Tiểu luận môn hóa sinh thực phẩm Đề tài Pectinase

LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay nước ta đang trong thời kì phát triển mạnh, cùng với xu thế hội nhập nền kinh tế quốc tế, thì các ngành khoa học kỹ thuật và dịch vụ ngày càng phát triển, theo đó ngà

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

o0o MÔN: HÓA SINH THỰC PHẨM 1

ĐỀ TÀI:

PECTINASE

Nhóm thực hiên: 3Lớp: DHTP10B/ 210543202Viện Công Nghệ Sinh Học & Thực PhẩmGVHD: Nguyễn Thị Trang

TpHCM, tháng 9 năm 2015

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TPHCM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

o0o MÔN: HÓA SINH THỰC PHẨM 1

ĐỀ TÀI: PECTINASE

Nhóm thực hiên: 3Lớp: DHTP10B/ 210543202Viện Công Nghệ Sinh Học & Thực PhẩmGVHD: Nguyễn Thị Trang

14061771140622411406646114063881

TpHCM, tháng 9, năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Trên thực tế không có sự thành công nào mà không gắn liền với những sự hỗ trợ, giúp đỡ dù ít hay nhiều, dù trực tiếp hay gián tiếp Trong suốt quá trình học tập bộ môn Hóa Sinh Thực Phẩm 1 nói riêng và các môn trong Viện Sinh Học & Thực Phẩm của trường Đại Học Công Nghiệp TPHCM nói chung, chúng em đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của nhà trường, Thầy Cô, gia đình & bạn bè

Với lòng biết ơn sâu sắc, chúng em xin gửi lời cám ơn đến quý Thầy Cô ở Viện Sinh Học & Thực Phẩm - Trường Đại Học Công Nghiệp TPHCM đã cùng với tri thức & tâm huyết của mình đã truyền dạy cho chúng em những bài học quý báu nhất

Chúng em xin chân thành cám ơn Cô Nguyễn Thị Trang đã tận tâm hướng dẫn chúng em qua từng buổi học trên lớp & bài tập tiểu luận về nhà Nếu không cónhững lời hướng dẫn, dạy bảo của Cô thì chúng em nghĩ bài Tiểu luận này khó có thể hoàn thiện được Một lần nữa, chúng em xin chân thành cám ơn Cô

Bên cạnh sự những sự giúp đỡ trên, còn có sự trợ giúp đắc lực là trang mạng www.google.com.vn đã giúp chúng em tìm ra những thông tin quý giá, góp phần rất quan trọng vào việc hoàn thành bài tiều luận

Bài tiểu luận được thực hiện trong khoảng 6 tuần, các bạn trong nhóm với lịch học khác nhau do vậy thời gian gặp nhau, trao đổi còn ít và kiến thức của nhóm vẫn còn nhiều hạn chế Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót, chúng emrất mong nhận được những ý kiến đóng góp của Thầy Cô & các bạn cùng lớp để bài Tiểu Luận của nhóm sẽ được hoàn thiện hơn & tiến bộ hơn trong các bài Tiểu Luận trong thời gian tới

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU 1

I GIỚI THIỆU CHUNG 2

1 Khái niệm 2

2 Phân loại 2

3 Pectin 3

3.1 Cấu tạo 3

3.2 Tính chất của pectin 4

II PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ 5

1 Phương pháp chuẩn độ iot 5

1.1 Nguyên tắc 5

1.2 Hóa chất và dịch chiết enzym 5

1.3 Tiến hành: 7

1.4 Kết quả: 7

2 Xác định hoạt độ theo độ nhớt của dung dịch phản ứng 8

2.1 Nguyên tắc : 8

2.2 Hóa chất : 8

2.3 Tiến hành : 8

2.4 Kết quả : 8

3 Phương pháp so màu : 8

3.1 Nguyên tắc 8

3.2 Tiến hành: 9

3.3 Kết quả: 9

III PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT 10

1 Tách chiết chế phẩm Pectinase bằng biện pháp canh trường bề mặt: 10

2 Tách chiết chế phẩm enzym pectinase từ canh trường bề sâu: 10

2.1 Phương pháp hiếu khí: 10

2.2 Phương pháp yếm khí 11

IV ỨNG DỤNG 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO 19

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay nước ta đang trong thời kì phát triển mạnh, cùng với xu thế hội nhập nền kinh tế quốc tế, thì các ngành khoa học kỹ thuật và dịch vụ ngày càng phát triển, theo đó ngành công nghệ thực phẩm cũng từng bước được cải tiến để cung cấp các sản phẩm đầy đủ chất dinh dưỡng, đẹp mắt, tiện lợi đáp ứng những nhu cầu ngày càng cao của con người

