-Lys-Arg) bằng nấm men S cerevisiae Kang

và cộng sự (1994) [34] đã thiết kế và biểu hiện thành công phức hợp

ZZ-miniproinsulin trong đó chiều dài đoạn peptide C thay đổi từ 1-11 amino acid

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

Hiện nay, vai trò của đoạn peptide C trong cấu trúc của proinsulin của động vật

chưa được xác định rõ ràng, chiều dài và trình tự amino acid của đoạn peptide C

này thay đổi từ 26-38 đơn phân tùy vào từng loài động vật Tuy nhiên cấu trúc

căn bản tại các vị trí gần khu vực liên kết của chuỗi B-C và C-A là không thay

đổi và được xem là yêu cầu tối thiểu để chuyển proinsulin thành insulin có hoạt

tính [14],[15],[34] Năm 2005, Dorschug và cộng sự đăng ký bản quyền (US

patent) về mô hình mini-proinsulin, biểu hiện bởi E coli hoặc ở nấm men

Saccharomyces cerevisiae, với đoạn C chỉ có một amino acid là Arg sau đó sử

dụng trypsin và carboxypeptidase để biến đổi thành insulin [23]

Tuy nhiên cho đến nay chỉ có các công bố sản xuất insulin người tái tổ

hợp thông qua mô hình mini-proinsulin ở qui mô phòng thí nghiệm, chưa có công

bố ở qui mô sản xuất [15] Sau đây là hai nghiên cứu tiêu biểu về tổng hợp

insulin theo mô hình mini-proinsulin

Shin và cộng sự (1997) [59] đã thiết kế mini-proinsulin (M2PI) với đoạn

peptide C chỉ có 9 amino acid Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asn-Val-Lys-Arg M2PI

được dung hợp ở đầu N một peptide T2 gồm 18 amino acid

Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-(His)10-Ser-Ser-Met có vai trò ổn định protein dung hợp và hỗ trợ việc tinh

chế bằng sắc ký ái lực giữa 10xHis và cột sắc ký Ni-NTA Khi được biểu hiện

trong E coli bởi hệ thống vector biểu hiện pET-3a, hiệu suất biểu hiện protein

dung hợp T2-M2PI có thể đạt 7 g/L và khoảng 62% của phức hợp này có thể

được chuyển thành insulin có hoạt tính sau khi qua các bước xử lý tiếp theo Như

vậy, việc sản xuất insulin tái tổ hợp thông qua mô hình mini-proinsulin biểu hiện

trong tế bào chất của E coli dạng thể vùi cho mức độ biểu hiện cao

Chang và cộng sự (1998) [16] đã thiết kế mini-proinsulin M2PI tương tự

như Shin (1997) và dung hợp với peptide T2 chứa 21 amino acid thay vì 18

amino acid trong đó bổ sung thêm một Met ở đầu N và Gly-Ser trước Met ở đầu

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

C (Met-Pro-Ser-Asp-Lys-Pro-His10-Ser-Ser-Gly-Ser-Met-M2PI) Khi được biểu

hiện trong E coli bằng hệ thống vector biểu hiện pET-3a, phức hợp T2-M2P

được tạo ra dưới dạng thể vùi với hàm lượng đạt đến 25% tổng protein của tế

bào Phần dung hợp T2 sau đó được cắt bỏ bởi CNBr và M2PI mini-proinsulin

được tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion Hiệu suất tái gấp cuộn của M2PI

