Giáo trình Công nghệ tế bào

Nối tiếp các kết quả nghi ên cứu về nuôi cấy mô ở điều kiện ánh sáng tự nhi ên,việc khảo sát: “Ảnh h ưởng của ánh sáng tự nhi ên trong quá trình nhân gi ống invitro lên sự tăng trưởng củ

CÔNG NGHỆ TẾ BÀO

THỰC VẬT

SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN TỪ LỚP MỎNG TẾ B ÀO CỦA

GIỐNG ĐIỀU (Anacardium occidentale L.) CAO SẢN BO1

NUÔI CẤY in vitro

Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Đ ình Sỹ, Nguyễn Thị Quỳnh

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Cây điều (Anacardium occidentale L.) là cây công nghi ệp đem lại hiệu quả

kinh tế cao ở một số n ước thuộc vùng nhiệt đới Châu Á và Châu Phi do nhân h ạtđiều có giá trị cao trong xuất khẩu Thông th ường cây được nhân giốn g từ hạt,nhưng phương pháp này đem l ại tính không đồng nhất về di truyền (Philip v à Unni,1994) Các phương pháp nhân gi ống vô tính truyền thống nh ư giâm cành, ghépthường được sử dụng để nhân các d òng điều có năng suất cao, tuy nhi ên hệ số nhân

giống không đáp ứng nhu cầu Do ph ương pháp nhân gi ống in vitro được sử dụng

và thành công trên nhi ều loài cây ăn trái g ần với cây điều (Barghchi & Alderson,

1983; Litz và cộng sự, 1984) n ên nhân giống in vitro cây điều có tính khả thi (Vũ

Ngọc Phượng và cs, 2003)

Nuôi cấy lớp mỏng tế b ào là một phương pháp cho nhi ều ưu thế hơn so với

những phương pháp nhân gi ống in vitro truyền thống khác v à được ứng dụng th ành

công trên nhiều loài cây khác nhau (Dương T ấn Nhựt và cs, 2003) Tuy nhiên, vi ệcứng dụng phương pháp nu ôi cấy lớp mỏng tế b ào ở cây thân gỗ ch ưa được công bốnhiều

Trong bài này chúng tôi trình bày m ột số kết quả nghi ên cứu về nuôi cấy lớpmỏng tế bào từ đốt thân mầm v à đốt tử diệp của cây điều

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Mẫu nuôi cấy l à hạt trưởng thành của giống điều cao sản BO1 thu đ ược từvườn đầu dòng của Trung tâm H ưng Lộc (Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệpMiền Nam), Đồng Nai Hạt điều có 2 lớp vỏ, vỏ cứng b ên ngoài và v ỏ lụa bêntrong Hạt được khử trùng bằng dung dịch NaOCl (C ơ sở Vân Phương, Quận 11,

Tp Hồ Chí Minh) với nồng độ 1% (w/v) trong 24 giờ, sau đó rửa lại bằng n ước cất

vô trùng 3 lần

Cây mầm phát triển từ hạt nuôi cấy tr ên môi trường khoáng MS không có đ ường

và vitamin sau 2 tu ần được dùng làm nguyên li ệu cho thí nghiệm Lớp mỏng cắt

ngang từ 2 loại vật liệu l à đốt tử diệp và đốt thân của câ y mầm (có bề dày khoảng0,3-0,5mm) được cấy trên các đĩa petri (Ф = 10cm) chứa 20ml môi trường.

Môi trường nuôi cấy l à môi trường MS (Murashige v à Skoog, 1962) có b ổsung nước dừa 10% (v/v), adenine su lphate (Sigma Chemical Co.,USA) 40 mg/L,saccharose (C ty Đường Biên Hoà, Đồng Nai) 20g/L, maltose (Sigma ChemicalCo., Missouri, USA) 10 g/L, agar (Cty C ổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quản g Ninh)9g/L, than hoạt tính 3g/L Môi trường được bổ sung các chất điều ho à sinh trưởngthực vật là 6-benzyladenine (BA), kinetin (KN) và naphthalene -1-acetic acid(NAA) ở các nồng độ khác nhau pH của môi tr ường trước khi khử trùng là 5,9.Môi trường được khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 20 phút Phòng nuôi cây có nhi ệt

độ 25 ± 2oC, độ ẩm 60 ± 5% Đĩa petri đựng mẫu đ ược che tối trong 3 ng ày đầu,sau đó được đặt dưới cường độ ánh sáng 40 -50 µ mol m-2 s-1 với thời gian chiếusáng 12 giờ/ngày

Mỗi đĩa petri có 24 mẫu cấy của mỗi loại vật liệu (đốt thân mầm hoặc đốt tửdiệp) Thí nghiệm có 3 yếu tố là 3 chất điều hoà tăng trưởng thực vật, mỗi yếu tố

có hai mức độ (Bảng 1) Thí nghiệm đ ược bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên và mỗinghiệm thức gồm 4 đĩa petri lập lại 3 lần Số liệu đ ược phân tích thống k ê bằngphần mềm MSTATC (Đại học Michigan, M ichigan, USA) Thí nghi ệm được theodõi trong 28 ngày

Bảng 1: Mô tả thí nghiệm (chung cho 2 loại vật liệu)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả thí nghiệm sau 28 ng ày nuôi cấy cho thấy các lát mỏng ở v ùng đốtthân chỉ cho một chồi c òn ở vùng đốt tử diệp thì cho nhiều chồi hơn Điều này chothấy là do vùng sinh mô ch ờ hiện diện chung quanh đốt tử diệp dễ bị kích hoạtdưới tác động của ch ất điều hoà sinh trưởng thực vật (K Trần Thanh Vân, 2003).(Hình 1)

Hình 1 Chồi hình thành từ lớp mỏng đốt thân mầm v à đốt tử diệp sau 28 ng ày.

Số chồi cao nhất (5, 7 chồi) từ lớp mỏng ở đốt tử diệp th uộc nghiệm thức 6 cĩ bổsung 10mg/l BA, 1mg/l KN và 0,5mg/l NAA Lớp mỏng tạo chồi thấp nhất (3 chồi) khiđược nuơi trên mơi trường cĩ bổ sung 5mg/l BA v à 0,5mg/l NAA

Ảnh hưởng của BA và KN lên sự tạo chồi của lớp mỏng v ùng đốt tử diệp thấy rõnhất khi nồng độ BA 10mg/L v à KN 1mg/L, trong khi ảnh hưởng của NAA khơng thấy

rõ lắm trong thí nghiệm n ày Đối với đốt thân mầm, nồng độ của các chất điều ho à sinhtrưởng thực vật được sử dụng trong thí nghiệm n ày khơng đem lại sự khác biệt về sốchồi hình thành ở cả 8 nghiệm thức (H ình 2)

0 1 2 3 4 5 6

Đốt thân Đốt tử diệp

Hình 2 Số chồi tạo thành từ lát mỏng đốt thân mầm v à đốt tử diệp ở ngày thứ 28.

đốt thân mầm

đốt tử diệp

Các chồi hình thành từ lớp mỏng được tiếp tục cấy chuyền sang môi tr ường MS có

bổ sung 1mg/l BA và 1mg/l KN để phát triển thành cây với số lần cấy chuyền l à 2tuần/lần Chiều cao cây trung bình đạt 3-4cm sau 2 tháng cấy chuyền (Hình 3)

Hình 3 Cụm chồi cây điều phát triển sau 2 tháng cấy chuyền.

KẾT LUẬN

Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào có thể được sử dụng để tạo chồi trực tiếp từtrục thượng diệp của hạt điều nảy mầm Số chồi đ ược tạo trực tiếp từ lớp mỏng đốt tửdiệp là cao nhất khi môi trường có bổ sung 10mg/l BA, 1mg/l KN v à 0,5mg/l NAA Đốivới nuôi cấy lớp mỏng của đốt thân mầm th ì chồi có thể phát triển trên môi trường có

BA 5mg/L và có hoặc không có kinetin v à NAA Cần tiếp tục nghiên cứu để tìm môitrường thích hợp cho sự phát triển chồi từ nuôi cấy lớp mỏng đốt thân mầm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Barghchi M, Alderson PG (1983) In vitro production of Pistacia species Acta

Hort 131, 49-60

2 Dương Tấn Nhựt, Da Silva JAT, B ùi Văn Lệ, Kiêm Trần Thanh Vân (2003) Thincell layer (TCL) morphogenesis as a powerful tool in woody plant and fruit cropmircopropagation and biotechnology, floral genetics andgenetic transformation In:Jain SM & Ishii K (eds.) Micropropagation of woody trees and fruits, pp 783-814,Kluwer Academic Publishers, Dordretch, The Netherlands

3 Litz RE, Knight Jr RJ, Gazit S (1984) In vitro somatic embryogenesis from

Mangifera indica L callus Sci Hort 22, 233 -240.

4 Philip VJ & Unni PN (1984) In vitro propagation of cashew for crop improvement.In: Bhaskara Rao EVV & Khan HH (eds.) Cashew Research and Development,pp.77-82, CPCRI, Kasargod, India.

5 Trần Thanh Vân K (2003) Thin cell layer concept In: Duong Tan Nhut, Van LeBui, Tran Thanh Van K, Thorpe T (eds.) Thin cell layer culture systerm:regeneration and transformation applications pp.1 -16, Kluwer AcademicPublishers, Dordretch, The Netherlan ds

SUMMARY

The organogenesis via thin cell layers cashew

(Anacardium occidentale L.) of the cultivar BO1 cultured

in vitro

Huynh Huu Duc, Nguyen Dình Sy, Nguyen Thi Quynh

Institute of Tropical Biology

Cashew (Anacardium occidentale L.) is a profi table cash crop of several tropicalcountries due to the export value of kernels A study on the in vitro organogenesis viathin cell layer (TCL) culture of the cultivar BO1 was carried out for an appropriateapproach to produce cashew transplants on a lar ge scale Mature seeds of the cultivarBO1 were surface sterilized with NaOCl 1% (w/v) on the MS sugar -free medium.Epicotyls of seedlings were used as explants for TCL culture and put on a modified MSmedium (Murashige and Skoog, 1962) supplemented with B A, KN and NAA atdifferent concentrations, 20g/L sucrose and 10 g/L maltose The TCL positions on theexplants affected the direct shoot induction and number of shoots Shoot formation fromTCLs derived from the cotyledonary nodal position was greater than that from othernodal positions of epicotyls Concentrations of BA, KN and NAA of 10, 1, and 0.5mg/L, respectively, were the best for the direct shoot formation of the cultivar BO1

ẢNH HƯỞNG CỦA ÁNH SÁNG TỰ NHI ÊN TRONG QUÁ

TRÌNH NHÂN GIỐNG in vitro LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG

CỦA CÂY LAN GIỐNG TRONG GIAI ĐOẠN VƯỜN ƯƠM

Lưu Việt Dũng, Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, nhu cầu trồng phong lan phát triển ở TP Hồ ChíMinh Tuy nhiên, việc cung cấp một số l ượng lớn cây giống khỏe mạnh, có tỷ lệsống khi trồng cao trong thời gian qua c òn gặp nhiều khó khăn do không có đ ơn vị

có khả năng cung cấp

Nhu cầu trồng lan từ cây giống bằng cách nuôi cấy in vitro ng ày càng lớn và ởgiai đoạn hiện nay Chính v ì thế việc nhân nhanh v à đưa ra thị trường một số lượnglớn những cây giống khoẻ mạnh l à một nhu cầu của thực tế

Để tạo được cây con khỏe mạnh, giá th ành thấp, bên cạnh thành công của nuôicấy in vitro, giai đoạn v ườn ươm là một vấn đề hết sức quan trọng L àm thế nào đểcây con cấy mô khi trồng ra v ườn ươm có tỷ lệ sống cao, phát triển tốt khi chuyển

từ môi trường nhân tạo ổn định trong b ình cấy mô ra môi tr ường biến động gần với

tự nhiên trong vườn ươm

Nối tiếp các kết quả nghi ên cứu về nuôi cấy mô ở điều kiện ánh sáng tự nhi ên,việc khảo sát: “Ảnh h ưởng của ánh sáng tự nhi ên trong quá trình nhân gi ống invitro lên sự tăng trưởng của cây lan giống trong giai đoạn v ườn ươm” là một bướcthu hẹp khoảng cách từ các kết quả nghi ên cứu khoa học đến tay nh à vườn ứngdụng vào thực tiễn, góp phần đ ưa khoa học kỹ thuật phục vụ sản xuất nông nghiệpcông nghệ cao

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Cây lan cấy mô được nhân giống trong điều kiện ánh sáng tự nhi ên và trongđiều kiện ánh đ èn huỳnh quang được lựa chọn các cây cùng kích cỡ để trồng ravườn ươm

Hình 1 Cây lan Dendrobium c ấy mô trước

khi trồng ra vườn ươm.

