Yêu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật

Ví dụ nấm men, nấm sợi và vi khuẩn có lượng chứa trung bình của 6 nguyên tố chủ yếu là không giống nhau bảng 13.1: Bảng 13.1: Lượng chứa trung bình các loại nguyên tố chủ yếu trong tế bà

Yêu cầu dinh dưỡng của vi

sinh vật

Bởi:

Nguyễn Lân Dũng

YÊU CẦU DINH DƯỠNG CỦA VI SINH VẬT

Thành phần hoá học của tế bào vi sinh vật

Cơ sở vật chất cấu tạo nên tế bào vi sinh vật là các nguyên tố hoá học Căn cứ vào mức độ yêu cầu của vi sinh vật đối với các nguyên tố này mà người ta chia ra thành các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng Các nguyên tố chủ yếu bao gồm: C, H, O,

N, P, S, K, Mg, Ca và Fe Trong số này có 6 loại chủ yếu (chiếm đến 97% trọng lượng khô của tế bào vi sinh vật), đó là C, H, O, N, P và S Các nguyên tố vi lượng thường là

Zn, Mn, Na, Cl, Mo, Se, Co, Cu, W, Br và B Tỷ lệ các nguyên tố hoá học tham gia cấu tạo tế bào vi sinh vật là không giống nhau ở các nhóm vi sinh vật khác nhau Ví dụ nấm men, nấm sợi và vi khuẩn có lượng chứa trung bình của 6 nguyên tố chủ yếu là không giống nhau (bảng 13.1):

Bảng 13.1: Lượng chứa trung bình các loại nguyên tố chủ yếu trong tế bào một số nhóm

vi sinh vật (% trọng lượng khô)

Theo các tài liệu của Tempest (1969), Pirt (1975) và Herbert (1976) thì thành phần trung bình của các nguyên tố tạo nên tế bào vi sinh vật nói chung là như sau:

Bảng 13.2: Thành phần các nguyên tố cấu tạo nên sinh khối tế bào

*Các tế bào bao gồm 70% trọng lượng là nước và 30% là các nguyên liệu khô khác Mức trung bình này được tính theo sinh trưởng của vi khuẩn Gr(-) trong điều kiện dư thừa chất dinh dưỡng ở nuôi cấy theo mẻ

Vi khuẩn lưu huỳnh (sulfur bacteria), vi khuẩn sắt (iron bacteria) và vi khuẩn đại dương (marine bacteria) có lượng chứa các nguyên tố S, Fe, Na, Cl nhiều hơn so với các nhóm vi khuẩn khác Tảo Silic (diatom) có chứa lượng SiO2khá cao trong thành tế bào Thành phần các nguyên tố hoá học còn thay đổi trong một phạm vi nhất định tuỳ thuộc

vào tuổi nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy Khi nuôi cấy trên các môi trường có nguồn N phong phú thì lượng chứa N trong tế bào sẽ cao hơn so với khi nuôi cấy trên các môi trường nghèo nguồn N

Các nguyên tố hoá học chủ yếu tồn tại trong tế bào vi sinh vật dưới dạng chất hữu

cơ, chất vô cơ và nước Chất hữu cơ thường bao gồm protein, carbon hydrat, lipid, acid nucleic, vitamin và các sản phẩm phân giải của chúng cũng như các chất trao đổi chất

Để phân tích các thành phần hữu cơ trong tế bào thường sử dụng hai phương pháp: một

là, dùng phương pháp hoá học để trực tiếp chiết rút từng thành phần hữu cơ trong tế bào, sau đó tiến hành phân tích định tính và định lượng Hai là, phá thành tế bào, thu nhận các thành phần kết cấu hiển vi rồi phân tích thành phần hoá học của từng kết cấu đó Chất vô cơ thường đứng riêng rẽ dưới dạng muối vô cơ hoặc kết hợp với chất hữu cơ Khi phân tích thành phần vô cơ trong tế bào người ta thường phân tích tro sau khi đã nung tế bào ở nhiệt độ 5500C, chất vô cơ thu được dưới dạng các oxit vô cơ được gọi là thành phần tro Dùng phương pháp phân tích vô cơ có thể định tính hay định lượng từng nguyên tố vô cơ

