giáo trình Sinh Học Phân Tử

Một số tính chất quan trọng của Protein - Liên kết cộng hoá trị trong phân tử protein là liên kết peptide, được hình thành do sự kết hợp nhóm amin của một axit amin với nhóm carboxyl của

CHƯƠNG 1 CÁC ĐẠI PHÂN TỬ SINH HỌC

Hình 1.1: Cấu trúc chung của một amino acid và sự hình thành chuỗi polypeptide, cấu trúc

sơ cấp của tất cả các protein

Mặc dù Protein rất ña dạng nhưng hầu hết chúng ñều ñược cấu tạo từ 20 L-α-axit amin khác nhau và 2 amit tương ứng

Dựa vào ñiện tích của chúng, các axit amin ñược phân thành 4 nhóm chính:

+ Nhóm 1: Các axit amin tính kiềm như Lysine, Arginine, Histidine; ở pH tế bào nhóm

amin ở nhánh bên bị ion hoá thành NH3 nên chúng mang ñiện tích dương

+ Nhóm 2: Gồm Aspartic và Glutamic mang tính acid, với nhóm carboxyl ở nhánh bên

bị ion hoá thành COO-

+ Nhóm 3: Các axit amin trung tính kị nước (không mang ñiện tích) như glicine,

alanine, valine, leucine, izoleucine, có nhánh bên mang các nhóm kị nước

+ Nhóm 4: Các axit amin trung tính phân cực có nhánh bên mang nhóm OH dễ tạo các

nối hydro với nước

Trong số 20 axit amin thường gặp trong phân tử protein có 8 axit amin mà cơ thể người

và ñộng vật không thể tự tổng hợp ñược, phải ñưa từ ngoài vào qua thức ăn, gọi là axit amin không thay thế hoặc axit amin cần thiết Đó là valine, leucine, lycine, izoleucine, phenylalanine, tryptophan, metionine, threonine

Trong phân tử protein, các axit ỏ-amin liên kết với nhau bằng các liên kết cộng hoá trị (covalent bond) gọi là các liên kết peptide hình thành chuỗi polypeptide có số lượng nhác nhau

và thành phần khác nhau về các loại axit amin Liên kết này ñược hình thành do sự kết hợp nhóm amin của một axit amin với nhóm carboxyl của axit amin kế tiếp, phản ứng kết hợp giải phóng 1 phân tử nước

Các protein thường dễ tan trong nước tạo thành các dung dịch keo hấp thụ cực ñại ở bước sóng 280nm trong vùng ánh sáng cực tím nhờ có axit amin là tirozine, phenylamine và tryptophan trong phân tử

Hình 1.2: Hai mươi loại axit amin phát hiện ñược trong tự nhiên

Protein bao gồm bốn dạng biểu hiện của cấu trúc phân tử:

+ Cấu trúc bậc 1 là trình tự sắp xếp các axit amin trong chuỗi polypeptide, ñược tạo ra bởi liên kết peptide (liên kết cộng hoá trị)

+ Cấu trúc bậc 2 bao gồm 3 dạng:

* Xoắn α là những liên kết hydro liên kết không cộng hoá trị giữa nhóm cacbonyl (C=O) của một liên kết peptide thứ nhất (axit amin RN) và nhóm amin (NH) của một liên kết peptide thứ tư (axit thứ RN+4) với 3,6 gốc trên một vòng xoắn ỏ

* Lá gấp β ñược tạo thành nhờ các liên kết hydro của hai chuỗi poppeptide cùng

chiều song song (từng thấy trong protein sợi tơ tằm và nhiều loại khác) hoặc ñổi chiều với nhau do một polypeptiñe bẻ ngoặt và liên kết hydro ñược hình thành ở khúc bẻ ngoặt

* Siêu xoắn Collagen: Bao gồm 3 chuỗi polypeptide bện vào nhau giống như ba

sợi dây thừng bện xoắn nhờ các liên kết hydro giữa các chuỗi polypeptiñe

Cấu trúc bậc 2 ñược bền vững chủ yếu nhờ liên kết hydro ñược tạo thành gữa các liên kết peptide ở gần kề nhau, cách nhau những khoảng xác ñịnh

+ Cấu trúc bậc 3: Là sự tương tác không gian ba chiều giữa các gốc axit amin ở xa nhau trong mạch polypeptide, là dạng cuộn lại trong không gian của toàn mạch polypeptide Cấu trúc này ñược tạo ra chủ yếu bằng các liên kết không cộng hoá trị (liên kết ion, liên kết kỵ nước, liên kết vandervan) và liên kết cộng hoá trị (liên kết peptide và liên kết disulfide)

+ Cấu trúc bậc 4: Là sự tương tác không gian (sự sắp xếp) của hai ñến nhiều chuỗi polypeptide (tiểu ñơn vị - Subunit - thường là một chuỗi polypeptide) trong phân tử protein có cấu trúc khác nhau hoặc giống nhau Các tiểu ñơn vị liên kết với nhau nhờ các liên kết không cộng hoá trị (liên kết hydrô, liên kết ion, liên kết kỵ nước, lực vandervan)

Hỡnh 1.3: Bốn bậc cấu trúc của protein

2 Các chức năng sinh học của protein

- Kiến tạo nên tế bào và cơ thể (collagen, elastin mô liên kết, )

- Xúc tác sinh học: Hầu hết các enzym xúc tác sinh học ñều có bản chất là protein

- Vận chuyển các nguyên tử và phân tử cần cho sự sống, ví dụ hemoglobin vận chuyển phân tử Oxy cần cho hô hấp tế bào, nhiều loại protein màng tế bào tham gia vận chuyển các ion (Na+, K+, H+, )

- Bảo vệ tế bào và cơ thể: Các kháng thể là những protein làm nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch, chống lại tác nhân gây bệnh

- Truyền xung thần kinh: Rodopxin tạo phản ứng cảm giác ánh sáng và hình ảnh,

- Truyền tin: Nhiều protein là các thụ thể hoặc enzyme có vai trò truyền tín hiệu hoá học trong trao ñổi chất, trong nhận diện và ñáp ứng trao ñổi chất, ñáp ứng miễn dịch

- Điều hoà: Một số protein có chức năng ñiều hòa quá trình truyền thông tin di truyền, ñiều hoà quá trình trao ñổi chất, ví dụ như các protein có hoạt tính hormone, protein ức chế ñặc hiệu enzyme, các AMP vòng

- Dự trữ dinh dưỡng: Protein là chất dinh dưỡng quan trọng cung cấp các axit amin cho phôi phát triển (các albumine, globunine ở lòng trắng trứng, gliadine trong hạt lúa mì, ) Ngoài ra, còn có các protein dự trữ khác như cazein trong sữa, feritin (protein dự trữ sắt) trong

lá lách,

Việc phân chia thành các chức năng khác nhau của protein nói trên không phải thật cứng nhắc, thực tế một protein có thể hoàn thành một số chức năng khác nhau

3 Một số tính chất quan trọng của Protein

- Liên kết cộng hoá trị trong phân tử protein là liên kết peptide, được hình thành do sự kết hợp nhóm amin của một axit amin với nhóm carboxyl của axit amin kế tiếp, phản ứng kết hợp giải phóng 1 phân tử nước, theo nguyên tắc này sẽ tạo thành các polypeptide và protein Ngoài ra, liên kết disulfide qua cầu nối S-S giữa các axit amin Cysteine cũng là liên kết cộng hoá trị

- Liên kết không cộng hoá trị trong phân tử protein là liên kết hydrô, liên kết ion, liên kết kỵ nước, liên kết vandervan có trong cấu trúc bậc 3 và bậc 4 của phân tử protein

-Trong phân tử protein thường có 3 axit vòng thơm (Tyrocine, phenylalanine, tryptophan) hấp thụ cao ở bước sóng 280nm Đặc tính này được ứng dụng để định lượng các protein tinh sạch bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 280nm

- Protein có khả năng được kết tủa thuận nghịch bằng muối trung tính ((NH4)2SO4,

Na2SO4) không bị biến chất, hoặc kết tủa ở điểm đẳng điện Đặc tính này được ứng dụng để phân lập và tinh sạch protein

- Dựa vào thành phần protein và phi protein trong cấu trúc mà phân loại thành 2 loại protein:

+ Protein 1 thành phần: là protein không chứa các thành phần khác phi protein (không phải protein) Ví dụ: albumine lòng trắng trứng, lyzozyme,

+ Protein 2 thành phần: là protein phức tạp có cấu tạo gồm phần protein (apoprotein) và phần phi protein Phần không phải là protein thường là các gốc đường, axit nucleic, lipid, Ví

dụ nucleoprotein của nhân tế bào có phần protein có tính kiềm và phần phiprotein là axit nucleic; hemoglobulin là một protein phức tạp có phần apoprotein gồm 4 chuỗi polypeptide, mỗi chuỗi đều kết hợp với một nhóm phi protein là nhân Hem - là vòng porfirin liên kết với một nguyên tử sắt; photphoprotein là một protein phức tạp có nhóm ngoại là axit photphoric (casein của sữa, vitelin của lòng đỏ trứng, )

- Các phản ứng màu đặc trưng của protein:

+ Phản ứng bi-ure do liên kết peptide kết hợp với ion đồng Cu2+ trong môi trường kiềm

và dùng để định lượng protein hoặc peptide bằng đo màu ở bước sóng 540nm

+ Phản ứng giữa các axit amin vòng với thuốc thử Folin-Ciocalteu (chứa ion đồng, axit molipdic và volframat) cho màu xanh, xanh tím Các phản ứng này được sử dụng để định lượng các loại protein ở bước sóng 660nm hoặc 750nm

+ Các axit amin tự do có phản ứng màu đặc trưng với thuốc thử ninhydryl, được dùng để phát hiện và định lượng axit amin

II AXIT NUCLEIC (ADN và ARN)

Axit nucleic là vật chất mang thông tin di truyền của các hệ thống sống, có cấu tạo đa phân (là một polyme) hình thành từ các đơn phân (monome) là nucleotid Mỗi nucleotid gồm

ba thành phần: Nhóm phosphate, đường pentose (đường 5C) và một bazơ hữu cơ (vì các nucleotid chỉ khác nhau ở bazơ nên người ta thường dùng từ bazơ thay cho nucleotid) Các bazơ hữu cơ thuộc hai nhóm: Các purine gồm adenine (A) và guanine (G), các pyrimidine gồm thymine (T), cytosine (C) và uracil (U) Một bazơ nitơ liên kết cộng hóa trị với gốc đường ở vị trí thứ nhất tạo nên nucleoside Nucleoside liên kết với một nhóm phosphate tạo nên nucleotid Các nucleotid được nối với nhau qua các nhóm phosphate và đường pentose - mỗi gốc axit phosphoric liên kết với nguyên tử cacbon số 5’ của một gốc đường khác, qua các liên kết phosphodiester tạo thành chuỗi polynucleotid

Axit nucleic gồm hai loại phõn tử cú cấu tạo rất giống nhau là: Axit Deoxyribonucleic (ADN) và Axit ribonucleic (ARN)

Hình 1.4: Mô hình cấu trúc hoá học không gian của các nucleotid

1./ ADN (Axit deoxyribonucleic)

a Đặc tính hoá học của ADN

Axit deoxyribonucleic là một chuỗi xoắn kép gồm hai mạch ñơn, mỗi mạch ñơn là một chuỗi polynucleotid xoắn nhau thành một chuỗi xoắn kép, trong ñó bazơ nitơ của mạch này liên kết với bazơ nitơ của mạch kia bằng cầu nối hyñro, theo nguyên tắc bổ sung:

+ A của mạch này liên kết với T của mạch kia bằng 2 liên kết Hydro

+ G của mạch này liên kết với X của mạch kia bằng 3 liên kết Hydro

Mỗi mạch ñơn là một trình tự có ñịnh hướng với một ñầu là 5’phosphate tự do, ñầu kia

là 3’hydroxyl tự do (hướng qui ước là 5’
3’) Hướng của hai mạch ñơn trong chuỗi xoắn kép ngược nhau nên gọi là hai mạch ñối song song

Hình 1.5: Liên kết bổ sung giữa các nucleotid trên hai mạch ñơn

ADN có cấu tạo ña phân, do nhiều ñơn phân hợp lại, có cấu tạo nhiều bậc, dẫn tới tính

ña dạng và ñặc trưng của sinh giới Ở mỗi loài, ADN có trình tự nucleotid riêng ñặc thù và số lượng nucleotid khác nhau, có thể từ 5000 ở một loại virus ñơn giản nhất lên ñến 5000 tỷ trong

46 NST ở người

Trong hai chuỗi polynucleotide, ñường cacbon và nhóm phosphate ñều giống nhau ở mọi phân tử ADN Tính ñặc thù của từng loại ADN là do các kiểu liên kết khác nhau của 4 bazơ nitơ A,T,G,C

Phân tử ADN trong NST của sinh vật nhân chuẩn (eucaryote) có dạng thẳng, còn ở phần lớn tế bào nhân sơ (procaryote) ADN có dạng vòng Nhưng ở dạng vòng hay dạng thẳng thì ADN ñều tồn tại dưới dạng cuộn chặt Kích thước ADN ở Eucaryote hoàn toàn không có mối liên quan gì ñến kích thước và mức ñộ tiến hóa của sinh vật Các ADN ở Eucaryote có nhiều ñặc ñiểm khác với ADN của prokaryote, toàn bộ phân tử ADN procaryote ñều mang thông tin mã hóa cho các protein trong khi ADN eucaryote bao gồm những trình tự mã hóa (các exon) xen kẽ với những trình tự không mã hóa (các intron)

