Nghiên cứu chè

Frenchbach đã nuôi Aspergillus niger trên môi trường Raulin dịch thể với nguồn đường được thay thế bằng axit tannic và đã tách chiết được enzim tannase từ loại nấm này vào năm 1901 Knuds

CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN

1.1 Nguồn gốc cây chè

Các công trình nghiên cứu và khảo sát trước đây cho rằng nguồn gốc của cây chè là vùng cao nguyên Vân nam Trung quốc, nơi có điều kiện khí hậu ẩm ướt quanh năm Theo các tài liệu của Trung quốc thì cách đây 4.000 năm người Trung quốc đã biết dùng chè làm dược liệu, sau đó mới dùng chè để uống

Năm 1823, R.Bruce phát hiện những cây chè dại lá to ở vùng Atxam (Ấn Độ)

từ đó các học giả người Anh cho rằng quê hương của cây chè là ở Ấn Độ chứ không phải ở Trung quốc

Những công trình nghiên cứu của Dejmukhatze (1961-1976) về phức catechin của

lá chè từ các nguồn gốc khác nhau, so sánh về thành phần các chất catechin giữa các loại chè được trồng và mọc hoang dại đã nêu lên luận điểm về sự tiến hoá, trên

cơ sở đó xác minh nguồn gốc cây chè Dejmukhatze kết luận rằng những cây chè

cổ xưa mọc hoang dại tổng hợp chủ yếu là (-)epi catechin và (+)epi catechin galat,

ở chúng phát triển chậm khả năng tổng hợp (-)epigalo catechin và galat của nó để tạo thành (+) galo catechin Khi nghiên cứu các cây chè dại ở Việt nam, ông cũng nhận thấy, chúng tổng hợp chủ yếu là (-)epi catechin và (+)epi catechin galat (chiếm 70% tổng số các loại catechin) Khi những cây chè dại được di thực lên phía Bắc, chúng thích ứng dần với các điều kiện sinh thái bằng cách có các thành phần catechin phức tạp hơn Từ sự biến đổi sinh hoá của các lá cây chè mọc hoang dại và các cây chè được trồng trọt, chăm sóc, Dejmukhatze cho rằng, nguồn gốc của cây chè chính là ở Việt Nam.[3]

Hiện nay chè được phân bố khá rộng trong những điều kiện tự nhiên rất khác nhau, từ 30 độ vĩ nam đến 45 độ vĩ bắc, là những nơi có điều kiện tự nhiên khí hậu khác xa vùng nguyên sản Những thành tựu khoa học của các nhà chọn giống Liên

Xô (cũ), Trung quốc, Nhật Bản, Đài Loan đã tạo ra rất nhiều giống chè mới có khả năng thích ứng với các điều kiện khí hậu khác nhau, tạo nhiều triển vọng cho nghề trồng chè trên thế giới.

1.2 Giới thiệu về hợp chất tannin

1.2.1 Định nghĩa tannin

Tannin là những hợp chất tự nhiên thuộc nhóm polyphenol phổ biến trong thực vật Chúng có vị chát, có tính thuộc da Có nghĩa là có khả năng liên kết với protein của da tạo thành cấu trúc bền vững với quá trình thối rữa Phân tử lượng tannin khoảng 500 - 5.000 Thuật ngữ " Tannin" sử dụng trong công nghiệp sinh học và thực phẩm để chỉ tất cả những polyphenol tự nhiên có vị chát, song không phải các chất này có khả năng thuộc da thật sự Tính chất này chỉ có với các hợp chất cao phân tử có phân tử lượng lớn từ 1.000 - 5.000 Các phân tử có phân tử lượng thấp hơn chỉ có vị chát không có tính thuộc da, để phân biệt người ta gọi là "tannin thực phẩm", "tannin chè"

1.2.2 Cấu trúc hoá học và phân loại

1.2.2.1 Cấu trúc hoá học

Cấu trúc của tannin phức tạp được chia làm 2 loại:

- Tannin thuỷ phân được (tannin pyrogallic)

- Tannin không thuỷ phân được (tannin pyrocatechic)

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử của tannin

1.2.2.2 Phân loại

a, Tannin thuỷ phân được (Tannin pyrogalic = galotannin)

Khi thuỷ phân bằng axit hoặc bằng enzim tannase giải phóng ra phần đường thường là glucose, có khi là những loại đường đặc biệt (hamamelose ) Phần không đường là các axit Axit hay gặp là axit gallic Các axit gallic có thể nối với nhau để tạo thành axit digallic, trigallic Ngoài axit gallic còn gặp các axit khác như axit

ellagic, axit luteolic Phần đường và phần không đường nối với nhau bằng cầu nối este (không phải cầu nối axetal) nên người ta coi tannin loại này là những pseudoglycosid

