Đồ án tốt nghiêp trồng hoa phong lan

Cácnhà chơi Lan ở Đà Nẵng cũng đã nhân giống, trồng và giữ giống thì cũng làmtheo phương pháp nhân giống thông thường như chiết cành, tách, ghép,… Vìvậy, tôi cho rằng, để đáp ứng nhu cầu

LỜI MỞ ĐẦU

“Vua chơi lan, quan chơi trà” – câu nói từ xưa của ông cha ta đã ngầm cho biết nét đẹp thanh tao, cao quí của loài hoa lan Phong lan tượng trưng cho vẻ đẹp sang trọng, lịch lãm Với đa số chủng loại, màu sắc, dáng nét phong lan đã làm say lòng không biết bao người yêu hoa Không những thế hoa phong lan còn mang đến cho tâm hồn con người những phút giây êm đêm và bình yên trong cuộc sống.

Thú chơi hoa lan đã có từ lâu, trước kia chỉ có những gia đình khá giả, có điều kiện mới dám nghĩ đến việc thưởng thức một vài chậu lan quý ở trong nhà Ngày nay khi thú chơi lan đã trở nên đại chúng, giá hoa cũng chỉ bằng chậu kiểng bình thường nên nhu cầu về hoa lan rất lớn, mỗi năm lượng người chơi phong lan tăng nhiều hơn rõ rệt

Việt Nam là quê hương của trên 140 loại phong lan tuy nhiên việc sản xuất hoa phong lan của chúng ta còn chưa phát triển và chưa thể xuất khẩu Người chơi lan chủ yếu là lên rừng tìm hoa, hoặc nhân bản vô tính nhưng phương pháp nhân vô tính thông thường rất chậm và với thời gian cây lan sẽ thoái hóa do già sinh lý và nhiễm bệnh virus, với một số giống quả thực rất khó nhân và không có hiệu quả đối với sản xuất kinh doanh đặc biệt là xuất khẩu Người ta tính ra xác suất để mọc một cây lan con là 1/5.000, nghĩa là gieo 5.000 hạt mới có một hạt thành cây và nhiều năm mới nở hoa

Là một sinh viên công nghệ sinh học em muốn áp dụng những kiến thức

đã học của mình về nuôi cấy mô để sản xuất hoa phong lan, phương pháp này

cho cây con sạch bệnh, chất lượng đồng đều Chính vì vậy khu nhân giống và sản xuất hoa phong lan năng xuất 1 triệu cây giống/năm, 1 triệu cây lan ra hoa/năm được thiết kế với hy vọng có thể đáp ứng nhu cầu chơi lan ngày càng

tăng trong người dân và cả việc cung ứng cho các đối tác xuất khẩu, nhanh chóng hội nhập thị trường hoa thế giới.

Chương 1: LẬP LUẬN KINH TẾ KỸ THUẬT

1.1 Sự cần thiết đầu tư dự án

Thời gian gần đây, phong trào kinh doanh và chơi hoa lan phát triển mạnh,người chơi hoa lan ngày càng nhiều hơn Các thị trường tiêu thụ trong nước nhưThành phố Hồ Chí Minh, hay khu vực phía Bắc… đặc biệt là thị trường Đà Nẵnghiện nay khi mà nhu cầu sử dụng các loại lan từ cao cấp đến bình dân ngày càngtăng trong mọi tầng lớp nhân dân Nhưng lại chưa có một nguồn cung cấp vớiqui mô lớn, chỉ có 1 số trung tâm nhân giống và sản xuất hoa ở Đà Lạt, thànhphố Hồ Chí Minh… Riêng tại thành phố Đà Nẵng, hầu như chưa có cơ sở vườnnào chuyên sản xuất giống có quy mô Phần lớn các loại Lan từ cây con cho đếncác loại Lan cắt cành và các lẳng lan đã ra hoa được kinh doanh tại các nhàvườn, shop hoa,… đều được thu mua từ Đà Lạt và thành phố Hồ Chí Minh Cácnhà chơi Lan ở Đà Nẵng cũng đã nhân giống, trồng và giữ giống thì cũng làmtheo phương pháp nhân giống thông thường như chiết cành, tách, ghép,… Vìvậy, tôi cho rằng, để đáp ứng nhu cầu chơi hoa Lan ngày càng tăng cũng nhưphục vụ ngành du lịch phát triển ở Đà Nẵng, cần thiết phải đầu tư để công nghiệphóa ngành sản xuất hoa Lan, từ khâu nhân cây giống thông qua phương phápnuôi cấy mô tế bào, cho đến việc điều chỉnh các chế độ tối ưu chăm sóc cây pháttriển và ra hoa trong nhà lưới, nhằm cung cấp cho thị trường Đà Nẵng nguồn câygiống có chất lượng không kém hoa nhập ngoại cũng như những chậu hoa đẹp và

có thể tiến tiếp tới việc sản xuất kinh doanh hoa cắt cành Khi đã đạt đến giaiđoạn này, chúng ta có thể nghĩ đến việc mở rộng thị trường tiêu thụ ra ngoài ĐàNẵng và tiến tới xuất khẩu là điều có thể làm được

1.2 Vị trí xây dựng trung tâm và đặc điểm tự nhiên

Trung tâm được xây dựng tại xã Hòa Sơn, huyện Hòa Vang, thành phố ĐàNẵng Phía Bắc giáp tỉnh Thừa Thiên Huế, phía Nam và Tây Nam giáp tỉnhQuảng Nam, phía Đông giáp biển Đông Đây là khu vực nằm trên trục giaothông huyết mạch Bắc - Nam về cả đường bộ, đường sắt, đường biển và đường

hàng không, là cửa ngõ giao thông quan trọng của cả miền Trung và TâyNguyên Thành phố còn là điểm cuối trên hành lang kinh tế Đông - Tây đi quacác nước Myanma, Thái Lan, Lào.

- Nhiệt độ trung bình 25,90C ( cao nhất 300C, thấp nhất 180C)

- Mùa khô từ tháng 1 đến tháng 7, mùa mưa tư tháng 8 đến tháng 12

Đây là những yếu tố thuận lợi đối với nhóm phong lan chịu khí hậu nóng: đó lànhững loài có xuất xứ vùng nhiệt đới: Dendrobium, Phalaenopsis, Oncidium,Catteleya

1.3 Nguồn nguyên liệu

- Cây lan giống được nhập về từ các nơi có uy tín trong nước, hoặc nhập về

Ngoài ra để đảm bảo cho trung tâm hoạt động liên tục và chủ động, trung tâm lắpđặt thêm một máy phát dự phòng

bảo cho trung tâm hoạt động tốt.

- Đội ngũ cán bộ khoa học kỹ thuật và quản lý: trung tâm sẽ tiếp nhận các kỹ

sư của các trường Đại học trên toàn quốc, đây sẽ là lực lượng chịu tráchnhiệm toàn bộ công nghệ của trung tâm

1.7 Giao thông vận tải

Trung tâm được đặt tại Đà Nẵng là nơi có hệ thống giao thông thuận tiện

Về đường bộ và đường sắt thì Đà Nẵng nằm trên tuyến đường huyết mạch Nam Đường hàng không thì sân bay quốc tế Đà Nẵng là một trong những sânbay nhộn nhịp nhất thế giới và hiện là một trong ba sân bay quốc tế lớn nhất ViệtNam, sân bay này được tổ chức hàng không quốc tế xác định là điểm trungchuyển của đường bay Đông - Tây Đường hàng không Đà Nẵng có thể nối trựctiếp với Singapore, Bangkok, Đài Bắc… là một điều rất thuận lợi trong giao lưuquốc tế Đường biển thì cảng Đà Nẵng là thương cảng lớn nhất miền Trung hiệnnay cách cảng Hải Phòng 310 hải lý, cảng Sài Gòn 520 hải lý, cảng Đài Loan1.030 hải lý, cảng Thái Lan 1060 hải lý nên rất thuận tiện cho việc đi lại, vậnchuyển Với hệ thống giao thông như vậy nên rất thuận lợi trong việc sử dụngphương tiện ô tô, tàu hỏa và cả tàu thủy để thu mua nguyên liệu cũng như đưasản phẩm đi tiêu thụ khắp nơi

2.1 Giới thiệu về phong lan

Phong lan thuộc họ cây Bì sinh, không phải là cây ăn bám như tơ hồng,tầm gửi, nó là cây hoàn toàn tự dưỡng nhờ ánh sáng, không khí và hơi nước, rễbám vào cây khác và buôn thân cây gọi là phong lan