Bảng 13.3:Thành phần hóa học của tế bào vi khuẩn (theo F.C.Neidhardt et al.,1996)

Chú thích:

(1) -Khối lượng khô của tế bào vi khuần Escherichia coli đang sinh trưởng là khoảng

(2) - Giả thiết Peptidoglycan và Glycogen là 2 thành phần chủ yếu.

(3) - Tế bào chứa vài loại phospholipid, do tính đa dạng của thành phần acid béo giữa các chi vi khuẩn khác nhau và do ảnh hưởng của điều kiện sinh trưởng mà có nhiều hình thức tồn tại của mỗi loại phospholipid

Nước là thành phần không thể thiếu để duy trì hoạt động sống bình thường của

tế bào Nước thường chiếm đến 70-90% trọng lượng tế bào Độ chênh lệch giữa trọng lượng tươi và trọng lượng khô chính là lượng nước trong tế bào, thường biểu thị bằng tỷ

lệ % tính theo công thức sau đây:

(Trọng lượng tươi - Trọng lượng khô) / Trọng lượng tươi x 100%

Đơn vị trọng lượng tế bào trong dịch nuôi cấy thường được biểu thị bằng đơn vị g/

l hay mg/ml Phương pháp nung khô tế bào ở nhiệt độ 5500C thường làm phân giải một

số hợp chất của tế bào vì vậy khi tính trọng lượng khô của tế bào nên dùng phương pháp sấy khô ở 1050C hay làm khô ở nhiệt độ không cao trong chân không, hoặc làm khô nhanh nhờ tia hồng ngoại

Các chất dinh dưỡng và chức năng sinh lý

Vi sinh vật chủ yếu thu nhận được chất dinh dưỡng từ môi trường bên ngoài Căn

cứ vào chức năng sinh lý khác nhau trong tế bào mà người ta thường chia các chất dinh dưỡng thành 5 nhóm lớn:

Nguồn carbon (source of carbon)

Là nguồn vật chất cung cấp C trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật Trong tế bào nguồn C trải qua một loạt quá trình biến hoá hoá học phức tạp sẽ biến thành vật chất của bản thân tế bào và các sản phẩm trao đổi chất C có thể chiếm đến khoảng một nửa trọng lượng khô của tế bào Đồng thời hầu hết các nguồn C trong các quá trình phản ứng sinh hoá còn sinh ra trong tế bào nguồn năng lượng cần thiết cho hoạt động sống của vi sinh vật Một số vi sinh vật dùng CO2làm nguồn C duy nhất hay chủ yếu để sinh trưởng, khi đó nguồn C không phải là nguồn sinh năng lượng

Vi sinh vật sử dụng một cách chọn lọc các nguồn C Đường nói chung là nguồn

C và nguồn năng lượng tốt cho vi sinh vật Nhưng tuỳ từng loại đường mà vi sinh vật có những khả năng sử dụng khác nhau Ví dụ trong môi trường chứa glucose và galactose thì vi khuẩn Escherichia coli sử dụng trước glucose (gọi là nguồn C tốc hiệu) còn galactose được sử dụng sau (gọi là nguồn C trì hiệu) Hiện nay trong các cơ sở lên men công nghiệp người ta sử dụng nguồn C chủ yếu là glucose, saccharose, rỉ đường (phụ phẩm của nhà máy đường) tinh bột (bột ngô, bột khoai sắn ), cám gạo, các nguồn cellulose tự nhiên hay dịch thuỷ phân cellulose

Năng lực đồng hoá các nguồn C ở các vi sinh vật khác nhau là không giống nhau.

