Bài Giảng Công Nghệ Sinh Học Dược Phẩm

KHÁNG THỂ - Ig• Kháng thể là các phân tử immunoglobulin có bản chất glycoprotein, do các tế bào lympho B cũng như các tương bào biệt hóa từ lympho B tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết

CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC PHẨM

• Phần 1: MIỄN DỊCH

• Phần 2: CƠNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC

PHẨM

Phần 2: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

DƯỢC PHẨM

Chương mở đầu

► Bài 1: Kỹ thuật lên men

► Bài 2: Công nghệ sản xuất enzym

► Bài 3: Sinh tổng hợp Vitamin B12

Chương 1: KHÁNG SINH

Bài 1: Đại cương về kháng sinh

Bài 2: Kháng sinh nhóm β-LactamLactam

Bài 3: Kháng sinh nhóm Tetracyclin và Aminoglycosid Bài 4: Kháng sinh nhóm Macrolid và kháng sinh có nguồn gốc vi khuẩn

Chương 2: CÔNG NGHỆ Y DƯỢC HIỆN ĐẠI

Bài 1: Vaccine

Bài 2: Interferon và Kháng thể đơn dòng

CÁC NHÓM KHÁNG SINH ĐIỂN HÌNH

• Kháng sinh nhóm β-LactamLactam

– Penicillin – Cephalosporin – Acid Clavulanic

• Kháng sinh nhóm Tetracyclin

– Clotetracyclin

• Kháng sinh nhóm Aminoglycosid

– Streptomycin – Gentamicin

• Kháng sinh nhóm Macrolid

– Erythromycin

• Kháng sinh có nguồn gốc từ vi khuẩn

– Polymicin

Miễn dịch là:

• Tập hợp tất cả các cơ chế sinh học giúp

cho một cơ thể đa bào giữ được sự liên

kết giữa các tế bào và các mô đảm bảo sự toàn vẹn của cơ thể bằng cách loại bỏ

những thành phần bị hư hỏng cũng như

các chất và sinh vật xâm hại

và phối hợp với nhau để bảo vệ cơ thể:

 Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu

 Hệ thống miễn dịch đặc hiệu

Hệ thống miễn dịch không đặc

hiệu

Bao gồm 2 hàng rào bảo vệ:

• Hàng rào thứ nhất: màng ngoài cơ thể (da, màng nhày)

• Hàng rào thứ hai: tế bào và chất hóa học

Thực bào: đại thực bào (monocyte), neutrophil,

eosinophil, …

Tế bào giết tự nhiên (NK): lymphocyte

Các hóa chất gây viêm (histamin, kinin,

protaglandin, lymphokin….)

Protein kháng VSV (interferon, bổ thể, CRP)

Phản ứng viêm

Ý nghĩa của phản ứng viêm:

• Ngăn ngừa sự lan rộng của các tác nhân gây hại đến mô lân cận

• Loại bỏ các mảnh vụn của tế bào và khử các mầm bệnh

• Tạo cơ sở cho các quá trình phục hồi

Những hiện tượng chính của quá trình viêm

• Sự giãn mạch và tính thấm của mạch tăng lên

 Hóa chất gây viêm được giải phóng→giãn

mạch→xung huyết địa phương

 Tăng tính thấm ở các mao mạch địa phương

→hiện tượng thoát dịch giàu protein →tái tạo

tế bào, cô lập vùng bị tổn thương

• Sự huy động thực bào: Neutrophil và đại thực bào được huy động→xuyên mạch →thực bào

Protein kháng vi sinh vật

• Chất bổ trợ (complement) là 1 nhóm protein

huyết tương có khả năng tiêu diệt VSV, làm tăng thực bào do hiện tượng “opsonization”, tăng cường phản ứng viêm và đáp ứng miễn dịch

Các protein bổ trợ tạo thành nhóm gọi là MAC đính trên màng VSV→tạo lỗ mở trên màng gây thất thoát Ca2+ của tế bào→tiêu diệt VSV

Tăng cường phản ứng viêm: kích thích tế bào

mỡ và basophil để giải phóng histamin

Quá trình opsonin hóa: Các phân tử protein bổ

trợ phủ bên ngoài VSV→ cung cấp cầu kết nối cho đại thực bào và neutrophil gắn vào đó, cho phép chúng nhận chìm VSV nhanh hơn

• Interferon(IFNs): Là các protein nhỏ được tiết bởi

các tế bào bị nhiễm virus để bảo vệ các tế bào chưa bị nhiễm

 Sự bảo vệ của IFNs có tính không đặc hiệu đối với virus, vì vậy IFNs được sản xuất để chống 1 loại virus đặc biệt có thể chống nhiều loại virus khác.

 Ngoài hiệu quả kháng virus, interferon còn hoạt hóa đại thực bào và γ-interferon huy động được interferon huy động được các tế bào giết tự nhiên

HỆ THỐNG MIỄN DỊCH ĐẶC

HIỆU

• Hệ thống miễn dịch đặc hiệu (MDĐH) là một hệ chức năng nhận biết được các vật lạ đặc hiệu, làm bất động, trung hòa hoặc tiêu hủy chúng

• Ba thuộc tính cơ bản của MDĐH:

Tính phân biệt cấu trúc bản thân và ngoại lai

• Mỗi kháng nguyên có nhiều vị trí

epitope khác nhau để gắn kết với kháng thể

Các đặc điểm Ag:

• Khối lượng phân tử lớn: Kháng nguyên

có khối lượng phân tử > 1000 dalton

→ Tính gây miễn dịch

• Cấu trúc phân tử phức tạp: Chất có cấu

trúc phân tử càng phức tạp thì tính sinh miễn dịch càng cao

→ Tính đặc hiệu kháng nguyên

Nguồn gốc Ag :

 Ag ngoại sinh là kháng nguyên xâm

nhập vào cơ thể từ bên ngoài, như do hít, ăn, tiêm

 Ag nội sinh là các kháng nguyên được

sản xuất bên trong tế bào, là kết quả của quá trình chuyển hóa tế bào bất thường, hoặc do nhiễm khuẩn nội bào hay nhiễm virus

KHÁNG THỂ - Ig

• Kháng thể là các phân tử immunoglobulin

(có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa

từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết

và vô hiệu hóa các tác nhân lạ

• Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất

Phân tử Ig cấu tạo từ 4 chuỗi polypeptide, gồm:

• 2 chuỗi nặng (H: heavy) giống hệt nhau

• 2 chuỗi nhẹ (L: light) cũng giống hệt nhau Có

2 loại chuỗi nhẹ κ (kappa) và λ (lambda)

Các chuỗi liên kết với nhau bởi cầu nối disulfide.

• Một phần cấu trúc của các chuỗi thì cố

các Ag tương ứng

Các lớp kháng thể

IgG IgA IgM IgE IgD

Lympho B

Máu

Bạch cầu ái kiềm

Tế bào mast

Lympho B

Tỷ lệ 70% đến 75%

15% đến 20% các

Ig trong

huyết thanh

độc tố,

vi khuẩn

và virus

Ngưng tụ, trung hòa các vi khuẩn, virus

Ngưng tụ, con đường

cổ điển của bổ thể

Dị ứng , trung hòa các

ký sinh trùng

Hoạt hóa các

tế bào lympho B

VAI TRÒ CỦA KHÁNG THỂ

• Trong một đáp ứng miễn dịch, Ig có 3 chức năng chính:

– liên kết với Ag

– kích hoạt hệ thống bổ thể

– huy động các tế bào miễn dịch

• Liên kết với Ag: Các Ig có khả năng nhận

diện và gắn một cách đặc hiệu với 1 Ag

tương ứng nhờ các domain biến thiên → hiện tượng trung hòa, ngưng kết

• Hoạt hóa bổ thể: Bổ thể là tập hợp các protein huyết

tương khi được hoạt hóa sẽ tiêu diệt các vi khuẩn xâm hại bằng nhiều cách:

(1) đục các lỗ thủng trên vi khuẩn,

(2) tạo điều kiện cho hiện tượng thực bào (opsonine) (3) phóng thích các phân tử histamin

(4) thanh lọc các phức hợp miễn dịch

• Hoạt hóa các tế bào miễn dịch:

có thể liên kết với các tế bào miễn dịch

ở đầu hằng định

khuẩn có thể liên kết với một đại thực

KT đa dòng (Pab) Vs đơn dòng (Mab)

Các nguyên tắc cơ bản phải thực hiện khi sử dụng huyết thanh

Đáp ứng miễn dịch thể dịch

• Miễn dịch thể dịch ( humoral immunity) do các tế

bào lympho B đảm nhiệm với các Ig miễn dịch

lưu hành trong các dịch : IgG, IgM, IgA, IgD, IgE

• Các Ig được tiết ra từ tương bào (tế bào plasma) có nguồn gốc là lympho B đã được hoạt hóa

• Ag của miễn dịch dịch thể là kháng nguyên ngoại bào bao gồm : vi khuẩn, virus, kí sinh trùng, ấu trùng của nó, và tất cả tồn tại và sống

ở dịch ngoại bào

• Sự chọn dòng và sự biệt hóa các tế bào B

Một tế bào lympho B được hoạt hóa khi các Ig gắn vào các thụ quan trên bề mặt của nó lần đầu tiên

Sau đó nó biệt hóa thành hai dòng tế bào: tương bào và tế bào nhớ

Tương bào đóng vai trò sản xuất Ig với số

lượng lớn để đáp ứng miễn dịch

Tế bào nhớ sống lâu, có thể gây đáp ứng

miễn dịch trực tiếp nếu chúng gặp lại Ag

Miễn dịch thể dịch tích cực và thụ động

• Miễn dịch thể dịch tích cực: Khi các tế bào B

gặp Ag và sản xuất Ig chống các Ag đó, ta có hiện tượng miễn dịch thể dịch tích cực

Tập nhiễm tự nhiên: khi cơ thể bị nhiễm

virus, vi khuẩn

• Miễn dịch thể dịch thụ động: Khi ta truyền

huyết thanh →ĐƯMD tức thời nhưng sau đó Ig được truyền sẽ thoái hóa 1 cách tự nhiên trong

cơ thể

Đáp ứng miễn dịch tế bào

• Miễn dịch tế bào do các tế bào lympho T đảm nhiệm

Các tế bào T không thể nhận diện các Ag tự do, nó

chỉ có thể nhận biết và phản ứng với các đoạn Ag

protein đã được xử lý, biểu lộ trên bề mặt các tế bào

của cơ thể

• Do vậy các tế bào T thích hợp đối với các động tác

qua lại tế bào – tế bào và chống các tế bào cơ thể

bị nhiễm virus, vi khuẩn hoặc các ký sinh trong tế bào, cả các tế bào cơ thể không bình thường hoặc

các tế bào ung thư và các tế bào của mô lạ được

cấy ghép.

Trình diện kháng nguyên

• Tế bào trình diện kháng nguyên (tế bào APC): là các

đại thực bào có khả năng xử lý và trình diện các Ag dưới

dạng cắt gọt trên màng tế bào thông qua các protein

MHC

• Xử lý Ag của các tế bào APC là quá trình hóa dáng

protein lạ (virus, tế bào ung thư…) thành các đoạn peptid:

– Protein lạ bị bắt giữ trong túi phagosome

– Các túi lysosome + phagosome→ phagolysosome

→các đoạn peptid nhỏ

• Trình diện kháng nguyên: là quá trình các đoạn peptid

gây miễn dịch trội được liên kết có chọn lọc với phân tử protein MHC và phức này được biểu lộ trên bề mặt tế bào để tế bào T nhận diện

Hoạt động của tế bào T trong ĐƯMD

• Nhận biết Ag: Các tế bào T chỉ nhận diện được

Ag thông qua tế bào APC

• Hoạt động của tế bào T: phức protein MHC-interferon huy động được Ag

được gắn lên thụ quan của tế bào T→các tế bào

T gây độc giết các tế bào cơ thể bị virus xâm nhập và các tế bào ung thư, cả những mô ghép lạ

• Sự tạo dòng và biệt hóa của các tế bào T: Khi

hoạt động, tế bào T lớn lên và sinh sản tạo thành một dòng tế bào biệt hóa và thực hiện các chức năng tùy theo lớp tế bào T

Quá trình phát triển của TB T trong tuyến ức

TB vùng lõi:

Sản xuất các nhân tố điều hoà

và biểu hiện rất nhiều MHC I và II

• Tại tuyến ức: 2 quần thể chính

– Tế bào tuyến ức vùng lõi

Biệt hoá TB T

• Tế bào lympho tiếp thu một sự huấn luyện miễn dịch gồm có:

– khả năng nhận biết kháng nguyên

– khả năng phân biệt kháng nguyên của mình với kháng nguyên lạ (không phải của mình)

• Sự huấn luyện qua 2 quá trình chọn lọc

• Liên quan đến khả năng nhận biết ra các phân tử MHC trên các tế bào khác thông qua TCR của tế bào tuyến ức vùng lõi

Những TB không nhận biết được

Tiếp tục qua sự chọn lọc lần 2

chết theo chương trình (apoptosis)

Chọn lọc dương tính

• Liên quan đến khả năng phản ứng với kháng nguyên bản thân

hay không có

Chết theo chương trình

(Apoptosis)

Di chuyển vào các trung tâm lympho ngoai vi

để tiếp tục trưởng thành

Chọn lọc âm tính

Phân tử CD4

– Là một monomer có 4 khu vực nằm bên ngoài tế bào

– Đặc trưng của dưới nhóm quần thể tế bào

lympho T hỗ trợ (TH) và được dùng như là ligand với các phân tử MHC lớp II

Phân tử CD8

– Hình thành bởi 2 chuỗi α và β nối lại với nhau

bằng một dây nối đồng hóa trị

– Đặc trưng cho dưới nhóm quần thể tế bào

lympho T độc (TC) và là ligand của phân tử MHC lớp I

IL-interferon huy động được 2 100 x ↑

TB T hiệu quả → TH &

T C

TB nhớ

Vào chu trình TB

Hoạt hoá TB Th sẽ tạo các TB T hiệu quả

– Tế bào T H: mang trên bề mặt những phân tử

protein tương tác với các ligand trên các tế bào khác (đại thực bào trong miễn dịch tế bào, tế bào

B trong miễn dịch dịch thể), đồng thời tiết cytokin

để hoạt hoá các tế bào khác

– Tế bào T C: mang những hạt chứa các protein có thể giết virus và tế bào ung thư

– Bên cạnh do, một số tế bào T được biệt hoá

thành tế bào T nhớ Có thể tồn tại một cách yên

lặng trong nhiều năm sau khi kháng nguyên

được loại bỏ

Sau khi trình di n kháng nguyên ện kháng nguyên

Sau khi trình di n kháng nguyên ện kháng nguyên

Phần 2: CÔNG NGHỆ SINH

HỌC DƯỢC PHẨM

KỸ THUẬT LÊN MEN

• Cơ sở công nghệ Vi sinh vật: là quá trình

sinh tổng hợp bằng kỹ thuật lên men nhờ VSV trong các bình phản ứng sinh học.

• Môi trường dinh dưỡng + VSV → Sản

phẩm + VSV + Cơ chất còn xót + Các sản phẩm phụ + Nhiệt năng

• Các hình thức lên men

– Lên men hiếu khí

– Lên men kị khí

Ưu và nhược điểm của phương pháp

sinh tổng hợp

• Ưu điểm:

– Có khả năng tạo các phân tử phức tạp như

protein, kháng sinh– Biến đổi sinh học cho năng suất cao hơn

– Sinh tổng hợp ở điều kiện ôn hòa

– Sản phẩm thu được không có đồng phân

Quá trình sản xuất dược phẩm bằng pp lên men VSV gồm 4 giai đoạn chính:

+ Lựa chọn môi trường thích hợp

+ Tuyển chọn giống VSV

+ Lên men ở đk tối ưu

+ Thu nhận và tinh chế SP

Môi trường lên men

α-interferon huy động được naptylacetic acid

• Điều kiện nuôi cấy:

– Nhiệt độ

– pH

Các nguồn nguyên liệu chủ yếu

của công nghệ lên men

• Nguồn NL từ nông nghiệp: củ cải đường, cà

phê, ca cao , dừa, chè, … và các phế phụ phẩm nông nghiệp như: rơm, bã mía, chất thải gia súc,

…

• Nguồn NL từ lâm nghiệp: vỏ cây, mùn cưa, tre,

nứa, dung dịch thủy phân gỗ, cellulose,…

• Nguồn NL từ công nghiệp: mật rỉ, phế phụ phẩm

của ngành chế biến thịt, cá, sữa, tinh bột …

• Nguồn rác đô thị, bùn, nước cống,…

Giống vi sinh vật

• Yêu cầu chất lượng giống:

– Tạo ra sp chính với năng suất cao, sp phụ ít

– Phát triển tốt trên các nguồn nguyên liệu rẻ tiền

– Sau lên men dễ tách sản phẩm ra khỏi sinh khối

– Phải là chủng VSV thuần khiết

– Có khả năng thích ứng và sinh sản mạnh

– Thời gian lên men ngắn, hiệu suất cao

– Dễ bảo quản, bảo tồn được đặc tính di truyền trong suốt thời gian bảo quản và sử dụng

• Nguồn giống VSV

– Phân lập từ nguồn tự nhiên: chọn nguyên

liệu dùng phân lập→Phân lập canh trường tập trung→Phân lập chủng thuần khiết

→Kiểm tra tính di truyền mong muốn →Tạo

sự ổn định đặc tính di truyền mong muốn

– Nguồn giống từ ngân hàng giống hoặc

bảo tồn giống: chọn điều kiện và môi

trường thích hợp để kích hoạt giống trước khi đưa vào sản xuất

Nguồn giống sẵn có từ các cơ sở sx:

• B1: phân lập lại giống vsv đang sx

• B2: kiểm tra tính di truyền

• B3: ổn định đặc tính di truyền

• B4: Nâng cao đặc tính di truyền

– huấn luyện thích nghi với đk lên men công nghiệp

– thay đổi cơ chế trong thông tin di truyền

Các biện pháp nâng cao chất

lượng giống

• Kỹ thuật gây đột biến

• Kỹ thuật dung hợp tế bào

• Kỹ thuật tái tổ hợp

Sơ đồ tổng quát quá trình nhân giống

vi sinh vật cho sản xuất:

• Giai đoạn nhân giống trong phòng thí nghiệm: Giống

VSV được bảo quản trên mt thạch nghiêng

→ Nhân giống cấp 1 trong 10ml môi trường lỏng

→ Nhân giống cấp 2 trong 100ml môi trường lỏng

→ Nhân giống cấp 3 trong 1l môi trường lỏng

• Giai đoạn nhân giống phân xưởng:

Thu nhận giống cấp 3

→ Nhân giống cấp 4 trong môi trường 10l

→ Nhân giống cấp 5 trong 100l môi trường lỏng

→ Nhân giống cấp 6 với thể tích 1m 3 trong thiết bị lên men có cánh khuấy bằng thép không rỉ

Sơ đồ quá trình chuẩn bị giống lên men

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình

nhân giống

• Thành phần định tính và định lượng của mơi

trường nuơi

• Điều kiện nuơi khuấy: Sự sinh trưởng của vi sinh vật

trong phương pháp nuơi cấy tĩnh cĩ thể được chia thành 6 giai đoạn:

– Giai đoạn thích nghi

– Giai đoạn sinh trưởng nhanh

– Giai đoạn logarit

– Giai đoạn sinh trưởng chậm

– Giai đoạn ổn định

– Giai đoạn suy vong

• Ảnh hưởng của nhiệt độ: Mỗi loài VSV sẽ có 1 giá trị nhiệt

độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển

• Ảnh hưởng của oxy: giúp VSV tổng hợp năng lượng, duy

trì các hoạt động trao đổi chất và tổng hợp sinh khối

• Sự khuấy trộn: giúp cho môi trường lỏng trở nên đồng

nhất và làm tăng hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường

• Ảnh hưởng của thời gian: Kết thúc quá trình nhân giống

để thu nhận sinh khối vào thời điểm đầu của giai đoạn ổn

định để đạt hiệu quả kỹ thuật và kinh tế cao nhất

• Bảo quản giống: Nếu không được bảo quản đúng kỹ thuật

giống sẽ bị giảm dần hoạt tính và số tế bào chết sẽ gia tăng

Các giai đoạn lên men

– Trong không khí chứa nhiều bụi

– Trong không khí chứa nhiều vi sinh vật

→gây nhiễm tạp khuẩn môi trường lên men

• Khử trùng môi trường trước khi lên men

– Tác nhân khử trùng: vật lý (tia X, tia cực tím,

sóng siêu âm, nhiệt, hơi nước…), tác nhân hóa học

– Khử trùng trực tiếp bằng nhiệt →gây biến

tính protein, 1 số vitamin, caramen hóa đường, oxy hóa các hợp chất phenol, trùng hợp các aldehyd chưa no, xảy ra pứ Maillard tạo các basechif là các chất độc đối với nhiều VSV

– Khử trùng liên tục bằng hơi nước quá nhiệt:

không gây biến tính các thành phần của môi trường nuôi cấy vì thời gian tiếp xúc nhiệt ngắn