Axit gallic Axit digallic

Hình 1.2 : Cấu trúc của axit gallic và axit digallic

b, Tannin không thuỷ phân được (Tannin ngưng tụ, tannin pyrocatechic)

Dưới tác dụng của axit hoặc emzim dễ tạo thành chất đỏ tannin gọi là phlobaphen không tan (Sản phẩm của sự trùng hợp hoá và oxy hoá) hay là phlobatannin Trong cấu trúc của các tannin loại này còn có các đơn vị catechin hoặc epicatenchin hoặc gallocatenchin Sự ngưng tụ thường xảy ra ở dây nối carbon – carbon, ví dụ giữa C8 của catechin và C4 của epicatechin tạo thành dimer

- Tạo nhiều dây nối hydro với mạch polypeotid của protein

Có thể dựa vào kết tủa với muối sắt để xác định tannin trên vi phẫu

1.3 Giới thiệu về enzim tannase [27]

cơ chất có độc tính gây ức chế quá trình hình thành axit gallic từ axit tannic trong các mụn cây đó Vanteighem là người đầu tiên chứng minh rằng sự hình thành của axit gallic là do hoạt động của một loại nấm mốc Ông tuyên bố rằng loài vi sinh

vật này là nấm mốc Penicillium glaucum và loài nấm mới được ông đặt tên là Aspergillus niger Ông bắt đầu nuôi bề mặt và dịch thể để đánh giá khả năng phân giải của axit tannic Frenchbach đã nuôi Aspergillus niger trên môi trường Raulin

dịch thể với nguồn đường được thay thế bằng axit tannic và đã tách chiết được enzim tannase từ loại nấm này vào năm 1901 (Knudson,1913)[19] Các nghiên cứu

mở rộng đầu tiên về đặc tính, nguồn gốc, ứng dụng, phạm vi sử dụng, cơ chế phản ứng và độ đặc hiệu của tannase đã được tiến hành bởi nhóm tác giả Fernbanch, Pottevin, Dykerhoff, Ambruter, Thom và Raper vào đầu của thế kỷ XX Những nghiên cứu này hơn nữa còn cho thầy rằng tannase là một enzim có thể biến đổi và

có thể được tổng hợp trong quá trình lên men trạng thái rắn do nấm sợi Aspergillus

và Penicillium Ứng dụng của tannase để sản xuất axit gallic từ các nguyên liệu

chứa tannin đã sớm được phát hiện

Năm 1960, tannase được tách và tinh chế từ thực vật và nấm bởi Madhavakrishna - Bose và Dhar – bose Một công ty của Nhật Bản đã tiến hành

thanh lọc và nghiên cứu đặc tính của Aspergillus sinh tannase Họ cũng đã phát

triển một thử nghiệm quang phổ để xác định của hoạt động tannase, trước đây dựa trên phương pháp chuẩn độ Trong đầu những năm bảy mươi, một số bằng sáng chế

đã được công bố cho các ứng dụng tiềm năng của tannase trong ngành công nghiệp thực phẩm và nước giải khát (Van de Lagemaat và Pyle, 2006)[36] Nhiều nghiên cứu về các nguồn, khảo nghiệm, ứng dụng, sự cố định, phương pháp lọc, và đặc tính của tannase diễn ra trong những năm 1980 Các nghiên cứu chỉ ra rằng ngoài hình thành từ nấm sợi, tannase cũng được tìm thấy trên động vật (Lekha và Lonsane, 1997)[23] và vi khuẩn (Deschamps et al, 1983)[12] Sau đó phương pháp

săc kí đã được phát triển để xác định / phát hiện hoạt tính của tannase (Jean et al,

1981)[17]

Việc sản xuất tannase từ nguồn vi khuẩn được tập trung phát triển từ năm 1990 trở đi Nhiều nghiên cứu đã chứng minh tiềm năng lợi thế của quá trình lên men

trạng thái rắn để sản xuất tannase từ nguồn nấm mốc Hatamoto et al (1996)[16] là

người đầu tiên tái bản trình tự và khuếch đại bộ gen có hoạt tính sinh tannase để

kích thích hoạt tính chuyển hoá sinh tannase trong Aspergillus oryzae Osawa và

Walsh (1993)[26] đã phát triển một phương pháp khảo nghiệm nhanh chóng và đơn giản để sàng lọc nấm sinh tannase ngoại bào phục vụ cho sản xuất

Hình 1.4 : Quá trình thủy phân axit tannic của enzim tannase

1.3.3 Vi sinh vật sinh tannase

Trên 140 năm nghiên cứu đã phát hiện ra nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tannase, nổi bật là vi khuẩn, nấm men và nấm mốc Một số loài động vật cũng

có khả năng sinh tannase Một vài nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự trao đổi vi sinh vật trong cơ thể động vật là nguyên nhân sinh tannase chứ không phải là do loài động vật đó.

