Investigation of peptide lipid interaction by fluorescence correlation spectroscopy

In this study, the interaction between MV4s and different lipid model membranes was investigated using single molecule sensitive fluorescence spectroscopy methods, such as fluorescence c

  INVESTIGATION OF PEPTIDE‐LIPID  INTERACTION BY FLUORESCENCE  CORRELATION SPECTROSCOPY 

      GUO LIN  (B.Sc.)     

A THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF 

DOCTOR OF PHILOSOPHY 

  DEPARTMENT OF CHEMISTRY 

NATIONAL UNIVERSITY OF SINGAPORE 

  2010

This  work  was  performed  in  the  Biophysical  Fluorescence  Laboratory,  Department  of Chemistry, National University of Singapore under the supervision of Associate Professor Thorsten Wohland. 

A doctoral thesis like this, involving various fields, would not be possible without the  help  of  many  people.  I  would  like  to  take  this  opportunity  to  acknowledge  the persons who provided great help in my study. 

First,  I  would  like  to  acknowledge  my  supervisor  Associate  Professor  Thorsten Wohland  from  Department  of  Chemistry  for  providing  such  an  interesting  research project. I am also grateful for his invaluable guidance, support and patience throughout the project. 

I  would  like  to  thank  Professor  Ding  Jeak  Ling  from  Department  of  Biological Science  and  Associate  Professor  Ho  Bow  from  Department  of  Microbiology  for  their scientific suggestions and discussions on the project. 

I  am  also  grateful  to  all  my  colleagues  from  Biophysical  Fluorescence  Laboratory for their kind help and support. Especially Lanlan Yu for her great advices on the project 

of antimicrobial peptides; Ling Chin Hwang and Xiaotao Pan for their helpful discussions 

on Fluorescence Correlation Spectroscopy; Ping Liu, Xianke Shi and Sebastian Leptihn for their kind support on biological relevant topics; Kannan Balakrishnan, Jia Yi Har, Manna Manoj Kumar and Jagadish Sankaran for their great help on the Imaging Total Internal Reflection Fluorescence Correlation Spectroscopy project. 

And  last  but  not  least  I  would  like  to  thank  my  parents  for  their  understanding, support and love for all these years. 

Acknowledgement    II  Table of Contents    III   Summary    VII  List of Figures    IX  List of Tables    XI 

Chapter 1  Introduction   1 

1.1  Introduction to Antimicrobial peptides   3 

1.1.1  Antimicrobial peptides   5 

1.1.1.1  Biological activities of antimicrobial peptides   5 

1.1.1.2  Origins of antimicrobial peptides   5 

1.1.1.3  Structural features of antimicrobial peptides   8 

1.1.1.4  Therapeutic potential of antimicrobial peptides   13 

1.1.2  Designed antimicrobial peptides   13 

1.1.2.1  Designed antimicrobial peptides   15 

1.1.2.2  De novo designed V peptide family   16 

1.1.3  Mechanism of antimicrobial peptides   18 

1.1.3.1  Biological membranes   19 

1.1.3.2  Model membranes   24 

1.1.3.3  Mechanisms of antimicrobial peptides   26 

1.1.3.4  Methods to study mechanism of antimicrobial peptides   30 

1.2  Conventional Fluorescence Correlation Spectroscopy   34 

1.2.1  Basic Theory – Autocorrelation Function   36 

1.2.2  Basic Setup ‐ Confocal Microscope   43 

1.2.3  Combining Fluorescence Correlation Spectroscopy with a Laser Scanning  Microscope   44 

Chapter 2  Investigation of the binding affinity of modified antimicrobial peptide to  membrane mimics   46 

2.1  Introduction   46 

2.2  Materials and methods   47 

2.2.1  Materials   47 

2.2.2  Peptides   47 

2.2.3  Small unilamellar vesicles (SUVs) preparation   48 

2.2.4  Interaction of modified V4 peptides with LPS   48 

2.2.5  Interaction of modified V4 peptides with SUVs   48 

2.2.6  FCS Instrumentation and confocal imaging   49 

2.3  Results and Discussion   50 

2.3.1  Calibration of the FCS setup   50 

2.3.2  Modified AMPs are more soluble compared with V4   51 

2.3.3  Modified antimicrobial peptide can bind to LPS strongly   55 

2.3.4  Modified antimicrobial peptide can bind to POPG strongly   59 

2.3.5  Modified antimicrobial peptides show low binding affinity to POPC   61 

2.3.6  Comparison between different V peptides   62 

Chapter 3  Investigation of the mechanisms of antimicrobial peptides interacting with  membrane mimics   66 

3.1  Introduction   66 

3.2  Materials and methods   68 

3.2.1  Materials   68 

3.2.2  Peptides   68 

3.2.3  Fluorophore entrapping vesicle preparation   68 

3.2.4  Fluorophore labeled vesicle preparation   69 

3.2.5  Interaction of MV4s with rhodamine 6G entrapped LUVs (REVs) and Rho‐PE  labeled LUVs (RLVs)   69 

3.2.6  FCS instrumentation and confocal imaging   69 

3.3  Results and discussion   70 

3.3.1  Modified antimicrobial peptides induce leakage of rhodamine 6G entrapped in  POPG LUVs   70 

3.3.2  Modified antimicrobial peptides interact with Rho‐PE labeled POPG LUVs   74 

3.3.3  Modified antimicrobial peptides interact with Rho‐PE labeled POPC LUVs   78 

3.3.4  Visualization of Modified peptides interacting with Rho‐PE labeled LUVs   79 

3.3.5  Comparison between different V peptides   79 

3.4  Confocal visualization of peptide‐lipid interaction   82 

3.4.1  Materials and methods   83 

3.4.1.1  Materials   83 

3.4.1.2  GUVs preparation   83 

3.4.1.3  Immobilization of GUVs on cover slide   83 

3.4.1.4  Confocal imaging   84 

3.4.2  Visualization of interaction between V4 and GUVs   84 

3.5  In vivo measurements  87 

3.5.1  Materials and methods   88 

3.5.1.1  Peptides   88 

3.5.1.2  Preparation of bacterial culture   88 

3.5.1.3  Bacterial assay   89 

3.5.2  Monitoring the GFP leakage from Gram‐negative bacteria   89 

Chapter 4  Imaging Total Internal Reflection Fluorescence Correlation Spectroscopy as a  tool to monitor the peptide‐lipid interaction   92 

4.1  Introduction to ITIR‐FCS   92 

4.1.1  Total internal reflection (TIR) illumination   92 

4.1.2  Imaging total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy   94 

4.1.3  Basic setup   98 

4.1.4  Basic theory ‐ Autocorrelation function for ITIR‐FCS   100 

4.2  Characterization of ITIR‐FCS   102 

4.2.1  Introduction to different fluorescence techniques   103 

4.2.1.1  Z‐scan FCS   104 

4.2.1.2  Fluorescence recovery after photobleaching   105 

4.2.1.3  Single particle tracking   107 

4.2.2  Materials and Methods   109 

4.2.2.1  Lipids and dyes   109 

4.2.2.2  Peptides   109 

4.2.2.3  Preparation of SLB   109 

4.2.2.4  Preparation of GUVs   110 

4.2.2.5  Immobilization of GUVs   110 

4.2.2.6  FCS instrumentation and measurement   110 

4.2.2.7  FRAP instrumentation and measurement   111 

4.2.2.8  SPT and ITIR‐FCS Instrumentation   111 

4.2.2.9  SPT measurement   111 

4.2.2.10  ITIR‐FCS measurement   112 

4.2.3  Results and Discussion   112 

4.2.3.1  Results   112 

4.2.3.2  Comparison of different techniques   116 

4.2.3.3  Features of ITIR‐FCS   121 

4.3  Utilizing ITIR‐FCS to investigate the behavior of antimicrobial peptides on lipid  membrane   122 

4.3.1  Introduction   122 

4.3.2  Materials and Methods   122 

4.3.3  Results and Discussion   123 

Chapter 5  Conclusions and Outlook   127 

5.1  Conclusion   127 

5.2  Outlook   131 

 Reference    134   

In  this  work  I  investigate  the  action  of  antimicrobial  peptides  (AMPs)  with  single molecule sensitive fluorescence spectroscopy methods. 