Đời sống của phong lan rất phong lưu, chỉ cần 1 phần rễ bám vào câykhác, treo lơ lửng trong không khí là có thể tồn tại được, rễ làm nhiệm vụ giữcho cây bám chắc và nhiệm vụ hút nước, chất dinh dưỡng từ thân cây giá thể, nócòn hút nước trong không khí Rễ khi phát triển mạnh bao phủ một lớp mô xếpthành bụi để dự trữ nước, có trường hợp phần dưới phình ra là để tập trung mùnrác, chứa chất dự trữ và chất dinh dưỡng, ngoài ra rễ còn tự quang hợp được.Hầu hết các loài lan đều có diệp lục để tự quang hợp

Lá lan dày, xanh bóng, chứa nhiều nước, xếp xít nhau Lá lan mọc cách ítkhi mọc đối, hoặc tồn tại lâu năm mà không ra lá hoặc chỉ 1 lá, có loại rụng lámùa Đông

Hoa phong Lan gồm các phần sau đây:

- Cánh đài hoa bên ngoài có kích thước

như nhau và màu sắc giống nhau

- Ba cánh bên trong là ba cánh hoa nằm

xen kẽ với ba cánh đài bên ngoài Có điều

hai cánh bên có kích thước lẫn hình dạng

giống nhau và có cùng màu sắc, cánh hoa

thứ ba còn lại có hình dạng và màu sắc

nổi bật hơn, quyến rũ hơn hai cánh bên

nên được đặt tên riêng là “cánh môi”

- Ở giữa hoa là phần trụ hoa, đây là

Hình 2.1 Cấu tạo hoa phong lan

cơ quan sinh dục của hoa lan, gồm có nhị đực và nhị cái (noãn)

Sự thụ phấn của hoa lan cũng giống như sự thụ phấn của hoa nhiều giống câytrái khác, cũng nhờ vào các loại côn trùng như ong, bướm

Từ ngày noãn được thụ phấn cho đến ngày trái chín, tùy theo từng loài,nhanh nhất là vài tháng, và chậm nhất là cả năm

Trong thiên nhiên các hạt lan sẽ nảy mầm vào mùa mưa, khi môi trường

xung quanh ẩm ướt, hạt lan nảy mầm nhờ một loại nấm ký sinh nhiễm vào trongcác hạt đó, đó là nấm Rhizoctonia Các loài nấm này có thể là:

- Rhizoctonia mucoroides: giúp nảy mầm hạt lan Vanda, Phalaenopsis

- Rhizoctonia repens: giúp nảy mầm hạt lan Cattleya, Laelia,Paphiopedilum

- Rhizoctonia lanugiosa: giúp nảy mầm hạt lan Oncidium, Miltonia,Odontoglosuum

Các loại nấm trên lần đâu tiên được ông Bernard Noel khám phá ra vàonăm 1910

Ngày nay tất cả các công việc trên đều do con người đảm nhận để có thểthụ phấn được theo ý muốn Công việc này được thực hiện một cách đơn giản vànhanh chóng, chỉ cần dùng 1 que gỗ vót nhọn, cậy bỏ nắp cột nhụy, thì khối phấn

sẽ bám dính lấy đầu chiếc que; sau đấy chúng ta sẽ đưa toàn bộ khối phấn dínhvào que đó đặt trên đầu nhụy ở ngay phía dưới phần của hốc phấn

Trong số các loại lan được ưa chuộng hiện nay thì lan Hồ Điệp là mộttrong những giống lan rất được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng màcòn mang một nét đẹp rất sang trọng và trang nhã Chính vì vậy, nó đã nhanhchóng trở thành sản phẩm trồng trọt mang lại hiệu quả kinh tế không chỉ ở ViệtNam mà còn ở nhiều nước trên thế giới như Đài Loan, Nhật Bản, Hà Lan, Mỹ…

Do đó trung tâm sẽ tập trung nhân giống và sản xuất lan Hồ điệp trong giai đoạnđầu

2.1.1 Tên khoa học và phân loại của lan Hồ điệp

Lan Hồ Điệp có tên khoa học là Phalaenopsis amabils, thuộc họ phụ Vandoideae Toong Vandeae, là loài lan có hoa lớn, đẹp, bền.

Giống Phalaenopsis gồm 21 loài lan phát sinh, ưa nóng có ở bán đảo Mã Lai,Indonexia, Philipin, các tỉnh phía Đông Ấn Độ và châu Úc

Lan Hồ Điệp được khám phá vào năm 1750, đầu tiên được ông Rumphiusxác định dưới tên là Angraecum album Đến năm 1753, Linné đổi lại làEpidendrum amabile và 1825, Blume, một nhà thực vật học Hà Lan định danhmột lần nữa là Phalaenopsis amabils Bl., và tên đó được dùng đến ngày nay.Tên gọi Phalaenopsis bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp trong đó Phalaina có nghĩa

là “con bướm” và Opsis có nghĩa “giống như”

Phalaenopsis có nguồn gốc ở Đông Nam Á và Châu Úc, mọc ở độ cao 400m, khí hậu ẩm, nhiệt độ từ 25-350C

Trên thế giới lan Hồ điệp có trên 70 loài và này càng lai tạo ra rất nhiều.Ở

Việt Nam có khoảng 5-6 loài Lan Hồ điệp thuần, bao gồm Phalaenopsis gibbosa Sweer, Phalaenopsis lobbii (Rchob.f), Phalaenopsis fuscata Rchob.f… Hầu hết

đều có hoa nhỏ nhưng màu sắc sặc sỡ và hương thơm độc đáo

2.1.2 Một vài đặc điểm của lan Hồ điệp

Lan Hồ điệp gồm các loài có hoa lớn đẹp, cuống ngắn gom lại thành nhữngchùm lỏng lẻo: đơn hay phân nhánh Lá dài và cánh hoa phẳng, trải rộng, thườngthì lá đài giống và gần bằng cánh hoa Môi liên tục, có góc trục kéo dài, vì mangmột điểm nhú nhỏ ở gốc, phiến bên trải rộng hay hướng lên trên một ít, phiếngiữa trải ra nguyên vẹn hay có hai phiến dài, hẹp và có dĩa, những bộ phận phụ

có dạng thay đổi: trụ bán nguyệt dày ở bên trên, thẳng hay hơi cong

Lan Hồ điệp có màu sắc phong phú không thua kém bất cứ giống lan nào từtrắng, hồng, đỏ, vàng, tím cho đến các loại Hồ điệp có sọc ngang hay sọc đứng,hoặc có đốm to hay nhỏ…

Những loài cây này luôn bám chặt vào những cái cây ở trong rừng sâu hoặcbám vào đá Chúng có những cái lá to, rộng mọng nước và cuống hoa uốn congmang nhiều hoa Thường một cây có 5 đến 10 lá và nhiều rễ màu trắng Một sốloài cuống hoa mang những hoa tròn to Những loài có cuống hoa ngắn và hoa

có màu sặc sỡ gồm màu trắng, hồng, vàng, hoặc cánh hoa có sự pha trộn các sọc,viền hay đốm Ngoài những loài này, một số lớn giống lai có khả năng thích nghi

trong điều kiện nhân tạo hơn so với môi trường tự nhiên Một yếu tố quan trọngcủa lan hồ điệp là trong điều kiện nhân tạo thời gian hoa tàn là 3 tháng Một sốloài khác và giống lai thì thời gian hoa tàn có thể kéo dài hơn Một số giống cóthể ra hoa quanh năm Mùa lan bắt đầu nở hoa từ tháng 12 đến cuối tháng 5 Lan hồ điệp có nhiều hình dáng và kích cỡ Có thể đặt nó vào chậu riêng hoặc

bỏ chung vào một chậu Những cái chậu thông thường chứa được nhiều cây vàcây có thể ra hoa trong vòng hai năm, nếu chúng được chăm sóc hợp lý

Các cây con có sẵn trong phòng thí nghiệm sẽ được đưa ra ngoài và kíchthước của cây phụ thuộc vào độ lớn của lá, mà độ rộng của lá được đo từ đỉnh láđến điểm đối diện Thông thường, một cây có chiều dài lá khoảng 20cm hoặclớn hơn được xác định khi cây có hoa đầu tiên nở, tuy nhiên một số loài chiềudài lá chỉ đạt 10cm khi hoa vừa mới nở