Có loài có khả năng sử dụng rộng rãi nhiều nguồn C khác nhau, nhưng có loài khả năng này rất chọn lọc Chẳng hạn vi khuẩn Pseudomonas có thể đồng hoá được tới trên 90 loại hợp chất C, nhưng các vi khuẩn thuộc nhóm dinh dưỡng methyl (methylotrophs) thì chỉ đồng hoá được các hợp chất 1C như methanol, methane

Nguồn C chủ yếu được vi sinh vật sử dụng gồm có đường, acid hữu cơ, rượu, lipid, hydrocarbon, CO2, carbonat (Bảng 13.4)

Bảng 13.4: Nguồn C được vi sinh vật sử dụng

Nguồn C Các dạng hợp chất

Đường glucose, fructose, maltose, saccharose, tinh bột, galactose, lactose,

mannite, cellobiose, cellulose, hemicellulose, chitin

Acid hữu cơ acid lactic, acid citric, acid fumaric, acid béo bậc cao, acid béo bậc

thấp, aminoacid

Lipid lipid, phospholipid

Hydrocarbon khí thiên nhiên, dầu thô, dầu paraffin

Carbonate NaHCO3, CaCO3, đá phấn

Các nguồn C

khác Hợp chất nhóm thơm, cyanide, protein, pepton, acid nucleic

Hình 13.1: Sản lượng sinh trưởng tối ưu khi vi sinh vật dị dưỡng

sử dụng các nguồn C khác nhau

Nguồn carbon thường được sử dụng trong công nghiệp lên men là rỉ đường (molasses)

Sự khác nhau giữa rỉ đường mía và rỉ đường củ cải được thấy rõ trong bảng 13.5

Bảng 13.5: Thành phần hóa học của rỉ đường củ cải và rỉ đường mía

Thành phần Tỷ lệ Rỉ đường củ cải Rỉ đường mía

Tỷ lệ các nguyên tố trong các hợp chất cao phân tử ở vi sinh vật có thể thấy rõ trong bảng sau đây:

Bảng 13.6: Tỷ lệ các nguyên tố trong các cao phân tử ở tế bào vi sinh vật

Thành phần

% trọng lượng khô

Trung bình Biên độ dao động

DNAd 3 1c–5f 36 4 34 17 - 10

-1 Theo Herbert (1976) Các thông số được thu nhận từ các vi sinh vật khác nhau, không điển hình cho một nhóm nào

2 Ở E coli (trong pha sinh trưởng log) Theo Neidhardt et al (1990).

3 Các tế bào có nguồn dự trữ C

4 Bao gồm các cao phân tử như ARN, ADN, polyphosphate hoặc một số thành phần của thành tế bào

5 Tại mức độ có tỷ lệ sinh trưởng cao

6 Các tế bào sinh trưởng chậm

7 Các loài ký sinh không có thành tế bào

8 Vi khuẩn Gram(+)

9 Các chủng thay thế nguồn phospholipid bằng các chất tương tự chứa P tự do, trong điều kiện hạn chế nguồn P

10 Vi khuẩn Gram(-)

11 Các tế bào trong điều kiện hạn chế nguồn N

12 Hạn chế nguồn P

13 PHA (polyhydroxyaldehyde) chứa 3-hydroxyoctanoic acid

14 Một số nấm men và vi khuẩn

15 Một số vi khuẩn lam có nguồn dự trữ N cyanophycin [(asp-arg)].n

*PHB= Poly- β- hydroxy butyrate

Nguồn N (source of nitrogen)

Nguồn N là nguồn cung cấp N cho vi sinh vật để tổng hợp nên các hợp chất chứa

N trong tế bào Thường không là nguồn năng lượng, chỉ một số ít vi sinh vật tự dưỡng (thuộc nhóm ammon hoá-ammonification, nhóm nitrate hoá- nitrification) dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn năng lượng Trong điều kiện thiếu nguồn C một số

vi sinh vật kỵ khí trong điều kiện không có oxy có thể sử dụng một số aminoacid làm nguồn năng lượng Nguồn N thường được vi sinh vật sử dụng là protein và các sản phẩm phân huỷ của protein ( peptone, peptide, aminoacid ), muối ammone, nitrate, N phân

tử (N2), purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (bảng 13.7)

