sinh hoc phan tu

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CỦA acid nucleicCác phương pháp phân tích acid nucleic đã đề cập trong các chương vừa qua cung cấp nhiều thông tin về acid nucleic nghiên cứu nhưng chưa

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CỦA acid nucleic

Các phương pháp phân tích acid nucleic đã đề cập trong các chương vừa qua cung cấp nhiều thông tin về acid nucleic nghiên cứu nhưng chưa cho phép kết luận về bản chất của nó, cụ thể là acid nucleic ấy tương ứng với gen gì, có chức năng điều hòa hay mã hóa cho protein nào Thông tin này chỉ có thể rút ra được từ việc xác định trình tự nucleotide của acid nucleic.

Hai phương pháp xác định trình tự chính là phương pháp hóa học của Macxam và Gilbert (1977) và phương pháp enzyme học của Sanger và cộng sự (1977) Dù rất khác nhâu về nguyên tắc hai phương pháp này đều có một số điểm chung : hình thành một tập hợp nhiều

oligonucleotide có chiều dài khác nhau, mỗi olygonucleotide có sác xuất xuất hiện bằng nhau trong phản ứng Các trình tự này sau đó được phân tách dựa vào kích thước bằng phương pháp điện di trên gel

polyacrylamide có khả năng phân tách hai trình tự chỉ cách nhau một nucleotide Kết quả đọc được trên bản phóng xạ tự ghi hoặc nhờ một máy dò tự động.

I-Nguyên tắc hóa học : Phương pháp Macxam và Gilbert.

Phương pháp này dựa vào sự thủy giải đặc trưng phân tử ADN cần xác định trình tự bằng phương pháp hóa học.

Trước hết phân tử ADN được đánh dấu bằng 32P ở một đầu Sau đó, chúng được chia thành 5 phân đoạn, mỗi phân đoạn chịu một xử lý hóa học chuyên biệt có khả năng làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide

và sau đó cắt phân tử AND ngay tại nnucleotide ấy Năm nhóm

nucleotide bị tạc động là : G, A, C , G + A , T + C Kết quả của sự xử lý hóa học lả sự hình thành nên năm tập hợp olygonucleotide, các

olygonucleotide trong một tập hợp có kích thước khác nhau nhưng lại cung chấm dứt tại cùng một loại nucleotide Cuối cùng năm phân đoạn trên được đen đi phân tách trên gel polyacrylamide Vị trí của các

oligonucleotide trên gel tương ứng với kích thước của chúng và được

phát hiện nhờ đầu đánh phóng xạ Kết quả được đọc trên bảng phóng xạ

tự ghi

II-Phương pháp enzyme học thông qua việc sử dụng các

dideoxynucleotide của Sanger

Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp nhờ enzyme ADNpolymerase mạch bổ xung cho trình tự ADN mạch đơn cần xác định Đặc trương của phương pháp là ngoài bốn loại nucleotide thông thường còn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những loại deoxynucleotide trong đó nhóm 3′OH được thay bằng H Điều này khiến các didoxynucleotide không còn khả năng hình thành các nối phosphatdiester và do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp.

Trình tự ADN cần được xác dịnh phải được tạo dòng trong một vecter mạch đơn (phage M 13) ADN polymerase sử dụng có thể là đoạn

Klenow của ADN polymerase I, Taq polymerase hay Sequanase Sự tổng hợp mạch mới bắt đầu từ một mồi bắt cặp với một trình tự chuyên biệt trên phage M 13, với sự hiện diện của bốn loại nucleotide trong đó một loại được đánh dấu đồng vị phóng xạ (35S) Phản ứng tổng hợp được tiến hành trong bốn phân đoạn riêng Người ta lần lượt cho vào mỗi

phân doạn một trong bốn loại dideoxynucleotide với hàn lượng rất nhỏ

Do hàm lượng thấp nên thỉnh thoảng mới có một dideoxynucleotide được sử dụng vào phản ứng tổng hợp một oligonucleotide; và lập tức sự tổng hợp oligonucleotide đó ngùng lại Tính xác suất thì trong mỗi phân đoạn sẽ có mặt tất cả các cỡ oligonucleotide ứng với tất cả các

nucleotide cùng loại hiện diện trên ADN VD : nếu triình tự DNA cần xác định là AATCGATAGGCTTGCATG thì trong phân đoạn có mặt dideoxynucleotide ddC sẽ có sự tổng hợp các oligonucleotide sau:

AATC

AATCGATGGC

Sau đó, bốn phản ứng tổng hợp sẽ được đem phân tách trên gel

polyacrylmide và kết quả dược đọc trên bản phóng xạ tự ghi.