Nấm sợi: Các loài nấm sợi thuộc các chi Aspergillus và Penicillium được sử dụng

rộng rãi cho việc sản xuất tannase Đa số các công trình nghiên cứu đã sử dụng

những nhóm này như: Aspergillus awamori Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae, Aspergillus terreus, Penicillium notatum, Penicillium islandicum, Penicillium digitatum, Penicillium citrinum Penicillium glabrum và Penicillium restrictum…

Nấm men : Có vài báo cáo về sản xuất tannase từ nấm men như: Candida ssp., Pichia ssp., Debaryomyces hansenii…

Vi khuẩn : Các báo cáo về khả năng sinh tannase từ vi khuẩn được thực hiện từ trước những năm 1980 Trong 25 năm gần đây, khoảng một chục các báo cáo đã được công bố về tannase vi khuẩn và khoảng 25 vi khuẩn sinh tannase mạnh đã

được phân lập Deschamps et al, (1983)[12] phân lập một số các chủng vi khuẩn

sinh tannase có thể sử dụng axit tannic như nguồn carbon duy nhất Họ đã có thể sản xuất tannase từ bốn chủng sử dụng tannin từ hạt dẻ và quan sát thấy rằng axit gallic là sản phẩm phân hủy duy nhất Từ thể kỉ 19 trở đi, đã có sự tập trung mạnh vào việc sản xuất tannase bởi các loại vi khuẩn Một số chủng đang được sử dụng

như: Bacillus plumilus, Bacillus polymyxa, Bacillus licheniformis, Pseudomonas solanaceaum, Lactobacillus ssp., Enterococcus faecalis… Một vài loài vi khuẩn

trong đường tiêu hoá của động vật hoang dã đã được tuyển chọn và thuần hoá để sản xuất tannase Những vi khuẩn này được tách từ phân của gấu túi, dê, bò và con người

Thực vật : Nguồn tannase đã được báo cáo có mặt trong nhiều loài thực vật chứa

tannin phong phú, chẳng hạn như Terminalia chebula (myrobolan) trái cây,

Caesalpinia (div - Divi) quả, lá Angeissus latifolia (dhawa) và vỏ cây Cassia fistula (Konnam) và Acacia arabica (Babul) Tannase thực vật được tìm thấy là

kém ổn định hơn so với các nguồn vi khuẩn và tách chiết khó khăn hơn (Lekha và Losane, 1997)[23]

1.3.4 Điều kiện nuôi cấy

Các loại nấm có nhiều sợi như Aspergillus và Penicillium được sử dụng phần

lớn để sản xuất tannase Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng nấm sợi Các báo cáo

về nguồn thu tannase từ vi khuẩn và nấm men có rất ít

1.3.4.1 Phương pháp nuôi cấy

Vi sinh vật sinh tannase được nuôi trên bề mặt dịch thể (SmF) và bề mặt lên men rắn (SSF) để nấm sợi phát triển Vi khuẩn và nấm men được nuôi cấy riêng trong môi trường SmF Trong sự giới hạn vị trí và đặc tính của enzim, năng suất thu được có lẽ không khả quan được như các phương pháp khác Những nghiên

cứu so sánh của Lekha và Losane (1994)[22] và Aguilar et al., (2001b)[6] chỉ ra rằng hiệu suất sinh Aspergillus sp., của môi trường SSF cao hơn SmF Lekha và

Losane (1994)[22] cũng chỉ ra rằng lượng enzim thu được từ vi sinh vật nuôi trong môi trường SSF cao hơn hẳn so với môi trường SmF Các enzim thu được từ môi trường SSF cho nhiệt độ và pH ổn định hơn

1.3.4.2 Cơ chất và môi trường nuôi cấy

Tất cả các kĩ thuật nhân tạo hoặc bán nhân tạo đều được sử dụng để sản xuất

chế phẩm tannase Bradoo et al., (1997)[11] báo cáo về việc sử dụng môi trường

Czapeck với một lượng rất nhỏ tannic axit lắc trong bình tam giác để nuôi

Aspergillus japonicus Các nồng độ axit tannic khác nhau ( 0,5 – 10%) trong từng

môi trường là nguồn cacbon duy nhất 2% (w/v) axit tannic cho hiệu suất thu enzim cao nhất Họ cũng có thể bổ sung thêm vào môi trường một lượng nhỏ đường

(0,2% w/v) trong các loại đường như: arabinose, fructose, galactose, xylose, lactose, sucrose, carboxy methyl celluose, bột mì vào môi trường nuôi cấy thu enzim Nhưng họ cũng lưu ý không dùng đường glucose quá nhiều vì sẽ làm giảm hiệu suất thu enzyme Nồng độ glucose tối thích là 1% Seth và Chand (2000)[33]