Các ADN ở tế bào nhân chuẩn liên kết với nhiều loại protein khác nhau, chủ yếu là các histon (có bản chất bazơ) và các protein phi histon (có bản chất axit), ñể tạo ra phức hợp nucleoprotein gọi là chất nhiễm sắc (chromatin) Trong nhiễm sắc chất, ADN ñược cuộn xoắn,

co ngắn lại ít nhất trên hàng 100 lần, có nhiều mức ñộ cuộn vòng, co xoắn khác nhau Mức ñơn giản nhất là thể nhân, tức nucleosome ñược xem là ñơn vị cấu tạo cơ sở theo chiều dọc của nhiễm sắc thể, có phần protein là 8 phân tử histon (octamer- gồm 2 phân tử H3 và 2 phân tử H4liên kết ở vùng trung tâm; 2 phân tử H2A và 2 phân tử H2B liên kết ở phía ngoài), ñược cuộn quanh bởi ADN Trong mỗi nucleosme, octamer histon ñược quấn bởi 13/4 vòng sợi ADN, ứng

với khoảng 140-160 bp Mỗi nucleosome cú ủường kớnh 100A0 Nucleosome này nối với nucleosome kia bằng một ủoạn ADN nối dài 15-100bp, cú gắn cỏc phõn tử histon H1 tạo thành một dóy nhiều nucleosome tạo nờn sợi cơ bản của NST cú ủường kớnh khoảng 100A0

ADN xoắn kộp trong NST cũn cú cấu trỳc siờu xoắn (super coiling) là mức ủộ xoắn của phõn tử ADN giống như hai sợi dõy thừng xoắn chặt với nhau quanh một trục của nú Cỏc phõn tử ADN ủều biểu hiện hai dạng siờu xoắn là siờu xoắn õm (negative supercoiling-mức ủộ xoắn thấp) và siờu xoắn dương (positive supercoiling-mức ủộ xoắn cao)

Cỏc trỡnh tự ADN trong nhõn tế bào Eucaryote ủược chia làm 3 loại:

+ Cỏc trỡnh tự lặp lại nhiều lần: Chiếm 10%-15% bộ gen ủộng vật cú vỳ Đú là những trỡnh tự ADN ngắn (10-200kb), khụng mó húa, thường tập trung ở những vựng chuyờn biệt trờn NST như ở vựng tõm ủộng (trỡnh tự CEN) hay ở ủầu cỏc NST (trỡnh tự TEL) Chức năng của chỳng chưa rừ, dường như chỳng tham gia vào quỏ trỡnh di chuyển của ADN trờn thoi vụ sắc (trỡnh tự CEN) hay tham gia vào quỏ trỡnh sao chộp toàn vẹn của phần ADN nằm ở ủầu mỳt NST (trỡnh tự TEL)

+ Cỏc trỡnh tự cú số lần lặp lại trung bỡnh: Chiếm khoảng 25-40% bộ gen người Chỳng

cú kớch thước lớn hơn (100-1000kb) và ủa dạng hơn cỏc trỡnh tự lặp lại nhiều lần Cỏc trỡnh tự này khụng tập trung mà phõn tỏn trờn toàn bộ gen Chỳng cú thể là những trỡnh tự khụng mó húa với chức năng chưa rừ mà cũng cú thể là trỡnh tự mó húa Vớ dụ như cỏc gen mó húa cho rARN, tARN, ARN 5S

+ Cỏc trỡnh tự duy nhất: Là cỏc gen mó húa cho cỏc protein, cú trỡnh tự ủặc trưng cho từng gen

Một ủặc tớnh khỏc của ADN, cú ý nghĩa quan trọng trong nghiờn cứu, ủú là khả năng biến tớnh (denaturation-là hiện tượng hai sợi ủơn của phõn tử ADN tỏch rời nhau) và hồi tớnh (renaturation-cỏc sợi ủơn lại cú thể bắt cặp trở lại theo nguyờn tắc bổ sung ủể hỡnh thành trở lại phõn tử ADN ban ủầu)

b Chức năng sinh học của ADN

- Lưu giữ thông tin di truyền của cơ thể sống dưới dạng các gen di truyền Gen di truyền

là một đoạn trình tự các nucleotid mã hoá cho một polypeptide có chức năng sinh học

- ADN thực hiện chức năng truyền thông tin di truyền qua cơ chế sao chép hay tái bản,

có chế phiên mã (tổng hợp ARN thông tin) và có chế dịch mã (tổng hợp protein biểu hiện tính trạng cơ thể) Cơ chế này cũng đảm bảo cho tính ổn định tương đối của thông tin di truyền

c Mối quan hệ gene - cistron ở cỏc prokaryote và eukaryote

Một cỏch tương ủối, theo nghĩa rộng, cú thể ủịnh nghĩa gene là một ủọan xỏc ủịnh của

bộ gene mó húa thụng tin của một polypeptide hoặc một phõn tử RNA chức năng (như tRNA, rRNA ) Và Cistron là một ủoạn xỏc ủịnh của DNA (hay bộ gene núi chung) mang thụng tin cấu trỳc của một polypeptide cụ thể mà giới hạn của nú ủược xỏc ủịnh bằng trắc nghiệm cis-trans Kớch thước trung bỡnh của một cistron là 1.200 cặp base Như vậy, cistron chớnh là gene cấu trỳc theo nghĩa hẹp hay gene mó húa protein

Tuy vậy, ủịnh nghĩa này khụng thể bao gồm ủầy ủủ chức năng và cấu trỳc của gene trong toàn bộ sinh giới, bởi vỡ cỏc chiến lược cho sự biểu hện gene và tổ chức bộ gene ở cỏc vi khuẩn và eukaryote là rất khỏc nhau

Ở cỏc prokaryote và eukaryote bậc thấp, thường cú một mối quan hệ ủơn giản giữa gene và sản phẩm của nú.Trong hầu hết trường hợp, cú một sự tương ứng một gene - một sản phẩm, và

sự ủồng tuyến tớnh giữa gene và chuỗi polypeptide của nú ủó ủược Ch.Yanofsky xỏc nhận năm

1961 Vì vậy ở các sinh vật này, gene và cistron là tương ñương: gene là ñơn vị chức năng di truyền, mang thông tin di truyền ñược biểu hiện trọn vẹn

Hình 1 6: (a) Ở vi khuẩn, các gene thường ñược sắp xếp trong một operon và ñược phiên mã thành một phân tử mRNA ña cistron (b) Ở eukaryote, các gene tồn tại riêng

biệt dưới dạng ñơn cistron

Ở vi khuẩn, các gene ñồng nghĩa với vùng mã hóa hay khung ñọc mở (open reading frame

= ORF), trong khi ñó ở các eukaryote nó ñồng nghĩa với ñơn vị phiên mã (transcription unit)

Đó là do các gene vi khuẩn thường ñược sắp xếp trong một operon, vì thế có nhiều sản phẩm ñược dịch mã từ một mRNA ña cistron Trái lại, ở các eukaryote, hầu hết các gene ñược phiên

mã dưới dạng mRNA ñơn cistron

Ở các bộ gene eukaryote bậc cao, thường thường có một mối quan hệ phức tạp giữa gene

và sản phẩm của nó Hầu hết các gene của eukaryote bậc cao ñều có chứa các intron (intervening sequences), tức các ñoạn không mã hóa protein, nằm xen giữa các exon (expressed sequences), các ñoạn mã hóa protein Các gene như vậy ñược gọi là gene phân

ñoạn (split gene) hay gene ñứt quãng (interrupted gene); nó ñược phát hiện lần ñầu tiên bởi

Phillip Sharp vào năm 1977 Thông tin trong gene ñược sử dụng một cách chọn lọc ñể sinh ra

nhiều sản phẩm khác nhau, gọi là cắt-nối có chọn lọc (alternative splicing) Các sản phẩm có

quan hệ về cấu trúc thường có các chức năng khác nhau Vì lẽ ñó, cistron ñôi khi ñược xem là tương ñương với exon của gene eukaryote, và gene phân ñoạn ñược xem như là một chuỗi các cistron gối nhau (Twyman 1998) Ngoài ra, có vài trường hợp trong ñó cần tới hai gene ñể sinh

ra một sản phẩm mRNA ñơn thông qua kiểu cắt-nối chéo (trans-splicing) hoặc biên tập RNA

(RNA editing)

Hình 1.7 Ảnh hiển vi ñiện tử và hình mô phỏng việc sử dụng vật dò mRNA tế bào chất có

ñ ánh dấu ñể phát hiện gene phân ñoạn (a và b); mô tả vắn tắt sự tổng hợp pre-mRNA và cắt

bỏ các intron ñể tạo ra mRNA trưởng thành từ một gene phân ñoạn có chứa hai intron (c)

Khám phá mới nhất cho thấy glucose 6-phosphate dehydrogenase là một enzyme có mặt

trong các tế bào hồng cầu người; nó bao gồm hai dạng nhỏ/thứ yếu và lớn/chính yếu (minor

(a

and major form); dạng ñầu có trình tự các amino acid thuộc gene trên NST X; và dạng sau gồm hai peptide ñược mã hóa từ thông tin của hai NST, các amino acid trong ñoạn 1-53 ñược

mã hóa trên NST số 6 và các amino acid ở ñoạn tiếp theo 54-479 ñược mã hóa trên NST X (theo McClean 1998) Tất cả những trường hợp này nói lên một ñiều rằng, ñể ñưa ra một ñịnh nghĩa chính xác về gene không hề ñơn giản Tuy nhiên, nhìn toàn cục thì một khái niệm thống

nhất nổi bật là, tất cả các sinh vật từ vi khuẩn E coli cho ñến con người ñều có chung hệ thống

mật mã di truyền và có chung phương thức 'chuyển tải' thông tin trong gene thành ra protein

Tổ chức của một gene có thể bao gồm các vùng riêng biệt với các chức năng ñặc thù (Bảng 6.1; theo Twyman 1998, có sửa ñổi)

Bảng 1.1 Các thuật ngữ ñược dùng ñể chỉ các phần chức năng của các gene

Một vùng của DNA ñược dịch mã thành protein Ở vi khuẩn, ñó là mộ

gene Ở eukaryote, vùng mã hóa có thể bị gián ñọan bởi các intron

Gene phân ñoạn Một gene mã hóa protein gồm các ñoạn không mã hóa (intron) nằm

xen kẻ giữa các ñoạm mã hóa (exon)

Gene Ở vi khuẩn, một ñơn vị chức năng di truyền mã hóa

hoặc là một polypeptide riêng biệt hoặc phân tử RNA Ở các eukaryote, một ñơn vị phiênmã có thể mã hóa 1 hoặc nhiều sản phẩm hoặc ñóng góp vào 1 sản phẩm

Locus gene Vị trí của một gene trên một nhiễm sắc thể, kể cả các

yếu tố ñiều hòa kề bên Thuật ngữ locus ñược dùng theo cách riêng ñể chỉ vị trí của gene-marker bất kỳ, yếu tố ñiều hòa, khởi ñiểm tái bản, v.v

Operon Một locus của vi khuẩn có chứa nhiều gene (mà ñược

phiên mã như là một bản sao polycistron ñơn) và các yếu tố ñiều hòa chung của chúng

Pseudogene Một trình tự không hoạt ñộng chức năng vốn có cấu trúc tương tự một

gene hoạt ñộng chức năng

Đoạn ñệm ñược

phiên mã

Bất kỳ phần nào của ñơn vị phiên mã của 1 gene RNA hay operon

gene RNA sẽ bị loại bỏ trong khi tạo ra các phân tử RNA trưởng thành

Đơn vị phiên mã,

vùng ñược phiên

mã

Một vùng của DNA ñược phiên mã thành RNA Ở các eukaryote, ñó

là một gene Ở vi khuẩn, nó có thể bao quát nhiều gene

Vùng không ñược

dịch mã (UTR)

Bất kỳ phần nào của ñơn vị phiên mã mà không ñược dịch thành

protein Các UTR kề bên một vùng mã hóa hay operon ñược gọi là các UTR 5' và 3'

Gene bị phân chia

(divided gene)

Một gene phân ñọan với các exon ở các locus riêng biệt ñược phiên

mã riêng rẽ và khâu nối lại bởi sự cắt-

nối chéo (trans-splicing) Thực ra ñó là cách gọi sai vì mỗi locus ñúng

ra phải ủược coi như là 1 gene riờng

Ở bất kỳ locus nào, một vựng DNA ủược phiờn mó cú thể gọi là một ủơn vị phiờn mó

(transcription unit) Ở prokaryote, một ủơn vị phiờn mó cú thể gồm nhiều gene; trong khi ủú ở eukaryote, cỏc ủơn vị phiờn mó hầu như bao giờ cũng tương ủương với một gene ủơn

Hỡnh 1.8 Cấu trỳc ủiển hỡnh của một gene eukaryote

Đối với cỏc gene mó húa protein cú một sự tỏch biệt giữa vựng ủược dịch mó thành

chuỗi polypeptide và vựng khụng ủược dịch mó Ở vi khuẩn, vựng ủược dịch mó là khung ủọc

mở (ORF), trong ủú cỏc gene phõn cỏch nhau bằng cỏc ủoạn ủệm (spacer) ủược gọi là cỏc vựng khụng mó húa bờn trong (internal noncoding region) Cỏc gene nằm ở hai ủầu của một operon cũng ủược kốm bởi một vựng khụng mó húa cú tờn là vựng khụng dịch mó 5' (5' untranslated region = 5' UTR) hay ủoạn dẫn ủầu (leader sequence) và vựng khụng ủược dịch mó 3' (3' UTR) hay ủoạn kộo sau (trailer sequence) Về bản chất, chỳng là cỏc ủoạn ủiều hũa; chẳng

hạn, vựng 5'UTR kiểm soỏt sự bỏm vào của ribosome, cũn vựng 3'UTR thường ủúng vai trũ quan trọng trong sự ổn ủịnh mRNA Ở cỏc gene eukaryote, vựng mó húa cũng ủược kốm bởi cỏc vựng UTR ủiều hũa, và cả hai vựng UTR 5' và 3' cũng như khung ủọc mở cú thể bị giỏn ủoạn bởi cỏc ủoạn khụng mó húa (tức cỏc intron) mà chỳng sẽ ủược cắt bỏ trước khi xuất mRNA trưởng thành ra khỏi nhõn Như thế, bất kỳ ủoạn nào mà rốt cuộc bị loại bỏ khỏi pre-

RNA thỡ ủược gọi là cỏc ủoạn ủệm ủược phiờn mó (transcribed spacer)

2./ ARN (axit ribonucleic)

Phõn tử ARN cú cấu trỳc tương tự ADN với ba ủiểm khỏc biệt sau:

+ Phõn tử ARN là chuỗi ủơn

+ Đường pentose của phõn tử ARN là ribose

+ Thymine của phõn tử ADN ủược thay thế bằng uracine trong phõn tử ARN

ARN gồm có các loại:

- mARN (messenger ARN) hay ARN thông tin: mã hóa cho Protein

- rARN (ribosomal ARN) hay ARN ribosom thành phần cơ bản xúc tác phản ứng tổng hợp protein

- tARN (tranfer ARN) hay ARN vận chuyển: có chức năng trong tổn hợp protein nh− một thành phần kết nối giữa mARN và axit amin

- snARN hay small nuclear ARNs nhân có phân tử nhỏ có một số chức năng nh− lắp ghép tiền mARN

- snoARN hay small nucleolar ARN là các ARN của hạch nhân đ−ợc sử dụng trong các quá trình thay đổi hóa học rARN

- Bên cạnh đó có một số loại ARN khác nh− hnARN, scARN

Nhìn chung các ARN có vai trò nhất định trong bộ máy tổng hợp protein, nh−ng các ARN chủ yếu là mARN, tARN, rARN

Hỡnh 1.9: Mụ hỡnh cấu trỳc phõn tử ARN

a./ ARN thụng tin (messenger RNA, mARN)

Đây là dạng ARN được tạo ra và sử dụng để truyền đạt thông tin của gen sang protein Trong mARN, ngoài các nucleotid làm nhiệm vụ mã hóa, còn có một số nucleotid không làm nhiệm vụ mã hoá nhưng có vai trò sắp xếp tiểu phần nhỏ của ribosom, làm mồi cho dịch mã, tương ứng cho acid amin đầu N Nó được tổng hợp trong nhân, nhưng được đưa ra khỏi nhân vào trong tế bào chất để tham gia vào quá trình tổng hợp protein Thông thường, các mARN có tuổi thọ rất ngắn, phân tử không bền trong tế bào Về cấu trúc, mARN cú cấu trỳc mạch thẳng, rất ngắn và ủược dựng làm khuụn mẫu ủể tổng hợp chuỗi polypeptide Mỗi mARN núi chung

- Đoạn theo sau (trailer): Nằm ở phớa 3’, ngay sau ủoạn dịch mó, khụng ủược mó hoỏ

Hỡnh 1.10: Sơ ủồ cấu trỳc của mARN ở prokaryote và eukaryote

* Chức năng của đuôi poly (A):

+ Bảo vệ mARN: mARN có đuôi poly (A) có đời sống dài hơn các mARN sau khi được gắn thêm đuôi được chuyển ra tế bào chất, ở đó đuôi này bị ngắn dần đi và thường chỉ còn lại khoảng 30-150 nu Các mARN không có đuôi hoặc đuôi ngắn thường nhanh chóng bị phân huỷ Tuy nhiên đuôi này không phải là yêu cầu tuyệt đối đối với mọi mARN của Eukaryote Trên thực tế có một số gen không có đuôi poly (A), ví dụ gen mã hoá protein Histon

+ Tăng cường khả năng dịch mã của mARN Trong quá trình dịch mã có protein bám poly (A) là PAB I (poly (A) binding protein I), nếu thiếu poly (A) thì mARN không thể gắn vào PAB I nên không thể dịch mã hiệu quả

* Cấu trúc mũ và chức năng:

Khi ARN được tổng hợp, đầu 5’ sẽ rời khỏi ADN với một đầu triphotphat, đó là một dãy

ba nhóm photphat liên kết với nhau Trước tiên một nucleotid chứa G được thêm vào triphotphat này, gắn với đầu carbon 5’ của đường ribose, sau đó bazơ G được methyl hoá Cấu trúc mũ có thể là m7GpppNpN, trong đó m chỉ nhóm methyl, 7 là vị trí nhóm methyl trên bazơ

G, ppp chỉ nhóm triphotphat, NpN là các nucleotid ở đầu của ARN Một số mARN được methyl hoá ở các nucleotid ở đầu 5’, lí do chưa được hiểu rõ

Cấu trúc mũ đảm nhiệm rất nhiều chức năng quan trọng trong tế bào:

+ Bảo vệ mARN khỏi bị phân huỷ Do ARNse tấn công bắt đầu ở đầu 5’ của mARN nhưng chúng không thể cắt được liên kết triphotphat

+ Tăng cường khả năng dịch mã của mARN Trong dịch mã có protein bám mũ binding protein) nhận biết mũ Nếu không có mũ protein này không thể gắn vào và mARN khó

(cap-có thể được phiên mã

+ Tăng cường sự vận chuyển mARN từ nhân ra tế bào

+ Tăng cường hiệu quả ghép nối của các mARN

Một phõn tử mARN ủược mó hoỏ bởi 1 gen Trong NST cú thể cú hàng ngàn gen khỏc nhau, do ủú một số lượng lớn cỏc phõn tử mARN khỏc nhau ủược hỡnh thành trong tế bào và chỉ tồn tại trong một thời gian rất ngắn Phõn tử mARN eukaryote chỉ mang thụng tin cấu trỳc của một polypeptid (monocistron) vỡ vậy trỡnh tự mó hoỏ của mARN trưởng thành là liờn tục

Tuy nhiờn, cú một số bú gen cựng là nguồn gốc cho 1 mARN, tức là cựng tổng hợp cho 1 protein Phõn tử mARN prokaryote núi chung thường mang thụng tin cho nhiều polypeptide (polycistron) Vỡ vậy trong ủoạn mó hoỏ cú nhiều ủoạn ủệm tỏch biệt giữa chỳng

b./ ARN vận chuyển (transfer RNA, tARN)

Cỏc tARN cú chức năng chớnh là vận chuyển cỏc axit amin ủến vị trớ tổng hợp protein trờn phức hệ mARN-ribosom trong quỏ trỡnh dịch mó

Cấu trúc bậc 1 của tARN là một trình tự thẳng khoảng 60-95 Nu, nhưng thường là 75Nu chứa nhiều base đượcbiến đổi (đôi khi chiếm đến 20% tổng số nu của mỗi phân tử tARN) Có hơn 50 loại biến đổi khác nhau của các base được tạo thành sau phiên mã, sự biến đổi này đã tạo ra các base hiếm, 4 trong số những loại thông thường nhất là ribothymine (T), pseudouridine (Ψ), dihydrouridine (D), inosine (I) trong cấu trúc bậc 1 có 15 Nu luôn bất biến

và 8 Nu khác có thể là purin hoặc pirimidine (nửa bất biến) đóng vai rò quan trọng trong cấu trúc bậc 2 của tARN

Cấu trúc bậc 2 của tARN có hình cỏ 3 lá gồm có nhóm 5’-phosphate, vòng aminoacid acceptor stem, tay D gọi là D-loop hay DHU - loop thường mang base biến đổi là D, vòng anticodon có chứa Inosine và vòng T chứa 7 base bất biến Những phần bất biến này góp phần hình thành nên cấu trúc bậc 3 của tARN

Hỡnh 1 11 : Một số base sửa ủổi cú thể cú trong thành phần của cỏc RNA

Cấu hỡnh khụng gian ba chiều của tARN cú dạng “lỏ chẻ ba” vững chắc là nhờ

sự kết cặp của cỏc bazơ ở một số ủoạn sau khi phiờn mó Núi chung, cỏc tARN thường rất giống nhau ở nhiều ủoạn và sai khỏc chủ yếu là ở anticodon Mỗi tARN thường cú 3 – 4 vũng chức năng như sau:

+ Vũng 1 chứa 8-12 bazơ, cũn gọi là vũng DHU, cú chức năng nhận biết enzym aminoaxyl-tARN synthetase ( kết hợp a.amin vào ủầu 3’ của tARN)

+ Vũng 2 chứa 7 bazơ, gọi là vũng ủối mó, cú chức năng ủọc mó trờn tARN bằng cỏch kết cặp cỏc bazơ của anticodon với codon

+ Vũng 3 cũn gọi là tay phụ, cú thể khụng cú ở một số tARN

+ Vũng 4 chứa 7 bazơ, gọi là vũng TYC cú chức năng nhận biết ribosom ủể ủi vào ủỳng

vị trớ tiếp nhận aminoaxyl-tARN

Đoạn mạch thẳng –CCA-OH (3’) là nơi gắn a.amin vào

Hỡnh 1.12 : Cấu trỳc tổng quỏt của một phõn tử tARN

Cấu trúc bậc 3 là cấu trúc không gian 3 chiều của tARN được tạo bởi 9 liên kết hydro, chúng chủ yếu liên quan đến sự bắt cặp của các base bất biến Sự bắt cặp base giữa các phần của tay T và D làm cuộn phân tử tARN vào, tạo thành cấu trúc hình chữ L với anticodon ở 1

đầu và một đầu là gốc mang aa Cấu trúc bậc 3 được bền vững là do sự tương tác tập trung của các base

Cấu trúc đặc biệt của tARN được tạo thành không chỉ đơn giản do sự phiên mã từ gen

mà phải trải qua sự chế biến rât phức tạp từ bản sao sơ cấp dưới sự xúc tác của các enzyme ARNse D, E, F và P theo một trình tự các bước liên tiếp Quá trình chế biến tạo pre-tARN là tương tự nhau nhưng sự biến đổi các base là duy nhất đặc trưng cho từng loại tARN

c./ ARN ribosom (Ribosom RNA, rARN) và ribosom

* ARN ribosome

Là loại ARN tham gia vào cấu tạo nên ribosome và phức hệ riboprotein rARN được tổng hợp trong nhân thông qua quá trình phiên mã từ ADN và được chế biến sau phiên mã để hình thành các loại rARN khác nhau

Trong prokaryote, bản sao sơ cấp 6000Nu cuộn lại thành những cấu trúc stem-loop do

sự bắt cặp base của các trình tự bổ sung cho phép 1 số protein bám vào và hình thành phức hệ riboprotein (RNP), nhiều protein sau này sẽ là thành phần của ribosome Sau đó, tiến hành methyl hoá 24 base đặc hiệu và hiện tượng cắt sơ cấp chủ yếu được thực hiện bởi ARNse III và giải phóng ra các phân tử rARN 5S, 16S, 23S sự cắt bỏ thứ cấp bởi enzyme ARNse M5, M16, M23 ở đầu 3’ và 5’ của mỗi phân tử tiền thân sẽ cho ra phân tử rARN trưởng thành

ở Eukaryote, rARN tiền thân được tổng hợp từ ADN dưới sự tác động của enzyme ARN pol I hình thành nên phân tử đơn, dài Các phân tử ban đầu được chế biến nhờ những sự thay

đổi đặc hiệu cùng với các bước cắt Quá trình này hiện nay vẫn chưa được hiểu rõ Phân tử rARN tiền thân có đặc điểm riêng về kích thước ở mỗi sinh vật, vào khoảng 7000-13500Nu ở

động vật có vú, chứa 1 bản sao của vùng mã hoá 18S và 1 bản sao của vùng mã hoá 5.8S và 28S Đối với rARN tiền thân 13500Nu (47S) ở động vật có vú, để tạo ra các rARN hoàn chỉnh phải trải qua nhiều lần cắt, sau khi cắt ở vùng ngoài phiên mã (ETSs) 1 và 2, tiến hành cắt ở

vùng trong (ITSs), sau đó giải phóng ra pre-rARN 20S từ phân tử 32S Vùng 5.8S bắt cặp với vùng 28S trước khi phân tử trưởng thành được hình thành Các phân tử này được cuộn lại và sự methyl hoá diễn ra tại hơn 100 vị trí Quá trình cắt thứ cấp tiếp theo sẽ giải phóng ra các phân

tử rARN hoàn chỉnh, chúng liên kết với các protein để tạo nên các phức hệ RNP rARN 5S ở Eukaryote được phiên mã bởi ARN pol III từ một gen không liên kết cho ra phiên bản 121 Nu

và không trải qua hay trải qua rất ít sự chế biến

* Ribosome

Ribosme có cấu tạo rất phức tạp và được hình thành do phân tử rARN tạo phức hệ với protein đặc hiệu trong quá trình chế biến, trực tiếp tham gia vào quá trình dịch mã Về cấu trúc, ribosome ở Prokaryote và Eukaryote có sự khác nhau cơ bản, song chức năng và cách thức hoạt

động thì tương tự nhau

Ribosome ở Prokaryote là loại 70S, cấu tạo từ 2 tiểu phần 50S và 30S Tiểu phần 30S

được cấu thành từ phân tử rARN 16S và 21 protein khác nhau đặt tên là S1 đến S21 Tiểu phần 50S chứa 1 phân tử 23S và 1 phân tử 5S kết hợp với 31 protein được đặt tên là L1 dến L31, trong đó L26 chính là S20; L2 là dạng acetyl hoá của L12; L8 là phức hệ của L10 va L7 Kích

cỡ của các protein này dao động từ L31 với 46 axit amin đến S1 với 577 axit amin Hầu hết protein tương đối nhỏ vì chúng bám vào rARN

Hình 1 13: Cấu trúc ribosome của prokaryote và eukaryote

ở Eukaryote, Ribosome là loại 80S cấu thành từ 2 tiểu phần 60S và 40S trong tiểu phần lớn 60S có chứa 50 phân tử protein và 1 phân tử rARN 5S, 28S và 5.8S Tiểu phần nhỏ chứa rARN 18S và khoảng 30 protein khác nhau Chính sự phức tạp trong cấu trúc mà Ribosome ở Eukaryote chưa được hiểu biết nhiều Tuy nhiên, ribosome của tế bào Eukaryote điển hình có thể hình thành 1000 liên kết peptid trong 1 giây

* Các dạng ARN này đều thực hiện chức năng chung là truyền thông tin di truyền từ ADN đến protein (thể hiện tính trạng di truyền) Đặc biệt chỉ có mARN là bản phiên mã di truyền chứa các mã bộ ba (codon) tương ứng với một axit amin của phân tử protein Thực hiện chức năng trực tiếp chuyển tải thông tin di truyền từ phân tử ADN đến bản dịch mã biểu hiện ở phân tử protein

iii saccharide

1 Cấu tạo hoá học

Saccharide là nhóm chất hữu cơ phổ biến khá rộng rãi trong cơ thể sinh vật, ở thực vật chúng chiếm tỉ lệ lớn từ 80%-90% trọng lượng khô Saccharide được cấu tạo từ các nguyên tố