Sử dụng enzym trong sản xuất và đời sống đã trở thành phổ biến trong ngành sản xuất thực phẩm và mang lại lợi ích khá lớn

Trước đây, nguồn enzym chủ yếu thu nhận từ thực vật và động vật Ngày nay, người ta nghiên cứu tìm ra nguồn enzym từ vi sinh vật phong phú, đa dạng &

rẻ tiền, được ứng dụng rộng rãi trong các ngành sản xuất khác nhau

Để hiểu sâu hơn về nguồn enzym này, nhóm em xin thực hiện để tài tiểu luận về enzym PECTINASE

Vì thời gian hoàn thành bài tiểu luận không nhiều, cũng như kiến thức còn hạn chế nên không tránh khỏi những sai sót, chúng em kính mong nhận được sự đóng góp ý kiến của Cô, các bạn để bài báo cáo của chúng em được hoàn thiện hơn và giúp chúng em tiến bộ hơn trong những bài tiểu luận sắp tới

Enzym Pectinase là enzym xúc tác sự phân hủy của các polime pectin, làm giảm độ nhớt và giảm khối lượng phân tử của các sản phẩm tạo thành

Enzym Pectinase được ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả

2 Phân loại

Theo quan điểm hiện đại, enzym Pectinase có thể được phân loại theo cơ chế tác dụng của chúng, được phân thành 3 nhóm:

 Pectinesterase (PE): phân cắt liên kết este giữa methnol và nhóm cacboxyl

của axit galacturonic

 Polygalacturonase (PG): thủy phân liên kết gắn với nhóm -COOH tự do ở

đầu hay mỗi mạch, tức là thủy phân liên kết -1,4-D- galacturoside giữa các axit galacturonic trong pectin và trong các axit polygalacturonic khác

 Transeliminase (TE): đây là nhóm enzym được tìm ra gần đây

(1960-1961), bao gồm protopectinase xúc tác sự phân cắt araban, galactan ra khỏi protopectin để tạo thành pectin hòa tan và enzym Transeliminase phân cắt phi thủy phân ( không có sự tham gia của nước) pectin để tạo ra các gốc galacturonic có nối kép giữa các nguyên tử C4 và C5. Phản ứng xảy

ra dễ dàng ở môi trường trung tính và kiềm



- Pectin là cơ chất của enzyme pectinase Pectin rất phổ biến trong thực vật, là hợp chất polimer tự nhiên tồn tại có 3 dạng: protopectin, pectin và acid pectinic Pectin là tên chung được gọi cho các hỗn hợp chứa các thành phần rất khác nhau, trong đó pectinic acid là thành phần chủ yếu.

- Pectin có nhiều trong các loại quả (1 – 1,5%) Các vỏ, cùi cam, chanh, dứa có nhiều pectin Trong rau cũng có pectin như cà rốt, bắp cải, bí

- Các pectin tự nhiên định vị trong thành tế bào có thể liên kết với các cấu trúc polysaccharide và protein để tạo thành các protopectin không tan Trong quả xanh,pectin ở dạng không hoà tan gọi là protopectin làm cho quả rất cứng Protopectin tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước và có cấu tạo hoá học phức tạp Protopectin tồn tại chủ yếu ở thành tế bào, thường ở dạng liên kết với

polysaccharide khác như arabin, tinh bột, cellulose… Khi quả chín, dưới tác dụng của enzyme protopectinase cũng như acid hữu cơ có trong quả làm cho protopectinchuyển thành pectin hoà tan, làm mềm quả

Tính chất quan trọng nhất của pectin là dễ tạo gel Pectin được ester hoá cao sẽ tạogel đặc trong môi trường acid 1% và trong dung dịch đường có nồng độ 65%

- Pectinic acid là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl được ester hoá bằng methanol Pectinate là muối của pectinic acid

Pectic acid là polygalacturonic acid đã hoàn toàn giải phóng khỏi nhóm methoxy, tức là trong đó có chứa một nhóm carboxyl tự do trên một đơn vị polygalacturonic acid

3.2 Tính chất của pectin

- Pectin là chất bột trắng xám nhạt hat có màu nâu.