đã sử sụng môi trường nuôi cấy có chứa muối vô cơ và axit tannic để nuôi

Aspergillus awamori và kết quả đạt được rất khả quan Nồng độ axit tannic dao

động từ 2,5 – 4,5 % (w/v) , và 3,5 % là nồng độ tối ưu Saxena (2004)[32] đã sử dụng bột chebulic myrobalan ( 32%) thay cho axit tannic trong thí nghiệm của họ

để nuôi các chủng Penicillium Họ cũng lạc quan cho rằng chế phẩm tannase sử

dụng loại tannin trong tự nhiên này phù hợp với việc nuôi cấy lắc trong bình tam giác 4- 12% ( w/v) lượng bột này dược sử dụng để bổ sung vào môi trường và 11,6% (w/v) là nồng độ thích hợp nhất Lekha và Losane (1994)[22] đã sử dụng

đường từ bã mía trong môi trường lên men rắn để nuôi Aspergillus niger PKL104

Đường trong bã mía được cung cấp vào môi trường dinh dưỡng có chứa 6% (w/v)

axit tannic Aguilare et al., (2001b)[6], đã báo cáo về việc sử dụng bọt Polyurethane cấp vào môi trường lên men rắn của Aspergillus niger Môi trường

trao đổi chất được sử dụng này có chứa nồng độ axit tannic lên đến 20% (w/v) Nồng độ tối ưu của axit tannic trong môi trường này là 10% (w/v) Hơn nữa, họ còn sử dụng đường glucose với nồng độ 0,65 – 20% (w/v) để cung cấp cho môi trường dinh dưỡng có chứa 2,5% (w/v) axit tannic Họ cho rằng các chất dị hoá được tích tụ mạnh mẽ hơn trong quá trình tổng hợp tannase là nhờ đường glucose được cung cấp vào môi trường

Ramirez-Coronel et al., (2003)[28] đã báo cáo về việc sử dụng bọt Polyurethane để cung cấp vào môi trường nuôi Aspergillus niger Họ đã sử dụng môi trường dinh dưỡng có chứa muối khoáng và 0.1% (w/v) axit tannic Sabu et al., (2005)[29] sử dụng lõi cây cọ và bột nghiền từ hạt me làm cơ chất bổ sung vào môi trường lên men rắn để thúc đẩy quá trình tạo tannase của Aspergillus niger

ATCC 16620 Môi trường này được cung cấp thêm NH4NO3, MgSO4, và NaCl Kĩ thuật bổ sung thêm bột nghiền lõi cây cọ được thêm các cơ chất khác như 1.0% (w/v) glucose, bột mì, sucrose, maltose, glycerol, axit tannic, methyl galate và axit gallic Battestin và Macedo (2007)[9] đã sử dụng vỏ café và cám gạo thêm vào môi

trường lên men rắn để nuôi Paecilomyces variotii Môi trường này được cung cấp

thêm muối vô cơ Nhiệt độ, tỉ lệ % cám gạo: vỏ cafê, hàm lượng axit tannic và muối được nghiên cứu với những mức dộ khác nhau để tìm ra điều kiện tối ưu nhất cho phương pháp này Nồng độ axit tannic được lựa chọn là 3 – 15% (w/v) Kết quả khả quan nhất là ở nồng độ axit tannic 155 (w/v),còn lại tỉ lệ của vỏ café : cám

gạo là 50:50 Banerjee et al., (2007)[8] đã sử dụng tannin thô từ một loại quế của

Thái Lan vào 5l môi trường lên men Họ đã có báo cáo thu được loại enzim tốt từ môi trường nuôi cấy có chứa 2.0 % ( w/v) tannin

Nguồn nitơ thường được thêm vào trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật sinh tannase là Natri nitrat, ammonium chloride, ammonium di-hydrogen phosphate, ammonium oxalate, ammonium sulphate, monosodium glutamate và axit glutamic

(Yamada et al., 1968 ; Lekha và Losane 1997) Banerjee et al., (2007)[8] đã có báo

cáo về việc sử dụng ammonium phosphate như nguồn nito duy nhất để sản xuất tannase Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng thêm một số lượng nhỏ các chất như : Na2HPO4, KCl, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, FeSO4, AlCl3 ( Van de Lagemaat và Pyle, 2006)[36]

Deschamps et al (1983)[12] sử dụng môi trường khoáng chất với 1% (w/v) chiết xuất hạt dẻ là nguồn cacbon chính để sản xuất tannase từ Bacillus polymyxa, Corynebacterium sp và Klebisella pneumoniae trong phòng thí nghiệm Kumar et

al (1999)[21] sử dụng môi trường khoáng chứa axit tannic với nồng độ khá cao khoảng 5% (w/v) để sản xuất tannase từ Citrobacterium freundii Mondal và Patri