 Yêu cầu về ánh sáng và nhiệt độ

Lan hồ điệp cần ánh sáng để phát triển tốt Trong nhà, lan hồ điệp ưa thíchmột vị trí gần cửa sổ có ánh sáng nhưng ánh sáng mặt trời trực tiếp thì khôngnên, đặc biệt hướng mặt trời chiếu vào lúc sáng sớm hoặc chiều muộn là lýtưởng Có thể cho đèn chiếu sáng nhân tạo Các đèn chiếu sáng nên đặt ở phíatrên của cây và nên chiếu ít nhất 12 đến 16 giờ hàng ngày Trường hợp ở trongnhà kính, bạn nên che bằng tấm vải nhất là trong mùa hè

Loài lan này cần nhiệt độ ban ngày là 18-290C và nhiệt độ ban đêm là

13-180C Trong suốt mùa thu, nhiệt độ nên duy trì dưới 160C liên tục trong 3 tuầnkhi cụm hoa bắt đầu xuất hiện Thông thường sự thay đổi bất thường về nhiệt độ

và độ ẩm có thể là nguyên nhân làm rụng nụ

 Ẩm độ và nước tưới

Lan hồ điệp cần 50-80% độ ẩm Nếu độ ẩm thấp hơn có thể dùng màn che,nhưng thỉnh thoảng việc làm này có thể gây ra nấm bệnh Một biện pháp đềphòng khác là giữ cây ở trong một cái bát có chứa sỏi hay đá cuội và nước Phảiđảm bảo cây phải ở trên sỏi, đá cuội và không chạm vào nước Việc tưới nướccho những cây này là quan trọng và nên thực hiện một cách cẩn thận Vào mùa

hè, nên tưới nước cho cây khoảng 2-3 ngày một lần, ngược lại vào mùa đông,

khô cho tới tối Nước dính lại có thể dẫn đến sự thối lá Vì thế, cách tốt nhất làtưới nước cho cây phù hợp với từng mùa, đồng thời cũng xem xét nhu cầu nước

và giá thể sử dụng (giá thể thường được sử dụng là vỏ cây, đá trân châu, vỏ câydương xỉ, than củi)

 Phân bón và thuốc trừ sâu

Phân bón nên được sử dụng thường xuyên hơn vào mùa hè, khi cây đangtrong giai đoạn tăng trưởng Trong mùa đông, cây sẽ sử dụng ít hơn Luôn tướinước cho cây đầy đủ trước khi bón phân Loại phân bón với công thức ổn địnhnhư là NPK 14-14-14 là tốt nhất cho cây Cây đang ra hoa sử dụng công thức cóhàm lượng photpho cao hơn NPK (10-30-20) Suốt những tháng mùa đông bạn

có thể giảm lượng phân bón xuống và bón cho cây một lần trong một tháng

Rất có lợi khi lặp lại việc bón phân cho cây trong suốt thời gian cây nở hoa.Lan hồ điệp đôi lúc cũng thu hút sâu hại giống như sâu đục nụ, nhện, rệp, ốc sên.Khi những con sâu hại bám vào lá sẽ được loại bỏ bằng nước xà phòng sau đórửa sạch lại bằng một miếng vải mềm Thậm chí bạn có thể sử dụng thuốc trừsâu thương mại

 Kích thích ra hoa

Hoa lan hồ điệp tàn sau khi nở 3 tháng Sau khi hoa tàn, có thể điều khiển chocây ra hoa lại bằng cách cắt bỏ toàn bộ cuống hoa Thỉnh thoảng việc làm nàycũng có thể cho một cụm hoa mới, mà nó có thể xuất hiện trong vòng 9 tháng.Phương pháp này rất tốt nếu cuống hoa già và có màu nâu Nhưng, nếu cuốnghoa còn màu xanh thì cắt một đốt trên cuống hoa Đoạn cành cắt bỏ dài khoảng10-12cm Điều này có thể giúp hình thành một cành mới trong vòng 2-3 tuần

 Thay chậu

Lan hồ điệp có thời gian sống rất dài nên cần phải biết thời gian làm như thếnào để thay chậu cho cây Có hai lý do mà cây cần được thay chậu, hoặc là câykhông sinh trưởng được trong chậu đang trồng hoặc giá thể bị phân hủy vàkhông đủ không khí để duy trì cho rễ phát triển tốt

Việc thay chậu có thể thực hiện một lần trong một năm hoặc hai năm Mùathích hợp nhất để thay chậu là mùa xuân

Rễ cây phát triển lan ra sẽ phủ lên chậu và giá thể ở trong chậu làm bịt kín cáckhe hở giữa các rễ, không có khoảng trống giữa giá thể và rễ cây Điểm bắt đầucủa thân cây nên được giữ một đoạn ngắn ở dưới giá thể Sau khi thay chậu nêngiữ cây trong bóng mát và tưới nước sau 3 ngày.

2.1.3 Nhu cầu về giá trị kinh tế của lan Hồ điệp

Lan Hồ điệp là loại hoa cao cấp có giá trị thẩm mỹ và giá trị kinh tế cao, sảnphẩm có sức tiêu thụ lớn và bán rất được giá, mang lại nguồn lợi kinh tế khá lớncho người trồng hoa Nhưng những năm trước đây, loài hoa quý này vẫn chưađáp ứng đủ nhu cầu của thị trường Việt Nam nói chung, của Quảng Ninh nóiriêng Theo kết quả điều tra của Viện Nghiên cứu Rau quả giai đoạn từ 2005 trởlại đây, chỉ tính riêng miền Bắc mỗi năm đã tiêu thụ vào khoảng 70-80 vạn câylan Hồ điệp vào dịp Tết Riêng tại TP Hồ Chí Minh mỗi năm tiêu thụ khoảngmột triệu cây hoa Tuy nhiên, nguồn cung chủ yếu vẫn phải nhập về từ TrungQuốc, Đài Loan vì sản xuất trong nước hầu như chưa đáp ứng được do quy môsản xuất còn nhỏ lẻ, chủng loại sản phẩm đơn điệu, không có giống mới

Do đó trung tâm nhân giống và sản xuất hoa phong lan được thành lập là điềucần thiết

2.2 Công nghệ sản xuất thực vật bằng nuôi cấy mô

2.2.1 Lịch sử và thành tựu đạt được trong nhân giống invitro ở thực vật

Năm 1964 Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ nuôi cấy chồi ngọn Ông đã thành công trong việc chuyển cây con của cây sen cạn và cây White Lupin từ môi trường nuôi cấy tối thiểu, tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hoàn chỉnh

Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự nảy chồi

Năm 1960-1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương mại hoá

Năm 1981: Takayama và Misawa đã thành công trong tự động hóa vi nhân giống bằng các hệ thống bioreactor Đến nay nghành nuôi cấy mô đã khẳng định vai trò của mình bằng một kho tàng đồ sộ các công trình nghiên cứu về thực vật in vitro

Đầu thế kỉ 21, hàng loạt các công ty về vi nhân giống cây trồng thươngmại với quy mô lớn lần lượt ra đời trên khắp thế giới con số lên đến 600 công ty.Như vậy, kỹ thuật nuôi cấy mô đã thực sự mở ra một cuộc cách mạng trong nhângiống thực vật

2.2.1.2 Ở Việt Nam

Từ những năm 1960 công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được dunhập vào nước ta bắt đầu tại miền Nam

Đến đầu những năm 1970 thì đã có tại miền Bắc

Hiện nay, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vậtđược phát triển mạnh: dung hợp cây lai tế bào chất và chuyển gen, nuôi cấy baophấn để tạo dòng thuần, nuôi cấy các cây dược liệu quý để bảo tồn nguồn gene

và tạo các dòng tế bào có hàm lượng các chất sinh học

Tuy nhiên chỉ từ cuối những năm 1980 trở lại đây công nghệ nuôi cấy mô

tế bào mới phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng, nhiều phòng thí nghiệm, nghiêncứu đã được xây dựng và triển khai ở hầu hết khắp các tỉnh thành trong cả nướcnhư: Hà Nội, thành phố Hồ Chí Minh, Đà Nẵng, Bình Định,… Lĩnh vực áp dụng

rộng rãi của công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là: bảo quản nguồn gene câytrồng, sự nhân giống vô tính trên quy mô lớn, tạo hạt nhân tạo, sản xuất câygiống sạch bên.