- Pectin không tan trong rượu và các dung môi hữu cơ khác, không thử oxy.Pectin hòa tan trong nước, amoniac, dung dịch kiềm, cacbonate natri và trong glycerine nóng

+ Độ hoà tan của pectin trong nước tăng lên khi mức độ ester hoá trong phân tử pectin tăng và khi khối lượng phân tử pectin giảm Khi đó, độnhớt của dung dịch pectin sẽ tăng lên không tỷ lệ với nồng độ

+ Pectin dễ bị kết tủa bởi ethanol, isopropanol, acetone, sulfat amon, chlorua nhôm, các muối đồng, muối canxi va acid

- Độ bền vững của pectin trước các enzym pectinase sẽ được tăng lên khi có mặt của các cation, nhất là Al3+ và Fe3+

- Pectin hòa tan dưới tác dụng của kiềm loãng hay enzyme pectinase sẽ giải phóng nhóm methoxy tạo thành rượu methylic và acid pectic tự do

- Khi có đường và acid, pectin có tính chất làm đông Pectin của quả có khả năng đông tốt hơn pectin của rau vì cấu tạo có nhiều nhóm methoxy hơn

+ Khi nhóm methoxy chiếm 11%, pectin đông tốt ở pH = 3,5

+ Khi nhóm methoxy chiếm 5%, pectin đông tốt ở pH = 2,9

+ Khi hàm lượng pectin khoảng 1%, độ acid từ 1 – 1,3%, pH = 2,8 – 3,2 ;

độ đường 65 – 70% thì sản phẩm có thể đông tốt

- Pectin thường được sản xuất từ táo, cà rốt, vỏ bưởi, lúa mạch nha…

II PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ

Trong số các enzym thuộc hệ pectinase, polygalacturonase là enzym được

quan tâm nhiều nhất và có phạm vi ứng dụng rộng lớn không những trong công nghiệp thực phẩm mà còn trong lĩnh vực công nghệ sinh học

Vì vậy, ta xác định hoạt độ của một loại enzym cụ thể trong hệ enzym

Pectinase là Polygalacturonase (PG) Enzym này thường ít gặp trong thực vật, chủ

yếu có trong vi khuẩn và nấm mốc Polygalacturonase là một phức hệ enzym gồm

nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao đối với cơ chất

1.2 Hóa chất và dịch chiết enzym.

 Dung dịch axit pectic 1%: hòa tan 10g polygalacturonat natri bằng dung dịch đệm axetat 0,05N, pH= 5,25 trong bình định mức 1000ml, bổ sung dung dịch đệm tới vạch mức

 Dung dịch enzym:

o Đối với môi trường nuôi cấy rắn: cân 5g môi trường rắn đã nghiền nhỏ cho vào cốc 200ml Bổ sung 100ml dung dịch toluene 0.33%, khuấy trộn đều và tiến hành tách chiết ở 40C trong thời gian 1 giờ Sau đó, lọc thu nhận dịch chiết enzym qua giấy lọc

o Đối với tế bào vi khuẩn: khối tế bào được làm lạnh đông trong thời gian 12 giờ, sau đó được nhả lạnh đông và bổ sung dung dịch đệm axetat 0,2M, pH=7,9 với tỷ lệ 1:2,5 Hỗn hợp được tiến hành đồng hóa trên máy và được giữ trong tủ lạnh trong thời gian 24 giờ, sau đó

được ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong thời gian 40 phút Bổ sung amoni sunfat vào dịch trong nhận được để đạt nồng độ 40% đểkết tủa và loại protein nhiễm tạp bằng ly tâm với tốc độ 4500

vòng/phút trong thời gian 30 phút Sau đó, bổ sung amoni sunfat một lần nữa để đạt độ bão hòa 70% kết tủa enzym, cuối cùng thu nhận enzym bằng ly tâm với tốc độ 4500 vòng/phút trong thời gian