(2000) đã sử dụng môi trường dinh dưỡng có nguồn nito là ammonium nitrate và

nguồn cacbon là axit tannic(1% w/v) lắc trong bình tam giác để nuôi Bacillus licheniformis KBR 6 Mondal et al (2001)[24] đã sử dụng môi trường dinh dưỡng

có axit tannic(1% w/v) và Amonium chloride lắc trong bình tam giác để nuôi

Bacillus cereus KBR9 Ayed và Hamdi (2002)[7] đã sử dụng môi trường trao đổi chất dạng nhũ tương lắc trong bình tam giác để nuôi Lactobacillus platarum Họ đã

sử dụng axit tannic với nguồn nito là ammonium sulfate và casamino axit Họ sử dụng khoảng 0.1 – 2% axit tannic(w/v) và hoạt tính cao nhất trong môi trường chứa 1,5%(w/v) tannic axit Họ cũng bổ sung thêm đường glucose và thầy rằng

hiệu suất thu enzim rất khả quan Das Mohapatra et al (2006) sử dụng 9 loại cây khác nhau chiết xuất ra nguồn tannin nuôi Bacillus lichiniformis KBR6 để sản xuất

tannase Nguồn chiết xuất này không cần bổ sung thêm nguồn dinh dưỡng nào khác

và được nuôi lắc trong bình tam giác Họ nhận được hoạt lực cao nhất từ nguồn

enzim thô của Anacardium occidentale Sabu et al (2006)[30] đã nuôi chủng Lactobacillus sp , ASR – S1 từ bột xay hạt me, cám mỳ, lõi cây cọ và vỏ cafê Họ

đã sử dụng nguồn nitơ là ammonium nitrat cùng với muối khoáng để làm tăng độ

ẩm cho môi trường rắn Hiệu suất tốt với môi trường vỏ café Belur et al (2010)

[10] đã có nghiên cứu cho rằng môi trường nhũ tương với nguồn nito hữu cơ cho hiệu suất cao hơn nguồn nito vô cơ khi họ tiến hành tách chủng Serratia ficaria

DTC Selwal et al (2010) đã có nghiên cứu cho thấy chủng Pseudomonas aeruginosa III B 8914 có hiệu suất sinh tannase cao hơn các chủng Phylanthus emblica (amla), Acacia nilotica (keekar), Eugenia cuspidate ( Jomoa) và Syzygium cumini khi nuôi cấy lắc trong bình tam giác Khi nguồn cacbon được dùng với nồng

độ 2% (w/v) , nguồn nito là Ammonium nitrate và muối vô cơ và hiệu suất của

chủng Phylanthus emblica (amla) là cao nhất Đã có những nghiên cứu về hiệu quả

của các nguồn cacbon khác được thêm vào môi trường ( 0,2 % w/v) như : Dextrose, manitol, glucose, xylose, starch, lactose, glyxerol, maltose, galactose, sucrose và lượng enzim thu được sẽ ít hơn nếu không cung cấp các nguồn cacbon này vào môi

trường Ngoài ra họ cũng thử sử dụng một số nguồn nitơ khác để bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy như natri nitrate, ammonium chloride, urea, ammonium nitrate

và ammonium sulphate Và kết quả cho thấy chất lượng enzim thu được tốt hơn khi môi trường được cung cấp ammonium nitrate Nguồn cacbon phụ được thêm vào với nồng độ thấp (0,06 – 7%) như glucose, fructose, sucrose Cách này để thúc đẩy

sự sinh trưởng của vi sinh vật vì nếu chỉ có axit tannic thì vi sinh vật sẽ khó hấp thu chất dinh dưỡng hơn Hầu hết các nghiên cứu đều chỉ ra rằng nồng độ tối ưu của axit tannic để vi sinh vật sinh tổng hợp ra enzim phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật

và từng điều kiện nuôi cấy khác nhau

1.3.4.3 Nhiệt độ lên men

Nhiệt độ nuôi thường từ 25 – 40oC với hầu hết các kĩ thuật nuôi cấy và khoảng

30oC với nấm sợi (Yamada et al , 1968 ; Rajkumar và Nandy, 1983 ; Lekha và Losane, 1994) Kumar et al., (1999) cho rằng nhiệt độ tối đa để sinh tổng hợp

tannase là 30 oC với Citrobacter freundii trong khi Das Mohapatra et al., (2006) cho rằng nhiệt đọ tối đa để sinh tổng hợp tannase của Bacillus lichiniforms KBR6

là 35 oC Mondal et al , (2001) đã nghiên cứu thấy nhiệt độ tối ưu của Bacillus cereus KBR9 là 40oC trong khi Lactobacillus sp ASR-S1 sinh tổng hợp tannase tốt

nhất ở 30oC (Sabu et al , 2006) Selwel et al., (2010) nghiên cứu thấy nhiệt độ tối

