Cong nghe gen trong ứng dụng thực tiễn

• Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận thường là vi khuẩn E.coli• Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng vi khuẩn mang gene tái tổ hợp • Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra

CÔNG NGHỆ GENE (GENETICS ENGENEERING)

• Bước 5: Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào nhận (thường là vi khuẩn E.coli)

• Bước 6: Chọn lọc và nhân dòng

vi khuẩn mang gene tái tổ hợp

• Bước 7: Nghiên cứu điều kiện để gene biểu hiện ra sản phẩm

2 Các vector chuyển gene

Plasmid:

- DNA vòng tròn

- Sao chép độc lập trong tế bào

- Có khả năng mang một số gene có khả năng biểu hiện thành protein

Vector:

- Có khả năng tự tái bản

- Tồn tại độc lập trong tế bào

- Mang được gene mong muốn

3 Hệ thống tế bào chủ (Host)

Mục đích:

- Nhân nuôi tạo số lượng lớn dùng cho thí nghiệm tạo dòng.

- Biểu hiện gene

- Sản xuất protein tái tổ hợp.

3.1 Escherichia coli (E.coli)

- Dễ nuôi cấy và nhân dòng

- Dễ chấp nhận các loại vector khác nhau.

- Vi khuẩn Gram-, hình que,

- Bộ gene khoảng 4,6x10(6) cặp base

3 Hệ thống tế bào chủ (Host)

3.2 Saccharomyces cerevisiae

- Đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật Eukaryote

- Phân lập được nhiều promotor hoạt động mạnh

- Thực hiện biến đổi sau dịch mã tạo protein có

đủ hoạt tính sinh học

- Sản xuất protein tái tổ hợp

- Sinh vật an toàn

3.3 Hệ thống tế bào thực vật

3.4 Hệ thống tế bào động vật

- Tế bào thận khỉ xanh châu Phi (COS- African green monkey kidney)

- Tế bào thận chuột đồng con (BHK- Baby hamster kidney)

- Tế bào thận phôi người (HEK-239- Human embryonic kidney

- Tế bào tử cung chuột bạch (CHO-Chinese hamster ovary)

- Tế bào côn trùng nuôi baculovirus biều hiện protein người

- Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans

3 Hệ thống tế bào chủ (Host)

1 Lai nucleic acid

- Tách chiết và tinh sạch DNA và RNA

- Điện di trên gel

+

-Wells

Small Large

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

1 Lai nucleic acid

- Lai trên pha rắn

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

Dot và slot blot

dùng cho RNA và DNA

1 Lai nucleic acid

- Lai trên pha rắn

- Lai tại chổ

(in situ hybridisation): nghiên cứu nucleic acid tại chổ không cần phải tách chiết ra ngoài

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

2 Thu nhận gene

- Thu nhận DNA từ bộ gene

* Shotgun

* Ngân hàng/thư viện DNA bộ gene (Bank/Library of genomic DNA)

- Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học

- Lập ngân hàng c-DNA

* Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron)

* Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

2 Thu nhận gene

- Thu nhận DNA từ bộ gene

- Tổng hợp gene bằng phương pháp hóa học

- Lập ngân hàng c-DNA

* Chứa trình tự mã hóa liên tục của một gene (no intron)

* Xác định đúng dòng gene muốn nghiên cứu : EX: hemoglobine

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

3 Tạo plasmid tái tổ hợp

a) Dùng đầu so le

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

3 Tạo plasmid tái tổ hợp

a) Dùng đầu so le

b) Dùng các đoạn nối (linkers)

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

3 Tạo plasmid tái tổ hợp

a) Dùng đầu so le

b) Dùng các đoạn nối (linkers)

c) Dùng enzyme terminal transferase

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào

4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bàoa) Hóa biến nạp

b) Điện biến nạp (electroporation)

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

4 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bàoa) Hóa biến nạp

b) Điện biến nạp (electroporation)

c) Vi tiêm (micro-injection)

d) Bắn gene

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

5 Chọn lọc, tạo dòng và sự biểu hiện gene

a) Xác định dòng vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp

Kỹ thuật và phương pháp căn bản

b) Tạo dòng

c) Sự biểu hiện của gene được tạo dòng

- Vector biểu hiện

Yêu cầu:

Số lượng hợp lý bản sao cho mỗi tế bào

Promotor biểu hiện

Trình tự bám vào ribosome (rbs) và DNA phụ cho dịch mã tốt

Sự ổn định lâu dài

Tránh sự thủy giải protein (proteolysis) do các enzyme trong tế bào

Ứng dụng công nghệ gene

1 Khai thác DNA các bộ gene

1.1 Genomics:

- Xác định trình tự nucleotide của bộ gene và chức năng của chúng

- Phát hiện, bảo tồn sự đa dạng sinh học, sử dụng chúng.

1.2 Proteomics

- Nghiên cứu cấu hình (conformation), vị trí (localization), các biến đổi

(modification), sự tương tác (interactions), chức năng (function)

- Tạo hormone, vaccin tái tổ hợp dùng chữa trị bệnh.

1.3 Human Genome Projet

1.4 Các ngành học khác

- Cellomics

- Metabolomics

- Ionomics

STT Sản phẩm Các bệnh điều trị Năm hết patent

2 Interferon alpha Viêm gan siêu vi B, ung

3 Interferon beta Xơ cứng 2003

4 Hormon tăng tưởng người Thiểu năng tăng trưởng 2003

5 Erythropoetin Thiếu máu 2004

6 T-PA (tissu plasminogen

activator) Nhồi máu cơ tim 2005

7 G-CSF (granulocyte –

COLONY Stimulating Factor Chemotherapy-induced neutropenia 2006

* Nối các đoạn gene tạo protein dung hợp (fusion protein)

* Làm mất đoạn hoặc tăng đoạn gene

* Thay thế nucleotide

- Micro array và Biochips

5 Vi sinh vật chuyển gene

6 Thực vật chuyển gene

7 Động vật chuyển gene

1 Khai thác DNA các bộ gene

8 Công nghệ gene đối với sức khỏe con người

Xét nghiệm SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

* Thiết kế thuốc cho từng bệnh nhân