mini-proinsulin tốt hơn từ 20-40% so với hiệu suất gấp cuộn của mini-proinsulin

1.3.2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất insulin trong nước

Ở Việt Nam, công trình nghiên cứu sản xuất insulin tiếp cận theo hướng

biểu hiện proinsulin ở tế bào E coli của nhóm tác giả PGS.TS Lê Văn Phủng và

cộng sự thực hiện đề tài cấp bộ (Bộ Y tế) [6],[7] Kết quả công bố cho thấy đã

thiết kế thành công gen biểu hiện proinsulin trên E coli BL21(DE3) bằng vector

pET-28a(+) và khảo sát được các điều kiện tối ưu để biểu hiện proinsulin

Hiện nay, nhóm nghiên cứu thuộc trung tâm công nghệ sinh học thành

phố Hồ Chí Minh thực hiện tạo dòng biểu hiện mini-proinsulin trên đối tượng là

nấm men Pichia pastosis [5] Theo kết quả công bố thì hiện đang ở giai đoạn tạo

dòng Pichia pastosis có khả năng biểu hiện mini-proinsulin, tuy nhiên mức độ

biểu hiện còn rất thấp

1.4 Sản xuất protein tái tổ hợp trong tế bào E coli

1.4.1 Đặc điểm của E coli trong sản xuất protein tái tổ hợp

Escherichia coli là vi khuẩn gram âm, hiếu khí tùy ý, hình que, có kích

thước khoảng 0,3-1,0 x 1,0-6,0μm, di động, được tìm thấy khắp nơi trong tự

nhiên (Hình 1.6) Do chúng có khả năng phát triển rất mạnh (thời gian thế hệ

khoảng 20 phút) và nhu cầu dinh dưỡng đơn giản nên được sử dụng trong công

nghiệp và các mục đích về y học Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu của E coli là 37oC,

pH 6,0-7,0 Thành phần môi trường tối thiểu để E coli phát triển là glucose

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

0,5%, Na2HPO4 0,6%, KH2PO4 0,3%, NH4Cl 0,1%, NaCl 0,05%, MgSO4 0,012%,

CaCl2 0,001% Ngoài ra, tùy theo loài E coli khác nhau mà có những môi trường

chọn lọc khác nhau [51]

Hình 1.6 Hình thái tế bào E coli

(a) Dưới kính hiển vi quang học, (b) Dưới kính hiển vi điện tử

E coli là tế bào chủ đầu tiên được sử dụng để tạo DNA tái tổ hợp sản

xuất các protein tái tổ hợp dùng làm thuốc phục vụ cho y học Từ đầu thập niên

1990 đến nay, hầu hết người ta sử dụng E coli làm chủng chủ để sản xuất các

protein tái tổ hợp phục vụ trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống con người

Tuy vậy, việc sử dụng E coli cũng có một số ưu-nhược điểm nhất định so với các

hệ thống khác (Bảng 1.1) [25] Nói chung, hệ thống E coli có những ưu điểm

sau: thao tác gen đơn giản, hiệu suất biểu hiện cao, có thể đạt 50% tổng protein

tế bào; có thể lên men mật độ cao bằng môi trường nuôi cấy rẻ tiền và hệ thống

thiết bị đơn giản Tuy nhiên, hệ thống này cũng có một số nhược điểm như: đối

với gen có nguồn gốc từ eukaryote thì cần tạo dòng bằng cách dùng cDNA thay

đổi codon hiếm ở gen ban đầu bằng codon phổ biến ở E coli; cần phải tái gấp

cuộn để thu nhận protein có cấu hình tự nhiên vì đa số trường hợp protein tái tổ

hợp được tạo ra dưới dạng thể vùi trong E coli; không có hệ thống glycosyl hóa;

có sự hiện diện của nhiều protease Nhược điểm này có thể được khắc phục

bằng cách dùng chủng chủ E coli đột biến không có protease

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

Bảng 1.1 So sánh các hệ thống tế bào chủ trong sản xuất protein tái tổ hợp

Đặc tính E coli Nấm men Tế bào

côn trùng

Tế bào động vật

Sự tăng trưởng tế bào Nhanh (30’) Nhanh (90’) Chậm (24 giờ) Chậm (24 giờ)

Môi trường tăng trưởng Đơn giản Đơn giản Phức tạp Phức tạp

Biểu hiện ở ngoại bào Chu chất Môi trường

nuôi cấy Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy

Glycosyl hóa liên kết N Không Mannose

cao Đơn giản, không có sialic acid Phức tạp

1.4.2 Các chủng E coli thường dùng trong sản xuất protein tái tổ hợp

Nhiều chủng E coli khác nhau đã được nghiên cứu thiết lập để biểu hiện

protein tái tổ hợp bằng các vector biểu hiện khác nhau Khi lập phương án sản

xuất protein tái tổ hợp trong E coli cần lựa chọn hệ thống vector biểu hiện và

chủng chủ thích hợp cho protein mục tiêu Sau đây là một số chủng E coli tiêu

biểu sử dụng dụng cho mục đích biểu hiện [51]