AMPs are novel and promising candidates of antibiotics. AMPs kill the pathogen by permeabilizing the bacterial membrane. So it is very hard for bacteria to develop drug 

resistance.  De  novo  designed  AMPs  can  greatly  enlarge  the  pool  of  available  peptide  candidates, eliminating some of the cytotoxic features of the natural ones. As a de novo 

designed peptide, V4 originated from a LPS (lipopolysaccharide) ‐binding motif, showed its good combination of strong antimicrobial effect and low cytotoxic/hemolytic effect. However, its application is limited due to its low solubility. To overcome this limitation, a series of modified V4 (MV4s) was designed to have better solubility.  

In this study, the interaction between MV4s and different lipid model membranes was  investigated  using  single  molecule  sensitive  fluorescence  spectroscopy  methods, such as fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and imaging total internal reflection fluorescence  correlation  spectroscopy  (ITIR‐FCS),  together  with  laser  scanning  confocal imaging.  A  similar  mechanism  of  MV4s  compared  to  V4  was  observed:  inducing  lipid aggregation  before  inducing  the  lipid  membranes  disruption.  By  comparing  different MV4s,  we  found  that  a)  highly  positively  charged  structure  maintained  preferential binding to negatively charged lipid, b) higher hydrophobicity gave rise to a higher activity against both negatively charged and zwitterionic lipid, and c) two binding motifs in MV4s may play a crucial role to maintain their activity. A good consistency was found between predicted  and  actual  property  of  peptides.  Further  study  of  AMPs  on  live  E.  coli 

By investigating different members of the V4 peptide family, this study contributes 

to our understanding of their mechanism of antimicrobial activity and selectivity. It thus provides further guidelines for the rational design of antimicrobial peptides. 

Fig 1.1 Schematic representation of the Gram‐negative bacteria cell wall.  20  Fig 1.2 Schematic representation of cell wall from Gram‐positive bacteria.  20 

Fig 2.7 ACF curves obtained for titrating LPS into different peptides.   57  Fig 2.8 Interaction between LPS and different peptides.  57  Fig 2.9 LPS dissolved the peptide aggregates.  58  Fig 2.10 V4norv‐TMR, V4abu‐TMR, V4ala‐TMR interacting with POPG SUVs.  60  Fig 2.11 TV4 showed almost no affinity to POPG SUVs.  61  Fig 2.12 binding affinity of different MV4‐TMR to POPG SUVs.  61  Fig 2.13 MV4s showed almost no affinity to POPC SUVs.  63 

Fig 3.2 Principle of disruption measurement.  67  Fig 3.3 Comparison between POPG REV and free R6G.  70 

Fig 3.4 Interaction between different peptides and POPG REVs.  73  Fig 3.5 Different peptides showed different activity against POPG REVs.  74  Fig 3.6 Interaction between different peptides and POPG RLVs.  75  Fig 3.7 ACF and intensity trace for POPG RLV aggregates and fragments.  76  Fig 3.8 Different peptides showed different activity against POPG RLVs.  77 

Fig 3.10 Confocal images of RLVs interacting with MV4.   82  Fig 3.11 Activity against different lipids for MV4s.  83  Fig 3.12 V4 evenly and reversibly bound on POPC GUVs.  86 

Fig 4.2 Schematic drawing of a prism‐based TIR‐FCS setup.  96  Fig 4.3 Schematic drawing of an objective‐based TIR‐FCS setup.  97  Fig 4.4 Schematic drawing of ITRF‐FCS setup used in the study.  99  Fig 4.5 Schematic representation on z‐scan FCS.  104  Fig 4.6 Schematic illustration of FRAP measurement.  106  Fig 4.7 Schematic illustration on the calculation of MSD.  108  Fig 4.8 Data obtained using different fluorescence techniques.  114  Fig 4.9 Histogram of diffusion coefficient obtained by SPT.  115  Fig 4.10 Dependence of the lateral diffusion time on the z‐position of the focus.  115  Fig 4.11 Comparison of the diffusion coefficients obtained with different techniques.  119  Fig 4.12 An example of ACF curves obtained using ITIR‐FCS setup.  124 

Fig 4.14 Another set of ITIR‐FCS data showing different result.  125  Fig 4.15 TIRF image of uneven distribution of V4.  126 

Table 1.1 Clinical developments of cationic antimicrobial peptides.  14  Table 1.2 Predicted molecular properties of modified V4.  18 

Table 2.1 Comparison between different MV4‐TMR and TMR.  53  Table 2.2 Different MV4‐TMR upon saturation binding with LPS.  59  Table 2.3 Comparison of different MV4‐TMR interacting with POPG SUVs.  60  Table 2.4 MV4s showed almost no affinity to POPC SUVs.  62  Table 4.1 ITIR‐FCS results obtained using different fitting model at various binning.  116  Table 4.2 Comparison of the working concentration and area of 4 different techniques.  117  Table 4.3 Comparison of FCS, FRAP, SPT and ITIR‐FCS results.  120 

Chapter 1 Introduction 

Due  to  drug  resistance  developed  by  bacteria,  treatment  of  bacterial  infections using  conventional  antibiotics  is  facing  a  serious  challenge.  Antimicrobial  peptides (AMPs)  are  considered  to  be  promising  candidates  for  solving  the  problem  of  drug resistance.  By  directly  targeting  the  membrane  of  the  bacteria  rather  than  proteins crucial  for  bacteria  survival,  it  is  much  harder  for  bacteria  to  develop  drug  resistance since a change in the membrane composition would also require corresponding changes 

in  many  membrane  related  proteins.  However,  due  to  their  lack  of  selectivity,  the pharmaceutical application of natural encoded AMPs is limited. Alternatively, designed AMPs  are  able  to  overcome  this  problem.  Nowadays,  different  mutations  of  natural AMPs can be easily synthesized and tested against different bacterial strains in order to 

find  AMPs  with  better  selectivity.  De  novo  designing  of  AMPs  using  computational 

simulation further enlarge the pool of available peptide candidates. 

In  a  previous  study  (Frecer  et  al.  2004)  a  series  of  de  novo  designed  AMPs  was 

proposed. These AMPs have a common motif of HBHPHBH (H: hydrophobic; B: basic; P: polar)  derived  from  a  LA‐  (lipid  A) or  LPS‐  (lipopolysaccharide)  binding  pattern.  Among the 7 designed peptides, V4 has the best combination of high antimicrobial activity, low cytotoxic and low hemolytic activity. However its application is limited due to its strong hydrophobicity as shown in previous study (Yu et al. 2005). To overcome this limitation, modifications of V4 peptides were proposed in the current study. Fluorescence imaging and  spectroscopy  were  used  in  this  study  to  investigate  how  peptides  interact  with different membrane system. More specifically, the aims are: 

‹ To  investigate  how  different  hydrophobicity  would  affect  the  solubility  of  the 

‹ To  study  the  binding  affinity  of  modified  V4  to  LPS  on  the  outer  membrane  of Gram‐negative  bacteria,  and  different  phospholipids  liposomes  which  mimic different  cytoplasmic  membranes  to  elucidate  the  membrane  activity  and specificity of different peptides. 

‹ To  compare  the  ability  to  induce  membrane  permeabilization  for  different peptides. 

‹ To  extend  previous  in  vitro  work  to  in  vivo  (measurement  on  Gram‐negative 

bacteria)  from  which  more  biological  relevant  results  on  activity  of  the  peptides will be provided. 

‹ To  elucidate  the  possible  mechanisms  of  interaction  between  AMP  and membranes. 

‹ To apply new techniques (imaging total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy) to study the peptide‐lipid interaction. 

The  study  is  aimed  to  enhance  the  understanding  of  the  specificity  of  the  V peptide  family  and  their  mode  of  action  on  membranes.  It  may  also  provide  more evidence  for  the  hypothetic  mechanism  of  interaction  between  V  peptides  and  lipid membranes. Moreover, the results could contribute to the rationale of designing novel 

antimicrobial drugs and provide useful information concerning new antimicrobial drugs.  

Information  on  the  mechanism  of  the  interaction  between  AMPs  and  lipid membranes  can  be  provided  by  fluorescence  correlation  spectroscopy  (FCS),  which  is the  main  technique  used  in  this  study.  However  FCS  cannot  distinguish  between insertion  and  adsorption  when  peptides  interact  with  lipid  membranes.  Moreover investigation  could  be  performed  on  different  types  and  strains  of  Gram‐negative  and 

Gram‐positive  bacteria,  providing  a  much  more  comprehensive  idea  on  the  effect  of AMPs on different bacteria. 

In this thesis fluorescence imaging and spectroscopy are proved to be useful tools 

to  study  the  interactions  between  AMPs  and  membranes  and  related  mechanism. Different membrane models are applied in this study, including micelles, small and large unilamellar  vesicles  (liposomes).  Micelles  and  small  unilamellar  vesicles  are  used  for investigating  the  binding  affinity  of  peptides  (chapter  2)  and  large  unilamellar  vesicles are used to study membrane permeation (chapter 3). Details in the methodology will be presented  in  each  related  chapter.  In  chapter  4,  a  recently  developed  method  called imaging total internal reflection fluorescence correlation spectroscopy (ITIR‐FCS) will be characterized  and  applied  to  peptide‐lipid  interaction  study.  A  final  conclusion  of  this study will be presented in chapter 5 including an outlook on future work. 

In  chapter  1.1,  previous  studies  on  AMPs  will  first  be  reviewed,  including  the 

general  introduction  of  AMPs,  de  novo  designed  AMPs  and  proposed  mechanisms  of 

peptide‐lipid interaction. After that, FCS as the main technique used in this study will be discussed in detail. 

1.1 Introduction to Antimicrobial peptides 

Since the early 1900s, the wide usage of antibiotics almost wiped out all diseases caused  by  bacterial  infection  (Breithaupt  1999).  The  discovery  of  antibiotics  has drastically increased human life expectancy. But due to indiscriminate use of antibiotics, bacteria  develop  multiple  resistances  to  the  currently  available  antibiotics  (Breithaupt 1999;  Lee  2008).  The  fact  that  bacteria  can  exchange  plasmids,  hence  spread  drug 

resistance  further  exacerbates  the  situation  (Hughes  et  al.  1983).  On  the  other  hand, only a few classes of antibiotics have been approved for clinical use in the last few years, including  daptomycin,  tigecycline  and  linezolid  (Lee  2008).  In  some  cases  due  to  the multi‐drug resistant pathogen, the treatment appears to go back to the so called “pre‐antibiotic era” (Breithaupt 1999; Lee 2008).  

In the last decade, AMPs have become promising candidates for novel antibiotics (Breithaupt 1999; McPhee et al. 2005). AMPs are small, with up to 50 amino acids, and usually  positively  charged  (due  to  arginine,  lysine,  or  histidine  in  acidic  condition)  and amphiphathic  (contains  >50%  hydrophobic  amino  acids)  (Reddy  et  al.  2004;  Gordon  et 

al.  2005).  More  information  on  AMPs  can  be  found  in  the  following  section  (1.1.1) including origins, structural features and therapeutic potential of AMPs.  

Normal  antibiotics,  which  are  usually  bacteriostatic  (prevent  bacterial  growth), work by inhibiting the synthesis of bacterial cell wall or proteins which are essential for cell growth. On the other hand, AMPs being bactericidal kill bacteria directly. However due  to  their  lack  of  selectivity  they  are  limited  in  pharmaceutical  use,  even  though designed AMPs can possibly overcome this limitation (Frecer et al. 2004) (refer to 1.1.2). AMPs  kill  bacteria  (Andreu  et  al.  1998;  Sitaram  et  al.  1999)  by  permeablizing  the membrane,  so  it  is  unlikely  for  bacteria  to  develop  drug  resistance  since  they  have  to adapt  themselves  to  the  new  drug  by  evolving  new  membranes  together  with  related proteins.  More  recently,  researchers  also  found  that  AMPs  are  also  involved  in  the immunomodulation  acting  as  cytokines  to  modulate  the  adaptive  immune  response (Brogden  2005).  But  in  general,  the  mechanism  of  AMPs  is  still  unclear,  and  further investigation is needed.  

1.1.1 Antimicrobial peptides 

1.1.1.1 Biological activities of antimicrobial peptides 

AMPs are ancient defense molecules which have evolved over at least 2.6 billion years.  Nowadays  AMPs  still  remain  effective  as  defensive  weapons.  The  existence  of AMPs  throughout  the  evolution  disconfirm  the  idea  that  bacteria  are  able  to  develop resistance to any feasible drugs (Zasloff 2002). AMPs have a very broad spectrum against different  microbes,  including  Gram‐negative  bacteria,  Gram‐positive  bacteria,  viruses, fungi  and  cancer  cells  (Reddy  et  al.  2004),  with  various  mode  of  action  (Zasloff  2002). AMPs  can  be  found  in  different  organism  and  species,  including  insects,  amphibians, mammals  and  plants,  where  they  act  as  the  first  component  to  defend  hosts  from pathogen invasion. In higher vertebrates, this is complemented by the response of the adaptive  immune  system  which  usually  acts  several  days  after  bacterial  infection (Hancock et al. 1998; Breithaupt 1999).  

1.1.1.2 Origins of antimicrobial peptides 

AMPs  are  present  in  a  wide  range  of  organisms.  Till  now,  almost  1500  different AMPs  have  been  identified  or  predicted  from  nucleic  acid  sequences (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). This section will briefly review a selective range of peptides  originating  from  mammals,  amphibians,  insects,  crustaceans,  plants,  bacteria, and viruses.  

Peptides from Mammals  

The most studied mammalian AMPs are defensins (Hancock et al. 1999; Ganz 2003; Oppenheim  et  al.  2003).  Defensins  are  divided  into  two  main  subfamilies,  namely  α‐defensins  and  β‐defensins.  In  mammals,  α‐defensins  are mainly  present  in  neutrophils 

and  paneth  cells,  and  the  β‐defensins  are  expressed  in  epithelial  cells  and  leukocytes. Both  α‐  and  β‐defensins  have  high  arginine  content.    6  cysteine  residues  form intramolecular  disulfide  bridges  resulting  in  a  triple‐stranded  β‐sheet  structure connected  by  a  loop  with  a  β‐hairpin  hydrophobic  finger.  But  the  length  of  peptide segments between cysteines and pairing of the cysteines are different in the two groups. Apart  from  α‐  and  β‐defensins,  another  subgroup  of  defensins  with  distinct  structure called θ‐defensin has been identified (Tang et al. 1999). By an unknown process, cyclic θ‐defensin  is  generated  by  splicing  and  cyclization  of  an  α‐defensin‐like  precursor. Peptides originating from human, such as cathelicidins, histatins and protegrins (Reddy 

et al. 2004; De Smet et al. 2005) were also found. Peptides from the family of histatins are small, cationic, histidine‐rich peptides isolated from human saliva. Cathelicidin (LL‐37) 

is derived proteolytically from the C‐terminal end of the human CAP18 protein. Histatins and cathelicidins form an α‐helical structure in a hydrophobic environment. 

Peptides from amphibians  

From the first discovered AMP bombinin (Kiss et al. 1962; Csordas et al. 1970), a large number of AMPs have been identified from amphibians, including magainins. One characteristic of amphibian peptides is that they tend to lack sequence similarity (Kreil 1994). There is no homology between AMPs from one species to another. However, all amphibian  peptides  are  predicted  to  form  cationic  amphipathic  α‐helices  (magainins, dermaseptins, and buforin II), or cysteine‐disulfide loops (ranalexin and brevinins). 

Peptides from Insects  

Since the first characterization of an AMP in moth (Steiner et al. 1981), more than 

170 peptides have been identified from different insects (Bulet et al. 1999). Insect AMPs 

are  divided  into  two  groups  based  on  their  sources,  namely  peptides  expressed  inside the  body (cecropin from moth haemolymph) (Hultmark et al. 1980) or outside the body (melittin  from  bee  venoms)  (Habermann  1972).  Different  insects  generate  a  series  of 

AMPs  when  they  suffer  an  injury.  Drosophila  (drosophila  melanogaster),  for  example, 

contains  7  different  AMPs  in  its  hemolymph,  namely  drosomycin,  cecropin,  drosocin, metchnikowin,  defensin,  diptericin  and  attacin  (Hergannan  et  al.  1997).  15  peptides, named  ponericins,  were  isolated  from  the  venom  of  a  certain  subfamily  of  ant  called 

Pachycondyla  goeldii  (Orivel  et  al.  2001),  which  show  similarity  with  peptides  such  as 

cecropins,  melittins  and  dermaseptins.  One  interesting  finding  is  that  Drosophila  can differentially  express  several  AMPs  in  response  to  various  classes  of  microorganisms, and also show adapted response to entomopathogenic fungi by producing only peptides with antifungal activities (Lemaitre et al. 1997). More recently (Lee et al. 1989; Boman 1995), the broader distribution of cecropin was revealed by the discovery of mammalian cecropin in porcine small intestine. 

Peptide from other sources  

AMPs  have  also  been  isolated  from  other  sources,  such  as  crustaceans,  plants, bacteria,  and  viruses.  Tachyplesin,  polyphemusin,  big  defensin  and  tachycitin  were isolated from different species of horseshoe crabs (Nakamura et al. 1988; Miyata et al. 1989; Saito et al. 1995; Kawabata et al. 1996). Androctonin (Ehret‐Sabatier et al. 1996) and penaeidin (Destoumieux et al. 2000) were isolated from crustaceans shrimp, or even from scorpion. Thoinin from a number of plant species (Florack et al. 1994), bacteriocins (Hancock  et  al.  1999)  from  Gram‐positive  and  Gram‐negative  bacteria  and  LLPs  from  virus (Tencza et al. 1997) are identified.   

Other  promising  sources  of  AMPs  are  synthetic  peptides.  A  series  of  AMPs  have been synthesized by modifying the sequence of their natural analogues, or according to 

a prediction of amphipathic structure. The ultimate goals of investigations on synthetic AMPs are to produce AMPs with higher antimicrobial activities and to gain more insight into the mechanism of AMPs interacting with living cells.  

1.1.1.3 Structural features of antimicrobial peptides 

Within AMPs from the same the species or higher taxonomic levels, the conserved sequences  are  considered  to  regulate  the  translation,  secretion  and  trafficking  of  the peptides (Zasloff 2002). However, diversity in the sequences of AMPs is high such that the same peptide sequence is rarely conserved in two different species, even when they are  closely  related.    This  diversity  of  AMP  sequences  indicates  adaptation  of  different species  to  the  environment.  The  biological  activity  of  individual  peptides  can  be dramatically  changed  by  a  single  mutation  in  its  sequence.  Thus  the  species  could survive  by  emergence  of  beneficial mutations  from  different  individuals  (Zasloff  2002). Due  to  the  great  diversity  in  AMPs,  we  can  only  categorize  them  based  on  their structural  features.  Different  reviews  have  provided  various  classifications  based  on different  criteria  (Boman  1995;  Blondelle  et  al.  1999;  Epand  et  al.  1999;  Reddy  et  al. 2004;  Brogden  2005;  McPhee  et  al.  2005).  In  this  work,  AMPs  will  be  categorized according to their secondary structure. 

α‐helical antimicrobial peptides 

Cationic  linear  α‐helical  AMPs  may  be  the  most  widely  spread  and  best characterized peptides, including melittin, magainin, cecropin, cathelicidin (Blondelle et 

al. 1999; McPhee et al. 2005) as well as a number of de novo designed AMPs (Dathe et 

al.  1996;  Dathe  et  al.  1997;  Wieprecht  et  al.  1997;  Dathe  et  al.  2002).  In  aqueous solution,  many  of  these  peptides  exist  in  a  disordered  structure.  However  upon interaction  with  hydrophobic  solvents  or  surfaces  such  as  trifluoroethanol,  sodium dodecyl  sulphate  (SDS)  micelles  or  phospholipid  vesicles,  they  fold  into  an  α‐helical conformation.  α‐helical  peptides  are  often  found  to  be  amphipathic,  and  thus  can adsorb  onto  bacterial  membrane  surfaces  and  insert  into  the  lipid  membranes  as  a cluster  of  helical  bundles.  However,  there  are  also  α‐helical  peptides  that  are hydrophobic (gramicidin A) or even slightly anionic (alamethicin) (Epand et al. 1999). In general, an amphipathic helical structure is considered to be important for antimicrobial and cytotoxic activity. For example magainin loses its helical structure and antimicrobial activity  when  only  few  amino  acids  were  replaced  with  their  D‐isomers  (Chen  et  al. 1988), even though exceptions to this do exist. By adding some D‐amino acid residues, α‐helical  pardaxin  (Oren  et  al.  1999)  was  converted  to  β‐structure,  losing  hemolytic activity  but  keeping  antimicrobial  activity.  Thus  the  structure‐activity  relation  is  still under debate.  

β‐sheet antimicrobial peptides 

These peptides constitute a large family of cyclic peptides in the presence of two 

or more β‐strands stabilized by one or more intramolecular disulfide bonds. In aqueous solution they mainly exist as β‐sheets, which are further stabilized upon interaction with lipid  surfaces  (Blondelle  et  al.  1999).  Among  all  β‐sheet  AMPs,  defensins  are  the  best‐characterized  subgroup.  Both  α‐defensins  and  β‐defensins  contain  3  β‐strands  and  6 cysteines which form 3 disulfide bonds, namely between C1‐C6 (disulfide bond between 

1st cysteine and 6th cysteine), C2‐C4, C3‐C5 for α‐defensins and C1‐C5, C2‐C4, C3‐C6 for 

A subgroup of these peptides may relate to β‐hairpin AMPs, e.g. bactenecins from cattle neutrophils are cyclic peptides containing one disulphide bond and a β‐turn. There are  also  peptides  whose  backbones  are  covalently  cyclized,  such  as  gramicidin  S  and polymyxin B (Hancock et al. 1999). 

Extended antimicrobial peptides 

Extended AMPs are a class of peptides lacking a typical secondary structure. They are usually rich in one or more specific amino acids (McPhee et al. 2005). Tritrpticins and indolicidins  are  examples  of  this  class.  They  are  rich  in  tryptophan  residues,  namely  3 and 5 tryptophan residues in their total 13 amino acids. They form a boat‐like structure when binding to diphosphatidylcholine (DPC) (Schibli et al. 1999; Rozek et al. 2000). The 

tryptophan‐rich  region  in  the  middle  of  the  peptides  interacts  with  one  layer  of  the membrane,  and  orients  the  two  termini  toward  the  aqueous  environment.  Other peptides,  such  as  histatin  isolated  from  human  saliva  is  rich  in  histidine  residues  (18‐29%)  and  highly  cationic  (De  Smet  et  al.  2005).  Bac‐5  and  Bac‐7  identified  in  bovine neutropils  are  rich  in  proline.  PR‐39  found  in  porcine  neutrophils  is  rich  in  proline  and arginine (Agerberth et al. 1991). Peptides rich in glycine can be found in amphibians and insects  (Otvos  2000;  Orivel  et  al.  2001).  Glycine‐rich  peptides  may  show  structural similarity to peptides such as melittin, cecropin or attacin. 

Although  AMPs  show  large  variation  in  their  structures,  they  do  share  some common features (Brogden 2005).  

(1) The usual size of AMPs is small, and ranges from 6 to 59 amino acids.  

(2)  Most  natural  AMPs  are  positively  charged.  They  are  cationic  peptides  rich  in arginine and lysine. The net charge usually ranges from +2 to +9 and varies with pH. The positive  charge  facilitates  the  selective  binding  of  peptides  to  negatively  charged membranes of both Gram‐positive and Gram‐negative bacteria. Anionic peptides rich in aspartic and glutamic acids also exist. However, a local cationic part is needed to interact with  negatively  charged  lipids.  Subtilosin  A  is  an  anionic  peptide,  though  its  lysine‐rich part  facilitates  its  binding  to  the  lipid  membrane  (Thennarasu  et  al.  2005).  Anionic peptides  complexed  with  zinc  or  highly  cationic  peptides  are  often  more  active  than neutral  peptides  or  those  with  a  lower  charge.  However  there  is  no  direct  correlation between  the  number  and  position  of  positive  charged  amino  acids  and  antimicrobial activity  and  specificity.  Highly  cationic  peptides  may  have  lower  or  even  lose antimicrobial activity (Dathe et al. 1999). The optimal charge was found to be between +4 and +6 (Tossi et al. 2000).  

(3) Studies have shown that amphipathicity of AMPs is crucial regardless of their secondary  structure  (Blondelle  et al.  1992;  Dathe  et al.  1999;  Kondejewski  et  al.  1999; Park et al. 2005). In an AMP, hydrophilic amino acid residues are located on one side of the peptide molecule and hydrophobic amino acids are located on the opposite side. For α‐helical peptides, amphipathicity is often defined as the vector sum of hydrophobicity indices,  which  indicates  the  spatial  separation  between  hydrophilic  and  hydrophobic side  chains.  Usually,  increasing  amphipathicity  can  lead  to  an  increasing  hemolytic activity  and  decreasing  antimicrobial  activity  (Dathe  et  al.  1999;  Kondejewski  et  al. 1999).  

(4)  The  hydrophobic  faces  of  the  molecule  enable  soluble  peptides  in  aqueous solution to partition into hydrophobic lipid bilayers. Thus hydrophobicity is expected to strongly  regulate  membrane  activity  of  AMPs.  Hydrophobicity  is  expressed  as  the average of the numeric hydrophobicity values of all amino acid residues (Eisenberg et al. 1984). Increasing hydrophobicity is related to an enhanced hemolytic effect (Dathe et al. 1999).  However,  the  relation  between  hydrophobicity  and  antimicrobial  activity  is  still debated.  

(5)  As  mentioned  above,  AMPs  can  adopt  a  series  of  secondary  structures. Peptides  with  α‐helix  and  γ‐core  motif  (defensin‐like  structure)  often  show  higher activity  compared  to  those  with  less‐defined  structures.  For  α‐helical  peptides,  higher helicity can facilitate a better spatial distribution of hydrophobic and hydrophilic amino acids,  resulting  in  higher  amphipathicity.  However,  in  designing  an  AMP,  helicity  is always  closely  related  to  both  amphipathicity  and  hydrophobicity.  The  reduction  of disulfide  bonds  presented  in  β‐sheet  structures  may  change  the  activity  or  even mechanism of the interaction of peptides (Andreu et al. 1998).  

With high occurrence of bacterial resistance towards antibiotics, it is urgent need for  discovering  and  developing  novel  classes  of  drugs  to  control  bacterial  infections. AMPs  which  target  the  membrane  make  it  difficult  for  bacteria  to  develop  drug resistance, and hence are promising candidates to achieve this target. 

1.1.2 Designed antimicrobial peptides 

The previous section briefly induces researches on natural AMPs recently. A large numbers  of  natural  AMPs  have  been  identified  which  show  a  broad  spectrum  against different pathogens. For example, magainins show antimicrobial activity against Gram‐positive  and  Gram‐negative  bacteria,  fungi,  protozoa  and  even  viruses  (Zasloff  1987; Zasloff  et  al.  1988;  Schuster  et  al.  1992).  Gramicidin  S,  also  show  good  performance against Gram‐positive and Gram‐negative bacteria, and certain fungi (Kondejewski et al. 1996;  Prenner  et  al.  1999).  However  natural  AMPs  are  often  cytotoxic  against mammalian  cells,  and  this  limits  their  potential  in  pharmaceutical  applications.  Thus large  efforts  have  been  undertaken  to  modify  native  AMPs  or  design  new  synthetic peptides in order to obtain AMPs showing better specificity against microbes with lower 

Hybrid  peptides  such  as  HP‐MA,  HP‐ME  (Helicobacter  pylori  ribosomal  protein  L1  and 

magainin 2 or melittin) (Kim et al. 2002) and cecropin A (1‐13)‐melittin (1‐13) (Boman et 

al. 1989) show higher or similar antimicrobial activity against Gram‐negative and Gram‐positive  bacteria  compared  to  its  protein  or  AMP  precursors,  whereas  the  hemolytic effect  was  abolished.  Another  study  (Lee  et  al.  2004)  on  the  structure‐activity 

relationship was performed on hybrid peptide cecropin A (1–8)‐magainin 2 (1–12), which suggest  the  amino  acid  residue  at  position  16  drastically  affects  its  antimicrobial  and 

antiviral  activity.  De  novo  design  is  another  important  way  to  produce  new  peptides.  DeGrado et al. reported the first de novo design of antibacterial β‐peptides and later a 

series of helical β‐peptides (Hamuro et al. 1999; Liu et al. 2001). GS14K4 (Lee et al. 2003) 

is  a  de  novo  design  based  on  the  framework  of  gramicidin  S.  Study  on  GS14K4  and  its 

analog shows that higher hydrophobicity is required against Gram‐positive bacteria and yeast compared to Gram‐negative bacteria. Shai et al. designed a group of diastereomer (containing D‐ and L‐amino acids) AMPs showing no hemolytic effect (Shai et al. 2001; Shai 2002).  

Due to the small size of AMPs, it is relatively easy to synthesize peptides and their different  analogs  chemically.  The  study  on  characteristics  of  these  newly  designed peptides can give guidance in rational designing AMPs to fulfill different pharmaceutical requirements. 

1.1.2.2 De novo designed V peptide family 

Early studies revealed an amphipathic highly cationic LPS‐ (lipopolysaccharide) or LA‐ (lipid A) binding motif from the endotoxin‐binding host defense protein (Hoess et al. 1993;  Ried  et  al.  1996).  LPS,  one  of  the  components  forming  the  outer  membrane  of Gram‐negative bacteria (refer to 1.1.3.1 for details), is shed during infection and lysis of bacteria  (Tracey  et  al.  1987).  The  released  LPS  will  cause  endotoxemia,  one  of  the leading causes of death in the developed world (Parillo 1993). Developing novel classes 

of AMPs neutralizing LPS can help to lower the risk of suffering endotoxic shock during and  after  treatment  of  bacterial  infection  (Hancock  1999).  The  eradication  of  Gram‐

negative  bacteria  by  cationic  peptides  targeting  LPS  (Boman  1995;  Gough  et  al.  1996; 

Hancock 1999) brings the idea of de novo design of AMPs based on this LPS‐/LA‐ binding 

motif.  

Previous  studies  proposed  a  relatively  short  symmetric  amphipathic  peptide sequence  HBHPHBH  and  HBHBHBH  (where  B  is  a  cationic  residue,  H  is  a  hydrophobic residue, and P is a polar residue) (Frecer et al. 2000; Frecer et al. 2004). The designed peptides  adopt  β‐sheet  conformation  (Frecer  et  al.  2004),  and  strongly  bind  to  the bisphosphorylated  glucosamine  disaccharide  head  group  of  LA,  primarily  by  ion‐pair formation  between  anionic  phosphates  of  LA  and  the  cationic  side  chains.  Among  all these  peptides,  V4  (CVKVQVKVGSGVKVQVKVC,  cyclized  between  two  cysteines)  shows the  most  outstanding  performances.  Both  molecular  dynamics  (MD)  simulation  and experimental data indicate its high specificity, high antimicrobial activity, low cytotoxic activity and low hemolytic activity (Frecer et al. 2004; Yu et al. 2005; Yu et al. 2009). However  due  to  the  high  percentage  of  valine  presented  in  V4,  it  is  highly hydrophobic resulting in aggregation in solution (Yu et al. 2005). Even DMSO, detergent and  LPS  cannot  fully  dissolve  V4.  These  aggregates  are  considered  to  be  biologically inactive. The fact that only 0.77% of the peptide is dissolved and active greatly limits the application of V4. To improve its performance, V4 can be redesigned to contain a higher percentage  of  polar  amino  acids  or  hydrophobic  valine  residues  replaced  with  more hydrophilic amino acids.  

In  this  study,  a  series  of  modified  V4  (MV4)  peptides  are  designed  (table  1.2, information provided by V. Frecer), including truncated V4 (TV4), V4‐norvaline (V4norv), V4‐aminobutyric acid (V4abu) and V4‐alanine (V4ala). TV4, as the name implies, is only a portion  of  the  original  V4.  It  contains  only  one  binding  motif,  and  the  sequence  is 

VKVQVKVGSG. V4norv, V4abu and V4ala have exactly the same sequence as V4 except all  the  valines  are  substituted  by  L‐norvalines,  L‐2‐aminobutyric  acids  and  L‐alanine, respectively. Some predicted properties of the new analogs are listed in table 1.2. It is expected that with less hydrophobic amino acids forming the nonpolar face, the extent 

of  aggregation  is  decreasing  whereas  the  predicted  antimicrobial  activities  remain almost the same. 

b Amino acid forming the nonpolar face;

c H side chain lipophilicity coefficient;

d Number of replaced H residues;

e Amphipathicity index (AI) was defined as the sum of experimental amino acid side chain lipophilicity parameters  π  over the subset containing B/P residues (all residues with odd sequential numbers in V4) and forming the polar face of the cyclic peptide as: AI = ΣiPF (π)i (PF = polar face) The π  is defined by means

of interphase partitioning coefficients (P o/w ) of the side chains measured in the n-octanol/water system (Fauchere 1996);

f lipophilicity index (Π o/w ) of the peptides was derived as the sum of lipophilicity parameters π o/w as: Π o/w =

Σi (π)i over all residues;

g averaged antimicrobial potency predicted from the QSAR model: ln(MIC ave ) = 9.49 Q M +10.17 AI- 0.05

Π o/w - 22.16 derived for V peptides (Frecer et al 2004); experimentally determined for original V4, predicted for analogs

1.1.3 Mechanism of antimicrobial peptides 

For both natural and designed AMPs, with low cytotoxicity they can selectively kill microbes without harming the host. This selectivity makes AMPs a promising new class 

of antibiotics. As mentioned earlier, researchers believe that AMPs target the bacterial cell membrane which protects the cells from the environment. And due to their highly cationic  property,  AMPs  show  a  strong  affinity  to  the  negatively  charged  surface  of 

bacterial membranes. In this case, AMPs can distinguish microbes and host cells by the recognition of particular molecules that are common to pathogens but absent for host, especially  molecules  on  bacterial  membranes.  In  this  section  the  target,  which  is  the bacterial cell membrane, and the mechanism of AMPs will be discussed. 

1.1.3.1 Biological membranes 

The unique compositional and structural features of bacterial cell membranes are shown  in Fig  1.1  and  1.2 (Alberts  2002;  Varki  et  al.  2002).  A  polymer  layer  called  the peptidoglycan  layer  is  located  immediately  outside  the  inner  membrane.  Poly‐N‐acetylglucosamine and N‐acetylmuramic acid residues are cross‐linked to form a mesh‐like  layer  which  provides  the  structural  strength  of  the  bacterial  cell  wall.  Bacteria  are categorized into two main types, Gram‐positive and Gram‐negative bacteria, depending 

on  their  thickness  of  the  peptidoglycan  layer.  The  peptidoglycan  layer  is  significantly thicker in Gram‐positive bacteria (20 – 80 nm) than in Gram‐negative bacteria (7 – 8 nm). Outside  the  peptidoglycan  layer,  there  is  another  outer  membrane  rich  in polysaccharides. In Gram‐positive bacteria, polysaccharides (teichoic acids) and its lipid‐linked analogs (lipoteichoic), embedded in this outer membrane, are negatively charged. Likewise,  lipopolysaccharides  (LPS)  present  in  the  Gram‐negative  bacteria  outer membrane  are  negatively  charged.  Thus  the  outer  membrane  of  bacteria  is  highly negatively charged  for  both  types  of  bacteria.  In  addition  to  the  outer  membrane,  the outer  leaflet  of  the  bacterial  inner  membrane  is  also  highly  populated  with  negatively charged  phospholipids.  In  constrast,  the  outer  leaflet  of  mammalian  cells  is  mainly composed  of  zwitterionic  lipids,  most  of  the  negatively  charged  lipids  are  segregated into the inner leaflet, thus possessing a neutrally charged outer surface (Matsuzaki 1999). 

The difference in the surface charge between bacterial and mammalian cells gives rise to the  different  affinity  of  AMPs  to  pathogens  or  host  cells.  Research  also  showed  that cancerous cells lose their lipid asymmetry and express negatively charged lipids on the outer leaflet, which can facilitate the antitumor activity of AMPs (Utsugi et al. 1991). 

Fig 1.1 Schematic representation of the Gram-negative bacteria cell wall showing several layers of polysaccharides and glycoconjugates, with reference from Essentials of glycobiology (Varki et al 2002) Red lipid indicates phosphatidyl-ethanolamine Yellow lipid indicates phosphatidylglycerol

Fig 1.2 Schematic representation of cell wall from Gram-positive bacteria, with reference from Essentials of glycobiology (Varki et al 2002) Gram-positive bacteria have a thicker layer of peptidoglycan which contains teichoic acids

Inner Membrane

Periplasm Lipoproteins

Phospholipids Protein Cytoplasm

Peptidoglycan MDO

LPS

Lipid A Porin

O-antigen repeat

Outer Core

Inner Core

Outer Membrane

Protein Cytoplasm

Peptidoglycan

LTA

LPS,  also  known  as  endotoxin,  is  an  important  cause  of  disease.  Bacteria  can release  toxins  into  host  organisms.  Different  form  “exotoxins”  which  are  excreted  by microorganisms,  endotoxins  are  toxins  from  structural  components  of  the  bacteria which are released when the bacteria are lysed. LPS is composed of three parts, namely lipid A, non‐repeating “core” oligosaccharide, and distal polysaccharides (or O‐antigen) (Raetz et al. 2002) (Fig 1.1). 

Fig 1.3 Structure of lipid A

Many of the immune activating abilities of LPS are attributed to the conserved lipid 

A  unit.  The  hydrophobic  lipid  A  anchors  LPS  to  form  the  outer  leaflet  of  the  outer membrane  for  Gram‐negative  bacteria.  The  glycan  structure  of  Lipid  A  consists  of  two β1–6 linked glucosamine residues with attached acyl chains (10 – 16 carbons in length), and  usually  contains  one  phosphate  group  on  each  carbohydrate.  Lipid  A  with  6  acyl chains  is  considered  to  be  the  optimal  immune  activating  structure.  In  E.  coli  lipid  A 

(shown in Fig 1.3), two units of β‐hydroxymyristic acid bind directly to the glucosamine sugars  on  each  glucosamine  residues,  one  in  ester  linkage  at  C‐3  and  one  in  amide linkage at C‐2. One additional lauroyl group and one myristoyl group are attached to the hydroxymyristic acid on the β‐hydroxy group.  

All lipid A molecules contain 1 – 4 unusual sugar units (such as 3‐deoxy‐D‐manno‐oct‐2‐ulosonic  acid,  heptoses,  hexoses,  and  hexosamines)  and  phosphate  groups forming the core region (Fig 1.3) (Erridge et al. 2002). In E. coli lipid A, the Kdo (3‐deoxy‐D‐manno‐oct‐2‐ulosonic acid) domain, together with the phosphate group on glycan in lipid  A,  can  bind  to  divalent  cations  and  stabilize  the  outer  membrane  (Nikaido  et  al. 1985; Varki et al. 2002; Zasloff 2002). Lipid A and Kdo (or Kdo like sugar) are minimum requirements for forming an LPS molecule (Raetz 1990; Schnaitman et al. 1993; Brabetz 

et al. 1997).  

The  outermost  portion  of  LPS  consists  of  the  polysaccharide  side  chain  called  O‐antigen.  The  length  and  the  sugar  composition  vary  between  different  Gram‐negative bacterial strains. Generally, it contains up to 50 subunits which are composed of 1 – 8 sugar  residues,  with  an  additional  cap  containing  0  –  50  residues  (Erridge  et  al.  2002; Varki et al. 2002). The sugar presented includes free and amidated uronic acids, amino sugars,  methylated,  deoxygenated  and  acetylated  sugars,  and  others  covalently  bound 

to amino acids and phosphate (Varki et al. 2002). The O‐antigen provides a hydrophilic barrier  that  protects  bacteria  against  hydrophobic  antibiotics,  bile  acids,  and  other materials.  Antibodies  of  the  host  recognize  pathogens  depending  on  the  O‐antigens. However, Gram‐negative bacteria can easily modify the sugar chain to avoid detection. When  released  into  the  animal  blood  circulation,  LPS  induces  a  strong  immune response in the hosts. By binding to the CD14/TLR4/MD2 receptor complex (Triantafilou 

et al. 2005) on monocytes and macrophages, it triggers the secretion of cytokines which are regulators of host responses to infection, inflammation, and trauma. Some cytokines serve to reduce inflammation and promote healing (anti‐inflammatory). However there are  also  pro‐inflammatory  cytokines,  for  example  Interleukin  (IL)‐1  and  tumor  necrosis factor  (TNF)  (Dinarello  2000).  Both  of  them  cause  dire  physiological  reactions,  such  as fever, inflammation, tissue destruction, and, in some cases, shock and even death.  AMPs are an effective way to kill bacteria. LPS serves as the first target for AMPs to kill  Gram‐negative  bacteria.  Researchers  showed  that  AMPs  interact  with  LPS  on  the outer  membrane  of  Gram‐negative  bacteria,  and  are  subsequently  taken  up  by  a  “self promoted uptake pathway” (Piers et al. 1994; Falla et al. 1996; Hancock 1997). Cationic AMPs  show  higher  affinity  (at  least  3  orders  of  magnitude)  to  LPS  compared  to  native divalent cations such as Ca2+ or Mg2+. Thus by adding AMP to the Gram‐negative bacteria, the  peptide  will  competitively  displace  the  cations.  The  bulky  peptides  destabilize  the outer  membrane  and  facilitate  entry  of  additional  molecules  from  the  exterior.  Thus more peptide molecules gain access to the periplasmic space to integrate into the inner membrane. 

The  inner  membranes  have  a  major  role  in  maintaining  cytoplasmic  integrity, transporting  substances  into  and  out  of  the  cytoplasm,  excluding  harmful  substances, generating  cellular  energy  and  maintaining  the  transmembrane  pH  gradient.  Hence, formation  of  channels  on  the  inner  membranes  kills  the  bacteria  (Hancock  1997). Typically  the  positively  charged  residues  of  the  peptides  will  first  interact  with  the negatively charged lipid headgroup. After the peptides fold into a certain structure, they aggregate  into  clusters  with  their  hydrophobic  faces  interacting  with  the  membrane hydrophobic fatty acid tail and their hydrophilic faces pointing inwards to form a channel. 