Bảng 13.7: Nguồn N được vi sinh vật sử dụng

Nguồn N Các dạng hợp chất

Protein và các sản

phẩm phân giải

của protein

peptone, peptide, aminoacid (một số vi sinh vật tiết men proteinase phân giải protein thành các hợp chất phân tử nhỏ hơn rồi mới hấp thu được vào tế bào)

Ammone và muối

ammone NH3, (NH4)2SO4, (dễ được hấp thu)

Nitrate KNO3(dễ được hấp thu)

N phân tử N2(với vi sinh vật cố định N)

Các nguồn N khác purine, pyrimidine, urea, amine, amide, cyanide (chỉ một số

nhóm vi sinh vật mới có thể đồng hoá được)

Nguồn N thường được sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật gồm có pepton, bột cá, bột nhộng tằm, bột đậu tương, bột khô lạc, cao ngô, cao thịt, cao nấm men Vi sinh vật sử dụng chọn lọc đối với nguồn N Chẳng hạn xạ khuẩn sản sinh terramycin sử dụng cao ngô với tốc độ nhanh hơn so với sử dụng khô đậu tương hay khô lạc, bởi vì nguồn N trong cao ngô là các sản phẩm phân giải dễ hấp thu của protein Cao ngô được coi là nguồn N tốc hiệu, còn khô dầu được coi là nguồn N trì hiệu Loại N tốc hiệu là có lợi cho sự sinh trưởng của vi sinh vật, còn loại trì hiệu lại có lợi cho sự hình thành các sản phẩm trao đổi chất Khi sản xuất terramycin chẳng hạn, người ta phối hợp sử dụng cao ngô và khô dầu theo một tỷ lệ nhất định để phối hợp giữa giai đoạn sinh trưởng tạo sinh khối và giai đoạn sinh tổng hợp các sản phẩm trao đổi chất, nhằm mục tiêu là nâng cao sản lượng terramycin

Năng lực hấp thu muối ammone và nitrate ở vi sinh vật là khá mạnh Ion NH4+ sau khi được tế bào hấp thu có thể được trực tiếp sử dụng, do đó các nguồn muối ammone được coi là nguồn N tốc hiệu Còn nitrate sau khi được hấp thụ cần khử thành

NH4+ rồi mới được vi sinh vật sử dụng Đa số các vi khuẩn hoại sinh (saprophyte),

vi khuẩn đường ruột, vi sinh vật gây bệnh ở người, động vật, thực vật đều có thể

dùng muối ammone, muối nitrate làm nguồn N Chẳng hạn các vi khuẩn Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa đều có thể

sử dụng nguồn (NH4)2SO4 và NH4NO3làm nguồn N; xạ khuẩn có thể sử dụng KNO3 làm nguồn N; nấm sợi có thể sử dụng KNO3 làm nguồn N Lúc dùng các muối như (NH4)2SO4để làm nguồn N nuôi cấy vi sinh vật cần chú ý là sau khi vi sinh vật hấp thu NH4+thì sẽ làm hạ thấp pH của môi trường Người ta gọi đó là những muối có tính sinh

lý acid Ngược lại khi dùng các muối nitrate (như KNO3) sau khi vi sinh vật hấp thu NO3- thì sẽ làm nâng cao pH của môi trường Người ta gọi đó là các muối có tính sinh

lý kiềm Để làm cho pH trong các môi trường nuôi cấy vi sinh vật ít bị biến động người

ta bổ sung thêm các chất có tính đệm (buffer substance)

Nguồn muối vô cơ (source of inorganic salt)