ưu để sinh tổng hợp tannase của Pseudomonas aeruginosa III B 8914 là 37 oC

Lactobacillus platarum là 6,0 (Ayed và Hamdi, 2002 ) ; Pseudomonas aeroginosa

là 7,0 (Sewal et al., 2010) ; Serratia ficaria DTC là 6,0

1.3.4.5 Thời gian lên men

Đối với các loại nấm sợi, hiệu suất sinh tannase lớn nhất từ 12- 24h trong

SmF (Bradoo et al , 1997 ; Aissam et al., 2005 ; Aguilar et al , 2007) và 72 – 86 h

trong SSF (Lekha và Losane, 1994 ; Kar và Banerjee, 2000 ; Saxena và Saxene,

2004 ; Sabu et al , 2005) Banerjee et al., (2007) nghiên cứu thấy khả năng sinh tổng hợp tannase trong 36h với 5l môi trường lên men của Aspergillus aculeatus

DBF9 là rất cao

Đối với vi khuẩn, hiệu suất lên men cao nhất là trong 24h Hiệu suất sinh

tannase lớn nhất trong pha phát triển là 24h của Pseudomonas aeruginosa III B

8914 (Sewal et al., 2010) ; Lactobacillus plantarum (Ayed và Hamdi, 2002) ; Bacillus cereus KBR9 (Mondal et al., 2001) Hầu hết các thử nghiệm đều cho thầy khả năng sinh tổng hợp tannase lớn nhất là trong 21h đối với Bacillus lichiniforms KBR6 (Mondal et al., 2000 ; Mondal và Pati, 2000); 6h đối với Citrobacter freundii (Kumar et al., 2000)… Tất cả các kết quả thu được đều chỉ ra rằng những

điều kiện tối ưu là khác nhau đối với từng loại vi sinh vật và điều kiện lên men

1.3.5 Ứng dụng của tannase

Hoạt tính của tannase được phân loại theo khả năng thuỷ phân các mối liên kết este Khả năng thuỷ phân axit tannic của tannase là sự giải phóng ra glucose, axit gallic và các este khác của glucose Tannin có độc tính và là hợp chất kìm hãm sự trao đổi các protein phức tạp trong vi sinh vật Tannin bảo vệ các phần dễ bị tổn thương của cây khỏi sự tấn công từ vi sinh vật bằng cách tiết enzim làm dày màng

tế bào Có rất nhiều loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn có khả năng kháng tannin được phát triển để sản xuất tannase Các phương pháp để ức chế bao gồm làm biến đổi tannin,làm giảm hoạt tính, tách tannin – cơ chất, ức chế hoạt động của tannin

bằng cách biến đổi cấu trúc, sửa chữa và cô lập ion Sự biến đổi của tannin là nhờ tannase Nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tannase Tanase thuỷ phân tannin

để ngưng tụ sản phẩm, một trong số chúng được sử dụng như một nguồn năng lượng Axit gallic là một trong những sản phẩm chính của quá trình biến đổi axit tannic Axit gallic được coi như một cơ chất có tác dụng chống oxi hoá để tạo aliphatic axit, tham gia vào quá trình tạo citric axit

Ứng dụng chính của enzim này là sản xuất axit gallic Axit gallic được sử dụng

để sản xuất thuốc chống sốt rét Trimethoprim Axit gallic là cơ chất cho quá trình hoá học và trao đổi enzim của propyl gallate Sử dụng như một chất chống oxi hoá cho dầu và mỡ cũng như trong công nghiệp đồ uống

Tannase cũng được sử dụng để lọc cặn trong rượu, nước quả và nước giải khát

có hương vị cafê Trong sản xuất rượu, tannin gây oxi hoá thành quinon khi kết hợp với không khí dẫn đến vẩn đục làm giảm giá trị sản phẩm Sử dụng tannase là giải pháp cho vấn đề này Trong sản xuất bia, tannin có trong thành phần của hoa houblon Hàm lượng protein trong bia càng cao thì càng dễ có nhiều vẩn đục Đây

là vấn đề khó khăn khi protein trong bia tiếp xúc với tannin trong hoa houblon Vấn

đề này cùng đã được giải quyết khi sử dụng tannase

Tannase cũng được sử dụng để sản xuất trà nhúng có thể hoà tan trong nước lạnh Hơn nữa tannase của trà xanh có nhiều chất chống oxi hoá hơn hơn các loại trà đen và trà thông thường Tannase phân giải trà xanh có tác dụng ức chế N- nitrosamine, một loại tác nhân gây ung thư, quái thai được tìm thấy trong một số chất bảo quản thịt Một và nghiên cứ đã chỉ ra được hoạt độ và tính ổn định của tannase phân giải trà xanh

Ứng dụng của tannase trong thực phẩm và công nghệ đồ uống đã góp phần giải quyết các vần đề khó khăn do tannin gây ra Sự hoạt động của enzim này trong nước quả làm giảm bớt vẩn đục, hư hỏng, tăng giá trị sản phẩm Các loại nước qủa

mới hiện nay được đón nhận hơn bởi lợi ích cho sức khoẻ từ chúng với thành phần chống oxi hoá Hàm lượng tannin cao trong hoa quả gây ra đục và hư hỏng,làm giảm màu sắc, hương vị trong quá trình tích trữ trái cây Để tránh những hư hại này thí quá trình enzim hoá được ưu tiên Những kết quả nghiên cứu của Rout và Banerjee (2006) từ quả lựu đã chứng minh rằng tannase có khả năng phân giải 25% tannin, trong khi đó sự kết hợp giữa tannase và gellatin (1:1) thì 49% tannase được phân giải.