30 phút Hòa tan kết tủa enzym bằng 5 ml dung dịch đệm photphat 0,1M, pH= 7

o Đối với chế phẩm enzym kỹ thuật: Cân 1 gam chế phẩm nghiên cứu

đã nghiền nhỏ cho vào cốc 200 ml Bổ sung 100 ml nước cất, khuấy trộn đều và giữ nguyên 1 giờ Sau đó, lọc thu nhận enzym qua giấy lọc

 Dung dịch natri cacbonat 1M

 Dung dịch axit sunfuric 2M

 Dung dịch iot 0,1N

 Dung dịch hyposunfit 0,05N: Hòa tan 12,5 gam Na2S2O3 với nước cất không chứa CO2 trong bình định mức 1000 ml Dung dịch phải được bảo quản trong bình thủy tinh màu nâu có ống xi phông và buret với ống canxi clorua nạp đầy vôi Trước khi sử dụng xác định lại nồng độ chuẩn xác của dung dịch

 Dung dịch tinh bột tan 1% trong dung dịch natri clorua bão hòa: Cho 1 gamtinh bột tan vào bình định mức vào nồi cách thủy sôi, lắc liên tục cho tới khi hòa tan hoàn toàn tinh bột Tiếp đó làm nguội bình và bổ sung 10ml dung dịch đệm (dung dịch đệm axetat pH 4,7 hoặc dung dịch đệm photphat

pH 6) định mức tới vạch ngấn NaCl

Kiểm tra mật độ quang của dung dịch: Phối trộn 10 ml dung dịch với 5 ml nước cất, trộn đều Hút 0,5 ml dung dịch nhận được cho vào 50 ml dung dịch iot, lắc đều và đo cường độ màu của dung dịch ở bước song là 656 nm với cuvet 10nm đốingược với mẫu trắng là nước cất Giá trị mật độ quang nhận được phải lớn hơn 0,690

số ml dung dịch Na2S2O3 0,1N

 Mẫu kiểm chứng: Mẫu kiểm chứng được tiến hành như mẫu thí nghiệm, chỉ khác là dung dịch enzym được bổ sung vào sau khi bổ sung NaCO3 và trước khi bổ sung dung dịch iot

- m là lượng chế phẩm enzym sử dụng, g

2 Xác định hoạt độ theo độ nhớt của dung dịch phản ứng

2.1 Nguyên tắc :

Trên cơ sở sự giảm độ nhớt của dung dịch pectin do thủy phân các liên kết

glucozit bởi enzym

Đơn vị hoạt độ polygalacturonase là lượng enzym xúc tác thủy phân các liên kết glucozit có thể làm giảm 50% độ nhớt của dung dịch pectin 0,2-2% ở 370C, pH= 5,25 trong thời gian 10 phút

2.2 Hóa chất :

Dung dịch natri polygalacturonat 0,2-2% : Hòa tan 2g-20g natri

polygalacturonat bằng dung dịch đệm axetat 0,05N, pH = 5,25 trong bình định mức 1000 ml, bổ sung dung dịch đệm tới vạch mức

2.3 Tiến hành :

Hút 10 ml dung dịch natri polygalacturonat 0,2-2%, bổ sung 1 ml dung dịchenzym, lắc đều và đặt vào máy điều nhiệt có nhiệt độ từ 30-370C, giữ nguyên ở nhiệt độ này trong thời gian đúng 10 phút Đo độ nhớt của dung dịch phản ứng bằng nhớt kế Ostwald

2.4 Kết quả : Hoạt độ enzym được xác định thông qua sự giảm độ nhớt của dung dịch phản ứng nhận được

3.1 Nguyên tắc

Trên cơ sở thủy phân các axit galacturonic bởi enzym giải phóng các nhóm khử Các nhóm khử tạo thành sẽ tham gia vào phản ứng với 2-cyanoaxetamit Đơn vị đo hoạt độ polygalacturonase là lượng enzyme xúc tác thủy phân giải phóng 1 nhóm khử ở 450C trong thời gian 1 phút