- E coli BL21

Chủng chủ E coli BL21[F-, ompT, hsdS (rB-, mB-), gal] là dạng đột biến

khuyết protease OmpT và Lon và là chủng chủ tốt nhất dùng để biểu hiện

protein tái tổ hợp dung hợp với GST bằng hệ thống vector biểu hiện pGEX Tuy

nhiên, do có đặc tính biến nạp không tốt nên chủng này không được dùng cho

mục đích dòng hóa Chủng E coli DH5α là chủng mang alen recA1 giúp cho quá

trình biến nạp và lưu trữ plasmid pGEX nên được dùng cho mục đích tạo dòng

thay cho E coli BL21 [18],[42]

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

- E coli BL21 (DE3) pLysS

Chủng E coli BL21(DE3)[F-, ompT, hsdSB (rB-, mB-), gal, dcm(DE3)]

thường được dùng trong biểu hiện protein dung hợp với 6xHis bằng vector biểu

hiện pET Hệ thống này cho phép biểu hiện vượt mức protein đồng thời hạn chế

tối đa hiện tượng phiên mã rò rỉ khi không có chất cảm ứng DNA bộ gen của

chủng chủ này chứa gen T7 1 mã hóa T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ

bacteriophage DE3 dạng tiềm tan (Hình 1.7) Gen T7 1 chịu sự điều khiển của

promotor lac Gen lacI có khả năng tạo ra một lượng lớn repressor của lac

operon (lacO) tham gia kiểm soát âm sự phiên mã của T7 1

Hình 1.7 Cơ chế biểu hiện gen bởi hệ thống vector pET trong tế bào E coli

(DE3)pLysS

Sự ức chế phiên mã sẽ được hóa giải nhờ IPTG làm bất hoạt lacO [46],

[51] Ngoài ra, chủng chủ này có thể được thiết kế chứa thêm plasmid pLysS gọi

là E.coli BL21(DE3)pLysS giúp tế bào chủ tổng hợp được một lượng nhỏ T7

lysozyme có vai trò làm bất hoạt T7 RNA polymerase Vector pET có chứa T7

promotor nên các gen nằm ở hạ lưu promotor sẽ được phiên mã nhờ hoạt tính

của T7 RNA polymerase của tế bào chủ Như vậy chủng chủ này có đặc điểm

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

hạn chế tối đa sự tổng hợp protein từ hệ thống vector biểu hiện pET khi không

được cảm ứng Cũng như một số chủng chủ BL21 khác, chủng chủ E coli BL21

(DE3)pLysS (hoặc -pLysE) cũng bị đột biến khuyết sản phẩm protease OmpT và

Lon nên hạn chế tối đa sự thủy phân không mong muốn của protein tổng hợp.

- E coli M15 (pREP4)

E coli M15 (pREP4) cho phép biểu hiện protein vượt mức bằng hệ thống

vector biểu hiện pQE Chủng chủ này có mang plasmid pREP4 mang gen lac I

mã hóa cho repressor LacI có vai trò ức chế sự phiên mã của gen nằm sau

promotor T5 theo cơ chế kiểm soát âm khi không có chất cảm ứng Chủng chủ E

coli M15 (pREP4) có kiểu gen [Nals, Strs, Rifs, Thi-, Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-,

RecA+, Uvr+, Lon+] Một chủng chủ khác có đặc điểm tương tự như

M15(pREP4) là SG13009 (pREP4) Ngoài ra, có thể dùng một số chủng chủ

khác để biểu hiện bằng hệ thống pQE như E coli XL1 Blue, E coli JM109, E

coli TG1 Tuy nhiên, chỉ các chủng chủ có mang pREP4 cho hiệu quả biểu hiện

cao và tránh được hiện tượng rò rỉ phiên mã [62]

- Chủng chủ Tuner

Các chủng chủ Tuner TM là dạng đột biến làm mất gen lacY mã hóa cho lac

permease trong chủng khuyết protease BL21, được sử dụng cho các vector

pGEX, pET Việc đột biến gen lac permease có tác dụng làm cho đồng bộ sự

tiếp nhận chất cảm ứng IPTG trong tất cả các tế bào trong quần thể Khi thay đổi

nồng độ của IPTG, sự biểu hiện có thể được kiểm soát từ mức rất thấp đến mức

tối đa Khi biểu hiện ở mức thấp, có thể làm tăng cường tính tan và hoạt tính của

các protein mục tiêu phức tạp [51]