Hình 2 Cây lan Catleya c ấy mô trước khi

trồng ra vườn ưom.

Thí nghiệm được tiến hành trên giống Dendrobium, Catleya và Phalaenopsis Sốlượng cây thí nghiệm: 150/giống/nghiệm thức x ba lần lặp lại Giá thể l à xơ dừa và dớnđen (là rễ của cây dương xỉ) Sau khi lấy cây khỏi b ình cấy mô cây được rửa sạch vàngâm 10 phút trong dung d ịch Dithan M-45 5gr/lít

Các chỉ tiêu khảo sát gồm: ♦ Số cây c hết tính theo % ♦ Số lá của một cây tính theotrung bình cộng ♦ Tỷ lệ số cây ra lá mới tính theo % ♦ Chiều cao cây: đo từ cổ rễ l ênhết thân + lá cao nhất của cây ♦ Chiều rộng lá: đo chiều rộng của lá lớn nhất, tính trungbình cộng các cây ♦ Số nhánh trên một bụi tính theo trung b ình cộng ♦ Số rễ hìnhthành mới trên một cây tính theo trung b ình cộng ♦ Số cây cho rễ mới tính theo % ♦Chiều dài rễ tính theo trung bình cộng

Thí nghiệm được tiến hành ở vườn ươm tại Thủ Đức Tp HCM, thuộc Ph òng Côngnghệ Tế bào, Viện Sinh học Nhiệt đới, Viện Khoa học v à Công nghệ Việt Nam

Hình 3: Cây lan Phalaenopsis c ấy mô trước khi trồng ra v ườn ươm.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Một trong những yêu cầu đầu tiên khi trồng lan là cây phải thích nghi và sốngđược Nhờ đã được tôi luyện trước đó trong các điều kiện ánh sáng v à nhiệt độ gầngiống như trong vườn ươm nên cây cấy mô trong điều kiện ánh sáng tự nhi ên tỏ ra thíchnghi tốt

Các kết quả trên cây Dendrobium được trình bày ở bảng 1 dưới đây:

Bảng 1 So sánh tăng tr ưởng cây lan Dendrobium trồng trong vườn ươm

cây nguồn gốc ánh sáng đ èn cây nguồn gốc ánh sáng tự nhi ên

số cây chết % 0 4,7 10,9 14,4 14,8 0 3,0 5,2 5,6 5,9

số lá (trung bình) 3,4 3,4 3,7 4,5 5,3 3,6 3,6 3,8 4,7 5,4

số cây ra lá mới (%) 0 2 15 52 100 0 6 40 89 100 cao cây (cm) 5,2 5,2 6,6 10,1 12,9 5,0 5,0 6,4 10,8 14,6

số nhánh của một bụi 2,0 2,0 2,8 3,4 3,6 2,0 2,0 2,4 3,1 3,8

số rễ mới 0 1,8 3,9 5,4 12,6 0 2,4 4,6 6,8 15,7

số cây ra rễ mới (%) 0 14,8 42,7 87,4 100 0 28,6 82,1 100 100 Dài rễ (cm) 8,2 8,3 11,4 16,7 19,8 8,4 8,5 12,6 18,4 24,4

Hình 4 Cây dendrobium ngu ồn gốc ánh

sáng tự nhiên 60 ngày tuổi

Hình 5: A- cây gốc ánh sáng tự nhi ên B- cây gốc ánh sáng đèn

Cây giống sản xuất trong điều kiện ánh sáng tự nhiên có sức sống tốt hơn, biểuhiện ở số cây chết giảm, mau ra lá mới, lớn nhanh n ên có chiều cao cây và số nhánhcũng như số rễ phát sinh mới tính tr ên một bụi cao hơn đối chứng là cây giống bìnhthường được sản xuất trong phòng máy lạnh và chiếu sáng bằng đèn

Các kết quả trên giống lan dendrobium đ ã khích lệ những nghiên cứu tiếp theo trêncây Catleya Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 2 sau đây:

Bảng 2 So sánh tăng tr ưởng cây lan Catleya trồng trong v ườn ưom

cây nguồn gốc ánh sáng đèn cây nguồn gốc ánh sáng tự nhi ên

số cây chết % 0 12,2 14,6 17,5 19,4 0 3,0 4,8 5,2 6,8

số cây ra lá mới (%) 0 11,3 44,6 78,5 100 0 23,4 64,8 98,1 100 Dài lá=cao cây cm 6,5 6,7 7,1 8,1 10,8 6,5 6,6 7,2 8,4 11,3

số nhánh của một bụi 2,0 2,0 2,2 2,8 3,3 2,0 2,0 2,4 2,8 4,4

số rễ mới 0 1,6 2,8 3,9 5,8 0 2,3 3,4 4,8 6,9

số cây ra rễ mới (%) 0 5,8 28,9 76,8 100 0 15,1 40,9 89,5 100 Dài rễ cm 5,2 7,4 8,7 10,5 13,4 5,2 8,6 9,4 12,6 14,8

Sự khác biệt biểu hiện ngay t ừ 10 ngày đầu tiên Trong khi gần một phần tư cây lanCatleya con bung lá mới ở công thức nguồn ánh sáng từ nhi ên thì chỉ trên mười phầntrăm số lan con ở công thức đối chứng có thở bung lá non Đây l à việc quan trọng vìCatleya vốn là một giống lan lớn ch ậm Số nhánh mới, chiều cao thân lá cũng nh ư số rễphát sinh mới cũng vượt trội so với đối chứng

Hinh 6 Lan Catleya 90 ngay tu ổi

gốc ánh sáng đèn

Hinh 7 Lan Catleya 90 ngay tu ổi gốc ánh sáng tự nhi ên

Trên giống lan Phalaenopsis cũng ghi nhận được các kết quả tương tự, xem bảng 3 dưới đây:

Bảng 3 So sánh tăng tr ưởng cây lan Phalaenopsis trồng trong v ườn ưom

cây nguồn gốc ánh sáng đ èn cây nguồn gốc ánh sáng tự nhi ên

số cây chết % 0 2,1 5,6 10,5 16,4 0 2,0 3,4 5,8 6,9

số cây ra lá mới (%) 0 2,8 38,4 56,8 100 0 3,0 4,1 76,2 100 rộng lá cm 1,8 1,8 2,2 2,6 3,0 1,8 1,9 2,4 2,9 3,5 Dài lá=cao cây cm 5,1 5,2 5,9 6,8 7,9 5 5,2 6,2 7,6 8,4

số rễ mới 0 0,6 1,8 3,1 3,9 0 1,1 2,4 3,8 4,5

số cây ra rễ mới (%) 0 4,0 12,6 76,8 100 0 11,2 54,6 98,8 100 Dài rễ cm 4,6 4,7 5,6 6,4 10,3 4,5 4,8 6,2 8,6 11,4

Các cây giống khi được sản xuất trong điều kiện ánh sáng tự nhi ên có một màu sắctrung gian giữa cây đối chứng được nuôi trong phòng lạnh dưới ánh sáng đèn và cây đãtrồng trong vườn ươm Cây nuôi trong ph òng lạnh thường có màu xanh tươi nhưng câynuôi trong ánh sáng tự nhiên thường vàng hơn và lẫn sắc tố đỏ (Vũ ngọc Ph ượng 2004,2005) Có thể do ánh sáng tự nhiên mạnh đã giúp cây thích nghi m ột phần nên khi đemtrồng ra vườn ươm ít bị chết và sớm bắt đầu tăng trưởng và phát triển.

KẾT LUẬN

Cây lan Dendrobium, Catleya và Phalaenopsis nhân giống bằng cấy mô trong ánhsáng tự nhiên khi trồng ra mau thích nghi với điều kiện v ườn ươm hơn đối chứng là câylan nhân trong phòng máy lạnh ánh sáng đèn Biểu hiện trước tiên nhận thấy ngay là tỷ

lệ chết giảm, cây mau ra rễ v à bung lá mới Sau 90 ngày trồng trong vườn ươm cây cóchiều cao, và số mầm nhánh cũng nh ư số rễ phát sinh mới tính tr ên một bụi cao hơn đốichứng Như vậy khi được nhân giống trong điều kiện ánh sáng v à nhiệt độ tự nhiênkhông những chỉ là một biện pháp để giảm giá th ành sản xuất do không cần sử dụngđiện chiếu sáng và điện máy lạnh mà đây còn là một biện pháp “rèn luyện” cho câygiống cho thích nghi trước một phần với điều kiện tự nhi ên

Hình 8: Cây Phalaenopsis 60 ngày tu ổi

gốc ánh sáng đèn

Hình 9: Cây Phalaenopsis 60 ngày tuổi gốc ánh sáng tự nhi ên

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Nguyễn Thị Quỳnh., Phượng V N , N Đ Sỹ, H H Đức (2006) Ảnh hưởng của

nồng độ đường và điều kiện ánh sáng lên sự tăng trưởng của lan Dendrobium nuôi

cấy in vitro Tạp chí Khoa học v à Công nghệ 44 (3), 100-106

2 Vũ Ngọc Phượng , Đ T A Thuyền, L V Dũng, T X Du & N V Uyển (2001).Quy trình ươm cây hồng (Paulownia fortunei) giai đoạn sau ống nghiệm Trongcuốn: Công nghệ Sinh học v à Nông nghiệp Sinh thái Bền vững Viện Sinh họcNhiệt đới NXB Nông nghiệp 69 -75

3 Vũ Ngọc Phượng (2004) Sử dụng các nguồn carbon hydrat khác nhau trong môi

trường nuôi cấy Dendrobium ở điều kiện ánh sáng tự nhiên Báo cáo Nghiệm thu

kết quả nghiên cứu đề tài nhánh năm 2004

4 Vũ Ngọc Phượng (2005) Sử dụng ánh sáng tự nhi ên trong nuôi cấy mô cây lan hồđiệp Báo cáo Nghiệm thu kết quả nghi ên cứu đề tài cơ sở chọn lọc năm 2005.

SUMMARY

The impact of natural daylight conditions during

micropropagation on growth of greenhouse orchid plantlets

Luu Viet Dung, Vu Ngoc Phuong, Thai Xuan Du

Institute of Tropical Biology

Plantlets of Dendrobium, Phalaenopsis and Catleya multiplicated in vitro undernaturally light conditions expressed better growth for first days in greenhousecomparing to normal fluorescent lamp illumination The results suggest that the naturalday light is not only a solution for saving the electricity for light and/or air conditio ningbut also created a way somehow to “harden” orchids for better adaptable plantlets togreenhouse conditions

NHÂN in vitro GIỐNG TIÊU GỐC GHÉP

(Piper columbrium Link.)