III-Các phương pháp cải biên từ phương pháp của Sanger

Trong thực nghiệm, việc sử dụng phương pháp chính thống nêu trên đòi hỏi thao tác phức tạo vì phải tạo dòng trở lại đoạn DNA cần xác định trình tự vào một vecter mạch đơn (phage 13) Do đó, để đơn giản hóa, ngay từ đầu người ta tạo dòng với vecter là các plasmid thế hệ thứ ba Ở hai bên của đoạn DNA được tạo dòng, các plasmid này có mang hai trình tự chuyên biệt, mỗi trình tự nằm trên một mặt khi cần xác định trình tự của mạch nào, trước hết người ta tách rời hai mạch (biến tính bằng NaOH) rồi sử dụng mồi bắt cặp với trình tự chuyên biệt nằm trên mạch đó Phản ứng tổng hợp xảy ra thoe nguyên tắc đã nêu ở phần trên 1-Xác định trình tự bằng máy tự động

Trong kỹ thuật này, người ta không đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ mà bằng hóa chất –các fluochrome Mỗi loại dideoxynucleotide được đánh dấu bằng một fluochrome có màu khác nhau Như vậy, tất cả các

oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu Sau khi điện di trên gel polyacryl amide, kết quả sẽ được đọc qua một hệ thống vi tính.

Tất cả các phương pháp vừa kể đều dùng để xác định trình tự của một DNA đã được tạo dòng Sự ra đời của phương pháp PCR cho phép xác định trực tiếp trình tự của một DNA khuyếch đại bằng PCR không qua tạo dòng.

2-Phương pháp PCR dùng trong xác định trình tự nucleic acid

Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên sự phối hợp giữa phương pháp PCR và phương pháp sử dụng các dideoxynucleotide.Phương pháp chỉ sử dụng được khi vùng cần xác định trình tư đã biết trước ; và ứng dụng chủ yếu là dùng phát hiện nhah một đột biến điểm.

Trước hết đoạn DNA cần xác định trình tự được khuyếch đại bằng

phương pháp PCR Sau đó, hai mạch của phân tử DNA được tách rời nhau Mỗi mạch được bắt cặp với một mồi (có thể là mồi dùng cho phản ứng PCR hay một mồi nằm bên trong đoạn DNA) Phản ứng tổng hợp xảy ra tượng tự như trong các phương pháp enzyme học sử dụng

dideoxynucleotide.

***************************************

Tóm tắt

Các phương pháp xác định trình tự nucleic acid đều dựa vào hai nguyên tắc :

-Nguyên tắc hóa học (phương pháp Macxam-Gilbert): dựa vào các phản ứng hóa học thủy giải đặ c hiệu DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước khác nhau.

-Nguyên tắc enzyme học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên) : dựa vào sự tổng hợp mạch bổ xung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước khác nhau.

Ở cả hai trường hợp, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylmide có khả năng phân tách hai trình tự DNA chỉ trên nhau một nucleotide Với việc sử dụng một loại nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết quả trình tự cần xác định được đọc trên bản phóng

xạ tự ghi từ bản điện di.

*********************************************

Vào giữa thập kỷ 70, có hai quy trình giải trình tự như sau được đưa ra gần như cùng một lúc:

- Phương pháp của Maxam và Gilbert (1977) cắt đứt sợi đôi DNA tại các vị trí đặc biệt bằng các phản ứng hoá học.

- Phương pháp Sanger (1977) dung enzyme xúc tác sợi bổ sung tương ứng của một chuỗi DNA cần xác định trình tự, nhứng sản phẩm tổng hợp bị chấm dứt tại một điểm đặc biệt nào đó.

Hiện này người ta không sử dụng rộng rãi phương pháp hoá học do độc tính của

hoá chất Do đó, chỉ còn phương pháp của Sanger được sử dụng phổ biến cả ở VN lẫn thế giới

Phương pháp của Sanger sử dụng ddNTP (dideoxyribonucleoside triphosphate) tức dNTP mà phân tử được của nó thiếu nhóm 3’-OH Điều này dẫn đến khi sử dụng ddNTP trong phản ứng tổng hợp PCR, phân tử này vẫn gắn vào gốc được của

dNTP trước đó bằng lien kết phosphodiester nhưng do không có gốc 3’-OH nen không thể tạo lien kết mới với bất kỳ phân tử dNTP nào khác do đó, phản ứng tổng hợp DNA chấm dứt tại đây

quá trình tổng hợp dừng lại khi ddATP gắn vào sợi DNA đang kéo dài Như vậy trong hỗn hợp phản ứng sau cùng sẽ thu được nhiều phân tử DNA