- Chủng chủ Rosetta

Các chủng chủ Rosetta TM là dẫn xuất của các chủng Tuner nên chúng có

đầy đủ các đặc tính ưu việt của chủng đột biến lacY và của BL21 [51] Tuy nhiên

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

chủng Rosetta còn có thêm đặc điểm khác là mang plamid pRARE, mã hóa

tRNAs cho các codon động vật, đây là những codon rất hiếm gặp trong E coli,

do vậy có thể làm tăng cường tối đa sự biểu hiện Plasmid pRARE được chọn lọc

trên chloramphenicol và có thể tương hợp với toàn bộ các vector thuộc họ pET

- Chủng chủ Origami

Chủng chủ Origami là dẫn xuất từ K-12 đột biến cả hai gen mã hóa

thioredoxin reductase (trxB) và glutathione reductase (gor) Do vậy, chúng có

khả năng tăng cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất

Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng Origami (DE3) làm tăng cường hoạt

tính của protein mục tiêu lên gấp 10 lần so với các chủng chủ thông thường mặc

dù tổng lượng protein biểu hiện trong cả quá trình là như nhau Các chủng chủ

Origami có thể tương thích với các plasmid kháng ampicillin và thích hợp cho

việc sử dụng với các vector pET-43.1, pET-44 và pET-32 [51]

- Chủng chủ Origami B

Chủng chủ Origami B kết hợp tính năng gấp cuộn protein của E coli

Origami và sự kiểm soát biểu hiện chính xác của các chủng Tuner Các chủng

này mang bộ gen khuyết các protease của BL21 và tương thích với các plasmid

kháng ampicillin [51]

- Chủng chủ Rosetta-gami

Chủng chủ Rosetta-gami là dẫn xuất từ chủng Origami và mang plasmid

pRARE mã hóa cho các tRNAs hiếm trong chủng K-12 đột biến trxB/gor để tăng

cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất Các chủng này có

thể tương hợp với các vector kháng ampicillin như pET-43.1, pET-44 và pET-32

- Chủng chủ AD494

Chủng chủ AD494 có dẫn xuất từ chủng đột biến trxB K-12, làm tăng

cường sự hình thành các cầu nối disulfide trong tế bào chất Chủng đột biến trxB

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

được chọn lọc bằng karamycin do vậy nên có thể dùng với các marker bla kháng

ampicillin [51]

1.5 Các hệ thống vector biểu hiện trong E coli

1.5.1 Hệ thống pGEX biểu hiện protein dung hợp với GST

Tất cả các vector pGEX đều có đặc điểm chung là có chứa tac promotor

(Ptac) điều khiển sự biểu hiện vượt mức của gen nằm ở hạ lưu theo cơ chế kiểm

soát âm được cảm ứng bằng IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) hoặc các chất

tương đồng về cấu trúc Họ vector pGEX có gồm tất cả 13 vector tương tự như

vector pGEX-2TK (Hình 1.8)

Hình 1.8 Sơ đồ hệ thống vector biểu hiện pGEX 2TK

Trong họ vector pGEX, có 9 vector có vùng MCS rộng, chứa đến 6 vị trí

cắt giới hạn của các enzyme, giúp dễ dàng trong việc dòng hóa Vector

pGEX-2TK có vị trí MCS rất khác biệt so với các vector khác trong họ vector pGEX,

được thiết kế cho phép phát hiện các protein đã biểu hiện bằng cách đánh dấu

trực tiếp in vitro Vùng MCS này nằm về phía hạ lưu của trình tự nhận biết của

kinase được ly trích từ cơ tim [8]