Các muối vô cơ là nguồn chất dinh dưỡng không thể thiếu đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật Chúng có các chức năng sinh lý chủ yếu là: tham gia vào thành phần của các trung tâm hoạt tính ở các enzyme của vi sinh vật, duy trì tính ổn định của kết cấu cá đại phân tử và tế bào, điều tiết và duy trì cân bằng áp suất thẩm thấu của tế bào, khống chế điện thế oxy hoá khử của tế bào và là nguồn vật chất sinh năng lượng đối với một

số loài vi sinh vật (bảng 13.8)

Bảng 13.8: Muối vô cơ và chức năng sinh lý của chúng

Nguyên

tố

Hợp chất sử

dụng Chức năng sinh lý

P K2HPO4KH2PO4,

Là thành phần của acid nucleic, nucleoprotein, phospholipid, coenzyme, ATP Làm nên hệ thống đệm giúp điều chỉnh pH môi trường

S MgSO(NH4)2SO4,

4

Là thành phần của các aminoacid chứa S, một số vitamin; glutathione có tác dụng điều chỉnh điện thế oxy hoá khử trong tế bào

Là thành phần trung tâm hoạt tính của enzyme phosphoryl hoá hexose, dehydrogenase của acid isocitric, polymerase của acid nucleic, thành phần của chlorophyll và

bacterio-chlorophyll

Ca Ca(NO3)2CaCl2, Tạo tính ổn định của một số cofactor, enzyme duy trì, cầncho sự dựng trạng thái cảm thụ của tế bào.

Na NaCl Thành phần của hệ thống chuyển vận của tế bào, duy trì ápsuất thẩm thấu, duy trì tính ổn định của một số enzyme.

KH2PO4

Là cofactor của một số enzyme, duy trì áp suất thẩm thấu của

tế bào, là nhân tố ổn định của ribosome ở một số vi khuẩn ưa mặn

Fe FeS04 Thành phần của sắc tố vi khuẩn và một số enzyme, là vậtchất nguồn năng lượng của một số vi khuẩn sắt, cần thiết để

tổng hợp chlorophyll và độc tố vi khuẩn bạch hầu

Trong quá trình sinh trưởng vi sinh vật còn cần tới một số nguyên tố vi lượng Những nguyên tố này cũng có vai trò quan trọng mặc dầu chỉ cần với số lượng rất nhỏ, khoảng

10-8-10-6 mol/ L môi trường nuôi cấy Nguyên tố vi lượng tham gia vào thành phần enzyme và làm hoạt hoá enzyme (Bảng 13.9)

Bảng 13.9: Tác dụng sinh lý của nguyên tố vi lượng

Nguyên

tố Tác dụng sinh lý

Zn Có mặt trong alcohol dehydrogenase, lactodehydrogenase, phosphatase

kiềm, ARNpolymerase, ADNpolymerase

Mn Có mặt trong peroxyd dismutase, carboxylase ciitric synthetase

Mo Có mặt trong reductase nitrate, nitrogenase, dehydrogenase formic

Se Có mặt trong reductase glycin, reductase formic

Co Có mặt trong mutase glutamic

Cu Có mặt trong cytochrome oxydase

W Có mặt trong dehydrogenase formic

Br Có mặt trong urease, cần cho sự sinh trưởng của vi khuẩn hydrogen

Nếu thiếu nguyên tố vi lượng trong quá trình sinh trưởng thì hoạt tính sinh lý của vi sinh vật bị giảm sút, thậm chí ngừng sinh trưởng Do nhu cầu dinh dưỡng của vi sinh vật

là không giống nhau cho nên khái niệm về nguyên tố vi lượng chi có ý nghĩa tương đối

Vi sinh vật thường tiếp nhận nguyên tố vi lượng từ các chất dinh dưỡng hữu cơ thiên nhiên, các hoá chất vô cơ, nước máy hay ngay từ trong các dụng cụ nuôi cấy bằng thuỷ tinh Chỉ trong những trường hợp đặc biệt mới cần bổ sung nguyên tố vi lượng vào môi trường nuôi cáy vi sinh vật