C, H, O với công thức chung là (CH2O)n, trong đó n ≥ 3

Dựa vào cấu tạo, tính chất của saccharide, có một số cách phân loại khác nhau, nhưng nói chung đều chia thành 2 nhóm lớn:

+ Monosaccharide (đường đơn) là dẫn xuất aldehyt hoặc xeton của polycol Công thức chung là (CH2O)n n là số tự nhiên dao động từ 3-7 các loại monose có n = 3 như glixeraldehyt và dihydroxylaxeton, ribose có n = 5, glutose và fructose có n = 6 giữ vai trò quan trọng trong hoạt động sống của tế bào Các nhóm aldehyt hay xeton có thể phản ứng với nhóm hydroxyl nội phân tử monose có n>4 để tạo nên cấu trúc vòng Dạng cấu trúc vòng tồn tại ở 2 dạng đồng phân lập thể là α và β

+ Polysaccharide: Là phân tử đường được tạo thành do một số hoặc nhiều đường đơn kết hợp với nhau

Disaccharide-còn gọi là đường đôi tồn tại gồm 2 dạng: disaccharide khử và không khử Một số loại disaccharide như mantose và lactose (dạng khử), saccharose và trehalose (dạng không khử) khá phổ biến ở có thể sinh vật

Polysaccharide được cấu tạo từ các monosaccharide giống nhau và khác nhau Các monosaccharide liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glucozit tạo thành mạch thẳng và 1-6 tạo thành mạch nhánh Do có khối lượng phân tử lớn nên polysaccharide được gọi là các đại phân

tử sinh học Cellulose là thành phần cấu trúc nên vách tế bào thực vật

Một số dạng glucide thường liên kết với protein tạo thành glycoprotein, liên kết với lipid tạo thành glycolipid Glycoprotein có nhiều trong cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật ở nhiều cơ thể động vật nó có trong thành phần của mô liên kết (sụn, gân ), có nhiều trong hormone của thuỳ trước tuyến yên: FSH, LH Glycoprotein còn có trong thành phần của màng

tế bào tham gia vào các hiện tượng miễn dịch Glycoprotein tham gia là thành phần của các kháng nguyên đặc hiệu cho các nhóm máu A, B và O Các dịch thể sinh học như nước bọt, nước mắt, sữa, máu đều chứa nhiều glycoprotein

2 Các liên kết hoá học trong polysaccharide

Liên kết hoá học quan trọng tạo nên cấu trúc polyme của saccharide là liên kết glycozit Trong các homopolyme là chất đồng trùng hợp của các saccharide (chỉ có một loại monome trong phân tử

CÂU HỎI ÔN TẬP CHƯƠNG I

Chương 2: quá trình tái bản adn

Sự tái bản của ADN, còn gọi là tự sao, tự nhân đôi của ADN, dựa trên cơ sở sự tái sinh của nhiễm sắc thể (NST), bảo đảm cho sự tái tạo trong nhân tế bào con mới được hình thành qua phân bào toàn bộ thông tin di truyền đặc trưng của tế bào ban đầu

Quá trình tái bản ADN trong tế bào sống đã được chứng minh qua thực nghiệm là không mang tính chất tự động Để thực hiện quá trình này thì trong tế bào chất của tế bào đã phải có những quá trình sinh tổng hợp mới, các nucleotit được tạo ra trong tế bào do sự kết hợp các chất đường ribose, axit amin, CO2 và NH3, hoặc bằng cách hình thành từ các axit nucleic trong

tế bào bị phân huỷ, chuyển hoá trở lại thành các nucleotit cần thiết cho tổng hợp axit nucleic

I các thành phần tham gia vào quá trình tái bản adn

1 Hệ enzyme tham gia vào quá trình tái bản ADN

a ADN polymerase

Trong toàn bộ hệ thống enzym sửa đổi điều chỉnh axit nucleic đã được phát hiện trong tế bào thì hệ enzym tham gia tái bản ADN chiếm vị trí quan trọng nhất, trong đó chủ yếu phải kể

đến ADN polymerase

* ADN polymerase ở E.Coli (xem bảng 2 1)

ADN polymerase ở E.Coli gọi là ADN polymerase I, ADN polymerase II, ADN

polymerase III được ký hiệu là Pol I, Pol II, Pol III luôn luôn cần sợi khuôn ADN để hoạt động nên được gọi là ADN - polymerase phụ thuộc ADN (DNA dependent - DNA - polymerase)

+ Pol III đóng vai trò chủ yếu trong tổng hợp ADN sợi khuôn ở chạc sao chép (replicative fork) Ngoài ra Pol III còn có vai trò đọc sửa (reading proof) nghĩa là có khả năng exonuclease theo hướng 3’-5’ ở đầu tận cùng phía sau giúp tự sửa sai trong quá trình tái bản

+ Pol II có hoạt tính thấp nhất và vai trò trong tái bản không rõ ràng, những nghiên cứu gần đây cho thấy vai trò chủ yếu của Pol II là sửa chữa sai sót trong quá trình tái bản

+ Pol I có hai vai trò chính là tổng hợp ADN thay thế và cắt bỏ đoạn mồi nhờ hoạt tính polymerase và exonuclease 5’-3’

Bảng 2.1: Đặc tính của các ADN polymerase ở E.Coli

Trong sự tổng hợp chuỗi mới, theo cùng một hướng mở chạc sao chép, pol III có thể hình thành dimer để tổng hợp hai sợi polynucleotide mới Để làm được việc đó, sợi lùi cần phải tạo ra một dạng uốn vòng để tạo khả năng dimer ADN pol III di chuyển theo một hướng cùng lúc tổng hợp ra hai sợi ADN đó

* ADN polymerase ở sinh vật nhân chuẩn

có

có pol A

1 120.000 rất thấp

có không pol B

3 175.000 rất cao

có

có pol C (hoặc DNA E)

ở sinh vật nhân chuẩn, sự tái bản ADN cũng cần có sự xúc tác của enzym polymerase,

cụ thể đã xác định được trong nhân tế bào ở các sinh vật bậc cao có hai loại là ADN polymerase α và ADN polymerase β, loại thứ ba là ADN polymerase λ được phát hiện trong ti thể

Ba loại này khác nhau về nhiều đặc tính, như đặc tính sắc kí, tính mẫn cảm với muối; trọng lượng phân tử cũng khác nhau

Nói chung, các enzym này rất biến đổi, sai khác giữa các loài sinh vật, đồng thời cũng

có chức năng khác nhau

ADN polymerase α có chức năng tái bản ADN của nhân

ADN polymerase β được sử dụng vào việc sửa đổi ADN

ADN polymerase λ chỉ làm nhiệm vụ tái bản hệ gen ADN ti thể

Cả 3 loại ADN polymerase trên đều không có hoạt tính đọc sửa

b Helicase và protein liên kết sợi đơn-SSB

Một enzyme có tác dụng tháo xoắn ở tại điểm khởi đầu tháo xoắn gọi là Helicase Tiếp theo một dạng protein liên kết với sợi đơn đã được tháo xoắn để làm ổn định sợi đơn, bảo vệ khỏi tác động của nuclease

c Primase

Sau khi sợi khuôn được tháo rời, enzyme primase sẽ tổng hợp nên mồi (primer) ARN (khoảng 5 nucleotid) tạo đầu 3’-OH tự do ở mồi để cho ADN polymerase hoạt động tổng hợp liên tục

d Topoisomerase

Các topoisomerase có vai trò làm biến đổi cấu hình không gian của siêu xoắn kép ADN, bao gồm 2 kiểu topoisomerase I và II đều được tìm thấy ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn, được viết tắt là Topo I và Topo II

Bảng 2.2: Tổng kết các kiểu topoisomerase ở E coli và sinh vật nhân chuẩn

Kiểu Tác động lên ADN Hiệu quả dãn xoắn

- Làm giãn siêu xoắn âm

- Làm giãn cả siêu xoắn dương và siêu xoắn

âm

- Cài siêu xoắn âm và siêu xoắn dương Tách được các vòng sợi ADN lồng vào nhau trong quá trình sao chép

- Làm giãn siêu xoắn dương nhưng không

có khả năng cài siêu xoắn âm

Hai enzyme này có cơ chế làm giãn xoắn khác nhau Topo I không thuỷ phân liên kết photphodieste mà chỉ cắt đứt một sợi ADN bằng cách chuyển một liên kết từ 1 nhóm 3’-OH của deoxyribose đến nhóm -OH của gốc tyrozin chuỗi bên của enzym Topo I Kết quả là không cần đến năng lượng để cắt một sợi chuỗi xoắn kép và quá trình có tính thuận nghịch, nghĩa là

sợi ADN bị cắt sẽ tự động nối lại Do đó Topo I không cần năng lượng ATP và topo I đã làm cho một sợi polynucleotide tự quay quanh sợi thứ hai và làm giảm mức độ siêu xoắn Trong khi

đó topo II làm đứt cả hai sợi polynucleotide của xoắn kép ADN, làm biến đổi cấu hình không gian ADN xoắn kép và cần năng lượng ATP

Kết quả hoạt động của topo là mức độ siêu xoắn của ADN được hạ thấp mức độ chuyển

siêu xoắn dương thành siêu xoắn âm Topo II ở E coli còn được gọi là Gyrase Hiện nay, người

ta đã có thể tìm thấy ít nhất có 11 biến dạng topo thuộc về 2 kiểu topo I và topo II ở các loài sinh vật khác nhau

e Ligase

Enzyme ligase có vai trò hàn gắn khe hở giữa đầu 5’-OH của một mảnh okazaki này với

đầu 3’-OH ở mảnh okazaki khác phía sau nó

II Các nguyên tắc cơ bản trong sao chép adn

Đây là nguyên tắc kết cặp bổ sung thể hiện trong cấu trúc ADN: A kết cặp với T, G kết cặp với C ( một purin và một pirimidin) Dẫn đến nguyên tắc tổng hợp ADN cũng theo nguyên tắc này

2 Nguyên tắc phân cực trong quá trình tự sao

Hình 2.2: Cấu trúc loop trên chạc sao chép ở sợi lùi

Phân tử ADN có tính chất phân cực một sợi chạy theo chiều 5’-3’ còn sợi kia chạy theo chiều ngược lại 3’-5’ gọi là sự đối song song ngược chiều của 2 sợi xoắn kép (antiparallel)

Điều này cùng với đặc tính chỉ kéo dài chuỗi polynucleotid theo chiều 5’-3’ của ADN polymerase dẫn đến trong quá trình tổng hợp ADN một sợi sẽ tổng hợp liên tục trên sợi khuôn cùng chiều với chiều mở chuỗi xoắn kép, trong khi sợi kia sẽ tổng hợp gián đoạn trên sợi gốc

Có vẻ như là hệ enzyme trên 2 sợi sẽ di chuyển ngược chiều nhau nhưng trong thực tế thì hai enzyme ADN polymerase trong quá trình kéo dài chuỗi tồn tại ở dạng dimer đó chính là nhờ cấu trúc tạo vòng nơ (loop) hình thành ở sợi lùi cho phép bộ máy tái bản trên cả hai sợi di chuyển cùng với chiều mở xoắn kép

3 Nguyên tắc hai hướng của quá trình sao chép

Hướng chạc sao chép mở

ADN mới được tổng hợp theo hai hướng

Hình 2.3: Sự sao chép theo hai hướng

Như chúng ta đã biết, những nghiên cứu trước đây về ADN được thực hiện trên các đối tượng sinh vật đơn giản như vi khuẩn hay phage Vi khuẩn là tế bào nhân sơ chưa có màng nhân, phân chia nhanh (chu kỳ tế bào khoảng 30 phút) cho ra số lượng lớn tế bào và là đối tượng lý tưởng cho phân tích các cơ chế ở mức độ phân tử như quá trình tự sao ADN Người ta cho rằng những phát hiện trên vi khuẩn cũng sẽ hé mở những điều tương tự ở các đối tượng phức tạp hơn Vì thế trong những năm sau khi thu được những bằng chứng về cơ chế tự sao bán bảo toàn ở đối tượng sinh vật này, cơ chế này càng được nghiên cứu sâu hơn nữa quá trình tự sao ở các đối tượng khác

Trong khía cạnh này, E coli là vi khuẩn đầu tiên được sử dụng để xác định cách

thức ADN khởi đầu quá trình tự sao Vấn đề đặt ra là nếu ADN tự sao ở một vị trí đặc hiệu thì

sự tự sao sẽ chỉ theo một hướng hay sẽ theo cả hai hướng Trước vấn đề này, năm 1963, John

Cairns sử dụng kỹ thuật chụp ảnh phóng xạ tự ghi quá trình tự sao ở E coli để giải đáp sự nghi

vấn này Đầu tiên ông gắn hydro phóng xạ (tritium 3H) vào ADN trong quá trình tự sao, sau đó chuyển ADN có đánh dấu phóng xạ này vào nhũ tương ảnh (photographic emulsion) Sự phát xạ nhờ đồng vị phóng xạ chuyển bạc trong nhũ tạo thành dạng nhìn thấy giống như các chấm

ánh sáng tạo ra hình ảnh trên phim

Chạc tái bản

Chạc tái bản

Hình 2.4: Sự sao chép ADN bắt đầu từ một điểm

Vào thời điểm đó, người ta biết rằng NST vi khuẩn và hệ gen của một số virus là dạng

vòng kép Ông thu được hình ảnh và sử dụng nó để giải thích cơ chế mà NST E Coli trãi qua

quá trình tự sao Phân tích cẩn thận hình ảnh nói trên cho thấy, hai mức độ khác nhau của việc

đánh dấu các loop khác nhau của ADN, ADN đã hoàn thành chu kỳ tái bản đầu tiên và bước vào một phần chu kỳ tái bản tiếp theo Trong chu kỳ tự sao đầu tiên, chỉ 1 sợi ADN được đánh dấu, nhưng ở lần tái bản thứ hai thì hai sợi cùng được đánh dấu Phần ADN kép được đánh dấu chiếu trên phim ở một phạm vi rộng hơn, sinh ra nhiều hạt bạc hơn Những bằng chứng thực nghiệm này chứng tỏ NST vi khuẩn có một điểm khởi đầu tự sao Lúc bắt đầu thí nghiệm, toàn

bộ phân tử được đánh dấu phóng xạ, và chỉ khi lần tự sao thứ nhất kết thúc, thì lần tự sao thứ hai mới bắt đầu

Cairns chỉ ra có một điểm origin tái bản trong hệ gen E Coli (cũng giống như tất cả các

ADN vòng kép từ các vi khuẩn khác), nhưng không xác định tự sao là một hay hai hướng Trong quá trình tự sao theo một hướng, vị trí tự sao mở rộng chỉ theo một hướng, ngược lại tự sao theo hai hướng thì vị trí tự sao mở rộng đồng thời theo cả hai hướng Một nỗ lực khác để giải đáp thắc mắc này là phương pháp đánh dấu ADN trong khoảng thời gian ngắn bằng mẫu

3H, tiếp theo đó là phản ứng loại các chất phóng xạ không liên kết với ADN Phương pháp này

được biết như là “xung đánh dấu” (Pulse labeling) Năm 1972, David Presscott và Peter

Kuempel tại trường đại học Colorado đã nuôi cấy E Coli trong môi trường chứa Thymine đánh

dấu 3H kết hợp trong ADN Chất phóng xạ xuất hiện mức độ thấp trong ADN chỉ đủ để quan sát đường đi của ADN từ điểm Origin sau khi được chiếu trên phim X - quang Sau đó họ cho

tế bào vào môi trường có nồng độ 3H Thymine cao (Pulse label) là dấu hiệu đen trên hình 2.4 Sau khi thuỷ phân, tế bào được bộc lộ với kỹ thuật nhũ ảnh, hai tác giả quan sát thấy hai đường tập trung các hạt bạc ngắn, nỗi lên ở hai đầu của NST đang nhân đôi Cách giải thích thoả đáng cho trường hợp này là ADN tự sao theo cả hai hướng từ một vị trí origin

Đến nay, chúng ta biết rằng Origin tái bản của E coli được kiểm soát bởi một trình tự

base gọi là oriC Là một đoạn ADN dài khoảng 250 bp, thường chứa một trình tự 9 bp (5’- TTAT(C/A)CA(C/A)A-3’), được lặp lại 4 lần Vị trí này cũng tìm thấy ở nhiều vi khuẩn Gram

âm và là vị trí liên kết của các phân tử protein tham gia quá trình khởi đầu quá trình tự sao

Hình 2.5: Nhiễm sắc thể nhân chuẩn có nhiều chạc tái bản

Sau thực nghiệm thành công trên đối tượng vi khuẩn, nhiều nhà khoa học cũng muốn đi

tìm câu trả lời tương tự ở sinh vật nhân chuẩn Những nghiên cứu quá trình tự sao ở Xenopus

hướng Tuy nhiên, cũng không giống như ở nhân sơ, mỗi NST nhân chuẩn có nhiều điểm khởi

đầu tái bản (multiple origin) Trong thí nghiệm điển hình, trước tiên tế bào được đánh dấu với

3H Thymine, sau đó vật chất phóng xạ này được loại đi, và tế bào được chuyển sang môi trường

có nồng độ 3H Thymine loãng hơn, cho phép sự tự sao tiếp tục Tế bào sau đó được phá vỡ và

được bộc lộ trên phim để phân tích hình ảnh phóng xạ tự ghi Vùng đánh dấu đậm được quan sát trong pha khởi đầu tái bản, và con đường nhạt hơn được quan sát thấy trong pha đánh dấu thứ hai Kết quả này được toả ra từ một điểm cố định, khẳng định tính hai hướng của tái bản Những quan sát thấy nhiều con đường như thế trên cùng một phân tử chứng tỏ có nhiều điểm khởi đầu tái bản trên cùng một NST

Đặc điểm “đa origin” rõ ràng là rất cần thiết cho các phân tử ADN có kích thước lớn,

được tự sao trong một phần của chu kỳ tế bào Một NST lớn của Drosophila melanogaster chứa

7.107 bp Tốc độ tự sao trung bình của sinh vật này là 2600 bp/1 phút Nếu với tốc độ này cộng với việc chỉ có một điểm khởi đầu tái bản thì cần ít nhất 2 tuần để hoàn tất quá trình tự sao của NST này Nhưng thực tế nó chỉ cần 4 phút để tái bản thành công, dựa trên những số liệu này

ước tính có khoảng 6000 - 7000 điểm khởi đầu tái bản Do đó, số lượng điểm khởi đầu tự sao quyết định chủ yếu thời gian tái bản của một tế bào

4 Nguyên tắc sao chép bán bảo thủ

Meselson và Stahl đã chứng minh ADN tự sao bán bảo thủ

Ngay sau khi mô hình cấu trúc ADN của Watson và Crick ra đời trên cơ sở đó xuất hiện các giả thuyết khác nhau về cơ chế nhân lên của vật chất di truyền này Do hai sợi bổ sung cho nhau nên một sợi sẽ làm khuôn xác định trình tự của sợi kia Có 3 giả thuyết khác nhau về các kiểu tái bản của ADN

chuỗi xoắn kép ADN mới được hình thành hoàn toàn từ nguyên liệu mới

được giữ lại trong 2 phân tử ADN con, tức là mỗi sợi ADN đơn của ADN ban đầu được giữ lại cùng nhau và làm khuôn để tổng hợp nên cả sợi ADN xoắn kép mới

này làm khuôn để tổng hợp ra các đoạn nhỏ khác, sau đó các đoạn nhỏ nói trên sẽ được nối lại với nhau Sợi ADN mới là hỗn hợp của cả sợi mới và sợi cũ

Hình 2.6: Ba giả thuyết về sao chép

Năm 1958, Mathew Meselson và Franklin Stahl tại trường đại học kỹ thuật California đã thiết kế một thí nghiệm thành công phân biệt mô hình sao chép bán bảo toàn và bảo toàn Họ cho E.coli sinh trưởng vào thế hệ trong môi trường chứa đồng vị phóng xạ nặng của Nitơ (15N) Những con vi khuẩn này và ADN của nó có trọng lượng lớn hơn vì Nitơ nặng đã liên kết chặt chẽ vào trong tế bào của chúng Sau đó chúng được chuyển sang môi trường có đồng vị nitơ bình thường 14N và thu ADN vi khuẩn trong mỗi bước Để phân biệt ADN nặng với ADN nhẹ,

họ dùng kỹ thuật li tâm gradient mật độ cân bằng Kỹ thuật này sử dụng dung dịch cesium chloride do phân tử cesium rất nặng (khối lượng phân tử là 132 và trọng lượng riêng là 1873g/ml) và cesium chloride rất tan trong nước, do đó người ta có thể pha chế được nồng độ CsCl 6M và có trọng lượng cao Tuy nhiên, dưới tác động của li tâm tốc độ cao phân tử cesium

đủ nặng sẽ di chuyển đáp ứng với gia tốc trọng trường và hình thành nên một gradient trọng lượng trong ống li tâm (từ 1.6g/cm3 trên đỉnh ống đến 1.8g/cm3 dưới đáy ống li tâm) Phân tử ADN có trọng lượng cân bằng với trọng lượng của CsCl xung quanh sẽ hình thành nên một vạch đậm giữa ống nghiệm Do đó, phân tử ADN có nồng độ nitơ nặng cao sẽ hình thành một vạch phân biệt trong ống dung dịch CsCl với vạch được hình thành từ phân tử ADN nhẹ Trọng

lượng trung bình của ADN gồm cả mạch chứa nitơ nặng và nitơ nhẹ sẽ hình thành nên một vạch nằm giữa hai vạch trên

Trong thí nghiệm cụ thể này, E coli được nuôi thời gian đủ trong môi trường nitơ nặng

để đảm bào tất cả các phân tử ADN được đánh dấu phóng xạ Các đồng phân phóng xạ không

được liên kết trong ADN sẽ bị loại bỏ Và vi khuẩn được chuyển sang môi trường chứa nitơ nhẹ

và cho phép tế bào sinh trưởng Tế bào sẽ được lấy ra ngay lập tức sau 1 đến 2 thế hệ để phân tích trọng lượng ADN khác nhau các tế bào được phá vỡ, chiết rút ADN và cho li tâm trong dung dịch CsCl Meselson và Stahl thu được kết quả sau một thế hệ nuôi trong môi trường nitơ nhẹ chỉ có vạch ADN trung bình xuất hiện, tuy nhiên ADN thế hệ thứ hai có cả vạch trung bình

và vạch nhẹ Kết quả thực nghiệm rõ ràng là không phù hợp với mô hình tự sao bảo toàn Hai

ông đã phát hiện ra vạch trung bình mà theo mô hình bảo toàn thì không thể có được Ngược lại với mô hình sao chép bán bảo toàn với giả thuyết một mạch đơn gốc dùng làm khuôn tổng hợp mạch mới rất phù hợp với kết quả thực nghiệm xuất hiện vạch trung bình ở lần sao chép đầu tiên trong môi trường nitơ nhẹ Kết quả lần sao chép thứ hai khẳng định hơn nữa sự phù hợp này

Hình 2.7: Quá trình thí nghiệm bán bảo toàn

5 Các giai đoạn của quá trình tái bản ADN nửa gián đoạn (semidiscontinous replication)

a./ Hiện tượng duỗi xoắn

Dưới tác dụng của enzym duỗi xoắn hoặc mở xoắn (enzym derulase hoặc pivotase), xảy

ra hiện tượng biến tính và dãn xoắn của chuỗi xoắn kép ADN, có sự đứt liên kết hydro giữa các bazơ nitơ, dẫn đến giải phóng các chuỗi đơn polynucleotid của ADN, tạo nên chạc tái bản (replication fork) hình chữ Y ở sinh vật nhân nguyên thuỷ thì có vòng tái bản (replycation bubble)

ở bước này có sự tham gia của một loại protein gọi là protein SSB (single-strand binding), tức là một protein bám sợi đơn, gắn trên ADN một sợi để sợi luôn luôn ở tình trạng

mở xoắn và được bền vững Mỗi SSB bám vào 8 bazơ nitơ của sợi đơn ADN Mỗi chạc tái bản

có khoảng 250 SSB

b./ Bước khởi đầu tái bản ADN bằng ARN mồi

Các ADN polymerase không thể thực hiện việc khởi đầu cho sự tái bản ADN, do đó giai

đoạn này đòi hỏi có một yếu tố mồi (primer) làm chức năng khởi động

Như ta đã biết, sự lắp ráp nucleotid tự do trong môi trường tế bào vào sợi khuôn, bao giờ cũng chỉ bắt đầu từ đầu 3’ của sợi, nói cách khác, sự kéo dài (elongation) được thực hiện do gắn thêm nucleotid vào đầu OH của carbon 3’ tự do ADN polymerase chỉ xúc tác sự gắn của một deoxyribonucleotid triphosphat trên cực 3’ OH, không có khả năng xúc tác sự gắn của nucleotit trên cực 5’P của chuỗi đối diện, nhưng ngay lúc đầu, chưa có đầu OH tự do ở ngay

điểm gốc tái bản Vì thế, enzym ARN polymerase hoạt động tổng hợp nên đoạn ARN mồi ngắn, tạo đầu 3’OH tự do, để sau đó enzym ADN polymerase III bắt đầu hoạt động tái bản ở

nitơ của đoạn mồi được định hướng theo trình tự nucleotit của sợi ADN khuôn

c./ Loại bỏ ARN mồi và hình thành những phân đoạn Okazaki

Sau khi ARN mồi được tổng hợp thì ADN polymerase I có hoạt động loại bỏ ARN mồi nhờ cắt từ đầu 5’ – 3’ và thay vào chỗ của ARN mồi một đoạn ADN khác

R.Okazaki (Nhật), 1969 là người đầu tiên phát hiện kiểu tái bản nửa gián đoạn của ADN, do đó người ta còn gọi cơ chế này là sự tổng hợp Okazaki

Okazaki đã chứng minh phần lớn ADN mới tái bản đều là những đoạn ngắn từ

1000-2000 nucleotid Người ta gọi đây là những phân đoạn Okazaki được bắt đầu bằng một đoạn ARN mồi ngắn, khoảng 10 đơn vị Đoạn mồi này được dùng là chất mồi để kéo dài chuỗi polydeoxyribonucleotid, nucleotit được gắn vào đầu 3’OH tự do và nối dài chuỗi ra theo chiều 5’-3’ Sau khi loại bỏ đoạn mồi và lấp đầy khoảng trống bằng tác dụng của ADN polymerase I thì các phân đoạn Okazaki được nối lại với nhau bằng enzym nối ADN ligase

Sợi ADN được tổng hợp bằng cách nối các đoạn Okazaki với nhau

được gọi là sợi ra chậm (lagging strand), hoặc sợi đi theo, là sợi được tổng hợp không liên tục, dùng khuôn sợi cũ có định hướng 5’-3’

Sợi kia được tổng hợp liên tục, dựa trên khuôn sợi cũ theo chiều 3’-5’, chiều mở của chạc ba, gọi là sợi dẫn đầu (leading strand) Đây là sợi mang đoạn mồi

Kiểu tái bản như trên đã trình bày, một sợi mới được tổng hợp liên tục theo khuôn sợi cũ, theo chiều 3’-5’, chiều mở của chạc ba, sợi mới kia được tổng hợp gián

đoạn, không liên tục, dùng khuôn sợi cũ có định hướng 5’-3’, được gọi là kiểu tái bản nửa gián

đoạn

d./ Nối các phân đoạn Okazaki nhờ enzym nối ligase

Khi sợi đi theo được hình thành thì đoạn mồi ARN được loại bỏ bởi ARN nuclease và những đầu tận cùng 5’ và 3’ của ADN được đồng thời đóng lại bởi ADN polymerase Cuối cùng các phân đoạn Okazaki được nối lại bởi ligase, tạo thành một sợi ADN mới liên tục như sợi dẫn đầu

Về các bước của quá trình nối các phân đoạn, khi xem xét cơ chế nối hai phân đoạn kế tiếp nhau, người ta thấy đầu 3’ của phân đoạn vừa mới được tổng hợp chỉ tiếp cận chứ không nối liền ngay với đoạn mồi ở đầu 5’ của phân đoạn được tổng hợp trước ADN polymerase III vừa hoàn thành tổng hợp phân đoạn mới sẽ tách khỏi ADN, ADN polymerase I sẽ thế chỗ, tiếp tục tổng hợp phân đoạn mồi theo chiều 5’-3’, đồng thời do có hoạt tính exonuclease, nó lại loại

bỏ đoạn mồi của phân đoạn Okazaki trước đó theo chiều 5’-3’ Khi ADN polymerase I kết

thúc, thì tồn tại một khe hở giữa 2 phân đoạn Okazaki kế tiếp nhau Khe hở này được lấp kín bởi sự xúc tác của enzym nối ADN ligase

III CáC HìNH THứC TáI BảN ở CáC ADN KHáC NHAU

1 Tái bản ADN ở các hệ ADN vòng nhỏ: ADN plasmid và ADN virus

Hệ ADN này sử dụng cơ chế vòng lăn (hay còn gọi là lăn đai thùng) để thực hiện quá trình sao chép Bước đầu tiên trong cơ chế này là hình thành một vết cắt trên một sợi đơn cho phép tháo xoắn sợi ADN chứa đầu 5’

Đầu tự do này nhanh chóng được phủ bởi protein SSB theo sau là sự kết hợp của primosome để tổng hợp mồi ARN và khởi đầu tổng hợp ADN nhờ ADN polymerase Đầu 3’

được mở rộng như hình thức sợi dẫn đầu trong sao chép ADN thông thường Đầu 5’ được tiếp tục “bóc” ra khỏi vòng lăn và các đoạn Okazaki mới được tổng hợp sẽ được nối lại với nhau Sau khi hoàn thành xong một vòng lăn, một sợi ADN vòng mới sẽ được tổng hợp, các đầu cuối của ADN thẳng sẽ được nối lại hình thành vòng thứ hai Và mỗi ADN mới cũng chứa một sợi

cũ theo nguyên tắc bán bảo toàn

Kiểu sao c hép vòng lăn

Hình 2.8: Cơ chế sao chép kiểu vòng lăn

Hình 2.9: Cơ chế tự sao của HSV

Ngoài ra, đối với hệ ADN vòng nhỏ còn có một hình thức tái bản nữa, đó là sự tái bản kiểu Theta (θ) ở vi khuẩn, như E.Coli, plasmid có dạng vòng, phân tử ADN trong đó cũng có

dạng vòng, sự tái bản bắt đầu tại một điểm mở đầu và đi theo hai chiều quanh vòng tròn, vì thế còn gọi là kiểu tái bản hai chiều (bidirectional) Đây còn gọi là kiểu tái bản theta vì các phân tử tái bản giống chu Hy Lạp theta Riêng đối với virus HSV có cả hai hình thức tái bản nói trên

2 Sao chép ở E coli- NST vi khuẩn chỉ có một điểm khởi đầu tái bản duy nhất

Hệ gen vi khuẩn của E coli chỉ chứa sợi ADN dài 4.6 x 106 bp Sự nhân đôi ADN bắt

đầu tại một điểm khởi đầu tái bản, hai chạc tái bản được hình thành ở đó và di chuyển về 2 hướng (tốc độ khoảng 500 - 1000 Nu/giây) đối diện nhau cho đến khi gặp nhau ở điểm đối diện

bên kia của vòng ADN Chỉ ở điểm này, E coli có thể điều khiển sự tái bản là điểm khởi đầu

origin Sau khi hai chạc tái bản được hình thành chúng di chuyển gần như với tốc độ không đổi cho đến khi kết thúc quá trình tự sao Hình thành một cấu trúc kiểu Theta (θ) Vì thế sự khởi

đầu tự sao là một quá trình điều hoà rất chặt chẽ, bắt đầu khi protein khởi đầu gắn vào vị trí khởi đầu đặc hiệu trong origin, và quấn ADN quanh chúng hình thành phức hợp ADN - protein Sau đó phức hợp này gắn vào helicase Cụ thể là phức hợp này đưa enzyme lên vùng ADN đơn ngay gần kề, các base của nó được bộc lộ ra trong quá trình hình thành phức hệ ADN - protein khởi đầu ADN primase kết hợp với helicase di chuyển ra xa chạc tái bản để tổng hợp đoạn mồi Ngay lập tức các protein còn lại cũng sẽ tập hợp hình thành 2 chạc tái bản với các phức hệ protein di chuyển về hai hướng ngược nhau tính từ origin Tiếp theo phức hệ enzyme này sẽ tiếp tục tổng hợp ADN cho đến khi toàn bộ sợi ADN phía sau origin được hoàn tất Sau đó enzyme topo II sẽ hoàn thành nốt công việc còn lại là phân ly hai sợi ADN cài xen vào nhau

ở E coli có sự điều hoà rất nghiêm ngặt mối quan hệ tương tác giữa protein khởi đầu và

origin tái bản, sao cho sự khởi đầu tái bản chỉ xảy ra trong điều kiện môi trường giàu dinh dưỡng, phức hệ origin - protein có thể hình thành trên phân tử ADN ngay khi chưa tổng hợp xong Bên cạnh sự điều hoà của protein khởi đầu, sự metyl hoá cũng góp phần vào sự kiểm soát này (sự tự sao bị ngăn chặn khi các Nu A bị metyl hoá)

Hình 2.10: Cơ chế tự sao ở E coli

3 Sự sao chép của ADN nhân chuẩn xảy ra ở một giai đoạn nhất định trong chu kỳ

tế bào

Sự tự sao trong hầu hết tế bào nhân chuẩn chỉ xảy ra trong một giai đoạn đặc trưng của

tế bào gọi là pha tổng hợp ADN hay pha S Trong tế bào động vật giai đoạn này thường kéo dài

8 giờ, ở những sinh vật đơn bào thời gian của giai đoạn này thường ngắn hơn, ví dụ ở nấm men

là 40 phút Cuối cùng, mỗi NST sẽ nhân đôi thành một NST kép dính nhau ở tâm động duy trì

tế bào, điều này chỉ có thể giải thích là do sự tái bản không đồng thời của các điểm khởi đầu tái bản, và mỗi đơn vị tái bản (thường chứa khoảng 20 - 80 điểm khởi đầu) chỉ xảy ra trong 1 giai

đoạn nhỏ trong toàn bộ pha S

Các đơn vị tái bản khởi đầu ngẫu nhiên hay theo một trật tự xác định? Để trả lời câu hỏi này, người ta sử dụng dẫn xuất tương tự Thymidin là bromodeoxyuridine để đánh dấu sợi ADN mới được tổng hợp trong quần thể tế bào đồng nhất, bổ sung hoá chất này vào các giai đoạn ngắn khác nhau trong suốt pha S Sau đó trong pha M những vùng NST có ADN được đánh dấu BrdU có thể nhận ra bằng cách nhuộm màu hay bằng kháng thể kháng BrdU (anti-BrdU-antibodies) Kết quả chỉ ra rằng các vùng khác nhau của mỗi NST tự sao theo một trật tự trong pha S Hơn nữa, từ tập hợp các chạc tái bản quan sát thấy trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi, sự

điều hoà thời gian tự sao phối hợp qua một vùng lớn của NST

b Vùng NST cuộn xoắn chặt hơn tự sao muộn hơn, trong khi các vùng có mức độ cuộn xoắn ít hơn có xu hướng tự sao sớm hơn

Dường như thứ tự các vùng khởi đầu tự sao hoạt hoá phụ thuộc một phần vào cấu trúc vùng NST chứa nó Như chúng ta đã biết về cấu trúc vùng NST, vùng dị nhiễm sắc (heterochromatin) là một trạng thái cô đặc đặc biệt của NST, trong khi những vùng chromatin

có hoạt tính phiên mã có mức độ cô đặc ít hơn cho phép nó tổng hợp ARN Heterochromatin có

xu hướng nhân lên ở giai đoạn sau trong pha S, vì thế có cơ sở để cho rằng thời gian tự sao liên quan đến việc đóng gói ADN trong chromatin Cơ sở này được củng cố bởi sự nghiên cứu NST

X ở tế bào động vật có vú cái (cả ở người) Trong khi 2 NST có trình tự nucleotid giống nhau thì một chiếc có hoạt tính phiên mã, chiếc còn lại thì không Hầu như, tất cả các NST bất hoạt

đều ở trạng thái heterochromatin, và được nhân đôi ở giai đoạn sau của pha S NST S đồng dạng còn lại có mức độ cô đặc ít hơn thì nhân đôi lên suốt cả pha S

Những phát hiện này chỉ ra rằng những vùng trong hệ gen có chất nhiễm sắc (chromain)

ít cô đặc, tạo thuận lợi cho cơ chế phiên mã, thì được nhân đôi đầu tiên Từ hình ảnh chụp phóng xạ tự ghi, người ta nhận thấy rằng chạc tái bản di chuyển với tốc độ có thể so sánh được giữa các vùng ít cô đặc và vùng cô đặc của chromatin trong suốt pha Vì thế sự tăng cường mức

độ cô đặc NST dường như ảnh hưởng đến thời điểm để chạc tái bản khởi đầu hơn là đến tốc độ sau khi đã hình thành của chúng

Mối quan hệ giữa thời gian tự sao và cấu trúc của NST được củng cố hơn khi chúng ta xem xét thời gian tự sao của các gen đặc trưng Kết quả cho thấy chỉ ở các gen được gọi là các gen “giữ nhà” (housekeeping) hoạt động trong tất cả các tế bào, tự sao rất sớm trong pha S

Ngược lại, các gen chỉ biểu hiện trong một vài dạng tế bào đặc trưng thì chúng được tự sao rất sớm trong những tế bào này và tự sao muộn hơn trong các tế bào mà chúng không biểu hiện

Mối quan hệ giữa cấu trúc NST và thời gian tự sao được thử nghiệm trực tiếp ở nấm men

động mã hoá đã được tiến hành Sau chuyển vị này thì vùng được chuyển từ chỗ tự sao trong giai đoạn muộn chuyển thành tự sao sớm hơn trong pha S Như vậy, thời điểm để sự khởi đầu sao mã bắt đầu được xác định bởi vị trí khởi đầu trên NST Tuy nhiên, những nghiên cứu với các origin khác lại cho thấy rằng sự khởi đầu của chúng muộn hơn thậm chí là nó nằm trong vùng NST cô đặc bình thường Do đó, thời điểm xuất hiện origin khởi đầu không chỉ phụ thuộc vào cấu trúc chromatin chứa nó mà còn phụ thuộc vào chính trình tự của nó

Ngoài những sai khác chi tiết trong hệ thống protein giúp tự sao và khởi đầu tái bản như trình bày ở trên thì NST nhân chuẩn còn có những vấn đề riêng mà vi khuẩn không có do chính cấu trúc của nó đem lại Đó là sự tổ chức nucleosome và dạng ADN thẳng của nó

c Nucleosome mới được hình thành sau chạc tái bản

Đây là điểm đặc trưng trong tự sao NST nhân chuẩn với cấu trúc nucleosome Sự nhân

đôi lên của NST không chỉ cần sự nhân đôi lên của ADN mà còn cả sự nhân lên và tập hợp các thành phần protein trong cấu trúc của nó Một hàm lượng protein Histon lớn gần như tương

đương với khối lượng ADN mới là cần thiết cho sự tổng hợp các nucleosome trong mỗi chu kỳ

tế bào Vì thế hầu hết các tế bào nhân chuẩn đều chứa nhiều bản sao cho gen mã hoá 5 loại protein Histon Ví dụ ở hệ gen động vật có xương sống có 20 nhóm gen lặp lại hầu hết chứa các gen mã hoá cho 5 loại Histon

Không giống như hầu hết các protein khác được tổng hợp trong kỳ trung gian, Histon chỉ được tổng hợp trong pha S: khi hàm lượng protein Histon tăng 50 lần nhờ tăng quá trình phiên mã và giảm quá trình thoái hoá ADN Nhờ cơ chế phụ thuộc vào đầu 3’ phần lớn mARN histon sẽ trở nên kém bền vững và sẽ bị phân huỷ rất nhanh khi sự tổng hợp ADN kết thúc ở cuối pha S (hoặc khi chất ức chế được bỏ thêm vào để ngừng sự tổng hợp ADN) Ngược lại, các protein histon lại khá bền vững và có thể sống sót trong toàn bộ chu kỳ phân bào Mối quan hệ giữa tổng hợp ADN và histon phụ thuộc vào một cơ chế liên hệ ngược (feedback) nhằm kiểm soát hàm lượng histon tự do để đảm bảo hàm lượng histon phù hợp với hàm lượng ADN mới

được tổng hợp

Cả hai phân tử ADN mới được tổng hợp đều được thừa hưởng histon cũ từ ADN mẹ Nhưng vì hàm lượng ADN tăng gấp đôi do đó histon mới cũng phải tăng gấp đôi Sự bổ sung histon vào ADN mới tổng hợp được sự hỗ trợ của CAF (chromatin assemble factor), là các phân tử protein kết hợp với chạc tái bản và đóng xoắn ADN mới được tổng hợp ngay sau khi nó

được bộc lộ ra khỏi phực hệ tự sao Các histon H3 và H4 mới được tổng hợp nhanh chóng được acetyl hoá ở đầu N của chúng, và sau khi nó được kết hợp với ADN thì các nhóm acetyl này

được loại đi nhờ các enzyme

d Vấn đề về telome

Đối với các phân tử ADN thẳng (như ở NST sinh vật nhân chuẩn), ADN polymerase chỉ

có khả năng gắn nucleotid vào đầu 3’-OH của polynucleotide trước nó, dẫn đến một vấn đề hết sức nghiêm trọng là khi chạc tái bản tiến đến đầu tận cùng của ADN thẳng sẽ tạo ra khoảng trống ở đầu tận cùng 5’ của sợi ADN mới tổng hợp (do mồi ARN bị loại bỏ) Do ở đầu 5’ của sợi mới sau khi loại mồi đi sẽ để lại một khoảng trống, do có đầu tận cùng 5’ nên ADN polymerase không có khả năng mở rộng thêm cũng như không có không gian để tạo ra 1 mồi ARN cần thiết để khởi đầu một đoạn tại vị trí quá gần đầu mút như thế

Hình 2.11: Sự biểu hiện đoạn telome trong sao chép ADN

Sự sao chép không hoàn toàn chuỗi xoắn kép ADN là không thể tránh khỏi để giải quyết vấn đề này tại các đầu của NST nhân chuẩn có sự kéo dài thêm một trình tự ADN đặc biệt không mang thông tin, đó là “ADN hy sinh” gọi là ADN telome (các đầu NST chứa nó

được gọi là telome) Các đầu này vẫn không được sao chép bằng bộ máy tổng hợp ADN như

đã mô tả nhưng không thành vấn đề đối với NST “thật” nó vẫn được sao chép một cách đầy đủ vì đoạn mồi được đặt đối diện với sợi khuôn ADN telome ở những tế bào phân chia nhanh, các telome được thêm vào để NST không bao giờ rơi vào tình trạng nguy hiểm “bỏ trống”

* Sự tổng hợp đoạn telome

Một telome gồm những đoạn bazơ ngắn lặp lại - nó thay đổi ở các loài khác nhau ở người có hàng trăm trình tự TTAGGG lặp lại Enzyme telomeraza thêm những trình tự này vào sau những trình tự ADN telome đã tồn tại trước đó Telomeraza là một dạng enzyme mà ta chưa từng gặp trước đây Nó có 2 đặc điểm đáng chú ý:

- Sử dụng ARN làm khuôn để tổng hợp ADN - nó là 1 enzyme sao mã ngược,

- Mang sợi khuôn trong cấu trúc của nó ARN này lai với một đầu của một đơn vị trình tự lặp lại, tại vị trí đó nó làm khuôn cho

sự lặp lại các đơn vị một cách chính xác, sau đó một đơn vị được thêm vào từng base một Khi một đơn vị được tổng hợp xong, enzyme di chuyển tới lai với một đầu của đơn vị mới và do đó telome được tạo thành một cách gián đoạn Sợi bổ sung với đoạn telome kéo dài được tổng hợp bằng cơ chế như đã biết để tạo thành telome sợi kép nhưng có một số điều không chắc chắn là làm thế nào sợi tổng hợp lại xảy ra được, có thể là một ADN polymerase khác đã được dùng

Hình 2.12: Cơ chế tổng hợp đoạn telome

Sự cần thiết của telome đã được kiểm chứng bằngviệc sử dụng YACs (Yeast Artifical Chromosome hay NST giả ở nấm men) Những NST có chứa 3 cấu trúc của ADN đặc biệt cho nhân đôi NST: tâm động, vị trí khởi đầu và telome YACs được bảo tồn cho các thế hệ sau khi

nó được thêm vào các tế bào nấm men nhưng nếu các NST này thiếu telome thì nó bị mất đi ngay khỏi tế bào

Không giống như ở Eukaryote, ở prokaryote các NST dạng vòng luôn tồn tại khuôn ADN sẵn để tổng hợp đoạn mồi Sự tồn tại telome ở Eukaryote có một ý nghĩa hết sức quan trọng Telomerase được tìm thấy trong tế bào mầm, ở đó các tế bào phân chia liên tục và nhanh chóng, telome dài ra liên tục để bù lại sự ngắn đi liên tục của chúng Tuy nhiên, ở các tế bào soma sự phân chia diễn ra chậm hơn, sự dài ra của telome ít thích hợp hơn và quả thật người ta tin rằng telomerase không tồn tại trong các tế bào này Nếu đúng như vậy thì có nghĩa là các tế bào soma chấp nhận những hạn chế về telome đủ đảm bảo cho cuộc sống của chúng và thế hệ sau Điều này dẫn đến các telome ở hầu hết các tế bào trở nên ngắn dần theo thời gian và điêù này có thể là một nhân tố quan trọng trong việc xác định tuổi thọ của loài Các tế bào soma có thể bị biến đổi trở nên phân chia nhanh chóng nêu chúng bị ung thư; chúng phân chia không giới hạn trong môi trường Thật thú vị khi biết rằng telomerase tồn tại trong các tế bào ung thư

và điều này cũng gợi mở những hướng nghiên cứu mới về việc sử dụng telomerase và cơ chế của chúng trong nghiên cứu và điều trị ung thư

4 Khả năng đặc biệt trong sự sao chép ADN ti thể và lục lạp

Tế bào nhân chuẩn chứa các bào quan như ty thể, là bộ máy sinh năng lượng (sinh ATP) quan trọng trong tế bào ATP như một nguồn năng lượng cho nhiều phản ứng hoá học trong tế bào Hầu hết tế bào thực vật đều chứa lục lạp có chức năng chuyển ánh sáng mặt trời thành năng lượng cung cấp cho tế bào sử dụng Cả hai bào quan này đều chứa ADN kép, thường là vòng, đôi khi là mạch thẳng trong một số thực vật, nấm, hay protozoa ADN không được tổ chức như ADN trong nhân và giống như ADN trong tế bào vi khuẩn hơn, với kích thước trung bình 1500-2000kb Tuy nhiên, sự sao chép ADN của các bào quan này lại khác cả ADN trong nhân lẫn ADN vi khuẩn Sự sao chép ADN của ty thể và lạp thể được khởi đầu bởi một đoạn mồi ARN Đến lúc này khi một sợi đơn ADN được sao chép nó sẽ thay thế vị trí của sợi bổ

sung gọi là vòng thay thế (displacement loop) cho đến khi sự tái bản hoàn thành một nửa Đến lúc này sự tái bản sợi thứ hai mới bắt đầu và đương nhiên sự tổng hợp là theo hướng đối diện Kết quả sao chép sinh ra hai phân tử ADN vòng lồng vào nhau Toàn bộ quá trình này như là sự

mở rộng d-loop Hai vòng ADN được tách nhau ra bởi enzyme topo II Enzyme này có khả năng thực hiện vết cắt trên cả hai mạch đơn và tái liên kết lại đồng thời với việc vượt qua từ sợi này sang sợi khác Nhờ có enzyme này mà hai ADN vòng được tách nhau thành 2 phân tử ADN riêng biệt giống nhau

Hình 2.13: Tự sao ở lục lạp và ty thể

Tế bào nhân chuẩn chứa các bào quan như ty thể, là bộ máy sinh năng lượng (sinh ATP) quan trọng trong tế bào ATP như một nguồn năng lượng cho nhiều phản ứng hoá học trong tế bào Hầu hết tế bào thực vật đều chứa lục lạp có chức năng chuyển ánh sáng mặt trời thành năng lượng cung cấp cho tế bào sử dụng Cả hai bào quan này đều chứa ADN kép, thường là vòng, đôi khi là mạch thẳng trong một số thực vật, nấm, hay protozoa ADN không được tổ chức như ADN trong nhân và giống như ADN trong tế bào vi khuẩn hơn, với kích thước trung bình 1500-2000kb Tuy nhiên, sự sao chép ADN của các bào quan này lại khác cả ADN trong nhân lẫn ADN vi khuẩn Sự sao chép ADN của ty thể và lạp thể được khởi đầu bởi một đoạn mồi ARN Đến lúc này khi một sợi đơn ADN được sao chép nó sẽ thay thế vị trí của sợi bổ sung gọi là vòng thay thế (displacement loop) cho đến khi sự tái bản hoàn thành một nửa Đến lúc này sự tái bản sợi thứ hai mới bắt đầu và đương nhiên sự tổng hợp là theo hướng đối diện Kết quả sao chép sinh ra hai phân tử ADN vòng lồng vào nhau Toàn bộ quá trình này như là sự

mở rộng d-loop Hai vòng ADN được tách nhau ra bởi enzyme topo II Enzyme này có khả năng thực hiện vết cắt trên cả hai mạch đơn và tái liên kết lại đồng thời với việc vượt qua từ sợi này sang sợi khác Nhờ có enzyme này mà hai ADN vòng được tách nhau thành 2 phân tử ADN riêng biệt giống nhau

*** Những đặc điểm chung về tái bản ADN ở các prokaryote và eukaryote

- Sự tái bản ADN diễn ra theo kiểu bán bảo toàn (semiconservative)

- Quá trình tái bản ADN diễn ra với sự tham gia của nhiều protein và enzym khác nhau, quan trọng nhất là các ADN-polymerase

- Quá trình tái bản ADN được khởi đầu tại một hoặc một số vị trí đặc thù trên ADN gọi

là khởi điểm (Origin)

- ADN polymerase tự nó không thể khởi đầu việc tổng hợp ADN mới mà cần phải có

đoạn mồi (primer), là một đoạn ARN ngắn (50-100 ribonucleotit) được tổng hợp trước bởi enzym primase

- Vì ADN polymerase chỉ hoạt động theo chiều 3’- 5’, trong khi ADN khuôn có hai sợi ngược chiều nhau cho nên ít nhất trên một sợi khuôn diễn ra sự tổng hợp không liên tục (gián

đoạn) các đoạn ADN ngắn 1000-2000 nucleotit, gọi là tổng hợp Okazaki

- Một ADN polymerase khác tiến hành cắt bỏ đoạn ARN mồi và tổng hợp ADN thay thế, và các đoạn Okazaki cũng sẽ được nối liền nhờ ADN ligase

Tuy nhiên, ở sinh vật nhân chuẩn có nhiều thành phần enzyme tham gia trong hệ thống

tự sao hơn là ở vi khuẩn, thậm chí chức năng cơ bản của chúng trong các domain này là giống nhau Ví dụ protein SSB ở sinh vật nhân chuẩn được hình thành từ 3 tiểu phần trong khi ở vi khuẩn chỉ gồm 1 tiểu phần ADN primase ở sinh vật nhân chuẩn được liên kết với một enzyme

đa phần ADN pol α, trong khi ở sinh vật nhân sơ thì primase liên kết với helicase trong primosome, enzyme này bắt đầu tổng hợp mỗi đoạn okazaki trên sợi theo sau và mồi ARN và sau đó mở rộng đoạn mồi ARN với một đoạn ADN ngắn, sau đó nhường chỗ cho enzyme thứ hai là ADN pol δ tổng hợp tiếp phần còn lại của đoạn Okazaki với sự hỗ trợ của enzyme kẹp tóc

Sự khác biệt nữa trong sự tự sao của sinh vật nhân chuẩn và sinh vật nhân sơ là: ở sinh vật nhân chuẩn chỉ tổng hợp các đoạn Okazaki 200bp và tốc độ tự sao thường chỉ bằng 1/10 tốc

độ của vi khuẩn

CÂU HỎI ÔN TẬP CHƯƠNG II

tắc của quá trình tái bản

các tế bào sinh vật nhân chuẩn

bản ở ty thể, plassmid)

sinh vật nhân chuẩn

Chương 3 Quá trình phiên mã

I các thành phần tham gia vào quá trình phiên mã

1 Hệ enzyme tham gia vào quá trình phiên mã

a Hệ enzyme ARN polymerase ở E coli

ARN polymerase có nhiệm vụ tổng hợp ARN, hoạt động giống như ADN polymerase, tức phải có trình tự khuôn mẫu, nucleotid triphotphate (ATP, UTP, GTP, CTP) và ion Mg2+, nhưng không cần đoạn mồi

ARN polymerase của E coli là một trong những enzyme lớn nhất trong tế bào, chứa ít

nhất 6 tiểu đơn vị polypeptide, bao gồm 2 tiểu đơn vị α, một tiểu đơn vị β, một tiểu đơn vị beta prime (β’), 1 tiểu đơn vị ω, và 1 tiểu đơn vị σ Năm tiểu đơn vị α, α,β, β’, ω liên kết chặt chẽ với nhau tạo thành lõi enzyme có khả năng tổng hợp ARN từ ADN nhưng không có khả năng nhận diện vị trí khởi đầu của một gen Tiểu đơn vị σ là tiểu đơn vị cần thiết cho khởi đầu phiên mã ở điểm bắt đầu của một gen và liên kết với lõi enzyme tạo thành holoenzyme nhưng không cần thiết cho giai đoạn kéo dài và được giải phóng khỏi phức hệ sau khi giai đoạn khởi đầu kết thúc Phần enzyme được giữ lại di chuyển dọc theo ADN, được gọi là lõi enzyme và có cấu trúc

α2ββ’ω ở E coli, ARN polymerase có thể tổng hợp ARN với tốc độ khoảng 40 Nu/1 giây ở

370C Enzyme có cấu trúc không phải hình cầu với sườn bên phải nhô ra một kênh hình trụ Kích thước của kênh được giả thuyết rằng nó có thể liên kết với 16bp của ADN Toàn bộ enzyme liên kết với một vùng ADN khoảng 60bp

Hình 3.1 : Sơ đồ phức hệ ARN-polymerase của E coli

ARN polymerase liên kết với ADN theo 2 bước:

Bước thứ nhất, enzyme liên kết với promoter: ở vi khuẩn, promotor cùng với nhân tố σ

điều khiển sự phiên mã thường xuyên của một gen Ví dụ σ70 tham gia quá trình khởi đầu phiên mã của enzyme “giữ nhà”, những gen này biểu hiện ở mọi thời điểm để duy trì sự trao đổi chất, cấu trúc tế bào, và do đó khởi đầu quá trình tổng hợp mARN từ một nhóm lớn các gen Tuy nhiên, có sự thay đổi trong trình tự promotor giữa các gen được nhận ra bởi tiểu đơn vị σ70 và

sự dao động này ảnh hưởng tới tần số của khởi đầu phiên mã Do đó một gen có thể khởi đầu phiên mã mỗi giây một lần nhưng gen khác lại có tần số là 5 phút Đây là ý nghĩa cơ bản của cấp độ điều hoà biểu hiện gen trong prokaryote

Bước thứ 2: ADN bắt đầu tháo xoắn ở trình tự (-10) để cho phép kết cặp base trên sợi khuôn và ARN pol xúc tác phản ứng Tiểu đơn vị σ nhận diện của các trình tự liên ứng, sau đó

được tháo ra khỏi lõi enzyme

Mặc dù hầu hết các ARN pol đều giống như ARN pol của E coli, tức là cấu trúc gồm

nhiều tiểu đơn vị, tuy nhiên không phải là tuyệt đối (ARN pol được mã hoá ở bacteriophage T3

và T7 là một chuỗi polypeptide đơn và nhỏ hơn nhiều so với các enzyme có nhiều tiểu đơn vị của vi khuẩn, chúng tổng hợp ARN với tốc độ rất nhanh-200Nu/giây ở 370C và nhận ra các trình tự ADN liên kết đặc hiệu của chính chúng)

b Hệ enzyme ARN polymerase ở Eukaryote

ở Eukaryote có 3 loại ARN polymerase khác nhau, đều là những enzym lớn chứa ít nhất