Đỗ Đăng Giáp, Đoàn Thị Ái Thuyền Thái Xuân Du

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Hồ tiêu (Piper) là một chi lớn, gồm khoảng 1.200 lo ài, phân bố chủ yếu ở các khuvực có khí hậu nhiệt đới điển h ình Trong vùng Đông Nam Á có khoảng 400 loài Ơnước ta, theo Phạm Ho àng Hộ (1991), chi Hồ tiêu có chừng 40 loài Do đó nghiên cứu

để khai thác, phát triển sử dụng hợp lý v à toàn diện nguồn gen đa dạng của chi Hồ ti êu ởnước ta là vấn đề đáng được quan tâm

Cây Hồ tiêu (Piper nigrum L.) rất dễ bị bệnh hại do nấm gây ra, đặc biệt l à nấm Phytophthora palmivorra Ngoài ra các loại tuyến trùng Radopholus spp cũng là mối

gây hại đối với cây Hồ tiêu ở nước ta Do đó đồng thời với các biện pháp ph òng trừthích hợp thì việc nghiên cứu, chọn lọc các giống Hồ ti êu có tính chống chịu khoẻ vàcho năng suất cao là hướng giải quyết rất tích cực hiện đang đ ược quan tâm Ở một vàinước, người ta cũng đã bắt đầu nghiên cứu việc ghép các giống Hồ ti êu trồng lên trênnhững gốc ghép là các loài cùng chi có t ốc độ sinh trưởng cao, chống chịu bệnh khoẻ(như dùng loài Piper columbrium Link.) (Lã Đình Mới, 2002)

Trong vài năm gần đây ở nước ta, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam

đang thử nghiệm ghép giống hồ ti êu trên loài tiêu gốc ghép (Piper columbrium Link.)

và đã trồng trên đồng ruộng Nhưng sự sạch bệnh của gốc ghép và khả năng giới hạntrong sự nhân nhanh gốc ghép l à một vấn đề đặt ra cần phải giải quyết Đồng thời vớinhững thành công trong việc nghiên cứu qui trình nhân in vitro giống hồ tiêu sạch virút(Đoàn Thị Ai Thuyền và cs, 2003) đưa tới hướng nghiên cứu vi ghép in vitro trên cây Hồtiêu tạo ra những giống Hồ tiêu không những sạch virút mà còn có khả năng kháng bệnh

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Giống tiêu gốc ghép (P colubrinum L.) do viện Khoa học Kỹ thuật miền Nam cung cấp Tìm hiểu sự tương thích giữa cây Hồ tiêu (P nigum L.) và tiêu g ốc ghép (P columbrinum Link.) bằng phương pháp giải phẫu cấu trúc thân Giống ti êu gốc ghép

được trồng trong bầu đất tại v ườn ươm viện Sinh học Nhiệt đới Cây cao 30 -70cm, có từ10-15 đốt Cắt những đoạn thân chứa những đ ốt bánh tẻ để khử trùng thu nhận mẫu nuôicấy in vitro Những mẫu không nhiễm đ ược nuôi cấy trên môi trường Murashige andSkoog, 1962 (MS) có bổ sung 6 - benzylaminopurine - BA (0,5mg/l) để tạo chồi Tạocụm chồi từ đốt trên môi trường MS có bổ sung BA (0 -5mg/l), indole-3-butyric acid -IBA (0,5mg/l) Các chồi dài 2-3 cm, được nuôi cấy trên môi trường trên MS để tạo cây

con hoàn chỉnh Ươm cây nhân giống in vitro ngoài vườn ươm Cây tiêu gốc ghép đượckiểm tra virút bằng kỹ thuật ELISA, tr ước, trong và sau khi nuôi cấy in vitro đối với các

loại virút hại chính trên cây Hồ tiêu là: ToMV (tobacco mosaic virus), PVX (potato virus X), PVY (potato virus Y) và CMV (cucumber mosaic virus).

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Tìm hiểu sự tương thích cấu trúc thân giữa loài Hồ tiêu và tiêu gốc ghép

Vài năm gần đây, Viện Khoa học v à Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đ ã thực hiệnghép và trồng thử nghiệm ngoài đồng ruộng giữa cây Hồ ti êu và cây tiêu gốc ghép.Bằng phương pháp giải phẫu cấu trúc thân, chúng tôi nhận thấy có sự t ương thích cơbản giữa cấu trúc thân của cây Hồ ti êu và cây tiêu gốc ghép Từ đó có những địnhhướng trong việc nhân giống in vitro cây ti êu gốc ghép để làm nguồn nguyên liệu gốcghép sạch bệnh trong thực hiện thử nghiệm vi ghép in vitro cây ti êu sau này

2 Vô trùng và đưa mẫu tiêu gốc ghép vào nuôi cấy in vitro

Chọn những cành dài khoảng 20-30cm, có từ 5-7 đốt, cắt lấy những đốt bánh tẻ.Sau đó rửa sạch bằng sà phòng pha loãng và sát trùng b ề mặt bằng cồn 700C trong 1phút Dùng dung dịch Javel thương mại pha loãng 1/3 để khử trùng mẫu trong khoảng30-40 phút Sau mỗi bước khử trùng, mẫu được rửa lại 3 lần bằng n ước vô trùng Tiếptheo lắc mẫu trong dung dịch kháng sinh cefotaxin (0,5%) từ 12 -24 giờ trên máy lắc (60vòng/phút) Mẫu vô trùng được cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung BA 0,5mg/l Sau

21 ngày có từ 10-15% các mẫu vô trùng hình thành chồi mới Các chồi mới đ ược cấytruyền sang mô trường MS để tạo nguồn gốc ghép

3 Thí nghiệm tạo cụm chồi từ cắt đốt

Các chồi cao 5-7cm, có 3 đốt được sử dụng tạo cụm chồ i từ cắt đốt Cắt mỗi đốt cómột lá, dài khoảng 1,5-2cm được cấy vào môi trường MS có bổ sung BA (0 -5mg/l),IBA(0,5mg/l) Sau 1 tuần ở nách lá xuất hiện chồi mới ở đốt gốc v à đốt giữa Đốt ngọnkhông hình thành chồi mới do ưu thế ngọn của chồi đỉnh Sau 4 tuần nuôi cấy, ở nhữngnghiệm thức có BA cao (2 -5mg/l) hình thành những chồi bất định ở phần gốc của đốtcấy, nơi mẫu cấy tiếp xúc với môi tr ường Nghiên cứu ảnh hưởng vị trí đốt cấy lên khảnăng hình thành chồi bất định cho thấy có sự khác nhau c ơ bản giữa đốt ngọn và nhữngđốt còn lại Không có khác biệt r õ rệt giữa đốt gốc và đốt giữa ở đốt ngọn có thể do ưuthế chồi ngọn phát triển mạnh rất sớm khi mới bắt đầu cấy v ào môi trường đã ức chếkhả năng hình thành chồi bất định, nên tỉ lệ tạo chồi bất định t hấp chỉ khoảng từ 2-3chồi/mẫu cấy ở môi trường có BA cao (5mg/l) Trong khi đó, vị trí đốt gốc v à đốt giữa

sự hình thành chồi bất định với tỉ lệ rất cao sau 4 tuần nuôi cấy Chồi ngủ cũng h ìnhthành nhưng không phát tri ển nhanh như là đốt ngọn ở những môi trường có BA cao (2-5mg/l) Sự hình thành chồi bất định cao nhất (> 11 chồi/ mẫu cấy) ở đốt gốc với môitrường MS có bổ sung BA (5mg/l)

Như vậy, để nhân nhanh in vitro cây ti êu gốc ghép ta có thể dùng phương pháp tạocụm chồi bất định từ cắt đốt Đốt c àng gần gốc chồi càng nhiều trên môi trường MS có

bổ sung BA (2-5mg/l) Các cụm chồi bất định sau 6 tuần tuổi đ ược cấy truyền sang môitrường MS không bổ sung chất điều ho à sinh trường thực vật để chồi phát triển C ác

chồi mới có thể cao từ 1 -1,5cm sẽ được sử dụng để tạo cây con in vitro hoàn chỉnh.

4 Nhân cây và đưa cây tiêu g ốc ghép ra trồng ngoài vườn ươm

Các chồi cao 1-1,5cm được nuôi cấy trong môi tr ường ½ MS không bổ sung chấtĐHSTTV, trước khi đưa ra vườn ươm với các điều kiện nuôi cấy sau: Sử dụng á nhsáng nhân tạo (ASNT) trong phòng sáng; Sử dụng ánh sáng nhân tạo + ánh sáng tựnhiên (ASNT+TN); Sử dụng ánh sáng tự nhi ên (ASTN); Thời gian nuôi cấy: 4 tuần.Kết quả thí nghiệm cho thấy, sau 4 tuần nuôi cấy các chỉ ti êu thu được ở nhữngbình cây nuôi kết hợp trong điều kiện ánh sáng nhân tạo (2 tuần) sau đó chuyển sangđiều kiện ánh sáng tự nhi ên (2 tuần) là tốt nhất Tuy nhiên sự chênh lệch ở các chỉ tiêu ở

ba điều kiện nuôi cấy nh ư trên là không đáng k ể Do đó chúng ta có thể nuôi cây tronggiai đoạn trước khi ra vườn ươm bằng ánh sáng tự nhiên để tiết kiệm được chi phí trongquá trình sản xuất

5 Đưa cây ra vườn ươm

Các cây con sau 4 tuần nuôi cây ở thí nghiệm tr ên được đưa ra trồng ngoài vườnươm với giá thể là hỗn hợp xơ dừa + tro trấu với tỉ lệ 1 :1 Sau 3 tuần ngoài vườn ươmcho thấy tỉ lệ sống của cây nuôi cấy mô l à 100% Sau 3 tháng trồng ngoài vườn ươmcây có thể cao từ 25 - 35cm Tuy nhiên những cây được nuôi cấy in vitro trong điềukiện có ánh sáng tự nhi ên đã thích ứng nhanh hơn và phát triển tốt hơn so với những câynuôi trong điều kiện nhân tạo

KẾT LUẬN

Thành công trong nhân gi ống tiêu làm gốc ghép Sử dụng phương pháp cắt đốt trênmôi trường MS có bổ sung BA (2 -5mg/l) để tạo chồi bất định ở cây ti êu gốc ghép Kếthợp nuôi cây mô trong đ iều kiện ánh sáng nhân tạo v à ánh sáng tự nhiên ở giai đoạnnhân cây trước khi ra vườn ươm

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bysov A S, (2001) Virus and viral diseases of black pepper ( Piper nigrum L.) in

condition of closed ground and tropical, subtropical agrocenose s The theasis forobtaining PhD degree Kyiv National Univercity, Kyiv

2 Chacko, S et al, (1996) Roasting studies on black pepper ( Piper nigrum L.).

Flavour and Fragrance Journal 11, 305 -310

3 De Waard, P W F & Anunciado, I, S., (1999) Piper nigrum L Plant Resources of

South-East Asia (13): 189-194

4 Đoàn Thị Ai Thuyền, Thái Xuân Du, Đỗ Đăng Giáp, Nguyễn Tăng Tôn (2005).

Bước đầu nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống Hồ ti êu (Piper nigrum L.)

7 Hoàng Quốc Tuấn (2003) Phát triển sản xuất ti êu hữu cơ - tiêu sạch Hội thảo Hồtiêu Việt Nam trên đường hội nhập Hiệp Hội Hồ ti êu Việt Nam

8 Lã Đình Mới (2002) Tài nguyên thực vật có tinh dầu Nxb Nông nghiệp, pp158 -173

SUMMARY

In vitro culture in Piper columbrium Link.

Do Dang Giap, Đoan Thi Ai Thuyen Thai Xuan Du

Institute of Tropical Biology

Black pepper (Piper nigrum L.) is a major spice used in food and medicine.Phytophthora foot rot is the major disease affecting pepper plant killing the entire vine

P colubrinum Link, a related species is unaffected by this fungi Grafting P.nigrum on

P colubrinum is one approach to safeguard the pepper from this disease Single node P.colubrinum Link was used as material in culture on the basic medium MS (1962)supplemented with BA (0 -5mg/l) Within 10 weeks of culture adventitious shootformation was observed on the best medium MS + BA (5 mg/L) Shoots were rooted on1/2 MS medium and in vitro culture plant conditions was described

SỬ DỤNG TINH BỘT TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH PHONG LAN BẰNG NUÔI CẤY MÔ Ở ĐIỀU KIỆN ÁNH

SÁNG TỰ NHIÊN

Vũ Ngọc Phượng, Thái Xuân Du

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Hiện nay chi phí điện cho máy lạnh v à đèn chiếu sáng chiếm một tỷ trọng cao trong

cơ cấu giá thành cây giống Và như thế khi để bình trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng

tự nhiên là một giải pháp mang lại hiệu quả kinh tế

Tuy nhiên khi để bình nuôi cấy mô trong điều kiện ánh sáng tự nhi ên để tiết kiệmđiện năng thì một vấn đề lớn đặt ra l à cây rất dễ nhiễm Có một cách chống nhiễm l àloại bỏ đường hoàn toàn khỏi môi trường nuôi cấy, nhưng thiếu đường thì cây mọcchậm lại nhất là trong giao đoạn đầu khi cây còn nhỏ chưa có khả năng quang hợp vớihiệu suất cao

Việc bổ sung tinh bột là một giải pháp đang được lựa chọn giúp cây một mặt l à lớnnhanh giữ được tốc độ tăng trưởng mặt khác giảm bớt nhiễm trong điều kiện nhiệt độ v àánh sáng tự nhiên

Báo cáo này trình bày h ệ thống các giải pháp cụ thể cũng nh ư những hiệu ứng hữuích khi cây được tôi luyện trong điều kiện trung gian chuyển tiếp từ cấy mô ra v ườnươm Và kết quả đạt được là tạo được cây con khỏe mạnh, giá th ành thấp

Việc hoàn tất quy trình còn cho phép chuyển giao những tiến bộ kỹ thuật nhângiống cấy mô phong lan ở quy mô hộ gia đình nông thôn ven đô thị, góp phần đưa khoahọc kỹ thuật phục vụ sản xuất nông nghiệp công nghệ cao

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu: giống Dendrobium Madam Cherry, Doritanopsis Sarah Jones v à Catleya BLC Tainan City

Môi trường: nuôi cấy Dendrobium có khoáng đa lượng như sau (mg/l): KNO3

1900, NH4NO3 1050, KH2PO4 1000, Ca(NO3)2.2H2O 400, MgSO4.7H2O 500 Môi

trường nuôi cấy Catleya và Doritannopsis có khoáng đa lượng Vacin & Went (1949)

như sau như sau (mg/l): KNO3 525, ()NH4)2SO4 500, KH2PO4 250, Ca3(PO4)2.2H2O

200, MgSO4.7H2O 122 Vi lượng và FeEDTA theo môi trư ờng MS (Murashige &

Skoog 1962) Thiamin HCL 1mg/l, m -inositol 100mg/l Nước dừa 10% pH 5,8 Đ ườnghoặc tinh bột 30gr/l chia đều v ào từng bình Agar 6gr/l.

Hình 1 Nhà plastic nuôi lan trong đi ều kiện ánh sáng tự nhi ên

Thí nghiệm thực hiện cho giai đoạn cấy cây lớn, cấy lần cuối c ùng chuẩn bị đưa ra

vườn ươm Catleyas và Doritanopsis có kích thước trung bình 3cm Dendrobium có

kích thước trung bình 5cm Cấy 6 cây một bình Mỗi bình cấy mô chứa 65ml môitrường Mỗi công thức gồm 30 b ình Công thức nuôi trong phòng được chiếu sáng 2000lux bằng đèn huỳnh quang Thời gian chiếu sáng 8 giờ mỗi ng ày Nhiệt độ 28oC+3.Công thức sử dụng ánh sáng tự nhiên để ngoài hành lang hoặc nhà plastic Ánh sáng tựnhiên khác với ánh sáng đèn ở chỗ cường độ chiếu sáng thay đổi liên tục trong ngày từ 500-7000lux Nhiệt độ ngày đêm cũng liên tục thay đổi và biên độ dao động trong điều kiện ánhsáng tự nhiên là 29oC+8 lớn hơn nhiều so với trong phòng chạy máy lạnh

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Trên đối tượng là cây Dendrobium kết quả đo đạc và cảm quan cho thấy việc sử dụng

carbohydrat ở dạng tinh bột tốt hơn so với dùng đường trình bày trong bảng 1 dưới đây:

Bảng 1 So sánh tăng tr ưởng cây lan Dendrobium trên môi trư ờng đường và tinh bột.

Qua bảng 1 cho thấy trong chu kỳ phát triển b ình thường 10 ngày đầu của cây

Dendrobium cấy mô không ghi nhận sự khác biệt đáng kể về trọng l ượng giữa cây để

trong phòng chiếu sáng bằng đèn và cây bên ngoài sử dụng ánh sáng tự nhi ên

Hình 2 Dendrobium cấy mô 45 ngày tuổi (A) cây ánh sáng tự nhiên + tinh bột (B) cây ánh sáng tự nhiên + đường (C) cây ánh sáng đèn + tinh bột (D) cây ánh sáng đèn + đường.

Khi để cây đến 45 ngày thì ghi nhận được những khác biệt rõ rệt bên ngoài vềmàu sắc Cây được chiếu sáng tự nhiên “xanh” hơn cây trong ph òng Lá rộng bản hơnnhiều so với cây nuôi dưới ánh sáng đèn trên cùng một công thức môi trường nuôi cấy.Khi tinh bột được dùng thay cho đường sự khác biệt được ghi nhận giữa cây trongphòng dùng ánh sáng đèn và cây ánh sáng tự nhiên Bắt đầu từ ngày 30 trở đi cây trênmôi trường tinh bột bắt đầu khác biệt với cây sống tr ên đường Nuôi cấy càng kéo dàithì sự khác biệt càng rõ rệt Số lượng cũng như chiều dài rễ cũng ghi nhận được sự khácbiệt giữa các công thức nh ưng không rõ rệt như trọng lượng thân lá

Tỷ lệ nhiễm giảm rõ rệt trên các công thức nuôi cấy dùng tinh bột làm nguồncarbohydrat duy nhất

Như vậy việc đưa cây cấy mô ra nuôi dưới ánh sáng tự nhiên không những chỉ làgiải pháp tiết kiệm điện m à lại tốt cho cây Trọng lượng sinh khối của công thức d ùngtinh bột kết hợp ánh sáng tự nhi ên giúp tăng được đến 30% so với công thức cây nuôitrên đường dưới ánh sáng đèn

Trên đối tượng là cây lan hồ điệp Doritanopsis cũng ghi nhận một kết quả tốt t ương tự

khi sử dụng ánh sáng tự nhiên thay cho ánh sáng đèn tr ình bày trong bảng 2 dưới đây:

Bảng 2 So sánh tăng tr ưởng cây lan Doritanopsis tr ên môi trường đường và tinh bột

số rễ

Một đặc điểm quan trọng đ ược ghi nhận là cây lan hồ điệp lớn chậm Để có thể

xuất cây ra trồng cần nuôi trong b ình đến 60 ngày trong khi Dendrobium chỉ cần 30

ngày là đủ Khi kéo dài thời gian nuôi cấy thường làm môi trường bị khô Ở điều kiệnánh sáng tự nhiên với biên độ dao động nhiệt lớn trao đổi khí diễn ra mạnh h ơn làm câylớn nhanh hơn nhưng cũng làm mất nước và môi trường mau khô hơn Việc bổ sungmôi trường lỏng có cùng thành phần giúp giữ môi trường không bị cạn kiệt v à cây pháttriển tốt Đồng thời khi nuôi trong ph òng thì việc bổ sung môi trường không có tác dụng

rõ rệt như khi nuôi ở điều kiện ánh sáng tự nhi ên (Vũ ngọc Phượng, 2005)

Hình 3 Doritanopsis c ấy mô 60 ngày tuổi (A) cây ánh sáng tự nhi ên + tinh bột

(B) cây ánh sáng đèn + đư ờng

Việc sử dụng môi trường có chứa tinh bột l à nguồn carbohydrat kết hợp chiếu sángbằng ánh sáng tự nhiên giúp cây vượt 50% so với đối chứng nếu xét ri êng bộ lá

Doritanopsis lớn nhanh với chiều cao cộng cả rễ to gần gấp đôi so với đối chứng nuôi

trên môi trường đường dưới ánh sáng đèn

Thí nghiệm trên cây lan Catleya cũng cho một kết quả t ương tự được trình bày

trong bảng 3 sau đây:

Bảng 3 So sánh tăng tr ưởng cây lan Catleya trên môi trường đường và tinh bột

Nhìn chung Catleya có tốc độ tăng trưởng chậm hơn Dendrobium Khi nuôi trong

điều kiện ánh áng tự nhi ên bằng môi trường tinh bột sự gia tăng về chiều cao đ ượckhoảng 32% và trọng lượng khoảng 26% so với đối chứng l à môi trường đường vàchiếu ánh sáng đèn

Sắc tố đỏ tía đặc trưng khi có ánh sáng mạnh xuất hiện trên cây cấy mô trong điềukiện ánh sáng tự nhiên (xem hình 4) Hiện tượng này ghi nhận được ở tất cả các giống

lan nhưng đặc biệt rõ trên Catleya.

Hình 4: Catleya 60 ngày tu ổi nuôi ở ánh sáng

tự nhiên trên môi trường tinh bột.

Hình 5: Catleya 60 ngày tu ổi nuôi ở ánh sáng đèn trên môi trư ờng đường.

KẾT LUẬN

Có thể sử dụng ánh sáng tự nhi ên như một giải pháp tiết kiệm điện máy lạnh v à đèn

chiếu sáng để nuôi cấy phong lan Dendrobium, Doritanopsis và Catleya Dendrobium

có tốc độ lớn nhanh hơn Doritanopsis và Catleya Khi sử dụng tinh bột thay cho đ ường

tỷ lệ nhiễm giảm Lượng agar dùng làm đông môi trường giảm đi Trong điều kiện ánh

sáng tự nhiên chiếu mạnh cây có sắc tố tím đỏ Trên đối tượng là cây Dendrobium, Doritanopsis và Catleya kết quả đo đạc cho thấy ở môi tr ường ánh sáng tự nhiên việc

sử dụng carbohydrat ở dạng tinh bột tốt h ơn so với dùng đường Kể từ ngày 30 trở đi bắtđầu ghi nhận được sự khác biệt với cây sống tr ên đường Trong vòng 60 ngày, thời giannuôi cấy càng kéo dài về sau thì sự vượt trội càng càng rõ rệt

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Murashige T., & F Skoog, 1962 A revised medium for rapide growth and bio assays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15, 473 -497

-2 Vacin E F and Went E W 1949 Bot.Gaz 110, 605 Trong cu ốn: DUCHEFABiochemicals Plant Cell and Tissue Culture Catalogue 2003 -2005 78

The use of starch for micropropagation of orchids

under natural daylight conditions

Vu Ngoc Phuong, Thai Xuan Du

Institute of Tropical Biology

Plantlets cultured under naturally light conditions expressed better growthcomparing to normal fluorescent lamp illumination The results suggest that the naturalday light is not only a solution for saving the electricity for light and/or air con ditioningbut also created a better biomas growth The use of starch as lonely source ofcarbohydrate help the growth plantlet at the late period of cultivation The same resultsobtained for Dendrobium, Doritanopsis and Catleya multiplicated in vitro

NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH CÂY vani BẰNG NUÔI CẤY MÔ

Vũ Ngọc Phượng, Lê Hoàn Hảo, Thái Xuân Du

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Vani có nguồn gốc từ vùng Mexicô, vùng Caribbean thu ộc châu Mỹ nhiệt đới Sảnxuất vani năm 2001 ước khoảng gần 5000 tấn tr ên diện tích 41.000 ha Giá cây vanihiện nay rất cao bằng khoảng h ơn 12-15 lần giá cà phê Việt Nam nằm trong vùng khíhậu thích hợp cho việc trồng cây vani B ên cạnh những cây có giá trị kinh tế khác đ ãđược đưa vào nuôi cấy mô (V N Phượng & CTG 2000, 2002, Đ T A Thuyền và CTG2001) việc đưa cây vani vào sản xuất là một bước đa dạng hóa sản phẩm nông nghiệpphục vụ xuất khẩu

Để khởi đầu phát triển, nuôi cấy mô l à một công việc hữu hiệu để nhân nhanh trongmột thời gian ngắn các giống đầu d òng sạch bệnh Bài viết trình bày các kết quả nghiêncứu từ khởi đầu đưa mẫu cây vào nuôi cấy, xác định môi trường và sau đó là trồng trongvườn ươm thành cây giống hoàn chỉnh

Môi trường tạo chồi có bổ xung chất sinh tr ưởng và phụ gia hữu cơ là: 6-BenzynAdenin (BA) 5mg/l Adenin 15mg/l Tyrosin 20mg/l Môi trư ờng tạo cây và ra rễ có bổxung chất sinh trưởng là: α-Naphthalene Acetic Acid (NAA) 0,5mg/l

Bình cấy chồi được chiếu sáng 2000 lux bằng đ èn huỳnh quang Thời gian chiếusáng 8 giờ mỗi ngày Nhiệt độ 28oC+3 Bình cấy cây sử dụng ánh sáng tự nhi ên đểngoài hành lang Cường độ chiếu sáng thay đổi li ên tục trong ngày từ 500-7000lux.Nhiệt độ ngày đêm dao động trong khoảng 29oC+8

Cây nuôi cấy 60 ngày đạt chiều dài trên 5cm được ươm trên dớn cọng trong 15ngày Dớn cọng là một loại giá thể trồng lan có độ giữ n ước ít, giúp cho bộ rễ khô ráophù hợp với việc ươm vani trong 15 ngày đầu Trong những ngày này không sử dụngphân bón.

Khi đầu rễ vani bắt đầu nhú l ên chứng tỏ sự hồi phục cây vani đ ược chuyển sangbầu có giá thể gồm: phân b ò 60%, tro trấu 20%, đất 20% Phân bón trong giai đoạn n ày

là NPK 30-10-10 và vi lượng HP-306

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Khởi đầu từ chồi nách cây mẹ giâm c ành các đốt thân được nuôi trên môi trườngtạo chồi Sau 1 tháng nuôi cấy từ nách lá nảy l ên chồi Chồi được cấy chuyển sang môitrường mới lại tiếp tục cho chồi khoẻ mạnh xem h ình 1:

Khi muốn có cây chồi được tách và cấy lên môi trường tạo cây Cây hoàn chỉnh cóthể xuất ra vườn ươm được trình bày ở các hình 2, hình 3 và hình 4 Ươm cấy, cấy mô

là một công việc đòi hỏi kỹ năng thuần thục (V.N Ph ượng và CTG 2001) Cây vani r ất

dễ chết úng khi trồng ra vườn ươm Các kết quả thử nghiệm cho thấy khi chọn dớn bôngloại có khả năng giữ n ước cao vốn để trồng lan hồ điệp th ì tỷ lệ cây chết rất cao Khicây được ươm trên một giá thể khô ráo ít giữ n ước thì tỷ lệ sống có thể đạt gần 100%(Lê Hoàn Hảo 2005)

Khi cây đã sống và bắt đầu bung rễ mới cây đ ược chuyển sang bầu gồm phân b ò, tro trấu và đất Các kết quả được trình bày ở hình 5 sau đây.

Theo quy trình đã trình bày kể trên sau 12 tháng kể từ khi bắt đầu tiến h ành nuôicấy đã sản xuất được trên 10 nghìn bầu cây vani giống cấy mô To àn bộ số cây giống kểtrên do một thương nhân người Pháp nhập cành từ nước ngoài về và bao tiêu toàn bộ sốcây giống sản xuất ra đem trồng tại nông trại ở tỉnh B ình Thuận

Hình 1: Chồi Vani cấy mô

Vanilla tahitiensis

KẾT LUẬN

Sau một quá trình nghiên cứu đã xác định được môi trường phù hợp với nuôi cấycây vani như sau: Môi trư ờng nuôi cấy có khoáng đa l ượng như sau (mg/l): KNO3 525,(NH4)2SO4 500, KH2PO4 250, Ca3(PO4)2.2H2O 200, MgSO4.7H2O 122 Vi lượng và Fe-EDTA theo môi trường MS (Murashige & Skoog 1962) Vitamin theo Morel (1949).Nước dừa 10% pH 5,8 Đ ường 30gr/l Agar 7gr/l Môi tr ường tạo chồi có bổ sung chấtsinh trưởng và phụ gia hữu cơ là: 6-Benzyn Adenin (BA) 5mg/l Adenin 15mg/l.Tyrosin 20mg/l Môi trư ờng tạo cây và ra rễ có bổ sung chất sinh trưởng là: α-Naphthalene Acetic Acid (NAA) 0,5mg/l Đây m ột quy trình hoàn chỉnh cho phép nhângiống cây vani bằng nuôi cấy mô với quy mô sản xuất

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Hảo L.H (2005) nghiên cứu khả năng thích nghi của cây Vanilla tahitien sis invitro trong giai đoạn vườn ươm Luận văn tốt nghiệp cử nhân Khoa Công nghệSinh học Đại học mở - bán công Tp HCM

2 Murashige T., & F Skoog, (1962) A revised medium for rapide growth and bio assays with tobacco tissue cultures Physiol Plant 15, 473-497

-3 Phượng V N , P Đ Trí, T X Du & N V Uyển (2000) Nhân giống vô tính cây xoan

Ấn Độ (Azadirachta indica A Juss.) bằng nuôi cấy mô Tạp chí Sinh học 22 (2), 34 -39

4 Phượng V N , P Đ Trí, Đ T A Thuyền, T V Nga, T X Du & N V Uyển

(2002) Nhân giống in vitro cây tre t àu (Sinocalamus latiflorus ) và tre mạnh tông (Dendrocalamus asper ) Tạp chí Sinh học 24 (2), 59 -64.

5 Phượng V N , Đ T A Thuyền, L V Dũng, T X Du & N V Uyển (2001) Quytrình ươm cây hông (Paulownia fortune i) giai đoạn sau ống nghiệm Trong cuốn:Công nghệ Sinh học và Nông nghiệp Sinh thái bền vững Viện Sinh học Nhiệt đới.NXB Nông nghiệp 69-75

6 Thuyền Đ T A., V N Phượng, T X Du & N V Uyển (2001) Nhân giống vô

tính cây hông - Paulownia fortunei (Seem.) Hemsl bằng phương pháp nuôi cấy

Vu Ngoc Phuong, Le Hoan Hao, Thai Xuan Du

Institute of Tropical Biology

The authors have establishe a complete in vitro technology to multiply Vanilla tahitiensis

and Vanilla Indonesia for mass seed plantlets production Culture medium contains macro elements (mg.l-1) KNO3 525, (NH4)2SO4 500, KH2PO4 250, Ca3(PO4)2.2H2O 200,

-MgSO4.7H2O 122 Micro-elements và Fe-EDTA followed MS medium (Murashige & Skoog1962) Thiamine HCl 1 mg.l-1, m-inositol 100mg.l-1 Coconut milk 10%v/v pH 5,8 Sucrose30gr per liter Agar 7gr per liter Medium for creation of multiple shoots contains: 6 -BenzynAdenin (BA) 5mg.l-1 Adenine 15mg.l-1 Tyrosine 20mg.l-1 Medium for root initiationsuplemented with α-Naphthalne Acetic Acid (NAA) 0.5 mg.l-1.

Hình 2: Cây vani cấy mô 60 ngày tuổi

Hình 3: Nhân giống đại trà câyVanilla tahitiensis

Hình 5: Cây Vanilla tahitiensis hai tháng tuổi trong vườn ươm

NHIÊN CỨU SỰ KHỬ TRÙNG, TẠO CHỒI VÀ TẠO RỄ

in vitro

TRÊN GIỐNG ĐIỀU CAO SẢN (Anacardium occidentale L.)

Nguyễn Đình Sỹ, Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Thị Quỳnh

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Cây điều, Anacardium occidentale L., thuộc họ Anacardiaceae, l à cây công nghiệp có

tằm quan trọng về kinh tế ở một số n ước vùng nhiệt đới thuộc Châu Á, Châu Phi vàChâu Mỹ La tinh (Philip, 1984) Việt Nam hiện nay l à nước sản xuất hạt điều lớn nhấtĐông Nam Á, đứng thứ ba thế giới sau Ấn Độ v à Brazil Tuy nhiên, đ ể đạt được diệntích trồng điều đến năm 2010 l à 500.000 hecta thì phải cần thêm một lượng nguồn giốngkhoảng 25.000.000 cây (VINACAS, 2004) Nhân giống bằng hạt v à ghép cành khôngđáp ứng được yêu cầu trên do cây sinh trưởng không đều và tỉ lệ thành công chưa cao(50% - 60%) Vì vậy, việc nghiên cứu phương pháp nhân giống cây điều bằng nuôi cấ y

mô là hết sức cần thiết để đáp ứng nhu cầu sản xuất (Vũ Ngọc Ph ượng và cs, 2003)

Do việc khử trùng mẫu từ cây trưởng thành để tạo nguồn mẫu ban đầu c òn nhiềukhó khăn nên cây mầm phát triển từ hạt của một số giống điều cao sản đ ược sử dụnglàm nguồn vật liệu để nghiên cứu phương pháp tối ưu trong nhân giống in vitro câyđiều Trong bài này chúng tôi trình bày ph ương pháp khử trùng hạt, phương pháp tạochồi từ đốt thân mầm và phương pháp tạo rễ từ chồi in vitro cây điều

Bảng 1 Mô tả thí nghiệm

Nghiệm thức Nồng độ % (W/V) Thời gian (phút)

J1 J2 J3

0,6 1,0 1,4

20 20 20

Sau khi được khử trùng, hạt được cấy trên môi trường khoáng MS (Murasighe v àSkoog, 1962) có bổ sung agar 9g/L (Công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long, Quảng Ninh),than hoạt tính 3g/L Mỗi nghiệm thức gồm 10 b ình, mỗi bình cấy 2 nhân hạt điều Mỗinghiệm thức được lặp lại 3 lần Các b ình chứa nhân hạt điều được đặt trong điều kiệncường độ ánh sáng 30mmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày, nhiệt độ 25 ± 2oC,

độ ẩm tương đối 60 ± 5% Thời gian thí nghiệm l à 14 ngày

2 Ảnh hưởng của nồng độ BA v à KN lên sự tạo chồi của đốt thân mầm cây điều

Đốt thân mầm (đốt thứ hai tính từ ngọn) phát triển từ hạt trong điều kiện vô tr ùngđược dùng làm mẫu cấy Môi trường nuôi cấy là môi trường khoáng MS có đa l ượng1/2 và bổ sung KH2PO4 200mg/L, KNO3 200mg/L, adenine sulphate 40mg/L, thanhoạt tính 3g/L saccharose 20g/L, maltose 10g/L, agar 8 g/L, 1-naphthaleneacetic acid(NAA) 0,5mg/L Benzyladenine (BA) và Kinetin (KN) đư ợc bổ sung ở các nồng độkhác nhau (Bảng 2)

Mỗi nghiệm thức gồm 4 bình, mỗi bình có 5 mẫu và được lặp lại 3 lần Cây được nuôitrong điều kiện cường độ ánh sáng 45-50mmol m-2 s-1 , thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày,nhiệt độ 25 ± 2oC, độ ẩm tương đối 60 ± 5% Thời gian thí nghiệm l à 30 ngày

Bảng 2 Mô tả thí nghiệm

Nghiệm thức BA (mg/L) KN (mg/L)

A1 A2 A3 A4

1 5 1 5

1 1 5 5

3 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự tạo rễ bất định của chồi điều in vitro

Chồi in vitro phát triển từ đốt thân, chiều cao 2,5 -3,0cm, mang 4 lá được dùng làmmẫu thí nghiệm Gốc chồi đ ược ngâm 1 giờ trong dung dịch NAA hoặc indol -3-butyricacid (IBA) với nồng độ 100mg/L trong tủ cấy vô trùng Sau khi xử lý auxin, chồi đượccấy trên môi trường khoáng MS có đa l ượng 1/2 được bổ sung KH2PO4 200mg/L,KNO3 200mg/L, saccharose 10mg/L, agar 8g/L, than ho ạt tính 1g/L Mỗi nghiệm thứcgồm 10 bình, mỗi bình có 2 mẫu cấy và được lặp lại 3 lần Cây được nuôi trong điềukiện cường độ ánh sáng 45-50mmol m-2 s-1 , thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ

25 ± 2oC, độ ẩm tương đối 60 ± 5% Thời gian thí nghiệm l à 30 ngày

Phần mềm MSTATC (Đại học Michigan, Mỹ) đ ược sử dụng để xử lý các số liệ uthu được từ các thí nghiệm tr ên

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Ảnh hưởng của NaOCl khi khử tr ùng vỏ lụa lên tỉ lệ nhiễm và nảy mầm của hạt điều

trưởng thành

Kết quả thu được khi tiến hành khử trùng vỏ lụa cho thấy ở nồng độ NaOCl 1% ,nhân hạt điều có tỉ lệ n hiễm thấp (2,56%), trong khi tỉ lệ nảy mầm, % rễ có chiều d ài

≥ 3cm, % chồi có chiều cao ≥ 3 cm cao hơn so v ới hai nồng độ 0,6% v à 1,4% Khiphân tích thống kê, sự khác biệt về tỉ lệ nhiễm v à tỉ lệ nảy mầm giữa các nghiệm thứckhông có ý nghĩa, trong khi sự khác biệt về % rễ có chiều dài ≥ 3cm ở mức p ≤ 0,05 và

% chồi có chiều cao ≥ 3cm ở mức p ≤ 0,01 Khi hạt đ ược tiến hành khử trùng ở nồng độNaOCl 1%, sự tăng trưởng của cây mầm với % chồi có chiều cao ≥ 3 cm là cao nhất(Bảng 3) Từ kết quả thu được, nồng độ NaOCl 1% với thời gian khử tr ùng 20 phútđược chọn khi tiến hành khử trùng vỏ lụa để tạo nguồn mẫu vô tr ùng cho các thí nghiệmkhác sau này

Bảng 3 Ảnh hưởng của NaOCl lên tỉ lệ nhiễm, tỉ lệ nảy mầm, chiều d ài rễ của hạt điều

trưởng thành ở ngày thứ 7 và chiều cao chồi ở ngày thứ 14

Ký hiệu nghiệm thức xem Bảng 2

2 Ảnh hưởng của nồng độ BA v à KN lên sự tạo chồi và tăng trưởng chồi từ đốt thân mầm

cây điều

Ở ngày thứ 30, trên môi trường A4 (BA 5mg/L + KN 5 mg/L) , số chồi xuất hiện làlớn nhất (1,78 chồi/mẫu), điều n ày cho thấy khi nuôi cấy tạo chồi cây điều, cần bổ sungmột lượng khá lớn cytokinin trong mô i trường nuôi cấy Tuy nhi ên số chồi tạo đượccàng nhiều thì sự tăng trưởng chiều cao của chồi c àng giảm (Hình 1)

0 0.5 1 1.5 2

Nghiệ m thức

S ố c h ồ i/ m ẫ u

Số chồi Số chồi có ≥ 4 lá Số chồi có chiều cao ≥ 3 cm

Hình 1 Ảnh hưởng của BA và KN lên sự tạo chồi và tăng trưởng chồi của đốt thân mầm

ở ngày thứ 30 Ký hiệu nghiệm thức xem Bảng 2

Sự gia tăng chiều cao chồi lớn nhất khi mẫu đ ược nuôi cấy trên môi trường có BA1mg/L + KN 5mg/L (trung bình có 0,98 chồi/mẫu có chiều cao ≥ 3 cm) (Hình 2).

Hình 2 Sự tạo chồi trên đốt thân mầm Ký hiệu nghiệm thức xem Bảng 2

Kết quả này không đồng nhất với kết quả của Boggetti và cs (1999) thực hiện trênmẫu cấy từ cây điều nuôi tr ong nhà kính là BA và KN cao (5 mg/L) không thích hợp cho

sự tạo chồi Môi trường A3 (BA 1mg/L + KN 5mg/L) hoặc A4 (BA 5mg/L + KN5mg/L) được chọn làm môi trường nuôi cấy đốt thân mầm tuỳ thuộc vào các thí nghiệmtiếp theo được tiến hành

3 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự tạo rễ bất định trên chồi điều in vitro

Theo Das và các cs (1996) không có sự khác biệt về sự tạo rễ khi nuôi cấy chồi điều

in vitro trên môi trường có bổ sung IBA hoặc NAA Trong thí nghiệm n ày, IBA có ảnhhưởng lên sự tạo rễ tốt hơn NAA khi đã sử dụng cùng nồng độ 100mg/L (Bảng 4) Số rễxuất hiện trên một chồi lớn hơn gần 2 lần, do đó cây tăng tr ưởng tốt hơn, dẫn đến sự giatăng trọng lượng tươi cũng lớn hơn (Hình 3)

Bảng 4 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên tỷ lệ sống, tỷ lệ ra rễ, số rễ, chiều d ài rễ và gia

tăng trọng lượng tươi của chồi điều in vitro ở ng ày thứ 30

Auxin

(100 mg/l)

Tỷ lệ mẫu sống (%)

IBA

NAA

52,5 52,5

55 70

2,1 1,2

6,6 8,4

360 230

z

NS, *, ** : không khác bi ệt hoặc khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,05 v à 0,01

Hình 3 Sự hình thành rễ sau khi xử lý (a) NAA v à (b) IBA

Trong thí nghiệm này, sau 30 ngày nuôi c ấy, có 47,5 % số chồi chết sau khi láchuyển vàng và rụng Sự vàng lá có thể liên quan đến sự hiện diện của ethylen ở nồng

độ cao trong bình nuôi cấy Bùi Trang Việt (2000) cho rằng sự hiện diện của auxin kíchthích sự sản xuất ethylen bằng cách kích thích sự th ành lập 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) Ngoài ra cây điều in vitro có bộ rễ gi òn và dễ gãy, dẫn đến tỉ lệsống rất thấp của cây điều in vitro khi chuyển ra v ườn ươm

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu đ ược, chúng tôi đã rút ra những kết luận như sau: Nồng độNaOCl 1% (W/V), thời gian 20 phút thích hợp nhất cho sự khử tr ùng vỏ lụa hạt điều.Môi trường nuôi cấy có bổ sung BA 5mg/L + KN 5mg/L cho sự tạo chồi tốt nhất vớimẫu cấy là đốt thân mầm Chồi cây điều in vitro tạo rễ khi được xử lí với IBA 100mg/Ltốt hơn so với NAA ở cùng nồng độ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Boggetti B., Jasik J., Mantell S (1999) In vitro multiplication of cashew

(Anacardium occidentale L.) using shoot node explants of glasshouse -raised plants.

Plant Cell Rep (18): 456-461

2 Bùi Trang Việt (2000) Sinh lý thực vật đại c ương, phần II: Phát triển Tr 81 -108.Nxb Đại học quốc gia TPHCM

3 Das S., Jha TB., Jha S (1996) In vitro propagation of cashewnut Plant Cell Rep.(15): 615-619

4 Murashige T., Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bioassayswith tobacco tissue cultures Physiol Plant., 15, 473 -479

5 Philip VJ (1984) In vitro organogenesis and plantlet formation in cashew

(Anacardium occidentale L.) Ann Bot (54): 149-152.

6 Vũ Ngọc Phượng, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Minh Tuấn, Thái Xuân Du (2003)

Bước đầu nghiên cứu nhân giống in viro cây điều ( Anacardium occidentale L.).

Tuyển tập của Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc lần thứ 2, tổ chức tại H àNội Nxb KHKT, pp945-952

SUMMARY

Study on the sterilization, shoot multiplication and root

formation of

cashewnut (Anacardium occidentale L.) elite cultivars

Nguyen Đinh Sy, Huynh Huu Đuc, Nguyen Thi Quynh

Institute of Tropical Biology

Cashew (Anacardium occidentale L.) is an important, economical crop in Vietnamand many tropical areas Seed and grafting propagation can not meet the demand due tothe ununiformity and low successful rate of grafting (50 -60%) Therefore, a rapidmethod for producing in vitro transplants is n ecessary Mature seeds of cashews werecollected from elite cultivars growing in the Hung Loc Center, Thong Nhat Dist., DongNai Province The seeds were effectively surface sterilized with NaOCl 1 %(W/V) forthe soft inner seed coat for 20 minutes Shoots developed faster on the modified MSmedium supplemented with BA and KN from 1 to 5 mg/L after 30 days of culture Rootinduction was better when in vitro shoot s were pretreated with IBA (100 mg/L) for 1 hcompared with that in the same concentration of NAA

NHÂN GIỐNG in vitro MỘT SỐ GIỐNG HỒ TI ÊU

(Piper nigrum L.) SẠCH virus

Đoàn Thị Ái Thuyền, Đỗ Đăng Giáp, Thái Xuân Du

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây việc tăng diện tích trồng ti êu ồ ạt đã dẫn tới tình trạngcây hồ tiêu bị bệnh, trong đó có bệnh do virut gây ra Kết quả điều tra t ình hình bệnhvirut hồ tiêu ở một số tỉnh miền Đông Nam Bộ cho thấy có 42 - 93% vườn hồ tiêu cótriệu chứng nhiễm virut biểu hiện tr ên lá và cây như đốm hoa lá, nhăn phiến lá, xoănmép lá, tóp ngọn, cây lùn dị dạng,… [3,6] Virut đ ược phát hiện trong mẫu lá hồ ti êu làcác virut ToMV (tobacco mosaic virus), PVX (potato virus X), PVY (potato virus Y) vàCMV (cucumber mosaic virus) [2,3] Nội dung chính của bài báo này là nghiên cứu khảnăng loại bỏ mầm bệnh nội sinh trong mẫu cấy hồ ti êu bởi sử dụng một số chất khángsinh; ảnh hưởng của các chất điều h òa sinh trưởng thực vật đến sự h ình thành chồi, táisinh chồi, cây từ mô sẹo ở các đốt cấy cũng nh ư sử dụng kỹ thuật ELISA để x ác định

giống sạch virut trong nhân giống in vitro một số giống hồ tiêu (Piper nigrum L.) được

trồng ở các tỉnh miền Nam Việt Nam

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các giống hồ tiêu được nghiên cứu là các giống được trồng phổ biến tại các tỉnhmiền Đông Nam Bộ do Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam cung cấp gồmcác giống: Vinh Linh (Việt Nam); Lada Belangtoeng (Indôn êxia); Karimunda (Ấn Độ).Cây hồ tiêu được trồng trong bầu đất tại v ườn ươm của Viện Sinh học Nhiệt đới Sau 2 -

3 tuần, cây ra chồi non Cắt các chồi có chiều dài từ 2-3 cm và các cành có từ 5-6 đốt.Các chồi được rửa sạch và sát trùng bằng cồn 700 Mẫu cấy được khử trùng bề mặt bằngdung dịch tẩy javel khoảng 30 -40 phút hoặc 0,1% HgCl2-10 phút hoặc kết hợp với sửdụng chất kháng sinh 0,5% x êfotaxin từ 1 - 24 giờ

Các chồi non vô trùng được nuôi cấy trên môi trường Murashige and Skoog, 1962(MS) có bổ sung 6 - benzylaminopurine - BA (0-5,0mg/l), indole-3-butyric axit - IBA(0 - 1,0mg/l) hoặc thidiazuron - TDZ (0 - 0,22mg/l) để tạo chồi Để nghiên cứu sựtái sinh chồi từ mô sẹo chúng tôi bổ sung BA (0 - 10mg/l), IBA (0,5 mg/l) và kinetin(0,5mg/l) vào môi trường nuôi cấy Đối với môi tr ường tạo rễ, chúng tôi sử dụng các

chồi lớn dài 3 - 4 cm có từ 2 - 3 cặp lá cấy trên môi trường MS có khoáng đa lượnggiảm một nửa và bổ sung 1-naptthalenaceacetic acid - NAA (0,2 - 0,5mg/l) hoặc thanhoạt tính Tất cả các mẫu cấy đ ược đặt trong điều kiện ph òng nuôi cấy ở nhiệt độ 270C -

290C, cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu sáng: 12 - 14 giờ/ngày Để kiểm tramẫu sạch virut, các giống hồ ti êu được giám định bằng kỹ thuật ELISA tr ước và sau khinuôi cấy in vitrođối với các loại virus ToMV, PVX, PVY, CMV

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Sử dụng chất kháng sinh trong quá tr ình khử trùng mẫu cấy

Hồ tiêu là một cây lâu năm, có nhiều mầm bệnh nội sinh nh ư nấm, khuẩn nằm bên trong

mô Bởi vậy một trong những vấn đề quan trọng đầu ti ên cần giải quyết trong nuôi cấy invitro hồ tiêu là phải loại bỏ hoàn toàn mầm bệnh nội sinh đó Các phương pháp khử trùng bềmặt thông thường đều không thành công trong việc khử trùng cây hồ tiêu Nguyên liệu banđầu là các chồi mới hình thành của cây giống được trồng cách ly trong nhà lưới và phun thuốctrừ nấm bệnh, đã qua kiểm tra virut Qua thực nghiệm cho thấy, các mẫu qu a xử lý ngay cảkhi sử dụng các chất có khả năng diệt mầm bệnh bề mặt cao nh ư 0,1 -1% HgCl2 (từ 5 - 10phút), mẫu cấy vẫn bị nhiễm trở lại sau một thời gian nuôi cấy Do đó nếu chỉ sử dụng cácchất khử trùng bề mặt như dùng nước tẩy javel hoặc HgCl2 đều không cho kết quả khả quan;toàn bộ mẫu sẽ bị nhiễm sau một thời gian d ài nuôi cấy

Để mẫu được vô trùng hoàn toàn, chúng tôi đ ã kết hợp sử dụng một số chất khángsinh như: penixillin, streptomyxin và xêfotaxin Trong đó, xêfotaxin v ừa có tác dụngdiệt khuẩn, nấm bên ngoài và vừa diệt được các mầm bệnh nội sinh trong mẫu cấy Cácbước khử trùng mẫu cấy lần lượt được thực hiện như sau: mẫu sau khi sát trùng bằngcồn 70%, được xử lý trong nước tẩy javel (10%) - 15 phút Sau đó ngâm dung d ịch0,1% HgCl2 - 10 phút Bước kế tiếp là lắc trong dung dịch 0,5% x êfotaxin trên máy lắc

từ 1 - 24 giờ Sau mỗi bước mẫu đều được rửa 3 lần bằng nước cất vô trùng Tuy nhiên,các mẫu đã qua khử trùng sau 20 - 45 ngày vẫn có thể bị tái nhiễm trở lại tại những vị trítiếp xúc với môi trường nuôi cấy do mầm bệnh nội sinh c òn trong mẫu

Để làm giảm sự tái nhiễm khuẩn mẫu cấy, chúng tôi bổ sung 0,5% xêfotaxintrong môi trường nuôi cấy ban đầu Sau đó, cấy truyền mẫu qua môi tr ường không cóchất kháng sinh để tạo chồi mới Nh ư vậy, mẫu là những chồi non phát sinh từ mẫu vôtrùng và không có khả năng tái nhiễm trở lại Với ph ương pháp khử trùng mẫu trên,chúng tôi có thể nhận được 25 - 30% số mẫu sạch hoàn toàn mầm bệnh nội sinh

2 Ảnh hưởng của vị trí đốt cấy v à các chất điều hoà sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) l ên khả năng hình thành chồi hồ tiêu

Sau khi được vô trùng 20 ngày, các đốt Hồ tiêu bắt đầu đâm chồi mới Chồi dài 5-6 cmđược cắt thành các đốt dài 2cm Mỗi đốt mang một cặp lá đ ược cấy trên môi trường MS

có bổ xung các chất ĐHSTTV khác nhau Sau 3 - 4 tuần nuôi cấy, từ nách lá xuất hiệnchồi mới Qua theo dõi ảnh hưởng của vị trí đốt cấy l ên khả năng hình thành chồi,chúng tôi nhận thấy có sự khác biệt r õ rệt về khả năng này ở các loại đốt Ở đốt ngọn

hầu như không xuất hiện chồi mới, ngay cả ở nồng độ BA cao (5 mg/l) Đốt giữa và đốtgốc dễ dàng tạo chồi mới hơn, số chồi mới hình thành có thể tới 4 - 6 chồi/đốt Trong đó

sự tạo chồi mới ở đốt gốc l à nhiều hơn so với đốt ngọn và đốt giữa

Khi nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các chất ĐHSTTV, chúng tôi nhận thấy, ở các môitrường chỉ bổ sung BA, khả năng tạo chồi thấp ở tất cả các đốt cấy Th ậm chí với nồng độ

BA cao (> 5mg/l) hoặc TDZ ở nồng độ 0,02 - 0,22mg/l chồi hình thành cũng ít hơn so vớicông thức có bổ sung NAA hoặc IBA Không phải nồng độ xytokinin v à auxin cao quyếtđịnh sự tạo chồi ở mẫu cấy mà là tỷ lệ thích hợp giữa xytokinin/auxin sẽ l àm tăng khả năngtạo chồi ở hồ tiêu Trong các thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ BA = 2mg/l, IBA =0,5mg/l số chồi được hình thành ở đốt giữa và đốt gốc cao nhất Điều này chứng tỏ, khi bổsung một lượng xytokinin và auxin thích hợp, sẽ làm tăng rõ rệt số chồi hình thành ở đốt cấy.Khi bổ sung thêm NAA hoặc IBA trong môi trường tạo chồi với nồng độ 0,5 - 1,0mg/l làmtăng khả năng hình thành mô sẹo ở các gốc cấy Ở nồng độ auxin (NAA, IBA) cao(1,0mg/l), mô sẹo càng nhiều và ức chế sự hình thành chồi của mẫu cấy

3 Ảnh hưởng của các chất ĐHSTTV l ên khả năng biệt hoá chồi từ mô sẹo

Các mô sẹo hình thành từ nuôi cấy đốt thân được dùng làm nguyên liệu cho nghiêncứu khả năng biệt hoá chồi từ mô sẹo của cây hồ ti êu Qua các thí nghiệm biệt hoá chồi

từ mô sẹo, chúng tôi nhận thấy tính chất của mô sẹo có phản ứng khác nhau đối với cácchất ĐHSTTV trên cây hồ tiêu

Môi trường MS có bổ sung BA (5mg/l), Kin (0,5mg/l) v à IBA (0,5mg/l) thích hợpnhất cho khả năng biệt hoá chồi từ mô sẹo Ở tổ hợp môi tr ường này, tỷ lệ mô sẹo tạochồi và số chồi trên một mẫu cấy lớn nhất (10,3 chồi/mẫu) Môi tr ường với nồng độ BAcao (>5mg/l) hoặc bổ sung TDZ đều gây ức chế khả năng biệt hoá chồi từ mô sẹo; một

số chồi được hình thành nhưng tỷ lệ chồi bị dị dạng rất lớn v à chồi kém phát triển khicấy truyền qua môi trường tạo cây con hoàn chỉnh

4 Tạo rễ

Trong các thực nghiệm tạo rễ cho cây hồ ti êu chúng tôi sử dụng môi trường 1/2 MS có

bổ sung NAA (0,1 - 1,0mg/l) hoặc IBA (0,5 -1,0mg/l) Ở những thí nghiệm có bổ sung NAA,sau 15 ngày nuôi cấy cho thấy: trong môi trường có nồng độ NAA thấp (0,1 - 0,2mg/l) rễ hìnhthành khoảng 2 - 3 rễ/chồi; với những nồng độ NAA cao hơn (0,5 - 1,0mg/l) số rễ hình thànhrất nhiều, từ 10 - 15 rễ/chồi, tuy nhiên rễ thường rất ngắn, kém phát triển và ở dưới gốc chồihình thành các khối mô sẹo Nồng độ NAA càng cao, khối mô sẹo càng nhiều và gây ức chế

sự phát triển của rễ Đối với môi trường có IBA, sự tạo rễ cũng xảy ra, tuy số l ượng rễ ít hơnnhưng rễ phát triển mạnh hơn so với môi trường có NAA Như vậy, sự ra rễ của cây hồ tiêu invitro thích hợp ở môi trường 1/2MS có bổ sung NAA (0,1-0,2mg/l)

5 Kiểm tra giống hồ tiêu sạch virut bằng kỹ thuật ELISA

Để xác định các giống hồ ti êu hoàn toàn sạch virut, chúng tôi đ ã tiến hành lấy mẫukiểm tra bằng kỹ thuật ELISA ở 3 giai đoạn: tr ước khi đưa vào nuôi cấy, giai đoạn nhânchồi in vitro và sau khi đưa cây con ra vườn ươm

KẾT LUẬN

1 Sử dụng chất kháng sinh x êfotaxin (0,5%) kết hợp với các phương pháp khử trùng

bề mặt, không những loại bỏ đ ược các nguồn lây nhiễm b ên ngoài mà còn có tácdụng diệt được các mầm bệnh nội sinh b ên trong mẫu hồ tiêu

2 Môi trường MS có bổ sung BA = 2,0mg/l, IBA = 0,5mg/l thích hợp nhất cho quátrình tạo chồi từ đốt ở cây hồ ti êu, trong đó khả năng tạo chồi ở những đốt c àng gầngốc càng cao

3 Sử dụng kỹ thuật ELISA l à cần thiết để xác định giống sạch virut trong quy tr ình

nhân giống in vitro hồ tiêu.

4 Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo tốt nhất trên môi trường MS có BA = 5,0mg/l,IBA = 0,5mg/l và Kin = 0,5 mg/l

5 Cây hồ tiêu dễ dàng tạo rễ trên môi trường 1/2 MS có bổ sung NAA ở nồng độthấp (0,1-0,2mg/l)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Bhat S K, Chandel K P S., Malik S K., (1995) Plant Cell Rep 14: 398-402

2 Bysov A S, (2001) Virus and viral diseases of black pepper ( Piper nigrum L.) in

condition of closed ground and tropical, subtropical agrocenoses The theasis forobtaining PhD degree Kyiv National Univerc ity, Kyiv

3 Đoàn T A T, Thái X D và cs, (2000) Bước đầu nghiên cứu chuẩn đoán bệnh virútcây Hồ tiêu (Piper nigrum L.) tại một số tỉnh miền Đông Nam Bộ Tuyển tập Côngtrình nghiên cứu KHCN., 189-195

4 Joseph B., Joseph D., (1996 ) Plant Cell Tiss Org., 41 (1):87-90

5 Kellar S M., Krishnamurthy K., (1998) Plant Cell Rep., 17(9): 721-725

6 Nguyen T T., Boico A L et al (2001) Virus and viral disease of black Ppepper

(Piper nigrum L.) in South East of Viet Nam III Intenational Coference

“Bioresoeurse and Viruses ”, Kyiv, Ucraina

SUMMARY

In vitro culture in Black pepper ( Piper nigrum L.) free virus

Đoan Thi Ai Thuyen, Đo Đang Giap, Thai Xuan Du

Institute of Tropical Biology

The plant regeneration from the single node or the callus culture of black pepper(Piper nigrum L.) was described Various combinations of media, growth regulators andexplant sterization were compared Problems, probably caused by endogenouspathogens associated with tissue exudated, offen occurred during the establishment of

culture The method to sterilize the black pepper plants using antibiotic agent such ascefotaxin was described For the shoot initiation and the establishment, the optimalconcentration of black pepp er growth was BA 2mg/l, IBA 0.5 mg/l The highconcentrations of BA (5 -10mg/l) had no effect on the shoot regeneration from callusand the development of lateral branches The MS medium containing BA 5.0 mg/l, Kin0.5mg/l and IBA 0.5mg/l was the best medium for subsequent growth and shootregeneration from callus under the current condition Shoots were rooted on 1/2 MSmedium containing NAA 0.1 -0.2mg/l In vitro plants were then transferred to pots inthe nursery house After 8 - 10 weeks, the plants with height of 20 - 25cm weretransferred to field for testing.