3.2 Tiến hành:

Hút 0,5 ml dung dịch hỗn hợp phản ứng chuẩn có chứa 0,5 mg axit

polygalacturonic hòa tan trong dung dịch đệm axerat pH= 3-5 cho vào ống

nghiệm Phản ứng được khởi động bằng cách bổ sung 20 dich chiết enzym, lắc đều và đặt vào máy điều nhiệt có nhiệt độ là 450C, giữ nguyên ở nhiệt độ này trong thời gian đúng 20 phút Bổ sung 1,2ml dung dịch chất phản ứng TBC (natri tetraborat 100 mM, axit boric 100 mM và 2-cyanoaxetamit 0,1%), đun sôi trong thời gian 10 phút để dừng phản ứng, sau đó làm nguội Màu của dung dịch sau phản ứng được đo bằng máy quang phổ ở bước song là 270 nm

Xây dựng đường chuẩn: đường chuẩn được xây dựng trong khoảng nồng độ0-0,4 mol/l axit polygalacturonic mỗi khi thí nghiệm

3.3 Kết quả:

Hoạt độ enzym được xác định thông qua đường chuẩn vừa mới được xây dựng

III PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT

Hiện nay, pectinase được tách chiết chủ yếu từ Vi sinh vật, có 2 phương pháp

Để thu được chế phẩm Pectinase tinh khiết thì chế phẩm enzym thô phải được trích ly bằng phương pháp kết tủa nhờ dung môi hữu cơ hay muối ammonium sulfate Dung môi hữu cơ sử dụng để kết tủa enzym pectinase có sunfat sử dụng có

độ bão hòa 0,79 Khi kết tủa bằng rượu ethanol, chế phẩm enzym thu được có độ tinh khiết khoảng 90%, còn nếu bằng muối thì độ tinh khiết đạt khoảng 75% Nhiệt độ kết tủa tối ưu với rượu là 2-50C, thời gian tiếp xúc với rượu càng ngắn càng tốt Sau đó, ly tâm để tách kết tủa khỏi dung dịch, sấy kết tủa trong thiết bị sấy chân không hay sấy thăng hoa rồi nghiền nhỏ và đem bảo quản

2 Tách chiết chế phẩm enzym pectinase từ canh trường bề sâu:

2.1 Phương pháp hiếu khí:

Sự tích tụ enzym trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi sinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị axit hóa mạnh và lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7,2 là thích hợp Đối với nấm mốc, pH=4 ức chế hoàn toàn sự tích lũyenzym pectinase Khi pH dịch về phía axit, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4,5-5, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzym pectinase bị kìm hãm Tuy nhiên, pH của các môi trường nuôi cấy A.niger và A.awamori 16 có thể dịch về 3,5-3,8 và 2,9-3,2 theo thứ tự

Vật liệu gieo cấy có thể nấm 24, 32 và 48 giờ tuổi và với hàm lượng từ 10% Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ

trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử Thời gian ủ

sơ bộ thường là 38-42 giờ Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2% Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hòa tan trong môi trường thường giảm

từ 6% xuống còn 1,5-1,8%

Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-1800C và đi ra đạt 60-700C Thời gian lưu của chế phẩm enzym trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấyphải không quá 400C Chế phẩm thu được cần phải được đóng gói kín để tránhhút ẩm Có thể thu chế phẩm pectinase tinh khiết bằng cách kết tủa enzym trong dịch lọc canh trường với ethanol theo tỉ lệ 4:1, với aceton theo tỉ lệ 2:1

và isopropanol theo tỉ lệ 1,3:1, hoặc với muối ammonium sunfate Nếu kết tủa bằng ethanol, hoạt độ pectinase trong kết tủa sẽ vào khoảng 88-90% so với hoạt độ của dịch canh trường ban đầu Nếu kết tủa bằng muối ammonium sulfat, cần tách muối ra khỏi enzym bằng phương pháp thẩm tích (với nước hoặc dung dịch đệm), sau đó sấy khô Khi độ bão hòa của (NH4)2SO4 bằng 0,5 thì sẽ kết tủa được đoạn có hoạt độ pectinase thấp (đoạn này chiếm 0,25% trọng lượng khô), nhưng nếu kết tủa bằng (NH4)2SO4 có độ bão hòa 1.0 thì sẽ kết tủa được chỉ chiếm 0,11% nhưng lại có hoạt độ pectinase cao

Nước chiết ngô 0,5%

Clostridium pectinopermentants 15 có khả năng tổng hơp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tíchlũy sinh khối Sự tích lũy enzym sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh