Báo cáo đề tài DNA marker

Restriction íragment length polymorphỉsm RFLPĐinh nghĩa: • Kỳ thuật phân tích RFLP đọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length Polymorphism • RFLP được định nghĩa là tính

DNA MARKER

0""000""0

Nhóm thưc hiên:

1. Trân Như Khoa

2. Nguyễn Duy Lan

3. Nguyễn Thị Bích Liễu

4. Lê Hoàng Lâm

5. Nguyễn Thị Kim Ngân

DNAMARKER

• về bản chất, bất kỳ chuỗi mã DNA nào được dùng đê phân biệt hai cá thế, hai dòng

hoặc hai giống khác nhau đều có thê được xem như một DNA marker Các DNA marker có

thế chia thành hai nhóm:

-Marker dựa trên cơ sở lai DNA: RFLP, minisatellite

Restriction íragment length polymorphỉsm (RFLP)

Đinh nghĩa:

• Kỳ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-flip/- viết tắt của Restriction Fragment Length

Polymorphism)

• RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biều

hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các enzyme

cắt giới hạn khi có sự thay đôi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào quan khác Nguyên tac Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

DNA Extracted from

cleavage

hiêu của các m

enzyme căt hạn chê (RE) đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen

• DNA bộ gen sẽ được cắt bàng các enzyme cắt giới hạn, chạy điện di qua gel

Radỉoactiv e

DNAprobe binds to speciíìc DNA

Fragmcnts of DNA arc Transíer of DNA ĩragrrienLs separatec by electrophoresis

to a mcmbrane (Southern blott)

Membrane is X -ray fllm, sand wỉchcd

washed free of to the membrane to detect

DNA pattem is compared with pattems from known

r

o

- denxcge oi DklA t>f

ĩeitnctton ĩnryrye

7 ' V ™ *

* prol

ĩ

'ĩừ*iĩvgof rodiơữctV

e DtiA prơb* to spvc/k

rnỉrrbronr

— vtứShrttềtồi

**<£*:

pobe

/ tranứẼ' tõ

a memtxaiìe

f'5otfh*rn bkxv m

f /

1t sepơMtor

ofON A (ro$rrr+ntĩ try

rie&roữhyr

plimA umpk (U«fi

■> —

-X-ỉơy fim cneơ to

ciVíívr

(OứOđcl/ự t

CcD

C o )

(5ZD Extract DNA

ticini the conuiiuuitv

Rccogiution

ot labeled

?=

PCR vvith n Huoiepcentty

1*11 I I I I I I I I I I I I I I

y

I I

Re^tiiction <u gest oi' K^Rpiodùcl

I I I I I I I I I Í '

ậ ặ ị

ỉn

m Fragnient

peparation in

-RFLP method

ƯU vả nhươc điểm

• Ưu điêm :

o Là marker đồng trội cho phép phân biệt được cá thê đồng họp và dị họp

o Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng marker tạo ra

nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu

• Hạn chế:

Schematic for RFLP by cleavage site loss

Parents Inheritance

of

RFLP

Onotvpps

Sibiinss

Ĩ¥ẸỊ

aa Aa AA

2. Phân tích cấu trúc di truyền DNA ứng dụng trong Y pháp nhận dạng :

Từ những năm 30s dấu vân tay được đưa vào úng dụng trong Y Pháp (Forensics) và trở

thành một công cụ cần thiết trong phòng thí nghiệm của cảnh sát hình sự và thám tử để nhận dạng

Tuy nhiên dấu vân tay bộc lộ nhiều khiếm khuyết một khi áp dụng trong thực tế Chẳng hạn,

tay thông thường chỉ có thể lấy mẫu được từ các đầu ngón tay mà thôi Đã thế ngày nay nó không

còn đặc hiệu cho từng cá thể nữa từ khi phẫu thuật chỉnh hình phát triển mạnh, người ta có

định thay đổi dấu vân tay qua phẫu thuật Chỉ trong vòng trên dưới 50 năm từ khi cấu trúc

truyền DNA được Watson và Crick công bố [1], ngành sinh học phân tử đã phát triển mạnh

được ứng dụng rộng rãi Một trong những ứng dụng quan trọng của sinh học phân tử là sử

tính của cấu trúc chuỗi di truyền DNA của từng cá thể vào trong Y pháp đế nhận dạng đối

như là một cuộc cách mạng trong Y học hình sự của nhân loại

Có thê hình tượng cấu trúc phân tử của một DNA như là một cái phéc-mơ-tuya (zip), mỗi

răng kéo là một trong bốn khối chất liệu căn bản, viết tắt bàng các ký tự A (adenine), c

(guanine), và T (thymine), mà mỗi một ký tự đó gọi là một nucleotide, chúng cũng đứng

như các răng kéo của phéc-mơ-tuya theo cặp cố định A-T hoặc G-C Thông tin chứa đựng trong

DNA được xác định cơ bản bằng chuồi tiếp nổi các ký tự này dọc theo cái "phéc-mơ-tuya"

đó Các 'ký tự' này đứng theo một thứ tự và một số lượng nhất định đề tạo thành đơn vị lớn

là gien Nhiều gien nối lại với nhau tạo thành nhiễm sắc thể Theo ước tính mới nhất, con

khoảng 35000 bộ gien Trong đó chỉ có 1% số lượng gien đóng vai trò chức năng (thí dụ

quy định màu da, tóc v.v ), 99% còn lại là những gien không có chức năng, các gien này rất đa

dạng, khác nhau ở từng cá thể Cho nên chẳng thể có người nào giống người nào về cấu trúc di

truyền DNA cả, trừ đó là người sinh đôi cùng trứng

'Hồ sơ' DNA (tạm dịch từ DNA proíiling) là một phần nhỏ trích từ cấu trúc toàn bộ của chuồi DNA

(của một cá thê), tức là các bộ gien và thuộc phân gien không có chức năng, đủ đê phản ánh

riêng nhất của mồi cá thể không lẫn lộn với người khác Và cũng từ đó mà thuật ngừ "Điềm chỉ"

DNA (tạm dịch từ DNA fmgerprint)- cũng chính là 'hồ sơ DNA', do một nhà Di truyền học người

Anh, Alec Jeffreys đề xuất, đê nói lên một đặc trưng duy nhất cho mỗi cá the giống như là

tay (hay diêm chỉ) 'Diêm chỉ' DNA là hoàn toàn giống nhau ớ tất cả các tế bào, tô chức mô, tạng

phủ trong một cơ thể; và điềm chỉ DNA không có thể thay đổi được bàng bất cứ hình thức

thức của nhân loại hiện nay

về nguyên lý nhận dạng cá thê sống bằng DNA rất đơn giản, đó là nguyên lý so sánh

cặp Đối với nhận dạng vết tích thì người ta đem mẫu DNA của vết tích so sánh với mẫu

trữ hoặc với các mẫu nghi ngờ Đối với việc nhận dạng quan hệ huyết thống (cha mẹ chẳng hạn),

người ta đem so sánh DNA của cha, mẹ với cá thể đó để xem có quan hệ di truyền hay

nôm na là như biên số đăng ký xe Mỗi một chiếc xe có một biến số riêng, người ta có thê

Các kỹ thuật phân tích điếm chỉ DNA hiện hành [2]:CÓ nhiều kỹ thuật phân tích

kỳ thuật thông dụng nhất hiện nay là:

Kỹ thuật phân tích RFLP (đọc là / ri-ílip/- viết tắt của Restriction Fragment Len^th

Polymorphism) (tạm dịch là các đoạn gien có độ dài giới hạn đa hình thái) Xuất phát từ

các đoạn DNA chức năng và các đoạn DNA không chức năng có thế tồn tại dưới nhiều hình thái

khác nhau Bằng cách sử dụng các enzyme đặc hiệu, chẳng hạn Restriction enzyme, có thể

đoạn gien RFLP Người ta đã có thể nhận dạng được đến vài nghìn loại RFLP, rất đặc hiệu

thể

Kỹ thuật phân tích PCR/STR (Polymerase Chain reaction/Short Tandem Repeat)

Tức là kỳ thuật dùng phản ứng chuỗi enzyme đa phân để 'khuếch đại' các đoạn gien ngắn có độ lặp

ngắn theo thứ tự (Short Tandem Repeat, STR) Ở đây polymesase tức là một loại enzyme có

phản ứng tạo ra nhiều bản copy của một đoạn DNA nào đó; phản ứng chuồi tức là một phản ứng

diễn ra liên tục Như vậy bằng kỹ thuật PCR có thê trong một thời gian ngắn tạo ra hàng

đến hàng tỷ bản copy của một STR Kỹ thuật này còn được gọi là kỹ thuật "khuếch đại

"Photocopy phân tử" trong một lối nói rộng rãi hơn

Đây là một kỳ thuật hiện đại nhất hiện nay được dùng trong Y pháp DNA về mặt cơ

thuật này cũng tiên hành tương tự như kỳ thuật RFLPs Lợi diêm của kỹ thuật này so với RFLP là:

- Mầu thu thập không nhất thiết phải đạt tiêu chuẩn cao, những mẫu lấy từ các mô bị huỷ hoại hoặc

cháy bỏng nặng, xác thối rừa do chôn lâu đều có thể dùng được, hoặc chỉ lấy các 'vi vết' như tàn

thuốc lá, vết dính nước bọt, những mẫu bệnh phấm bị trộn lẫn như máu của nạn nhân lẫn

hay dịch của phạm nhân

Các đặc điềm khác nhau về kỹ thuật cơ bản giữa PCR/STR vơi RFLP là: (a) Trong nhận

cho các sắc dân da trắng, đen, da màu và dân Á châu, vấn đề là ngay trong mỗi nhóm sắc dân đó

cũng có sự biến đổi (chẳng hạn Á châu thì gồm Đông Á, Tây Á, Đông Nam Á v.v ) Xác

thể khớp đuợc một mẫu DNA với một mẫu trong quần thể tham khảo là rất thấp (1 phần 6

đó xác suất này có thê cao hơn nếu dùng phụ nhóm của quần thê tham khảo (có thê tăng lên 1/800000)

Một trở ngại khác liên quan đến bàng chứng Ket quả báo cáo của chuyên viên DNA được toà ghi

nhận, thế nhưng lại không có bằng chứng cụ thể nào để xác nhận mẫu DNA đó là sản phẩm

mẫu bệnh phâm nguyên thuỷ cả

Điếm sau cùng trong tính phức tạp của kỹ thuật diêm chỉ DNA là liên quan đến vấn

đức và pháp lý Đây là vấn đề tranh cãi rất nhiều và chưa hoàn toàn thống nhất trong hệ

luật của nhiều quốc gia Thứ nhất là về ngân hàng dữ liệu DNA tội phạm Luật lệ nhiều

như thống nhất là tội phạm hoặc như nghi phạm bắt buộc phải làm DNA Còn những người bình

thường thì không có cơ sở luật pháp bắt họ phải làm, như vậy về mặt dữ liệu sẽ bị thiếu hụt Trong

một số trường hợp những bệnh nhân bình thường, vì lý do gì đó phải xét nghiệm DNA thì

trong những trường hợp nguy cơ kết quả DNA bị lạm dụng Hoặc giả sử một trường hợp

liên quan đến đạo đức, vừa luật pháp Ví dụ một đôi vợ chồng có một đứa con bị bệnh Cystis

Fibrosis (hay CF, dịch là bệnh xơ nang ton thương chủ yếu là tuy tạng và phối) là một bệnh

lặn, do đó về di truyền thì bố mẹ phải có gien ẩn của bịnh này mới 'truyền' được cho đưá

khốn thay, khi xét nghiệm ra thì chỉ có người mẹ mang gien lặn mà thôi, vấn đề đặt ra là,

thông báo cho người chồng của bà mẹ biết rằng ông không phải là bố của đứa trẻ hay

nên thông báo cho cha chính thức của đứa trẻ rằng chính ông có mang gien lặn của bệnh

di truyền ông không nên cưới vợ có cùng mang gien lặn bệnh như ông nữa, hay không?

Điểm chỉ DNA và vụ thảm hoạ hoả hoạn ở ITC thành phố HCM tháng 10/2002:

Một người da đen (gọi là "X") sinh tại Anh đã bỏ qua sổng với cha của mình tại Ghana Sau đó

anh

ta xin qua trở lại Anh để sống với mẹ (gọi là "M") và ba người anh chị em ruột của mình thì

bị từ chối cho nhập cảnh vì người ta nghi ngờ đã bị thay thế bởi một người cháu hay một người

không thân thuộc gì với bà mẹ Câu chuyện từ chối visa nhập cảnh này xảy ra vào năm 1985, lúc

này xét nghiệm dấu ấn protein (protein markers) đã được thực hiện và xác định được bà mẹ có liên

hệ với

"X?", tuy nhiên không thể loại trừ được M là cô hay dì của "X?" Thắc mắc trên tưởng

chừng bế tắc, không có cách giải quyết, nhưng may mắn Jeffereys và các cộng sự đã được nhờ đến và lần

đầu tiên xét nghiệm dấu ấn DNA được áp dụng trong trường họp này Ket quả xét nghiệm đã xác

định được đúng "X?" chính là "X" vì "X?" có mang các dấu ấn DNA từ M, đồng thời có chung các

dấu ấn DNA với những đứa con của "M" thừa hưởng từ người cha

Vậy dấu ấn DNA là gì? Nguyên tắc hoạt động của các xét nghiệm dấu ấn DNA như thế nào?

Những tiến bộ và các phạm vi ứng dụng hiện nay của xét nghiệm dấu ấn DNA ra sao?

DNA bộ gen người của chúng ta có đến 30% chứa các trình tự base lặp lại và hầu như không

mang những mã có ý nghĩa chức năng Cũng như các trình tự base có ý nghĩa chức năng (gọi là

gen), các trình tự base lặp lại này được di truyền từ cha mẹ sang con cái theo định luật phân ly độc

lập của Mendel Tuy nhiên khác với gen, rất khó tìm thấy sự khác biệt về trình tự base của gen giữa

các cá nhân, có nhiều trình tự base lặp lại có thê giúp phân biệt được cá nhân này với các nhân

khác, không những thế, có thể giúp tìm xem họ có quan hệ huyết thống với nhau hay không? Các trình

tự base lặp lại này được gọi là các dấu ấn DNA Có hai loại dấu ấn DNA hiện đang được dùng trong

xét nghiệm dấu ấn DNA là:

Các tiêu vệ tinh (minisatellite)

Đó là các trình tự base lõi lặp lại, gọi là các tiểu vệ tinh VNTRs (Variable Number of Tandem Repeats = số lượng thay đổi các trình tự base lặp lại), có các kích thước thay đổi từ 1.000

base (1 KB) đến 30.000 base (30 KB) Các VNTRs này hiện diện rải rác tại nhiều vị trí trên bộ gen,

có thế trích được bộ gen nguyên vẹn (phải lấy không dưới lOml máu đế tách đủ bạch cầu dùng trong

ly trích bộ gen)

4. Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm Coiynespora cassiicola Wei gây

bệnh trrên cây

cao su (Hevea brasỉliensis) bằng phương pháp RFLP - PCR.

(VŨ THỊ QUỲNH CHI Đại hoc Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2005 Hướng

dẫn khoâ học: PGS.TS BÙI CACH TUYẾN, ThS PHAN THÀNH DŨNG.)

Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su là một bệnh mới do nấm Corynespora cassiicola

Curt.) Wei gây ra nhưng có tác hại rất lớn đến nền kinh tế của nhiều nước, đặc biệt là những nước

sản xuất cao su thiên nhiên Triệu chứng biêu hiện của bệnh hiện nay rất biến thiên và dễ

với các bệnh về lá khác Do đó tìm hiếu phương pháp chấn đoán, phát hiện nhanh bệnh Corynespora

cũng là cách giúp khống chế bệnh nhanh hơn, trước khi bệnh lây lan Nhừng nghiên cứu

cho thấy, nấm c cassiicola có sự phân hóa trong cùng loài, c cassiicoỉa trên các dòng vô

su khác nhau có sự khác biệt về di truyền, nhò' đó có thế nhận biết c cassiicola qua khả

bệnh cho các dòng vô tính cao su khác nhau Việc nghiên cứu đa dạng di truyền của nấm c cassiicola trên cây cao su ở nước ta là một việc làm cần thiết nhàm tìm hiểu mối quan hệ

dạng di truyền của c cassiicola với tính kháng của một số dòng vô tính cao su đang được

Việt Nam

Kết quả đạt được :

Ampliíĩed Fragment Length Polỉmorphism (AFLP)

Khái niêm

❖ AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) là sự đa hình chiều dài các đoạn

DNA được khuếch đại chọn lọc, là kỳ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR

❖ 1975 Vos và cộng sự đã phát minh ra kỳ thuật này.

- Xây dựng bản đồ DNA marker có hiệu quả nhất so với những marker khác ( Vos và

viên 1995)

- Khám phá ra nhừng clone genome, vd YAC

- Fingerprinting các đoạn DNA đã đuợc cloned như cosmid, Pl, BAC, YAC (Vos và

viên 1995)

❖ AFLP marker dựa trên sự khuếch đại DNA bàng kỳ thuật PCR

❖ AFLP là một marker trội -Marker trội: marker không thể phân biệt những cá thể

và cá thê dị họp tử

Kỹ thuât AFLP

Nguyên tắc của kỹ thuật AFLP giống như RFLP, điểm khác biệt cơ bản là AFLP không cần tiến

hành lai phân tử (lai Southern blot), do vậy thực hành nhanh

1. NỐI DUNG Cơ BẢN CỦA PHƯƠNG PHÁP

Pnmerl + 1 Adaptor EcoRI 4- A (5‘) Adaptor Msel + c (5‘)

Pnmer2+2

X X I I I I I /—4 X X J>mm* GGGTTA

Sơ đồ kỹ thuật AFLP

AFLP Procedure

5’ -GAATTC -TTAA -3’

3' -CTTAAG -AATT -5

Ị Mse 1 Adaptsr Llgation

PCR1

PCR 2

AATTCMN

"

TTAAGNN

I

TAl

I

EcoR 1 adapter MSP 1 adaptpr NNTTA NNAA7

tooR 1 pnmer F-AC Mse 1 pnmerM-CC

‘AA

AATTCAC -GGTTAỊ AAGTG -CCAATI

I

E^-ACA M-CCAC

rAATTCACA

ÌTTAAGTGT-Ll-Cor s*q«ier>c*r

denaturing polyacrylamide geỉ eiectrophocests

I

-GTGGTĨt

ÍACCAA

"

ứng dung

So sánh đa hình AFLP giữa hai nhóm cá thế cá tra (pangasius hypophthaỉmus) có trọng lượng

phân biệt

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

có trọng lượng lớn nhất (trung bình là 3,9 gam) và 10 mẫu có trọng lượng nhỏ nhất (trung bình

là 2,2 gam)

Tách chiết DNA:

DNA cá tra được tách chiết chủ yếu theo Fetzner [3] Cụ thể: khoảng 50 mg mẫu được rửa sạch

cồn bằng 0,9 ml đệm TLE (10 mM Tris; 0,1 mM EDTA; pH 8.0) Thêm vào 0,9 ml đệm phá tế

bào (10

mM Tris; 100 mM EDTA; 2% SDS, pH 8.0) Bổ sung 5pil enzyme protease K (20 mg/ml),

ủ 55°c trong 14-16 giờ Đe mẫu ở nhiệt độ phòng và bổ sung 4pl RNAase A (lOmg/ml), ủ 37°c

trong 30 phút Thêm vào 0,3 ml dung dịch kết tủa protein (7,5 mM Ammonium Acetate), trộn đều và

ủ trong

đá 30 phút Ly tâm 2 lần đề loại tủa protein và thu dịch DNA Ket tủa DNA bằng 0,9 ml

isopropanol,

để -20 c trong 3 giờ, ly tâm thu tủa DNA Rứa DNA bàng 0,75 ml cồn 70° Hòa tan DNA

trong 100pl đệm TLE Bảo quản ớ 4°c để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

Bảng 1: Trình tự các adapter và mồi được sử dụng trong phân tích AFLP

Phân tích sản phẩm AFLP: sau PCR, một thể tích íbrmamide dye được thêm vào phản ứng

Mầu được biến tính bàng nhiệt ở 95°c trong 3 phút, và đặt ngay vào đá Sản phẩm AFLP được

điện di trên gel polyacrylamide biến tính (19:1 acrylamide:bisacylamide; 7,5 M urea; 0,5 X TBE

buffer )

KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

DNA hệ gen từ hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn và nhỏ được tách chiết Ket quả đánh giá

trên điện di agarose cho thấy chất lượng DNA đạt tiêu chuấn cho các phân tích tiếp theo

Để chuẩn bị khuôn DNA cho AFLP, DNA hệ gen được cắt đồng thời bởi 2 enzyme giới hạn

EcoRI

có trình tự nhận biết 6 base pair (G(AATTC) và Msel có trình tự nhận biết 4 base pair

(T(TAA)

Thành công của kỳ thuật AFLP phụ thuộc vào sự cắt hoàn toàn của phản ứng cắt và chất

(PSP - preselective primers) PSP chứa các trình tự: i) bô trợ với adapter; ii) bô trợ với trình tự

nhận biết của enzyme giới hạn; iii) một nucleotid Các đoạn DNA mà nucleotid liền kề với trình

tự nhận biết của enzyme giới hạn bổ trợ với nucleotid của PSP sẽ được nhân lên (theo xác suất một

phần tư

số đoạn DNA sẽ được nhân lên) Tương tự, các đoạn DNA mà 3 nucleotid tiếp theo liền kề

với trình

tự nhận biết của enzyme giới hạn bô trợ với 3 nucleotid của mồi chọn lọc (SP - selective

54 tổ hợp mồi được sử dụng để phân tích đa hình AFLP của hai nhóm cá tra có trọng lượng lớn

và nhỏ Mỗi tổ họp mồi tạo ra từ 27 đến 94 băng, trung bình là 55 băng trên một tổ hợp mồi

Trong đó, cao nhất là tổ họp mồi ACC/M-CAG: 94 băng/mẫu, và thấp nhất là tổ họp mồi

E-ACG/M-CTG:

27 băng/mẫu Trong 54 to họp mồi nghiên cứu, 11 to họp mồi không tạo băng AFLP và 43

tô họp mồi tạo 204 băng AFLP Tỷ lệ băng đa hình giữa các mẫu cá tra là 1,35% cho thấy sự đa

hình AFLP

Hình 1 Đa hình AFLPgiữa nhóm cá lớn và nhóm cả nhỏ của tố hợp mồi E-ACA/M-CAG

Tổng cộng có 204 băng AFLP được tạo ra từ 43 tổ hợp mồi, trung bình là 4,74 băng

suất xuất hiện các băng AFLP ở hai nhóm cá tra là khác nhau nên chúng tôi đã tính tần số

Bảng 2: Tần số khác biệt của các băng AFLP giữa hai nhóm cá tra

Nhừng băng AFLP có tần số khác biệt trên 50% được thể hiện ở bảng 3