Ảnh: Nhân giống in vitro cây hồ ti êu (Piper nigrum L.) s ạch virút

1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng; 2 Biệt hoá chồi từ mô sẹo; 3 Tạo cụm chồi từ đốt thân; 4 Cây con hoàn chỉnh cấy từ cụm chồi; 5 Cây con in vitro sau 3 tuần ngo ài vườn ươm

KHẢO SÁT SỰ TĂNG TRƯỞNG in vitro CỦA CÂY

KHOAI LANG Ipomoea batatas L TRONG ĐIỀU KIỆN

CHIẾU SÁNG TỰ NHIÊN

Nguyễn Mỹ Uyên, Đỗ Đăng Giáp

Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học Nhiệt đới

MỞ ĐẦU

Việc cắt giảm chi phi sản xuất để hạ giá th ành, trong đó bao gồm cả chi phí điệnnăng đang ngày một tăng cao luôn là vấn đề rất được quan tâm Giá thành cây cấy mô ởViệt Nam nói chung còn khá cao, trong đó, chi phí điện thắp sáng và làm lạnh phòngnuôi cấy chiếm một tỷ lệ lớn Nghi ên cứu này khảo sát khả năng sinh tr ưởng và pháttriển của cây khoai lang Ipomoea batatas L in vitro trong điều kiện chiếu sáng tự nhi ên

ở nhiệt độ môi trường nhằm so sánh năng suất v à chất lượng cây giống với ph ươngpháp nuôi cấy truyền thống trong ph òng sáng

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 4 đến tháng 8/2006 Mẫu nuôi cấy l à các đốt

thân thứ 2 đến 4 tính từ ngọn cây khoai lang Ipomoea batatas L in vitro sạch virus Mỗi

đốt kèm theo một lá với trọng luợng trung b ình 0,07± 0,01 g Các nghi ệm thức được bốtrí như bảng 1 và được theo dõi trong 28 ngày

Bảng 1: Các nghiệm thức nuôi cấy

Nghiệm thức Nơi bố trí thí nghiệm

Cường độ ánh sáng (µmol.m-2.s-1)

Thời gian chiếu sáng (giờ/ ngày)

Nhiệt độ ngày đêm ( 0 C)

Độ ẩm (%)

Phòng nuôi

Cường độ ánh sáng được quy đổi từ lux ra µmol.m-2.s-1 theo Warrington và Mitchell (1976)

Cây con in vitro của 3 nghiệm thức nuôi cấy trong thí nghiệm tr ên được ươm vàtheo dõi sự tăng trưởng trong 30 ngày ở vườn ươm Cường độ ánh sáng trong ngày daođộng từ 0 - 148.1µmol.m-2s-1, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ng ày, nhiệt độ ngày đêm daođộng trong khoảng 27 -370C, độ ẩm 45-85% Các số liệu được phân tích thống k ê theoAnova và trắc nghiệm phân hạng LSD

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1 Biến thiên cường độ ánh sáng, nhiệt độ v à độ ẩm trong ngày ở các điều kiện nuôi cấy

Cường độ ánh sáng, nhiệt độ v à độ ẩm được đo vào ngày không mưa m ột lần/tuầntrong thời gian tiến hành thí nghiệm Nhiệt độ bên trong bình nuôi cấy ở điều kiện tựnhiên chỉ cao hơn nhiệt độ môi trường từ 0,5 - 10C

2 Sự tăng trưởng của cây khoai lang Ipomoea batatas L in vitro trong điều kiện chiếu

sáng tự nhiên

Tất cả các nghiệm thức đều cho tỷ lệ sống đạt 100% Khác biệt r õ nhất giữa cácnghiệm thức nuôi cấy in vitro ở điều kiện tự nhiên và điều kiện phòng nuôi là chiều caocây, diện tích lá, độ dày lá và màu sác thân lá Cây ở điều kiện phòng nuôi có thân ngắn,mập, lá to, dày, màu xanh đậm Ngược lại, cây nuôi ở điều kiện tự nhi ên có thân dài,

ốm, lá nhỏ và mỏng, thân là màu xanh nhạt Biểu hiện này được thấy ở cả hai nghiệmthức có hay không có bổ sun g đèn, do đó, chúng tôi gi ả thiết đây không phải là biểuhiện của sự thiếu sáng nh ư thông thường mà là ảnh hưởng của nhiệt độ kết hợp với chấtlượng ánh sáng Tia đỏ tr ong quang phổ ánh sáng về cơ bản xúc tiến sự kéo dài của cây,tạo sắc tố xanh vàng, lá mỏng, còn tia xanh có tác dụng ngược lại, kìm hãm sự kéo dài(Grondzinxki và cs, 1973, Sager và Britz, 1990) Trong khi đó, quang ph ổ ánh sáng đènhuỳnh quang có nhiều t ia xanh hiện diện hơn tia đỏ và ngược lại ở ánh sáng tự nhi ên(Fuentes và cs, 2005) T ỷ lệ ánh sáng xanh/đỏ trong quang phổ đ ã gây ra sự biến đổihình thái của cây con in vitro m à không nhất thiết đồng thời làm thay đổi chất lượng câycon (Warrington và Mit chell, 1976) Đồng thời, nhiệt độ cao (350C) làm cho thân câykhoai lang kéo dài với tốc độ nhanh hơn ở nhiệt độ thấp (Kozai v à cs, 2003)

Bảng 2: Sự tăng trưởng của cây khoai lang in vitro ở các điều kiện chiếu sáng khác nhau

Số rễ ns 5,09 ± 0,25 5,79 ± 0,27 5,19 ± 0,27 Chiều cao cây (cm)  3,28 ± 0,28 b 9,85 ± 0,28 a 8,92 ± 0,28 a Đường kính thân (mm)  2,58 ± 0,08 a 1,92 ± 0,08 b 1,90 ± 0,08 b

Số lá 6,62 ± 0,11 6,65 ± 0,11 6,63 ± 0,12

Độ dày lá (mm)  29 ± 2 a 24 ± 2 ab 20 ± 2 b Diện tích lá (cm 2

)  4,77 ± 0,36 a 2,88 ± 0,33 b 3,327 ± 0,41 b

Tỉ lệ chlorophyll a/b 3,05 ± 0,15 2,86 ± 0,15 2,96 ± 0,15 Hàm lượng chlo a+b (mg/g lá)  51,05 ± 2,51 b 55,05 ± 2,51 ab 63,94 ± 2,51 a Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây)  988 ± 46 b 1.280 ± 46 a 1.105 ± 46 ab Gia tăng trọng lượng khô (mg/cây)  30 ± 6 b 43 ± 6 a 34 ± 6 b Phần trăm chất khô (%)ns 4,2 ± 0,1 4,2 ± 0,1 3,9 ± 0,1 Anova ns : khác biệt không có ý nghĩa về mặ t thống kê.

* : khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,01 < p < 0,05

** : khác biệt có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01

Do cây ở cả hai nghiệm thức điều kiện tự nhi ên phát triển nhanh theo h ướngkéo dài thân, chỉ tiêu về trọng lượng tươi và khô cao hơn nhi ều so với đối chứngtrong phòng nuôi Ngoài ra, hàm lượng chlorophyl a v à b cao nhất ở nghiệm thứcđiều kiện tự nhi ên, thấp hơn ở điều kiện tự nhi ên có bổ sung đèn và thấp nhất ởnghiệm thức phòng nuôi Kết quả này cho thấy sự ảnh hưởng phức tạp của chấtlượng ánh sáng chứ không chỉ l à cường độ ánh sáng l ên cây.

Các chỉ số phần trăm chất khô, số lá, số rễ của ba nghiệm thức có giá trị t ươngđương nhau Ch ỉ số gia tăng trọng luợng khô v à phần trăm chất khô của hai nghiệmthức điều kiện tự nhi ên tương đương so v ới đối chứng loại trừ khả năng ngậm n ướcdẫn đến sự gia tăng trọng l ượng tươi trong thân, cu ống, lá của cây nuôi cấy ở nhiệt

độ môi trường cao

Một đặc điểm khác biệt nữa đ ược ghi nhận l à cây khoai lang nuôi trong đi ềukiện phòng nuôi có độ giòn của thân lá khá cao Trong khi thân và cu ống lá củacây nuôi cấy ở đìều kiện phòng nuôi rất giòn và dễ gãy, cây nuôi cấy ở điều kiện tựnhiên khá dẻo dai, vẫn giữ nguy ên vẹn hầu hết số lá sau khi lấy ra khỏi b ình màkhông cần phải thao tác tỉ mỉ Đây cũng l à một đặc điểm đáng được xem xét khinuôi cấy cây khoai lang ở số l ượng lớn

Việc đậy kín các b ình nuôi cấy bằng nắp giấy tỏ ra có hiệu quả trong việc traođổi nhiệt độ trong v à ngoài bình Hi ện tượng hiệu ứng nh à kính hầu như không xảy

ra bên trong bình, do đó, nhiệt độ bên trong chỉ cao hơn ngoài ở khoảng 0,50C nếu

có thể đảm bào việc che chắn tránh ánh nắng chiếu trực tiếp v ào bình nuôi cấy.Trong điều kiện thí nghiệm, chúng tôi ghi nhận tỷ lệ nhiễm giữa các ngh iệmthức nuôi cấy trong v à ngoài phòng sáng không có s ự chênh lệch đáng kể

3 Sự tăng trưởng của cây khoai lang Ipomoea batatas L ở vườn ươm sau giai đọan nuôi

cấy in vitro trong điều kiện chiếu sáng tự nhi ên

Tuy sự kéo dài thân, lá nh ỏ, mỏng và xanh vàng thư ờng được xem là biểu hiệncủa cây yếu, kém phát tri ển, nhưng trong điều kiện thí nghiệm của chúng tôi,những cây khoai lang trên v ẫn phát triển đồng đều so với cây đối chứng ở giaiđoạn ex vitro

Sau 30 ngày ươm ex vitro, các ch ỉ tiêu về số lá, diện tích v à độ dày lá, gia tăngtrọng lượng tươi, trọng lượng khô, phần trăm chất khô, h àm lượng chlorophyl a v à

b, v.v… đều có giá trị tương đương nhau ở các nghiệm thức Bộ rễ của cây ươm từnghiệm thức tự nhi ên không đèn phát tri ển tốt hơn, có giá trị lớn hơn hai nghiệmthức còn lại Tỷ lệ sống của hai nghiệm thứ c ở điều kiện tự nhi ên cao hơn so v ớiđối chứng Tác giả Santamaria v à cs (2005) cũng cho rằng, nhiệt độ không khí v àquang phổ rộng của ánh sáng tự nhi ên có những tác động tích cực l ên tỷ lệ sống vàtốc độ tăng trưởng của cây nhiệt đới ở giai đoạn ex vitr o mặc dù trong một sốtrường hợp có thể l àm giảm hiệu suất quang hợp của cây trong giai đoạn in vitro