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

GST (Glutathione S-Transferase) là họ enzyme có thể chuyển nhóm S

của glutathione vào những cơ chất như nitro và các hợp chất của halogen, làm

cho chúng bị khử độc tính [50] Hệ thống pGEX biểu hiện protein tái tổ hợp

dung hợp với GST Trung tâm cơ chất của GST có ái lực cao đối với glutathione

Đặc tính này giúp việc thu nhận dễ dàng protein tái tổ hợp ở dạng dung hợp với

GST GST còn có vai trò trong sự phát hiện protein dung hợp với GST bằng

phương pháp so màu dựa vào hoạt tính của GST trên cơ chất tạo sản phẩm có

màu như CDNB (1-chloro-2-dinitrobenzene) hoặc bằng phương pháp miễn dịch

dựa trên kháng thể đặc hiệu của GST Hệ thống gen dung hợp GST đã được ứng

dụng thành công trong nhiều lĩnh vực như trong miễn dịch học phân tử [9], trong

sản xuất vắc xin (đối với các protein có kích thước phân tử nhỏ khi dung hợp với

GST thành kích thước lớn hơn làm tăng tính kháng nguyên), trong nghiên cứu

tương tác protein-protein, hoặc tương tác protein-DNA [26], [33]

1.5.2 Hệ thống pET biểu hiện protein dung hợp với 6xHis

Hệ thống vector biểu hiện pET cho phép dòng hóa và biểu hiện protein

tái tổ hợp ở dạng dung hợp với một homooligohistidine (6xHis) trong tế bào E

coli Sự biểu hiện của gen mục tiêu được kiểm soát bởi promotor T7 và nhờ hoạt

tính của T7 RNA polymerase của tế bào chủ được biến đổi bởi phage T7 (Hình

1.9) Vector biểu hiện này chứa đoạn DNA mã hóa oligo-histidine gọi là thẻ His

(His-tag), đoạn này có thể chứa 6 hoặc 8 hoặc 10 amino acid Tùy theo plasmid

mà His-tag có thể dung hợp ở đầu N hay đầu C hay nằm ở giữa protein dung hợp

với vai trò hỗ trợ việc tinh chế protein mục tiêu và còn giúp cho sự phát hiện

protein mục tiêu ở dạng dung hợp nhờ kháng thể chuyên biệt với His-tag

Protein tái tổ hợp chứa 6xHis có thể được thu hồi với độ tinh sạch trên 90% bằng

cách hấp phụ lên cột sắc ký Ni2+-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA), nhờ tương tác

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

giữa 6xHis và Ni2+ (Hình 1.10) sau đó ly giải ở pH thấp hoặc dùng chất kìm cạnh

tranh là imidazone [46],[51]

Hình 1.9 Cấu trúc vector biểu hiện pET 43-1a(+)

Hình 1.10 Tương tác giữa protein dung hợp chứa 6xHis và giá thể gắn Nikel

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

1.5.3 Hệ thống biểu hiện dung hợp với MBP - Hệ thống pMAL

Trong hệ thống này, gen mã hóa protein mục tiêu được chèn vào vector

pMAL ở vùng hạ lưu từ gen malE, mã hóa cho protein kết gắn maltose, MBP

(Maltose Binding Protein) Hệ thống này sử dụng promotor mạnh Ptac để biểu

hiện một lượng lớn protein dung hợp, sau đó được thu nhận bằng sắc ký ái lực

dựa vào ái lực đặc trưng của MBP với amylose (Hình 1.11) [48] Hệ thống pMAL

có khả năng biểu hiện cả ở tế bào chất và chu chất với mức độ biểu hiện cao

(100 mg / L) trong E coli và làm tăng tính tan của protein dung hợp [50]

Hình 1.11 Sơ đồ biểu hiện và thu nhận các protein có gắn thẻ MBP

1.5.4 Hệ thống IMPACT biểu hiện protein dung hợp với CBP

Đặc điểm nổi bật của hệ thống IMPACT (Intein Mediated Purification

with an Affinity Chitin-binding) là tính năng tự cắt các đoạn protein dung hợp

(intein) trong thu nhận và tinh chế protein tái tổ hợp (phân tử intein từ Sac

cerevisiae VM1) (Hình 1.12) [47] Phân tử intein này được biến đổi để có thể thực

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

hiện phản ứng tự cắt liên kết peptide khi được cảm ứng ở 4oC với các tác nhân

thiol như DTT (1,4-Dithiothreitol), β-Mercaptoethanol hoặc cysteine Trong hệ

thống này gen mã hóa intein thường nằm ở đầu 3’ của gen mục tiêu, tiếp theo là

đoạn gen mã hóa cho vùng gắn chitin, chitin-binding domain (CBD), kích thước

5 kDa từ Bacillus circulan Khi được nạp vào cột chitin, protein dung hợp với

CBP sẽ được giữ lại Sau khi thực hiện phản ứng cắt của intein ở 4oC bởi DTT

hoặc β-Mercaptoethanol, protein mục tiêu được ly giải khỏi cột

Hình 1.12 Sơ đồ biểu hiện và tinh chế sử dụng hệ thống gắn thẻ Chitin

1.6 Phương pháp lên men vi sinh vật

1.6.1 Các phương pháp lên men sản xuất protein tái tổ hợp

Lên men E coli để sản xuất protein tái tổ hợp có thể được thực hiện theo

các phương pháp: mẻ (batch), mẻ-bổ sung (fed-batch), liên tục (continuous)

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

Trong phương pháp lên men mẻ, chủng vi sinh được cấy vào môi trường dinh

dưỡng với một tỷ lệ thích hợp, quá trình lên men bắt đầu diễn ra mà không có sự

bổ sung bất kỳ nguồn dinh dưỡng nào Trong phương pháp lên men mẻ-bổ sung,

chất dinh dưỡng được bổ sung tăng dần lên ở những thời điểm khác nhau mà

không rút dịch nuôi cấy ra ngoài cho đến khi kết thúc quá trình lên men Đối với

lên men theo kiểu liên tục, nguồn dinh dưỡng được bổ sung liên tục trong quá

trình lên men và dịch lên men cũng được chiết ra liên tục, cân bằng với tốc độ

bổ sung nguồn dinh dưỡng một khi thể tích dịch lên men đạt đến mức tới hạn

(Hình 1.13) Do các qui trình lên men sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp

thường là dạng hiếu khí có kiểm soát, nên cần thiết phải cung cấp oxygen trong

quá trình nuôi cấy, ngoài ra trong một vài trường hợp cần bổ sung thêm chất phá

bọt và đôi khi có cả acid hoặc base để hiệu chỉnh pH [61]

Hình 1.13 Mô hình biểu diễn sự động học của nồng độ tế bào và của cơ chất

trong quá trình nuôi cấy theo thời gian của các phương pháp lên men

(a) Phương pháp mẻ, (b) Phương pháp mẻ-bổ sung, (c) Phương pháp

liên tục

1.6.2 Đặc điểm lên men mẻ

Trong phương pháp lên men mẻ (batch culture) thì toàn bộ những biến đổi

trong nồi lên men như thành phần môi trường nuôi cấy, nồng độ tế bào vi sinh

vật, hàm lượng của các chất trao đổi… là kết quả của quá trình tăng trưởng tế

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

bào, của sự trao đổi chất trong nội bào [61] Quá trình lên men mẻ diễn ra qua 4

giai đoạn (Hình 1.14)

Giai đoạn đầu tiên là ngay sau khi cấy giống vào hệ thống gọi là lag pha

(a) Trong giai đoạn này quá trình tăng trưởng hầu như không xảy ra, vi sinh vật

thích ứng với môi trường và điều kiện nuôi cấy mới Khi nuôi cấy vi sinh vật với

qui mô sản xuất cần phải giảm thiểu giai đoạn này Trong giai đoạn tiếp theo

(log pha) (b), vi sinh vật bắt đầu tăng trưởng nhanh dần và đạt tốc độ cao nhất

sau đó chậm dần Ở giai đoạn ổn định (stationary phase) (c), mật độ tế bào hầu

như không thay đổi do sự giới hạn của một số cơ chất dinh dưỡng trong môi

trường nuôi cấy và sau đó quá trình nuôi cấy đi vào pha suy vong (death phase)

(d) khi mà môi trường nuôi cấy trở nên bất lợi như nguồn dinh dưỡng cạn kiệt,

một số chất gây ức chế được sinh ra bởi chính vi sinh vật trong các pha trước đó

0 0.2 0.4 0.6 0.8

Sự biến đổi mật độ tế bào trong log pha có thể được biểu diễn theo

phương trình dx/dt = μ.x (1), trong đó x là mật độ tế bào vi sinh vật; t là thời gian

lên men (giờ) và μ là tốc độ tăng trưởng đặc trưng, giờ-1 Từ phương trình trên, ta

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

có: dx/x = μdt Ỉ ∫t = ∫

to

t to dt x

dx/ μ Ỉ (lnx t - lnx o ) = μ(t-t o ) (2) Trong đó x o là

lượng sinh khối ban đầu (t o) xt: lượng sinh khối sau thời gian nuôi cấy t (giờ)

Môi trường nuôi trong pha log rất giàu dinh dưỡng, các điều kiện nuôi cấy

tối ưu, do vậy vi sinh vật có thể tăng trưởng với tốc độ tối đa, μmax Sự phụ thuộc

của mật độ vi sinh vật (x) vào cơ chất dinh dưỡng có thể biểu diễn qua phương

trình: x = Y b/s (s i - s r ) (3) Trong đó Yb/s là hiệu suất chuyển đổi cơ chất thành sinh

khối (g/g), si, sr lần lượt là nồng độ cơ chất ban đầu và còn lại sau thời gian nuôi

cấy t (giờ) Phương trình trên có thể dùng để dự đoán được nồng độ tế bào thông

qua lượng cơ chất sử dụng và hiệu suất tổng hợp sinh khối (Yb/s) Sự phụ thuộc

của tốc độ tăng trưởng vào nồng độ cơ chất giới hạn trong môi trường nuôi cấy

có thể mô tả theo phương trình Monod như sau: μ=μmax s r /(K s + s r ) (4) Trong đó

K s là hằng số sử dụng cơ chất Đối với một cơ chất nhất định thì mỗi chủng vi

sinh vật có K s khác nhau Trong pha ổn định tốc độ tăng trưởng μ Ỉ 0, khi đó

các hoạt động trao đổi chất trong tế bào vi sinh vật tiếp tục diễn ra với tốc độ

cao, đặc biệt là các chất trao đổi thứ cấp (không xảy ra trong pha tăng trưởng)

Theo Pirt (1975) [61] thì động học của sự hình thành sản phẩm trao đổi chất của

vi sinh vật trong quá trình nuôi cấy được phân biệt ra thành hai dạng: các sản

phẩm phụ thuộc tăng trưởng (sản phẩm biến dưỡng sơ cấp) và các sản phẩm

không phụ thuộc tăng trưởng (sản phẩm biến dưỡng thứ cấp) Sự hình thành các

sản phẩm biến dưỡng sơ cấp có thể được mô tả theo phương trình: dp/dt = q p x

(5) Trong đó p là nồng độ sản phẩm, q p là tốc độ tạo sản phẩm đặc trưng (mg

sản phẩm/g sinh khối/giờ) Mặt khác, sự hình thành sản phẩm liên quan đến sinh

khối tế bào theo phương trình: dp/dx = Y p/x (6) Trong đó Y p/x là hiệu suất sản

phẩm theo sinh khối tế bào (g sản phẩm/ g sinh khối) Từ hai phương trình trên ta

có: (dp/dt)/(dp/dx) = q p x/Y p/x Ỉ dx/dt = q p x/Y p/x (7), mà dx/dt = μ.x

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

Do vậy μ.x = q p x/Y p/x Ỉ q p = μ.Y p/x (8)

Như vậy, tốc độ tạo sản phẩm đặc trưng phụ thuộc vào tốc độ tăng trưởng

đặc trưng của chủng trong quá trình nuôi cấy [61]

1.6.3 Đặc điểm lên men liên tục

Pha tăng trưởng trong nuôi cấy dạng mẻ có thể được tiếp tục duy trì bằng

cách bổ sung thêm môi trường dinh dưỡng vào nồi lên men Thông thường môi

trường bổ sung này có chứa cơ chất giới hạn Trong quá trình lên men, nếu

không có sự ảnh hưởng của các chất ức chế thì sự tăng trưởng của chủng được

duy trì đến khi cơ chất dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt Cơ chất dinh dưỡng