12 tiểu đơn vị, tương ứng với các tiểu đơn vị trong lõi enzym ARN polymerase của E coli Các

gen mã hóa cho 2 tiểu đơn vị lớn nhất của mỗi polymerase có tính tương ứng lẫn nhau Tiểu

đơn vị lớn nhất và tiểu đơn vị lớn thứ hai tương tự với tiểu đơn vị β’ và β của polymerase trong

cho cả ARN pol I và pol III, ngoài ra có một tiểu đơn vị khác đặc hiệu cho ARN - pol II tương ứng với tiểu đơn vị α của ARN pol ở E coli Có ít nhất 5 tiểu đơn vị là chung cho các enzym

Mỗi enzym còn chứa từ 4 đến 7 tiểu đơn vị chỉ có mặt trong loại đó mà không có ở loại khác Các phức hệ của ARN polymarase có chức năng phiên mã những loại gen khác nhau, có độ mẫn cảm khác nhau đối với độc tố α-amanitin của nấm và có thể được phân biệt theo hoạt

động của chúng:

+ ARN pol I phiên mã hầu hết các gen mã hoá rARN, nằm trong hạch nhân (nhân nhỏ)

và không mẫn cảm với độc tố nấm α-amanitin ARN pol I cũng có cấu trúc tương tự như các ARN pol khác, nhưng vắng mặt đuôi C, điều này sẽ giúp giải thích tại sao sản phẩm phiên mã của nó không bao giờ gắn mũ hay có đuôi poly (A) Và sự khác biệt này sẽ giúp tế bào phân biệt giữa ARN không mã hoá và mARN

+ ARN pol II phiên mã tất cả gen mã hoá protein và một số gen mã hoá snARN, nằm trong dịch nhân và rất mẫn cảm với α-amanitin Tiền ARN phải được chế biến sau khi tổng hợp bởi việc hình thành mũ, gắn đuôi poly (A) và cắt intron ở trong nhân trước khi đi ra tế bào chất

để tham gia tổng hợp protein

+ ARN pol III là một phức hệ gồm ít nhất 16 tiểu đơn vị, nằm trong nhân và mẫn cảm trung bình với α-amanitin ARN polIII có vai trò trong việc tổng hợp tARN, tiền 5S rARN, các snARN và các ARN nhỏ khác

Bên cạnh những enzym trong nhân, tế bào eukaryote chứa những polymerase bổ sung trong ty thể và lạp thể

Giống như ARN polymerase của vi khuẩn, trong tế bào eukaryote, mỗi enzym xúc tác quá trình phiên mã theo chiều 5’
3’ và tổng hợp ARN bổ sung với sợi khuôn antisense Phản ứng yêu cầu các tiền nucleotid (NTP) và không yêu cầu mồi để khởi đầu phiên mã Không giống như ở vi khuẩn, ARN polymerase ở eukaryote cần sự có mặt của protein khởi đầu trước khi chúng có thể liên kết với promotor và khởi đầu phiên mã

2 Promotor

a Promotor ở prokaryote

ARN polymerase liên kết với các vị trí khởi đầu đặc hiệu nằm trước các trình tự được phiên mã, gọi là promotor Các promotor khác nhau được nhận ra bởi các nhân tố σ khác nhau

Promotor lần đầu tiên được mô phỏng thông qua đột biến làm tăng lên hay giảm bớt tỷ lệ phiên mã của các gen lac-operon Trình tự promotor nằm ở điểm bắt đầu phiên mã (được ký hiệu là

vị trí +1) Để phù hợp với điều này, các trình tự promotor được ký hiệu là một số âm phản ánh

khoảng cách ngược kể từ điểm khởi đầu Đột biến di truyền của E coli cho thấy chỉ một đoạn

các trình tự rất ngắn được bảo tồn là quyết định chức năng promotor

Hình 3.2: Trình tự các promotor ở một số sinh vật

Promotor σ70 bao gồm một chuỗi polynucleotid khoảng từ 40 đến 60bp Vùng nằm trong khoảng -55 đến +20 liên kết với polymerase, và vùng nằm trong khoảng từ -20 đến +20 được bảo vệ chắc chắn khỏi sự phân huỷ của ADNase I, ngăn cản sự đến gần của nuclease với ADN

Đột biến di truyền của các trình tự promotor cho thấy các trình tự nằm xung quanh vị trí -40 là cần thiết cho chức năng promotor 6 base ở xung quanh vị trí -10 và -35 có tầm quan trọng đặc

biệt với chức năng của promotor trong E coli

+ Trình tự -10: được bảo toàn nhất ở promotor σ70, là một đoạn 6bp Trình tự này nằm quanh vị trí -10 so với điểm bắt đầu phiên mã, có một trình tự liên ứng là TATAAT, còn được gọi là hộp pribnow (được Pribnow tìm thấy năm 1975) Hai base đầu tiên và base cuối cùng

được bảo tồn cao nhất 6 base này cách điểm khởi đầu phiên mã khoảng 5-8bp Các base xen giữa không được bảo tồn mặc dù khoảng cách 5-8bp là quan trọng Đây chính là trình tự mà ADN bắt đầu được tháo xoắn bởi ARN polymerase

+ Trình tự -35: Xung quanh vị trí -35 có một bộ 6base có trình tự liên ứng TTGACA

được bảo tồn nhất trong promotor, đặc biệt là 3base đầu tiên Trình tự này cách hộp pribnow khoảng 16-18bp trong tổng số 90% các promotor Các trình tự xen giữa các yếu tố bảo tồn này không quan trọng

Các gen có điểm bắt đầu phiên mã chứa base purin chiếm đến 90% Điểm khởi đầu (vị trí +1) có G phổ biến hơn A Thông thường các base C và T nằm bên cạnh nucleotid khởi đầu phiên mã ( ví dụ: CGT hay CAT)

TTGACA -16-18bp -TATAAT -5-8bp -C(G/A)T -

Những trình tự được mô tả ở trên là những trình tự liên ứng mẫu mực Tuy nhiên, có sự khác nhau trong trình tự giữa các promotor khác nhau, và chúng có thể thay đổi hiệu quả phiên mã hơn 1000 lần

Tóm lại, chức năng của các vùng promotor khác nhau có thể được xác định như sau:

Trình tự thừa nhận

Trình tự -35 là thành phần của vùng nhận biết, làm tăng cường sự nhận biết và tương tác với tiểu đơn vị σ của ARN pol

Vùng -10 rất quan trọng cho sự tháo xoắn ADN và là trình tự cơ bản của σ

Những trình tự xung quanh điểm bắt đầu phiên mã ảnh hưởng đến sự khởi đầu phiên mã

Promoter structure in prokaryotes

5’ PuPuPuPuPuPuPuPu AUG

Promoter

+1 +20 -7

-12 -31

-36

mRNA

TTGACA AACTGT

-30 region

TATAAT ATATTA

Hình 3 3 : Câú trúc promotor điển hình ở prokaryote

Trình tự 30 base đầu tiên được phiên mã cũng ảnh hưởng đến quá trình phiên mã Trình

tự này điều khiển tỷ lệ σ rời khỏi promotor, cho phép khởi động lại phức hệ ARN pol khác, do

đó ảnh hưởng đến tỷ lệ phiên mã và độ bền của promotor Tầm quan trọng của sự tách rời mạch trong phản ứng khởi đầu là do ảnh hưởng xoắn âm của sợi khuôn ADN làm tăng cường khởi

đầu phiên mã vì cấu trúc siêu xoắn này cần ít năng lượng để tháo xoắn ADN hơn Một số promotor không có khả năng được phiên mã hoàn toàn dưới điều kiện bình thường Ví dụ: Lac promotor (P lac) yêu cầu một yếu tố hoạt hoá phụ gọi là protein tiếp nhận AMP vòng (cAMP receptor protein CRP) để liên kết vào một vị trí trên ADN, giúp cho promotor tăng cường khả năng liên kết và khởi đầu phiên mã Những promotor khác, như promotor của gen sốc nhiệt bao gồm các trình tự promotor liên ứng khác nhau có thể được nhận ra bởi một ARN pol trong đó yếu tố σ khác với yếu tố σ70

b Promotor ở Eukaryote

Các ARN polymerase phiên mã các gen mã hoá cho các ARN, bắt đầu loại bám vào một trình tự promotor Promotor được mô tả rõ nhất ở trong tế bào người, trong đó nó bao gồm trình

tự song phương trong vùng trước điểm khởi đầu nằm trên ADN

Trình tự promotor bao quanh điểm khởi đầu, kéo dài từ -45 đến +20, và giúp khởi đầu phiên mã Tuy nhiên, ảnh hưởng của nó tăng lên rất nhiều bởi yếu tố điều khiển nằm ở vị trí trước đó, UCE (upstream control element), từ 180 đến - 107 Cả 2 vùng có một thành phần cấu tạo lạ thường cho 1 promotor là giàu GC

ARN pol I yêu cầu 2 yếu tố phụ thuộc UBF I (upstream binding factor I) là một polypeptide đơn liên kết với yếu tố giàu GC trong lõi promotor và UCE Yếu tố SL I (selectivity factor I) không có sự đặc hiệu cho promotor Khi 2 nhân tố đã liên kết, ARN pol I có thể liên kết với lõi promotor để khởi đầu phiên mã Chúng ta thừa nhận rằng các nhân tố liên kết với trình tự promotor tương tác thẳng với ARN pol I, nhưng chúng ta không biết sự liên kết của các nhân tố giống nhau ở UCE - kích thích khởi đầu ở phần trình tự của promotor lõi như thế nào

SL I bao gồm 4 protein Một trong chúng được là TBP (TATA -binding protein), nhân tố này cũng có chức năng trong khởi đầu phiên mã của polymerase II và polymerase III TBP không

liên kết với chuỗi ADN giàu GC, nên nhiệm vụ liên kết với ADN là của các thành phần khác của SLI Nó cũng giống như TBP tương tác với ARN pol I, có thể với 1 tiểu đơn vị chung hay 1

điểm mà có thể được bảo tồn giữa các polymerase

Cách thức hoạt động của SLI cũng tương tự như nhân tố sigma, vì một phức hệ protein

độc lập, nó không liên kết đặc hiệu với promotor, nhưng trong sự kết hợp với các thành phần khác, vùng promotor đặc hiệu được liên kết Nó có thể có chức năng “sơ cấp” đảm bảo rằng ARN pol I được khoanh vùng một cách chính xác ở điểm khởi đầu Một chức năng có thể so sánh được là cung cấp cho ARN pol II và III bởi 1 nhân tố chứa TBP liên kết với các protein khác Do đó, một nét đặc điểm chung trong khởi đầu bởi cả 3 enzym là 1 sự nương tựa trên 1 nhân tố xác định vị trí “positioning” bao gồm TBP liên kết với protein đặc hiệu cho mỗi loại promotor

Đối với ARN pol II, cũng như trong prokaryote, ở eukaryote cũng có promotor ở đầu 5’

để bắt đầu phiên mã Điểm bắt đầu phiên mã được nhận ra là một trình tự ngắn nằm giữa các

Nu -3 và +5 gọi là vùng khởi đầu Khoảng 80% gen có hộp TATA ở vị trí -25, hộp này cũng tương ứng như hộp Pribnow ở promotor của prokaryote Nằm giữa khoảng 100-200 hay xa hơn nữa so với điểm khởi đầu, những yếu tố hay những hộp chứa các trình tự ADN đặc hiệu gọi là các nhân tố phiên mã (trancription factor) Ba yếu tố chung là hộp CAAT (gọi là CAT), hộp GC

và hộp tám cặp base Những hộp này nằm ở vùng giữa vị trí -100 và -200 ở những gen khác nhau Thêm vào đó, có những yếu tố ADN khác hay những hộp khác liên kết với nhân tố phiên mã để hoạt hoá sự phiên mã của gen, và được gọi là yếu tố tăng cường enhancer Đặc điểm

đáng lưu ý của chúng là chúng nằm cách xa gen, khoảng cách thậm chí là lên đến hàng ngàn base và sự định hướng của chúng trong ADN có thể được đảo ngược lại mà không làm suy yếu chức năng của chúng

Điều này, khiến sự xác định promotor ở eukaryote ít chính xác hơn trong prokaryote Promotor trong gen của eukaryote bao gồm các trình tự của ADN phải ở một vị trí tương đối xác định với điểm khởi đầu Do đó, promotor bao gồm vùng khởi đầu, hộp TATA và các yếu tố phía trước như hộp GC và CAAT nhưng không có yếu tố sự tăng cường

Hình 3 4 : Câú trúc promotor điển hình ở Eukaryote

Trong mối quan hệ giữa chức năng của các nhân tố phiên mã và enzyme ARN pol III, promotor được chia thành hai nhóm được nhận biết bởi những cách khác nhau và bằng những nhóm nhân tố khác nhau Promotor cho gen mã hoá ARN 5S và tARN nằm ở bên trong, sau

điểm khởi đầu phiên mã Promotor của gen mã hoá snARN nằm ở phía trước điểm khởi đầu Trong cả hai trường hợp, những nhân tố cần thiết cho chức năng promotor bao gồm những trình

tự dành riêng cho sự nhận biết bởi các nhân tố phiên mã Hai loại promotor này bao gồm 3 nhân tố kèm theo: TFIIIA là thành phần của zinc finger protein, TFIIIB bao gồm TBP và hai protein khác, TFIIIC là một phức hệ protein lớn và chứa ít nhất 5 tiểu đơn vị Hiện nay vẫn chưa hiểu rõ tất cả các tương tác xảy ra ở promotor polIII, nhưng qui tắc thì đã được làm sáng

tỏ ở cả hai loại promotor, TFIIIC nhận ra hộp B nhưng liên kết với một vùng rộng hơn bao gồm hộp A và hộp B (Vùng chỉ đạo phiên mã của gen tARN nằm sau vị trí khởi đầu trong đơn

vị phiên mã và có hai trình tự được bảo tồn cao gọi là hộp A: 5’-TGGCNNAGTGG-3’ và hộp B: 5’-GGTTCGANNCC-3’) TFIIIA và TFIIIC có thể bị cắt khỏi promotor mà không ảnh