Nhu cầu cây giống trồng rừng nhân giống bằng phương pháp vô tính nhưcây: xoan ta, chò chỉ, cáng lò, dó bầu… đang ngày càng phát triển, đòi hỏi phảiđầu tư nghiên cứu xây dựng các quy trình công nghệ nhân giống bằng nuôi cấy

mô Bên cạnh đó, phong trào trồng các loại hoa mang tính hàng hóa như: phonglan, đồng tiền, cúc… đang ngày càng phát triển cũng đòi hỏi nguồn cây giống vôtính lớn, đồng nhất mà chỉ có thể sản xuất bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bàomới đáp ứng được

2.2.2 Phương pháp nhân giống vô tính invitro ở thực vật

2.2.2.1 Nhân giống vô tính invitro ở thực vật

 Định nghĩa

Nuôi cấy mô tế bào thực vật (nuôi cấy in vitro) là phạm trù khái niệm để chỉ chung cho tất cả các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo trong điều kiện vô trùng

Nhân giống in vitro là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh từ các bộ phận, cơ quan như chồi, mắt ngủ, vảy củ, đoạn thân, lá…của cây mẹ ban đầu thông qua kĩ thuật nuôi cấy in vitro

Ưu điểm

- Hệ số nhân giống nhanh

- Cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền

- Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường)

- Chủ động kế hoạch sản xuất

- Tạo được cây sạch virus

- Các cây sau nhân in vitro có xu hướng được trẻ hóa nên nâng cao hiệu quả nhân bằng các phương pháp thông thường sau đó

 Hạn chế của nhân giống vô tính in vitro

- Chi phí cao so với các phương pháp nhân giống vô tính khác nên giá thành không cạnh tranh

- Không phải bất cứ loại cây nào cũng có thể vi nhân giống

- Một số loài cây trồng rất dễ bị biến dị khi nhân giống in vitro: cây con nuôi cấy mô có thể sai khác với cây mẹ ban đầu do hiện tượng biến dị

tế bào soma Kết quả là cây con không giữ được đặc tính quý của cây

mẹ Tỷ lệ biến dị thường thấp ở giai đoạn đầu nhân giống nhưng có chiều hướng tăng lên khi nuôi cấy kéo dài và làm tăng hàm lượng các chất kích thích sinh trưởng

Phòng thí nghiệm đòi hỏi trang thiết bị, hóa chất với chi phí cao

 Ứng dụng của phương pháp nhân giống vô tính in vitro

- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gene quý hiếm làm vật liệu cho côngtác lai tạo giống

- Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạtgiống rau, cây hoa và các cây trồng khác

- Nhân nhanh các loại cây trồng khó nhân giống bằng các phương phápthông thường khác

- Tạo cây sạch bệnh, phục hồi các giống nhiễm vius và bảo quản nguồngene trong ngân hàng gene

Bằng phương pháp nhân giống vô tính in vitro người ta có thể nhân giống vô

tính cây trồng ở quy mô công nghiệp với hệ số nhân giống cao, không lệthuộc vào mùa vụ đảm bảo phát triển cây mới suốt năm Hơn thế các câygiống được sản xuất ra hoàn toàn sạch bệnh và đồng nhất về mặt di truyền.Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác giống

2.2.2.2 Các phương pháp nhân giống in vitro ở thực vật

 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng bao gồm nuôi cấy chóp đỉnh và chồi bên Sau khi

vô trùng mẫu, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp Môi trường thíchhợp sẽ thay đổi theo từng loại cây trồng được đưa vào nuôi cấy nhưng phải đảmbảo chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng, khoáng vô cơ, hữu cơ và được bổ sungchất kích thích sinh trưởng thích hợp

Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian nuôi cấy nhất định sẽ phát triểnthành một hay nhiều chồi Sau đó, chồi sẽ tiếp tục vươn thấn, ra lá, ra rễ và trởthành một cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển ra đất có điều kiện phát triểnbình thường Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thứcnhân giống thông thường.

Dùng để tạo ra dòng cây sạch bệnh, hoàn toàn không có vius với hệ số nhângiống cao Tuy nhiên, phương pháp này chỉ có thể thực hiện ở một số loài thựcvật nhất định

Các phương thức phát triển cây hoàn chỉnh từ đỉnh sinh trưởng nuôi cấy nhưsau:

- Phát triển cây trực tiếp: chủ yếu ở các đối tượng hai lá mầm(dicotyledon) như khoai tây, thuốc lá, cam chanh, hoa cúc…

- Phát triển cây thông qua giai đoạn protocorm: chủ yếu gặp ở đối tượngmột lá mầm (monocotyledon) như: phong lan, dứa huệ… Cùng một lúcđỉnh sinh trưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm này có thểtiếp tục phân chia thành các protocorm hoặc phát triển thành cây hoànchỉnh

 Nuôi cấy mô sẹo

Trong điều kiện sự cân bằng các chất kích thích sinh trưởng trong thực vậtthay đổi, cụ thể trong tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra nuôi cấyriêng rẽ trên môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành

Mô sẹo là khối tế bào phát triển vô tổ chức, có màu trắng Khối mô sẹo cókhả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chấtkích thích sinh trưởng tạo mô sẹo

Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với các loài thực vật không có khả năngnhân giống thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống cây mẹ và từ một cụm tế bào mô sẹo

có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhưngphương pháp này tạo ra mức độ biến dị tế bào lại cao hơn

 Gieo hạt lan nảy mầm trong điều kiện in vitro rồi tái sinh thành cây

hoàn chỉnh

Thường sau khi thụ tinh, một cây lan cần thời gian từ 6 tháng đến 1 năm đểquả chín Sau đó hạt lan tung ra và phát tán nhờ gió Tuy nhiên hạt lan rất khónẩy mầm trong tự nhiên ( chỉ nẩy mầm từ 1-2%) do hạt lan không có chứaanbumin và một phôi chưa phân hóa, có kích thước rất nhỏ nên không chứa chất

dự trữ Vì vậy trong tự nhiên để hạt lan nẩy mầm nó cần cộng sinh với nấm Có 3loại nấm cộng sinh trên nhiều giống lan khác nhau được biết:

Rhizoctonia mucoroides: giúp nảy mầm hạt lan Vanda, Phalaenopsis.Rhizoctonia repens: giúp nảy mầm hạt lan Cattleya, Laelia,Paphiopedilum

Rhizoctonia lanugiosa: giúp nảy mầm hạt lan Oncidium, Miltonia,Odontoglosuum

Nấm sẽ cung cấp đường để nuôi cây, phân giải các chất hữu cơ khó hấpthu Bù lại cây sẽ cung cấp nước cho nấm, chỗ ở, các chất khoáng mà nó thuđược từ sương

Dựa trên nguyên tắc này, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô đã tạo nênmôi trường gieo hạt lan trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo có khoáng, đường

và hạt lan nầy mầm với tỷ lệ rất cao Hiện nay, phương pháp nuôi cấy mô làphương pháp duy nhất có thể nhân giống lan trên quy mô công nghiệp

Trái lan khi hái phải đủ già và chưa bị nứt đem khử trừng Môi trường cấychuyền là môi trường gieo hạt nhưng bổ sung thêm 10% nước dừa choprotocorm phát triển nhanh

Khi chồi đã lớn chuyển sang môi trường như môi trường cơ bản, saukhoảng 6-7 tháng tùy giống khi cây cao từ 4-5cm, ra rễ và có từ 4-5 lá là có thểmang ra ngoài trồng.

2.3 Mô hình nhân giống lan Hồ điệp in vitro

2.3.1 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời trong nhân giống lan Hồ điệp lai- Phalaenopsis hydrid

Ngay từ khi công nghệ nhân giống cây in vitro ra đời người ta tiến hànhnuôi cấy mẫu trên môi trường thạch Nhưng khi ứng dụng của hệ thống vi nhângiống thông thường trên môi trường thạch vào quy mô công nghiệp thì gặp phảinhững khó khăn lớn về tỉ lệ nhiễm bệnh, tồn nhiều chi phí nhân công, hiệu quả

sử dụng môi trường không cao, hệ số nhân giống còn thấp dẫn đến giá thành còncao Để khắc phục các nhược điểm trên người ta đã tiến hành vi nhân giống câytrên môi trường lỏng trong các thiết bị bioreactor Phương pháp nhân giống trênmôi trường lỏng tuy khắc phục được các nhược điểm khi nhân giống trên môitrường thạch, cho hệ số nhân giống cao và có thể tiến hành nhân giống với một

số lượng lớn nhưng các mẫu cấy khi nuôi trong môi trường lỏng ngập chìm trongnước quá lâu dẫn đến bị trương nước và bị hiện tượng thủy tinh thể, mẫu còn bịnhững tổn thương do quá trình lắc, và trong quá trình nuôi phải sục khí vào môitrường

lỏng để tránh hiện tượng mẫu bị thiếu oxi do ngập liên tục trong môi trườnglỏng

Để khắc phục nhược điểm của cả hai phương pháp trên người ta đã cho rađời hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời - Temporary Immersion System (TIS).Giống như tên của hệ thống, hệ thống này là bước cải tiến từ việc nuôi cấy mẫutrên môi trường lỏng nhưng ở hệ thống này mẫu chỉ được ngập trong môi trườnglỏng một thời gian nhất định rồi cứ theo một chu kỳ chúng lại tiếp tục được chongập một khoảng thời gian

Sau đây là ba hệ thống khác nhau đã được phát triển và bán rộng rãi trênthị trường, đó là hệ thống RITA, thứ hai là hệ thống bình đôi BIT, và hệ thống

2.3.1.1 Hệ thống RITA

Hình 2.2 Hệ thống RITA

Pha 1: mô không ngập trong môi trường, Pha 2: hiện tượng ngập được

hoạt hóa, các van mở ra cho khí đi qua các màng lọc đẩy môi trường lỏng lên

ngập mô cấy, Pha 3: sự trao đổi khí trong hệ thống RITA, Pha 4: chu kỳ kết

thúc, các van đóng lại và môi trường lỏng rút xuống ngăn bên dưới

Hệ thống RITA (Hình 1) là công trình của Teisson và Alvard vào năm

1995 Một bình chứa 1 L gồm có hai phần, phần trên chứa mẫu cấy và phần dướichứa môi trường Một áp suất vượt mức tác động vào môi trường lỏng chứatrong phần dưới và đẩy chúng dâng lên ngăn chứa mẫu cấy Mẫu cấy được ngậpchìm trong môi trường lỏng lâu hay mau tùy theo thời gian áp suất vượt mứcđược duy trì Trong suốt thời gian ngập, không khí được sục vào trong môitrường lỏng, môi trường được chuyển động làm cho mẫu cấy xoay trở được cácmặt tiếp xúc với bề mặt môi trường, áp suất vượt mức sau đó được thoát ra bênngoài nhờ một ngõ ra phía trên đầu hệ thống

2.3.1.2 Hệ thống bình sinh đôi BIT ®

Hệ thống bình sinh đôi BIT (Hình 2) được thiết kế bởi Escalona và cộng sự(1998) được dự định nhân giống số lượng lớn qua con đường phát sinh phôisoma Ðối với nhân giống theo con đường phát sinh cơ quan kích thước mẫu cấyđòi hỏi một hệ thống có thể tích lớn hơn và rẻ hơn Con đường dễ dàng nhất đểđạt được trạng thái ngập chìm tạm thời theo chu kỳ nhất định là nối hai bình thủytinh hay plastic có kích thước từ 250 mL - 10 L bằng một hệ thống ống dẫn, vàđiều khiển tạo ra áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu vàngược lại Hệ thống BIT® được thiết kế đáp ứng với những yêu cầu trên

Hình 2.3 Hệ thống bình sinh đôi BIT

2.3.1.3 Hệ thống Plantima ®

Hệ thống này được thiết kế tổng thể tương tự như hệ thống RITA tuy nhiên

có thay đổi và cải tiến một số chi tiết như hệ thống bơm và vị trí các màng lọc

Hệ thống này được sản xuất và cung cấp bởi Công ty A-tech Bioscientific tại đảoÐài Loan Cấu tạo và phương pháp vận hành cơ bản (Hình 3, Hình 4):

Hình 2.4 Các thành phần của Hình 2.5 Hệ thống Plantima với hệ thống

hệ thống Plantima điều khiển chu kỳ ngập

2.3.2 Trồng lan bằng phương pháp thủy canh

Theo cách truyền thống, lan thường được trồng trên những cơ chất hữu cơhoặc trên than và được phun với 2 loại phân bón, một loại để thúc đẩy sự tăngtrưởng sinh dưỡng, và một loại phân khác để cảm ứng sự ra hoa Cách phun taycho lan thường tẻ nhạt, tốn nhiều thời gian và chất dinh dưỡng dư thừa dễ gây ratảo Mặc dù có những bất tiện như vậy, nhưng những người trồng lan thườngkhông sẵn sàng chuyển sang sử dụng công nghệ thủy canh để sản xuất hoa cắtcành thương mại vì hầu hết các loại lan biểu sinh có giá trị về kinh tế thường dễ

hệ thống khí canh (Aeroponic system), công nghệ màng dinh dưỡng ( Nutrientfilm technique), và hệ thống ngập và rút (ebb and flow system).

Để giải quyết những vấn đề quan tâm này Trường Cao đẳng Temasek đãsáng chế ra một hệ thống trồng lan theo phương pháp thủy canh có điều chỉnhchính xác dòng dung dịch đi vào [Precise Influx Hydroponic Growth System(PIHGS) ] Hệ thống này sử dụng máy tự động để phân phát một lượng chínhxác dung dịch dinh dưỡng vào vùng rễ của lan mà không làm cho giá thể quá ẩmướt

Cách này đã khắc phục được một cách có hiệu quả vấn đề thối rễ mà cácnhà nuôi trồng lan bằng phương pháp thủy canh đang phải đối mặt Công trìnhhợp tác nghiên cứu 3 năm giữa trường Cao đẳng Temasek và cơ quan Agri-FoodVeterinary Authority của Singapore (AVA) đã chứng minh hệ thống PIHGS khikết hợp với một công thức dinh dưỡng thủy canh do trường Cao đẳng Temaseknghiên cứu đã tạo ra một công nghệ mang lại lợi nhuận cao cho việc sản xuấthoa lan cắt cành bằng phương pháp thủy canh

Hệ thống mới này có các công dụng sau:

- Cho phép trồng nhiều cây lan trên một đơn vị diện tích;

- Loại trừ công việc phun phân bằng tay tẻ nhạt và vấn đề tảo phát sinh;

- Bỏ bớt việc phải thay chậu định kỳ cho những cây đã lớn, và giảm lượngphân bón sử dụng;

- Làm tăng đáng kể chất lượng và số lượng của hoa cắt cành khi so sánh vớicác phương pháp trồng truyền thống

Nghiên cứu này xác nhận một lần nữa tính chất đa dụng của công nghệ thủycanh trong việc sản xuất thương mại hoa cắt cành ngay cả đối với những cây dễ

bị thối rễ như lan Công nghệ nuôi trồng lan theo phương pháp thủy canh mớinày đã được cấp giấy phép cho một người trồng lan và và một công ty công nghệsinh học để trồng thí nghiệm quy mô nhỏ

2.4 Mô hình vườn ươm lan Hồ điệp

2.4.1 Nhà kính

Nhà kính là một khu vực sản xuất bậc cao của vườn ươm với kết cấu sau:

- Khung giàn làm bằng sắt để chống gió

- Lắp các khung bằng những tấm kính trong suốt hoặc nhựa polyethylene

- Có 1-2 cửa ra vào và có cửa sổ bằng kích thước cửa nhà bếp

- Nhựa bọc nhà kính là polyethylene từ 3-5 lớp, có phủ lưới màu đen hoặcxanh đen

- Hệ thống tưới phun, xịt những giọt nước đồng dạng và được lắp đặt ở cuốiđiểm nhà kính, có máng xối thoát nước, cửa trời đường kính 1,3m chínhgiữa mỗi nhịp tại điểm cao nhất của kết cấu nhà kính

- Vị trí nhà kính nên chọn nơi quang đãng, có ánh sáng, có hệ thống thoátnước, những nhà kính lâu dài phải có nguồn nước ngầm thấp và đảm bảo độsạch sẽ, làm bằng gạch sẽ bền hơn Các thiết bị như thiết bị phun tướ, thiết

bị tăng nhiệt, thiết bị giữ ẩm, thiết bị che bóng, các giá hoa và giàn treo

- Nhà kính vi tính hóa ( phần mềm và phần cứng máy tính cho phép kiểmsoát tự động nước phân phối và khí hậu trong nhà kính).