có độ dài khác biệt và tất cả cúng đều chấm dứt tại vị trí A (do việc gắn ddATP thay vì dATP là ngẫu nhiên) Các sản phầm có độ dài khác nhau này có thể phân biệt và quan sát trên gel polyacrylamide biến tính Kết quả trên trường điện di là các vạch có chiều dài khác nhau và đều có vị trí tận cùng là T trên sợi khuôn.◊Sanger đã áp dụng đặc tính này bằng cách trong phản ứng tổng hợp DNA, ngoài

dNTPs, ông cho thêm vào hỗn hợp một dẫn xuất ddNTP,

ví dụ thay dATP bằng ddATP

Phản ứng sau đó được tiến hành lại nhưng thêm ddGTP;

cứ như thế tiếp diễn với ddTTP và ddCTP Chúng ta sẽ thu được 4 trường điện di và suy ra trình tự sợi khuôn

DNA

Trong thực tế, các ddNTP này thường được gắn với thuốc nhuộm phát huỳnh quang với các màu khác nhau cho mỗi loại ddNTP Tiên hành phản ứng tổng hợp với cả 4 dNTPs

và 4 ddNTPs, sản phẩm của phản ứng được đưa lên máy đọc Máy đọc sử dụng tia laser để xác định các chất phát huỳnh quang phát ra từ thuốc nhuộm gắn lên sản phẩm và kết quả được chuyển vào máy tính để xử lý và cho ra trình

tự cần xác định

Hiện nay ở VN sử dụng phương pháp đọc trình tự của

Sanger với các máy đọc tự động nhập của nước ngoài Theo tôi biết ở trên viện CNSH có một cái sử dụng liên tục, ở trường ĐHBK, ĐHKHTN, ĐHSP, viện di truyền nông nghiệp… cũng đều có nhưng hầu như chả sử dụng mấy Cái máy mua về hay được tại trợ theo dự án để đấy cho đẹp thôi, tiền hoá chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự hơi to nên chả dại dung nhiều, nhỡ không ra hoặc hỏng máy thì toi

1 Giải trình tự là gì?

Thông tin di truyền của mọi cơ thể sinh vật được chứa đựng trong phân tử có tên là ADN (acid deoxynucleic), đó

là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch đơn được tạo thành

từ bốn loại nucleotide gồm A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine) Các nucleotide này nối tiếp

nhau theo một trình tự xác định, và khác nhau ở từng loài, thậm chí ở từng các thể Giải trình tự ADN là kỹ thuật

giúp xác định sự sắp xếp của bốn loại nucleotide A, T, C,

G trên phân tử ADN, nhờ đó nghiên cứu được đặc điểm di truyền ở mức độ sinh học phân tử

2 Các phương pháp giải trình tự ADN

Phương pháp Maxam và Gilber

Vào năm 1977, hai nhà khoa học người Mỹ Allan Maxam

và Walter Gilbert đã phát minh ra một phương pháp hóa học có thể xác định được trình tự các nucleotide trong

chuỗi ADN Theo phương pháp này để giải trình tự ADN thì trước hết phân tử ADN được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5’ Sau đó chúng được chia thành 4 nhóm, mỗi nhóm sẽ xử lý hóa chất khác nhau nhằm làm biến đổi đặc trưng một loại nucleotide và cắt phân tử

ADN ngay tại nucleotide đó Bốn nhóm bị tác động bao gồm: G, A+G, T+C, và C Kết quả sẽ tạo thành những

đoạn oligonucleotide có chiều dài khác nhau Các đoạn này được phân tách trên gel polyacrylamide và hiển thị bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Từ kết quả phóng xạ tự ghi của bốn nhóm trên có thể xác định được vị trí của bốn loại nucleotide trong chuỗi ADN

Bảng đọc kết quả trình tự theo phương pháp Maxam và Gilber

Phương pháp hóa học xác định trình tự ADN của Maxam

và Gilbert trên thực tế không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, trong

đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn của các chất hóa học sao cho khi xử lý mẫu ADN thì trên mỗi đoạn ADN chỉ có một base bị biến đổi Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam-Gilber hiện nay ít được sử dụng, mà thay vào đó các nhà khoa học dùng phương

pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội hơn

Phương pháp Sanger

Phương pháp Enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977, và ngày hôm nay phương pháp này càng ngày càng được hoàn thiện và thực hiện dễ dàng tại các phòng thí nghiệm Để thực hiện phương pháp này, trước hết, các đoạn ADN cần xác định trình tự phải được tạo dòng vào một vector để nhân thành nhiều bản sao

trong tế bào vi khuẩn, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do Lượng ADN sau khi được tách chiết sẽ được phân vào bốn ống nghiệm khác nhau để thực hiện phản ứng giải trình tự Mỗi phản ứng bao gồm: vector có gắn chèn đoạn ADN cần xác định trình tự, đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí đoạn chèn ADN, enzyme ADN

polymerase, bốn loại dNTP và 1% mỗi loại ddNTP

ddNTP là dideoxynucleotide triphosphate có cấu trúc hóa học mất gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường

deoxyribose làm cho dNTP kế tiếp không thể gắn vào Do

đó sẽ kết thúc phản ứng kéo dài chuỗi Kết quả sẽ tạo

những mạch ADN có chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn ADN gốc Các ddNTP sẽ được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ 32P

hay 35S Sau khi điện di trên gel polyacrylamide giống như phương pháp Maxam-Gilbert, các vạch điện di này được hiển thị bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi Từ các vạch này có thể xác định được trình tự ADN

Bảng đọc kết quả trình tự theo phương pháp Sanger

Giải trình tự bằng máy giải tự động

Ngày nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng nhờ

có sự hỗ trợ của máy giải trình tự tự động Máy giải trình

tự hoạt động dựa theo nguyên lý của phương pháp Sanger

có cải biến Trong đó các ddNTP không được đánh dấu phóng xạ mà được đánh dấu bằng chất huỳnh quang khác nhau cho mỗi loại ddNTP Máy giải trình tự tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ mao quản, hệ chiếu sáng laser, hệ nhận và xử lý tín hiệu Các vạch điện di trong mao quản sẽ được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser Hệ thống nhận diện tín hiệu màu sẽ ghi lại

và mã hóa thành các nucleotide A, T, C, G

Sơ đồ hệ thống máy giải trình tự tự động

3 Ứng dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử của virus Virus là nhóm vi sinh vật nhỏ nhất chưa có cấu tạo tế bào Vật liệu di truyền của virus rất đa dạng bao gồm ADN sợi đôi, ADN sợi đơn, ARN sợi đơn, ARN sợi đôi, v.v

Trong đó virus có vật liệu di truyền là ARN chiếm đa số

Và dù là ADN hay ARN, tất cả thông tin di truyền đều được đọc dưới dạng A, T, G, C theo như trình tự của

ADN Do vậy giải trình tự ADN vẫn áp dụng đối với

nhóm virus ARN Theo đó, để gải trình tự ARN của virus ARN của virus được tách chiết từ mẫu bệnh phẩm, sau đó

sẽ chuyển đổi ngược thành cDNA, và được nhân lên bằng

kỹ thuật PCR Thông tin di truyền sẽ được giải mã bằng máy giảitự động

Các bước giải trình tự gen virus:

- Tách chiết vật liệu di truyền ADN hay ARN của virus từ mẫu,

- Thực hiện phản ứng PCR hay RT-PCR để tăng lượng và giới hạn vùng gen cần giải của virus với mồi chuyên biệt,

- Tinh sạch sản phẩm PCR,

- Thực hiện phản ứng PCR giải trình tự với một mồi và chất ddNTP để tạo những đoạn ADN có kích thước khác nhau với đầu tận cùng là ddNTP có đánh dấu chất phát huỳnh quang,

- Tinh sạch sản phẩm PCR giải tình tự để loại các ddNTP thừa và mồi dư,

- Thực hiện giải trình tự trên máy giải tự động

Những ứng dụng nghiên cứu:

- Định danh virus:

Trong trường hợp xét nghiệm virus bằng kỹ thuật PCR cho kết quả vạch không đặc hiệu khó xác định hay còn nghi ngờ thì kỹ thuật giải trình tự giúp định danh rất chính xác vì mỗi loại virus có một trình tự rất riêng biệt, không trùng lẫn với những loài khác

- Xác định kiểu gen:

Kiểu gen (genotype) là kiểu gen khác nhau ở cùng một loài virus Việc phân biệt những kiểu gen khác nhau dựa trên sự khác nhau ở một số nucleotide trong cùng một

gen Xác định kiểu gen giúp nghiên cứu dịch tễ học phân

tử của các virus gây bệnh truyền nhiễm Chẳng hạn virus sởi có hơn 23 kiểu gen khác nhau được ký hiệu theo chữ cái và chữ số ví dụ kiểu A, B1, B2, B3, C1, C2, C3, D1, D3, D4, D5, H1, H2, Ở Việt Nam, kiểu gen sởi lưu hành chủ yếu là H1, H2, D5