Vì nhiều nguyên tố vi lượng là kim loại nặng cho nên nếu dư thừa sẽ gây hại cho vi sinh vật Khi cần bổ sung thêm nguyên tô vi lượng vào môi trường cần lưu ý khống chế chính xác liều lượng

Nhân tố sinh trưởng

Nhân tố sinh trưởng (growth factor) là những hợp chất hữu cơ mà có những vi sinh vật cần thiết để sinh trưởng tuy với số lượng rất nhỏ và không tự tổng hợp đủ so với nhu cầu

Các vi sinh vật khác nhau có những yêu cầu không giống nhau về chủng loại và liều lượng của các nhân tố sinh trưởng Sau đây là một số ví dụ (bảng 13.10)

Bảng 13.10: Các nhân tố sinh trưởng cần thiết dối với một số loài vi sinh vật

Vi sinh vật tự dưỡng và một số vi sinh vật dị dưỡng (như Escherichia coli) thậm

chí có thể sinh trưởng mà không cần bất kỳ nhân tố sinh trưởng nào Mặt khác, cùng một loài vi sinh vật nhưng nhu cầu đối với nhân tố sinh trưởng cũng thay đổi tuỳ theo

điều kiện môi trường Ví dụ Mucor rouxii khi sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí thì cần

thiamin (B1) và biotin (H), nhưng trong điều kiện hiếu khí thì lại tự tổng hợp được các vitamin này Có trường hợp chưa giải thích được bản chất của nhu cầu về nhân tố sinh trưởng ở một số loài vi sinh vật Thông thường bổ sung vào môi trường các chất hữu cơ như cao nấm men, cao thịt, dịch đun động thực vật (nhộng, giá đỗ…) là có thể đáp ứng được nhu cầu về nhân tố sinh trưởng

Căn cứ vào sự khác nhau về cấu trúc hoá học và chức năng sinh lý của các nhân

tố sinh trưởng người ta chia nhân tố sinh trưởng thành các nhóm vitamin, aminoacid, purine và pyrimidine Vitamin là nhân tố sinh trưởng được tìm thấy bản chất hoá học sớm nhất Hiện nay người ta đã phát hiện được nhiều loại vitamin có tác dụng là nhân tố sinh trưởng Một số vi sinh vật có thể tự tổng hợp được vitamin, nhưng nhiều loại khác lại cần được cung cấp vitamin trong môi trường dinh dưỡng thì mới sinh trưởng được Vitamin chủ yếu là coenzyme hay cofactor của các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất Một số vi sinh vật không tự tổng hợp được những aminoacid nào đó, cần bổ sung vào môi trường các aminoacid đó hay bổ sung peptide chuỗi ngắn Chẳng hạn vi

khuẩn Leuconostoc mesenteroides cần tới 17 loại aminoacid mới sinh trưởng đươc Một

số vi khuẩn cần cung cấp D-alanin để tổng hợp thành tế bào Purine và pyrimidine chủ yếu được dùng làm coenzyme hay cofactor của các enzyme cần thiết cho quá trình tổng hợp nucleoside, nucleotide và acid nucleic

Bảng 13.11: Chức năng của một số vitamin thông thường đối với vi sinh vật

Vitamin Chức năng Ví dụ về các vi sinh vật cần cung cấp

Biotin (H)

-Carboxyl hóa (cố định CO2) -Trao đổi chất một carbon

Leuconostoc mesenteroides (B) Saccharomyces cerevisiae (F)Ochromonas malhamensis (A)Acanthammoeba castellanii

(P)

Vitamin

B12

Sắp xếp lại phân tử -Nhóm mang methyl trong trao đổi chất một carbon

Lactobacillus spp (B) Euglena gracilis

(A)Tảo silic và nhiều vi tảo khác

(A)Acanthammoeba castellanii (P)

Acid folic -Trao đổi chất một

carbon

Enterococcus faecalis (B) Tetrahymena pyriformis (P)

Acid lipoic -Chuyển nhóm acyl Lactobacillus casei (B) Tetrahymena spp.(P)