Nhà kính có những đặc điểm nỗi bậc như:

- Điều tiết nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, tạo ra một khu vực có khí hậu nhân tạophù hợp với loại cây đang trồng trong nhà kính hiện tại Hạn chế rửa trôiđất

- Phòng chống sâu bệnh, ngăn chặn vi sinh vật có hại xâm nhập để cây trồngphát triển và tăng năng suất chất lượng

- Quay vòng sử dụng nhanh, cho phép tối ưu sử dụng phân bón và phân phối

số lượng trong suốt mùa vụ gieo trồng

- Kiểm tra thông số sản xuất bao gốm khí hậu, phân bón, bệnh và côn trùngNhược điểm:

- Các thiết bị tự động hầu hết nhập ở nước ngoài về, trong nước không tự sảnxuất được Đòi hỏi vốn đầu tư và xây dựng cao Chi phí bảo hành các thiết

ô 1x1 mm Nhà lưới có thể lắp đặt hệ thống phun tưới, làm mát nhưng còn thủcông hơn so với nhà kính

Hiện nay có các kiểu nhà lưới phổ biến trong sản xuất như:

- Khung nhà làm bằng cột bê tông hoặc khung sắt hàn hoặc bắt ốc vit.

- Chiều cao h=2-3m, diện tích S=500-1000m2

- Lưới che bằng vải mùng màu trắng hoặc xanh lá cây

Loại nhà lưới hở

- Được che chủ yếu trên mái và 1 phần bao xung quanh

- Mái bằng và mái nghiêng 2 bên

- Khung nhà làm bằng cột bê tông hoặc khung sắt hàn hoặc bắt ốc vit

- Chiều cao h=2-2.5m, diện tích S=500-1000m2

- Mái lợp bằng lưới hoặc nylon màng nẹp bằng dây điện, mái trên mái dướicách nhau một khe hở 25-30 cm (có tác dụng đối lưu)

Mặc dù nhà lưới có vốn đầu tư ít, dễ làm trong quy mô hộ gia đình nhưng nócũng có nhược điểm cơ bản về vật liệu như độ bền không cao, thời gian sử dụngngắn, thời gian sử dụng tốt nhất là khoảng từ 6-8 tháng sau đó lưới bị rách và hưhỏng Những vấn đề mà nhà lưới cũng chưa giải quyết được như:

- Quy trình kỹ thuật canh tác cây trồng trong nhà lưới chưa được nghiên cứumột cách khoa học mà chủ yếu áp dụng từ quy trình canh tác ngoài đồngruộng Vấn đề sâu bệnh phát sinh trong nhà lưới do canh tác liên tục

- Chưa giải quyết được bài toán ảnh hưởng của gió, nhiệt độ cao trong nhàlưới Chưa đảm bảo độ kín gió do đó dễ dàng bị các loại sâu hại có kíchthước nhỏ xâm nhập

- Quy mô, diện tích nhà lưới chưa được xác định bao nhiêu là tối ưu phù hợp

số lượng xác định, khả năng cớ giới hóa, hiệu quả kinh tế

2.4.3 Mô hình vườn ươm kết hợp

Cũng như trên thế giới, ở Việt Nam hiện nay có những mô hình kết hợp giữanhà lưới và nhà kính tạo ra một quy mô vườn ươm khá hoàn chỉnh, vừa tiết kiệmchi phí mà vẫn thu được năng suất chất lượng cao Để áp dụng cho mô hình sảnxuất thu hiệu quả kinh tế cao thì vườn ươm chịa làm các khu nhà nhỏ như: khuhuấn luyện cây mô, khu chăm sóc cây con, khu chăm sóc cây trưởng thành, khuchuẩn bị đất, phân bón, giá thể và để các nguyên vật liệu khác… Các khu nhànhỏ này có chức năng riêng biệt ứng với tên gọi Chúng được phân cắt bằng cácluống đất hoặc các tấm lưới che bằng tre hoặc lưới sắt có mắt nhỏ Các lối đi

Lấy mẫu (phát hoa)

Môi trường nuôi cấy

Xử lý mẫu

Tạo cây con in vitro

thông nhau trong các nhà nhỏ này khoảng 1-1,5m Bên cạnh đó, các giàn lướiphun, các hệ thống giữ ẩm, hệ thống làm mát, hệ thống điều chỉnh ánh sáng cónhững điểm khác nhau nhằm phục vụ mục đích riêng của từng khu nhà

Chương3 QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ VÀ THUYẾT MINH

3.1 Quy trình sản xuất lan

1 phần

Cấy chuyền

5 phần

Môi trường tạo rễ câyTạo rễ

3 tháng

Vào chậu

5-6 tháng

Bán 1 triệu câythành phẩm/năm

Ra hoa

Tiến hành rửa lại mẫu bằng nước cất vô trùng (3 lần)

Loại bỏ hoại tử, cấy mẫu lên môi trường MS có bổ sung BA 3 mg/l

Điều kiện nuôi cấy: mẫu nuôi cấy được đặt trong điều kiện: 25oC, 12 giờchiếu sáng và ẩm độ là 80%

Sau 10 tuần nuôi cấy, các chồi sinh dưỡng hình thành từ mắt ngủ phát hoa

và mang các lá non đủ rộng để làm nguyên liệu khởi tạo PLB từ mô lá

Hình 3.1 Sự hình thành chồi sinh dưỡng từ phát hoa

3.3.3 Tạo protocorm like body (PLB)

Các mẫu lá thu được từ các chồi sinh dưỡng được cắt theo kích thước 5 x 5 mm.Các mẫu lá được đặt nuôi trên môi trường MS 1/2 bổ sung các chất điều hoà sinhtrưởng thực vật NAA 1mg/l, BA 10 mg/l, Adenin 10 mg/l

Sau 10 tuần nuôi cấy:

- Các PLB được hình thành chủ yếu từ các mảnh lá ở phần gốc và ít ở cácmảnh lá phần đỉnh Lá và thân mặc dù có những nét giống nhau về hình tháigiải phẫu nhưng khác nhau về cách sinh trưởng và cách sắp xếp các mô Lá

có sinh trưởng tận cùng hữu hạn Do đó, để có sự phát sinh hình thái mới,đỉnh lá cũng cần phải có sự phân hoá của các tế bào nhu mô để trở về trạngthái mô phân sinh

- Sau một thời gian, các chồi xuất hiện xung quanh mép lá (nơi có vết thương) tiếp tục phát triển trong khi phần mô lá ban đầu bị hoại đi Phiến lá ban đầu được sử dụng như nguồn dinh dưỡng khởi đầu cho PLB và cho chồi sau này nhưng hệ thống mạch của chồi được hình thành thì hoàn toàn độc lập với hệ thống mạch của mô mẹ

Hình 3.2 Sự tạo PLB từ mô lá

3.2.4 Cấy chuyền

Trung bình cứ một cụm chồi ban đầu sau 2 tháng sẽ cho 6 cụm chồi mới.Các cụm chồi này có thể chia ra và tiếp tục nhân lên Thực hiện thao tác cấychuyền như sau:

- Dùng que cấy lấy hết cụm chồi trong bình nuôi ra đĩa petri sạch vô trùng,dùng dao cấy phân cắt cụm chồi thành các cụm nhỏ, trung bình cứ 1 cụmchồi ta chia được 6 phần nhỏ

- Lấy 1 phần nhỏ đem đi nuôi cấy trong bình có chứa môi trường tạo

- Phần còn lại ta nuôi trong bình nuôi cấy chứa môi trường phát triển chồi.Như vậy, hệ số nhân chồi ở đây là 5 Cứ 1 phần nhỏ sẽ cấy trong một bìnhchứa môi trường phát triển chồi.

Các bình sau khi nuôi cấy đem nuôi trong giàn nuôi cấy với điều kiệnnhiệt độ 22-270C, cường độ chiếu sáng là 2000-4000 lux

3.2.5 Tái sinh chồi và rễ

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá, rễ để chuẩn bịđem ra vườn ươm Các thể chồi sẽ được đưa sang môi trường tạo rễ ( chứa nhiềuauxin) Điều kiện nuôi cấy gần như giống với môi trường bên ngoài, giúp cây cóthể thích nghi tốt sau khi chuyển ra vườn ươm

Lan có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện invitro khálâu ở nhiệt độ 22-270C, cường độ chiếu sáng 2000-4000 lux, quang kỳ là 14 giờ,thời gian khoảng 4-6 tháng

3.2.6 Cây con hoàn chỉnh

Sau khoảng 6 tháng cây lan nuôi cấy mô sẽ đạt kích thước khoảng 8 – 10 cm

có đầy đủ các bộ phận dinh dưỡng thì có thể được xuất ra thị trường tiêu thụ ởnhững nơi có yêu cầu Vì cây nuôi cấy mô nằm trong bình nên rất dễ vận chuyển

đi xa

3.2.7 Huấn luyện

Trước khi đưa cây lan ra nhà kính nuôi lan chúng ta cần huấn luyện nhằmmục đích để cây lan quen dần với nhiệt độ bên ngoài vườn ươm bằng cách: chuyểncác bình chứa lan ra nhiệt độ bình thường bên ngoài, tránh nắng trực tiếp chiếu rọivào các bình nuôi cây lan, thời gian để ở ngoài có thể từ 1 đến 2 tuần

3.2.8Chuẩn bị chậu và giá thể

 Chuẩn bị chậu

Yêu cầu của chậu trồng lan hồ điệp phải là chậu không sâu, nhỏ, màu trắng

và trong suốt thuận lợi cho bộ rễ phát triển và quang hợp Khi cây còn nhỏ dùngchậu có đường kính 5cm, sau 4 - 6 tháng khi cây có khoảng cách giữa 2 lá lớnhơn 12cm thì chuyển sang chậu có đường kính 8,3cm Sau giai đoạn trồng từ 9đến 12 tháng khi khoảng cách giữa 2 lá lớn hơn 18cm thì tiếp tục chuyển sangchậu có đường kính 12cm

 Chuẩn bị giá thể

Cám dừa được sàng sạch, loại bỏ tạp chất, ngâm trong nước vôi 5% trong 3ngày, vớt ra rồi ngâm rửa sạch nước vôi, phơi khô và bảo quản nơi khô ráo

Than gỗ chặt nhỏ vừa (kích thước 1 x 3 x 2cm), ngâm rửa sạch và để khô ráo.

Vỏ dừa già chặt thành những miếng nhỏ, chiều ngang 2-3 cm; chiều dài 4-5

cm, ngâm vào nước vôi 5% từ 3-5 ngày để vỏ dừa mềm và bớt chất tanin, rửasạch nước vôi, và vớt ra để ráo nước

Rêu nước (dớn): ngâm trong nước sạch tối thiểu 24 giờ để cho rêu đủ mềm vàsạch cát, rửa lại nhiều lần bằng nước sạch, vớt ra để ráo

Tỷ lệ phối trộn giá thể cho lan hồ điệp (phalaenopsis):

Lan từ 0 - 6 tháng tuổi: 100% cám dừa hay dớn trắng Các giá thể trướckhi trồng phải được ngâm và xả nhiều lần với nước và phải xử lý thuốc nấm đểphòng bệnh

Tiến hành trồng cây ra vỉ nhựa, bên dưới đáy ly ta lót một miếng xốp đểgiúp hút nước và thoát nước Cách trồng: quấn quanh lớp rễ bằng miếng xơ dừahoặc là dớn trắng Sau đó cho vào vỉ hoặc chậu

Cho vỉ trồng ra nơi thuần dưỡng Dùng bình xịt tưới nước 2-4 lần/ ngàytùy theo mùa nắng hay mùa mưa Chú ý chỉ tưới nước ướt lá

Lan từ 6 tháng tuổi trở lên: 60% than củi+ 20% vỏ dừa chặt khúc+ 20%

rêu nước

3.2.9 Kỹ thuật chuyển chậu

Sau khi đưa từ bình thủy tinh ra trồng trong khay nhựa, khoảng 3-4 tháng

có thể chuyển chậu 1 lần Đối với lan Hồ điệp, thời gian từ khi trồng cây cấy môđến lúc ra hoa là khoảng hơn 1năm

Từ cây con, sau khoảng 3-4 tháng trồng, chúng ta sẽ chuyển chậu và cây con sẽphát triển thành cây trung Cứ thế sau khoảng 3-4 tháng trồng ta tiếp tục chuyểnchậu, cây trung phát triển thành cây đại rồi thành cây vòi mang nụ hoa và bắt đầutrổ bông Bên cạnh đó,chế độ dinh dưỡng, nhu cầu tưới nước, ánh sáng, độ ẩm…cần được cung cấp và điều chỉnh hợp lí theo từng giai đoạn

 Kỹ thuật chuyển chậu lần thứ nhất

Sau khi trồng được từ 4 - 6 tháng, lúc này khoảng cách giữa 2 lá khoảng12cm thì chuyển sang chậu có đường kính 8,3cm Lấy cây ra khỏi bầu, tách bỏgiá thể cũ và thay bằng giá thể mới rồi trồng lại vào chậu mới nhẹ nhàng tránhlàm tổn thương đến rễ Dưới đáy chậu nên lót 1-2 miếng xốp giúp chậu thoátnước tốt, tránh làm cây bị úng Lan hồ điệp sinh trưởng chậm, phải mất tới 40ngày trong điều kiện chăm sóc tốt mới mọc thêm 1 lá hoàn chỉnh Khi cây cótrên 4 lá mới có khả năng phân hoá mầm hoa Để chăm sóc cho cây sau khi thaychậu lần 1 phải phun dung dịch diệt khuẩn Trong từ 3-5 ngày đầu không cầntưới nước nhưng vẫn phải giữ ẩm cho cây cũng như môi trường xung quanh Saukhoảng 10 ngày tưới nước trở lại kết hợp bón phân Lượng phân bón là đạm, lân,kali theo tỷ lệ 30-10-10 nồng độ 40mg/1lít nước Ngoài ra có thể bổ sung thêmcác loại phân hữu cơ khác như Komix

 Kỹ thuật chuyển chậu lần thứ hai

Lần thay chậu thứ 2 cũng là lần thay chậu cuối cùng được xác định khi cây cókhoảng cách 2 lá đạt khoảng 18cm Lúc này cây được từ 16 - 20 tháng, đường

kính chậu chuyển sang phải đạt 12cm Cách thay chậu lần này tương tự như lầnđầu nhưng chú ý dùng dao, kéo sắc cắt bớt các rễ già trước khi trồng lại

Chú ý trong giai đoạn này chế độ che sáng như sau: Ánh sáng mùa hè giảm

từ 60-70%, mùa đông giảm 40-50%, nhiệt độ từ 20-28 độ C, độ ẩm từ 70-85%.Sau khi chuyển chậu lần thứ 2 từ 5-6 tháng cây có từ 4 lá và bắt đầu phân hoámầm hoa Trong thời gian này cần duy trì nhiệt độ thấp từ 18-25 độ C hoặc nhiệt

độ chênh lệch ngày đêm từ 8-10 độ C

Lan hồ điệp có hoa liên tục do đó xử lý nhiệt độ thấp càng dài thì hoa càngnhiều, khoảng cách giữa các hoa càng ngắn Nếu nhiệt độ trên 25 độ C thì khôngthể phân hoá hoa và dưới 15 độ C thì không ra nụ, ra hoa Khi thấy cây lan nhúhoa tưới phân NPK 6-30-30 pha nồng độ 2g/lít nước, thời gian phun 7-10ngày/lần, để cho hoa mập hơn, bền và sắc hoa tươi lâu hơn Ngoài ra, để cho hoađược bền lâu, khoảng 1-2 tháng cần đặt cây ở nơi thoáng mát, nhiệt độ thích hợp20-25 độ C, ánh sáng che bớt 70% Đặc biệt khi cây nở hoa không nên tưới nướchoặc dinh dưỡng lên hoa vì nước sẽ làm hoa bị úng hoặc cháy Khi cành hoa nởgần tàn nên cắt ngay cành hoa và tưới phân NPK 30-10-10 để dưỡng cây cho tràhoa sau

3.2.10 Chăm sóc lan

Lan là cây trồng dễ chăm sóc nếu chúng ta đảm bảo được các điều kiện thuậnlợi cho lan phát triển Các yếu tố quan trọng nhất đối với lan là ánh sáng, nướctưới, độ ẩm, chậu hay giá thể và dinh dưỡng, chính vì vậy ta tiến hành trồng lan

trong nhà kính để dễ dàng điều khiển ánh sáng cũng như độ ẩm, …

Vì vậy, nếu nhiệt độ thấp được tăng lên đến 260 C, các hoa bắt đầu nở sớmhơn Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao sẽ ức chế sự ra hoa rõ ràng sự phát triển và

nở hoa của lan Hồ Điệp phụ thuộc nhiều vào khoảng nhiệt độ nhất định nhưng

nó cũng phụ thuộc vào cường độ ánh sáng

3.2.1 Pha chế môi trường

 Môi trường tạo cây con in vitro

Môi trường để tạo cây con in vitro là môi trường Murashige - Skoog(MS, 1962) bổ sung thêm 3mg/L cytokinin (BA)

 Môi trường tạo protocorm

Môi trường thích hợp để cấy mẫu tạo protocorm đối với lan Hồ điệp làmôi trường Murashige - Skoog (MS, 1962) bổ sung thêm NAA 1mg/L, BA10mg/L, Adenin 10mg/L, nước dừa 15% [9, tr 19]

Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc),người ta không cân hóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dướidạng đậm đặc (dung dịch mẹ), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng Các dungdịch đậm đặc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu.Cácdung dịch mẹ sau khi pha chế, sử dụng tối đa trong 3 tháng, và tốt nhất là sửdụng trong tháng

Nếu chuẩn bị môi trường tốt thì sẽ giảm một số thời gian đáng kể cho côngtác nuôi cấy

Chuẩn bị môi trường Murashige - Skoog (MS, 1962):

Chia môi trường MS ra làm 5 phần

(g/200 mL)

Dung tích dùng cho 1 L môi trường

1,7 16,5 3,7

0,5 mg 0,5 mg 0,172

5 mg 16,6 mg

- Bổ sung 3 mg/L đối với môi trường tái sinh cây in vitro

- Bổ sung NAA 1mg/L, BA 10mg/L, Adenin 10mg/L, nước dừa 15%đối với môi trường tạo protocorm

- Thêm 20 g saccharose vào và khuấy tan

- Đo pH của dung dịch, dùng HCl 0,1N hoặc NaOH 0,1N để điềuchỉnh pH đến mức cần thiết

- Lấy 8 g agar cho vào 1 cốc thủy tinh khác (loại chịu nhiệt và trungtính), bổ sung 300 mL nước cất và đun sôi (đến khi agar tan hết)

- Đổ dung dịch MS ở cốc thứ nhất vào cốc thứ hai đựng agar rồi thêmnước cất đến 1 L Khuấy đều sẽ được môi trường dinh dưỡng dùng

bình Cần chia xong môi trường trước khi dung dịch nguội xuốngdưới 50oC.

- Dùng nút bông không thấm nước đậy kín lại rồi đem hấp khử trùng ởnhiệt độ 121oC, áp suất 1 atm/15 - 30 phút

Để nguội và ráo nước trên bề mặt môi trường thì mới dùng để nuôi cấy(thông thường môi trường sau khi nấu 2 ngày là có thể cấy được)

 Môi trường tái sinh chồi

Bảng 3.2: Thành phần môi trường knudson C [6, tr 140].

Thành phần Hàm lượng trong

1Lít môi trườngCa(NO3)2.4H2O 1g

Chương 4 TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT

4.1 Các số liệu ban đầu

4.1.1 Năng suất của trung tâm

Cây lan giống : 1 triệu cây/ năm

Cây lan ra hoa : 1 triệu cây/ năm

4.1.2 Kế hoạch làm việc của trung tâm

Trung tâm làm việc theo giờ hành chính, ngày làm việc 8 giờ Mỗi tuần làm việc 6ngày, nghỉ chủ nhật và các ngày lễ lớn trong năm (tổng cộng là 10 ngày)

Mỗi năm có 52 tuần (= 365/7), vậy số ngày làm việc trong 1 năm là:

Đợt

Sản phẩm

I (35%)(tháng 12-2)

II (35%)(tháng 3-5)

III (15%)(tháng 6-8)

IV (15%)(tháng 9-11)

4.1.3 Tỷ lệ hao hụt của các công đoạn

Bảng 4.3 Tỉ lệ hao hụt qua từng giai đoạn

4.2 Tính cân bằng vật chất

4.2.1 Số cây lan trưởng thành lấy hoa

Số cây lan ra hoa c = 1000000(cây)

Số cây từ nhà kính chuyển sang chậu c 2 :

Chuyển từhộp ra nhàkính

Chuyển từnhà kínhsang chậu

Ra hoa

Tỷ lệ hao

hụt

Vậy số cây từ nhà kính chuyển sang chậu là 1.041.342 cây

Số cây từ hộp nuôi cấy mô chuyển sang nhà kính c 3 :

Tỷ lệ hao hụt khi chuyển từ nuôi cấy mô sang nhà kính: 8%

Số cây cần nuôi cấy mô tạo rễ c 4 :

Tỷ lệ nuôi cấy mô bị nhiễm:3%

Số cây cần nuôi cấy mô tạo chồi c 5 :

Tỷ lệ nuôi cấy mô bị nhiễm: 3%

Số cây cấy chuyền c 6 :

Tỷ lệ nuôi cấy mô bị nhiễm: 3%

4.2.2 Số cây lan giống

Số cây lan giống: b = 1.000.000 cây

Số cây chuyển từ hộp nuôi cấy mô sang nhà kính b1:

Số cây cần nuôi cấy mô tạo rễ b 1 :

Tỷ lệ nuôi cấy mô bị nhiễm : 3%

Số cây cần nuôi cấy mô tạo chồi b 3 :

Tỷ lệ nuôi cấy mô bị nhiễm: 3%

Tổng số cây cần nuôi cấy mô trong 1 năm:

1.240.198 + 1.155.232 = 2.395.430 (cây)

Số cây giống ban đầu B:

Chọn cây hoa lan giống có 2 phát hoa, mỗi phát hoa có khoảng 5 mắt ngủ

Như vậy ta được 5 cây con in vitro Từ 5 cây con trên ta khởi tạo PLB thì mỗi cây

cho khoảng 5 cụm PLB Từ PLB trên ta tiếp tục cấy chuyền Trung bình 1 cụm chồi

có thể phân thành 6 phần, 1 phần tái sinh cụm chồi, 5 phần nhân tiếp 5 phần nàytiếp tục cấy chuyền để nhân nhanh số lượng Cứ 1 phần nhân ra làm 5 phần Nhưvậy sau 3 lần nhân được số protocorm nhỏ là : 5×53= 625 (protocorm)

Vậy từ 1 cây phong lan giống ta được số protocorm: 2×5×5×625=31.250(protocorm)

Từ 31.250 protocorm đem tái sinh thành cây ta được số cây:31.250×15=468.750 cây

Như vậy để đáp ứng số cây con hoàn chỉnh trong một năm là 2.395.430 câythì số cây giống ban đầu là:

C

2.395.430

5,110468.750

(cây)Vậy số cây giống ban đầu là: 6 cây

a. Lượng hóa chất cho môi trường MS

1 hộp nuôi cấy chứa khoảng 40 ml môi trường, 12 cụm chồi

 Đợt I, II:

Số cây cần nuôi cấy mô trong 1 năm là 1.240.198 cây

Đợt I, II mỗi đợt chiếm 35% tổng số cây

⇒

số cây lấy hoa cần nuôi cấy mô trong mỗi đợt là:

1.240.198 35100

×

=434.069,30 (cây)

Vậy số cây mỗi đợt là 434.070 cây

Số cây lan giống cần nuôi cấy mô trong 1 năm là1.155.232cây

Đợt I, II, III, IV mỗi đợt chiếm 25% tổng số cây.

⇒

số cây giống cần nuôi cấy mô trong mỗi đợt là:

1.155.232 25100

×

=288.808 (cây)Vậy số cây mỗi đợt là 288.808cây

Tổng số cây con : 434.070 +288.808 = 722.878 (cây)

Một cụm chồi tạo nên 15 cây con nên số cụm chồi sau lần nhân thứ 3 :

48.192 + 9.639+1.928 +387= 60.146 ( cụm chồi)Một hộp nuôi cấy mô chứa 12 cụm chồi

⇒

số hộp: H1

60.146 5.012,16712

(hộp)Vậy số hộp cần dùng là 5.013 hộp

Mỗi hộp chứa 40ml môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng nên lượngmôi trường cần dùng: V = 5.013 × 40 =200.520 ml = 200,52 L