Các cấu tử tannin ở dạng khó hoà tan khi kết hợp với protein Sự trao đổi qua lại này có vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến Tannin trong các nguyên liệu có nguồn gốc cây cỏ khó tiêu hoá và protein nội bào phải tiết ra enzim để chuyển hoá Tannin có có các ion khá phức tạp làm ảnh hưởng đến khả năng tiêu hoá Sử dụng tanase trong thành phần thức ăn của động vật ăn cỏ giúp cải thiện sự tiêu hoá Enzym này được sủ dụng trong công nghiệp thuộc da và bán xử lí tannin trong cỏ

Tuy nhiên về mặt thương mại enzim này có giá thành tương đối cao Tanase được cung cấp bởi một số nhà sản xuất như Biocon ( Ấn Độ), Kikkoman (Nhật bản), ASA Specilaenzyme GmbH (Đức)

1.4 Tình hình sử dụng phế thải chè làm phân bón hữu cơ

Sau hơn thời gian trở thành thành viên của tổ chức WTO, cũng như các ngành kinh tế khác, ngành chè nước ta có thêm nhiều cơ hội và thách thức Và thách thức lớn nhất là chất lượng sản phẩm Chất lượng là cánh cửa để chè Việt Nam bước ra thị trường thế giới Để chè thành phẩm có chất lượng tốt thì 30% phụ thuộc vào chế biến còn 70% là do cung cấp nguyên liệu Vì vậy vấn đề lựa chọn nguyên liệu

và hướng dẫn bà con nông dân trong vùng chè kỹ thuật chăm sóc và hái chè để có chất lượng cao là hết sức quan trọng Từ đó chúng ta mới có thể xây dựng vùng chè sạch Đặc biệt là quy trình đốn chè, sau mỗi vụ thu hoạch, việc tiến hành đốn rất

quan trọng bởi nó ảnh hưởng trực tiếp tới sản lượng ra búp của lứa sau đồng thời tiến hành đốn giúp cho cây chè có tán đồng đều, tạo thuận lợi tới việc thu hái chè bằng máy đạt năng xuất tối đa Qua đó giúp cho người trồng chè thu hoạch chè với năng suất cao, chất lượng chè đồng đều Có rất nhiều hình thức đốn chè khác nhau : Đốn tạo hình, đốn phớt, đốn lửng, đốn đau, đốn trẻ lại Đốn đau trước, đốn phớt sau Đốn tạo hình chè con trước, đốn chè trưởng thành sau Trên cơ sở như vậy chúng ta thấy sản lượng chè đốn hàng năm của các vùng trồng chè là rất lớn Qua tìm hiểu thì hiện nay hầu hết bà con nông dân đều bỏ qua nguồn nguyên liệu này

Họ chỉ biết cách xử lý là đối với các cành chè già thì cho làm củi hoặc dấp xuống gốc cây làm phân bón Nhưng như vậy khả năng tạo nguồn sâu bệnh sẽ lớn, thời gian phân hủy sẽ rất lâu ít nhất để phân hủy được hoàn toàn cũng phải mất 6 tháng cho đến một năm

Nhằm tăng tốc độ phân hủy các loại phụ phẩm chè dưới gốc cây, việc ứng dụng các chế phẩm vi sinh cũng là một trong những phương cách hữu hiệu nhằm rút ngắn thời gian phân hủy Ở Việt Nam, nhiều đề tài nghiên cứu ủ phân hữu cơ vi sinh được nghiên cứu và triển khai tại các vùng sản xuất nông nghiệp hoặc các khu xử lý rác thải của thành phố Các đề tài có thể áp dụng các chế phẩm EM (chứa các vi sinh vật ngoại lai) sẵn có trên thị trường hoặc các chế phẩm sản xuất trong nước chứa các vi sinh vật được tìm thấy trong các hệ sinh thái ở Việt Nam Tuy nhiên, đa số các nghiên cứu này tập trung vào phương pháp ủ đống với nhiệt lượng sinh ra trong các đống ủ cao nên công tác tuyển chọn bộ giống vi sinh vật bổ sung vào đống ủ đa số là các vi sinh vật ưa nhiệt