được bổ sung liên tục cho đến khi nồi lên men đạt thể tích giới hạn Khi đó, bắt

đầu thực hiện việc chiết dịch lên men ra khỏi nồi theo tốc độ cân bằng với lưu

lượng nạp cơ chất dinh dưỡng và thể tích dịch lên men trong nồi được duy trì ở

mức giới hạn Phương pháp lên men này gọi là lên men liên tục (continuous

culture) Sự biến động thể tích dịch lên men do việc nạp môi trường dinh dưỡng

vào được xác định bởi độ pha loãng D: D = F/V (9) Trong đó F là lưu tốc nạp

liệu (dm3/hr), V là thể tích (dm3) Tổng sự biến đổi nồng độ tế bào trong một

khoảng thời gian nhất định của quá trình nuôi cấy có thể được biểu diễn:

dx/dt = tăng trưởng – chiết suất hay dx/dt = μ.x - D.x (10)

Trong điều kiện ổn định, hệ thống cân bằng, nồng độ tế bào trong nồi lên

men không thay đổi, lúc đó dx/dt = 0, từ đó μ = D Như vậy, đối với phương pháp

lên men liên tục, chúng ta có thể dùng độ pha loãng D (hay tốc độ bổ sung dinh

dưỡng F) để kiểm soát tốc độ tăng trưởng đặc trưng μ của chủng nuôi cấy

1.6.4 Đặc điểm lên men mẻ-bổ sung

Năm 1973, Yoshida và cộng sự [61] đã giới thiệu một dạng lên men khác

gọi là fed-batch, lên men mẻ-bổ sung: nuôi cấy theo dạng mẻ có bổ sung dinh

Luận án Tiến sĩ Tổng quan

dưỡng liên tục nhưng không chiết xuất dịch nuôi cấy Chất dinh dưỡng được nạp

vào hệ thống trong kiểu lên men này theo một số phương án sau: (i) Dịch bổ

sung hoàn toàn giống như môi trường dinh dưỡng ban đầu; (ii) Dịch bổ sung có

chứa cơ chất giới hạn với nồng độ giống như nồng độ của cơ chất này trong môi

trường ban đầu; (iii) Dịch bổ sung chứa cơ chất giới hạn với nồng độ đậm đặc;

(iv) Dịch bổ sung chứa cơ chất giới hạn với nồng độ rất đậm đặc, làm tăng

không đáng kể thể tích dịch lên men Hệ thống lên men mẻ-bổ sung theo (i) và

(ii) làm thay đổi thể tích dịch lên men trong quá trình nuôi cấy, gọi là hệ thống

lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích Theo phương án (iii), (iv), không làm thay

đổi đáng kể thể tích dịch lên men nên được gọi là hệ thống lên men mẻ-bổ sung

không thay đổi thể tích

- Lên men mẻ-bổ sung thay đổi thể tích

Xét quá trình lên men theo phương pháp mẻ trong đó sự tăng trưởng bị

giới hạn bởi nồng độ của một cơ chất dinh dưỡng, nồng độ sinh khối được biểu

thị bằng phương trình: x t = x o + Y(s i -s r ) (11) Trong đó xt là nồng độ sinh khối sau

thời gian nuôi cấy t giờ, xo là nồng độ tế bào tại thời điểm nạp giống vào, si, sr là

nồng độ cơ chất giới hạn trong môi trường ban đầu và còn lại trong quá trình

nuôi cấy Giả sử xo là rất nhỏ, khi sr = 0 thì: x t = x max = Y.s i (12) Nếu tại thời

điểm s r = 0, môi trường dinh dưỡng được nạp vào với tốc độ pha loãng D < μmax

thì khi đó hầu như toàn bộ chất dinh dưỡng đưa vào đều bị sử dụng hết và như

vậy: F.s i = μ.(X/Y) (13) Trong đó F là tốc độ nạp liệu, X là tổng sinh khối trong

dịch nuôi cấy, X = x.V với V là thể tích dịch nuôi cấy tại thời điểm t Từ phương

trình trên, có thể thấy lượng cơ chất dinh dưỡng đưa vào hệ thống được vi sinh

vật sử dụng hết ngay lập tức và do vậy ds/dt = 0 Mặc dù tổng lượng sinh khối X

tăng lên theo thời gian nhưng nồng độ tế bào x không thay đổi, dx/dt = 0 nên μ =

D Khi thể tích dịch lên men tăng lên, D giảm xuống: D = F/(Vo+Ft) (14), Vo là