Details  on  different  pore‐forming  mechanisms  are  described  in  the  next  part.  The channels destroy membrane integrity, and the bacterial cell dies. Usually bacteria show large  transmembrane  potentials,  high  content  of  negatively  charged  lipids,  and  lack  of cationic  lipids  and  cholesterol,  which  facilitates  the  channel  formation.  On  the  other hand,  eukaryotic  cells  have  low  membrane  potentials,  high  levels  of  cholesterol,  and modest  anionic  lipid  contents,  hence  are  less  likely  to  be  disrupted  by  the  AMPs. Membrane curvature induced by the relative size of head groups and alkyl chains of lipid molecules  will  also  affects  the  peptide‐lipid  interaction  (Epand  1998;  Matsuzaki  et  al. 1998;  Huttner  et  al.  2002).  The  fluidity  of  the  membrane  (Matsuzaki  et  al.  1991)  is another  parameter  regulating  the  peptide‐lipid  interaction.  Lipids  with  lower  gel  to liquid‐crystalline  transition  temperatures  show  higher  fluidity.  In  the  liquid‐crystalline phase, hydrocarbon chains of the lipid molecules are fluid and randomly oriented thus facilitating peptide‐lipid interaction. However, in gel phase the rigid hydrocarbon chains 

of  lipid  molecules  are  fully  extended  and  closely  packed  hence  hindering  the  peptide‐lipid interaction.  

Apart from the lysis activity of AMPs, LPS‐neutralizing peptides are also found to inhibit LPS‐mediated cytokine release (Tan et al. 2000; Tan et al. 2000; Rosenfeld et al. 2006). A strong binding of a peptide to LPS aggregates competes with the binding of LPS 

to  lipopolysaccharide‐binding  protein,  or  to  its  receptor,  and  hence  inhibits  cytokine secretion resulting in a weaker pro‐inflammation effect. 

1.1.3.2 Model membranes 

Although  actual  biological  membranes  are  ideal  objects  to  study  peptide‐lipid interactions,  accurate  investigation  of  biological  membranes  is  difficult  to  achieve. 

Biological membranes are very complex and are composed of a large variety of lipid and protein  molecules.  Thus  the  interaction  of  peptide  molecules  with  their  actual  target lipid molecules will be strongly influenced by other molecules. Hence model membranes are  introduced  to  simplify  the  task.  Common  model  membranes  include  monolayers, liposomes and supported lipid bilayers (Fig 1.4). Lipid monolayers can be easily formed 

at  the  air/water  interface.  Since  the  introduction  of  experimental  and  theoretical modern  concepts  by  I.  Langmuir,  a  large  number  of  studies  have  been  done  to  study AMPs on monolayers (Maget‐Dana 1999; Lourenzoni et al. 2007).  

Liposome is another commonly used model. Liposomes, or vesicles, are spherical enclosed lipid bilayers composed of similar materials as cell membrane. Liposomes are usually  made  of  phospholipids.  They  can  be  made  in  different  size:  small  unilamellar vesicles  (SUVs),  large  unilamellar  vesicles  (LUVs)  and  giant  unilamellar  vesicles  (GUVs). SUVs  are  usually  smaller  than  50  nm.  They  are  often  used  to  study  binding  activity  of peptides to lipids. SUVs are also used in some spectral measurements, like fluorescence spectroscopy  and  circular  dichroism  spectroscopy  (Matsuzaki  et  al.  1999),  because  the SUV  solution  is  transparent.  LUVs  range  from  50  nm  to  200  nm.  LUVs  are  used  for studying peptide‐induced leakage or disruption (Matsuzaki et al. 1999; Yu et al. 2005). GUVs  can  have  a  diameter  up  to  50  μm  or  more  and  thus  can  be  imaged  using  light microscopy.  GUVs  can  provide  a  direct  visualization  on  how  peptides  affect  lipid membrane  (Ambroggio  et  al.  2005;  Tamba  et  al.  2005).  Supported  lipid  bilayers  are another commonly used model membrane in atomic force microscopy (AFM) (Mecke et 

al. 2005; Shaw et al. 2006), surface plasmon resonance spectroscopy (SPR) (Mozsolits et 

al. 2001; Mozsolits et al. 2002), impedance spectroscopy (Chang et al. 2008; McGillivray 

et al. 2009) and fluorescence microscopy (Bocchinfuso et al. 2009; Fox et al. 2009).  

Fig 1.4 Schematic drawing of different model membranes, namely (A) monolayer, (B) bilayer and (C) lipsome

1.1.3.3 Mechanisms of antimicrobial peptides 

Transmembrane pore‐forming mechanisms 

AMPs must be attached to the bacterial surface before they can kill the bacteria. This  process  is  driven  by  the  electrostatic  interaction  between  AMPs  and  the  acidic (negatively  charged)  lipids  in  membranes  (Matsuzaki  et  al.  1997;  Brogden  2005).  However  in  actual  bacteria,  the  situation  is  complicated  by  the  presence  of  other molecules like sugars and proteins. For cationic peptides, they are first targeted to the lipopolysacchride (LPS) on the outer membrane of Gram‐negative bacteria and teichoic acids  on  the  surface  of  Gram‐positive  bacteria  (Scott  et  al.  1999;  Li  et  al.  2006).  Once attached onto the bacterial cell wall, AMPs must traverse the polysaccharide outer layer 

to interact with the inner membrane. This process is crucial, but is rarely addressed in mechanistic studies. In this section, different models explaining how AMPs lyse the inner membrane are reviewed. 

At  a  low  peptide/lipid  ratio,  peptides  are  only  bound  superficially  to  the  lipid bilayer.  As the peptide/lipid ratio increases, peptides will reorient themselves to insert into the lipid bilayer. Transmembrane pores formed by peptides permeabilize the lipid membrane.  Currently,  there  are  mainly  three  proposed  mechanisms  on  how  AMPs 

A

B

C

Substrate Substrate

Barrel‐stave model  

The  barrel‐stave  model  was  first  proposed  to  explain  the  single‐channel conductance  induced  by  alamethicin  on  lipid  membranes  (Baumann  et  al.  1974).  In short,  peptide  molecules  associate  with  each  other  and  form  a  bundle  with  a  central lumen.  The  hydrophobic  parts  of  the  peptides  align  with  the  hydrophobic  lipid  core region and the hydrophilic part forms the interior region of the pore. The pore is just like 

a barrel made of helical peptides as staves.  

 Fig 1.5 The barrel-stave model of antimicrobial-peptide-induced killing, with reference from the review by Brogden (Brogden 2005)

Carpet model  

In  the  carpet  model,  peptides  are  electrostatically  attracted  to  the  anionic phospholipid headgroups and lie parallel to the surface of the membrane (Pouny et al. 1992).  Peptides  accumulated  on  the  membrane  surface  interact  with  each  other  in  a 

“carpet” like manner. When peptide concentrations reach a critical threshold, peptides are thought to disrupt the bilayer in a detergent‐like manner, eventually leading to the formation of micelles (Shai 1999; Ladokhin et al. 2001). 

Fig 1.6 The carpet model of antimicrobial-induced killing, with reference from the review

is consistent with the barrel‐stave model among several naturally produced amphiphilic peptides, including melittin and protegrins (Yang et al. 2001).  

Intracellular killing mechanism 

Apart from the transmembrane pore‐forming mechanisms described above, other modes of intracellular killing have also been proposed. For example, some anionic AMPs cause  flocculation  of  intracellular  contents  (Brogden  et  al.  1996).  PR‐39,  PR‐26,