Tuy nhiên, phương pháp chúng tôi đề xuất trong nghiên cứu này là phương pháp ủ tại gốc chè đốn Vì vậy, quá trình phân hủy sẽ không sinh ra nhiệt lượng lớn do đống ủ nhỏ và thấp, nhiệt lượng dễ phát tán ra bên ngoài Vì vậy cần phải tuyển chọn bộ vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phân hủy tốt các loại phế thải chè tại

nhiệt độ thấp như nghiệt độ của môi trường xung quanh (30oC) Hơn nữa, tùy vào các điều kiện sinh thái khác nhau mà vi sinh vật có khả năng sinh trưởng trên nguồn cơ chất khác nhau Chính vì thế, nguồn cơ chất trong các phần phụ phẩm của chè có thể phù hợp cho sự phát triển của một nhóm vi sinh vật nào đó Vì vậy, phân lập và tuyển chọn vi sinh vật bản địa có khả năng sinh trưởng tốt trên phụ phẩm chè và có khả năng sinh các enzim ngoại bào mạnh như tannase, cellulose, xylanase, amylase, protease vv là việc làm có ý nghĩa khoa học cao Chọn lọc các vi sinh vật đó để tạo chế phẩm vi sinh bổ sung vào phụ phẩm chè thu gom dưới gốc cây không chỉ góp phần rút ngắn thời gian hoàn trả chất dinh dưỡng lại cho đất mà còn là một trong những phương cách tăng cường và làm giàu hệ vi sinh vật hữu ích của bản địa, là nhân tố góp phần vào quá trình phát triển bền vững ngành trồng chè

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguồn vi sinh vật và thiết bị

2.1.1 Nguồn vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật dùng trong nghiên cứu được phân lập từ các mẫu đất trồng chè ở Hoà Bình, Phú Thọ và các chủng đang được lưu giữ tại Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật – ĐHQGHN (VTCC)

2.1.2 Thiết bị, hoá chất và môi trường

Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã sử dụng thiết bị và hoá chất có tại Viện

Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội

a, Thiết bị và dụng cụ

- Cân điện tử AL - 300 (Osi, Mỹ)

- Nồi hấp khử trùng Hiclave HV - 85 (Hirayama, Nhật)

- Tủ cấy (Nuaire, Mỹ)

- Kính hiển vi quang học Axio (Zeiss, Đức)

- Máy li tâm 5417R (Eppendorf, Đức)

- Máy đo quang phổ (Beckman, Mỹ)

- Nhóm hoá chất thử hoạt tính enzyme: tinh bột tan, casein, CMC và pectin, tannic axit.

- Nhóm hoá chất dùng cho định lượng: Methyl gallate (Methyl 3,4,5 – trihydroxybenzoate) 0,01M ; Citrate buffer 0,05M ; Methanolic rodanine 0,667% ( w/v)

c, Môi trường

Các môi trường dùng trong thí nghiệm bao gồm: Môi trường nuôi cấy, Môi trường phân lập, môi trường giữ giống, môi trường lắc khởi động, môi trường dịch thể, môi trường dùng trong xác định hoạt tính enzyme

* Môi trường nuôi cấy nấm sợi

- Môi trường Czapeck (g/l): Sucrose – 30; NaNO3 – 3; K2HPO4 – 1; 0,5 ; FeSO4.7H2O – 0.01; KCl – 0.5; agar : 17 pH 6

MgSO4.7H2O Môi trường PDA (g/l) : khoai tâyMgSO4.7H2O 200 ; glucoseMgSO4.7H2O 20 ; agarMgSO4.7H2O 17 ; pH6

* Môi trường nuôi vi khuẩn

Môi trường NA (g/l) : pepton-5 ; Cao thịt-3 ; NaCl-3 ; agar-16 ; pH7

* Môi trường nuôi xạ khuẩn

- Môi trường YG (g/l) : Glucose-10 ; Cao men-10 ; agar-17 ; pH7

- Môi trường ISP4 (g/l): Tinh bột tan-10 ; K2HPO4-1 ; MgSO4.7H2O-1 ; NaCl-1; (NH4)2SO4-2 ; CaCO3-2, pH7

* Môi trường nuôi nấm men

Môi trường YM (g/l) : Glucose-10 ; pepton-5 ; cao men-3 ; cao malt-3 ; agar-17 ; Cloraphenicol-0.4 ; pH6.2

* Môi trường dịch thể NA, YM, ISP4, Czapeck có bổ sung axit tannic 1% và 1% chè khô; tannic axit được bổ sung vào môi trường sau khi khử trùng môi trường để tránh bị biến tính do nhiệt độ.

* Môi trường dùng để xác định hoạt tính enzim:

Môi trường cơ chất 1% (CMC, tinh bột, casein, pectin, tannic axit) trong citrat buffer 0.2M ; pH6

* Môi trường phân lập (g/l): Chè – 10; Glucose – 10; agar – 17, pH 6

* Môi trường giữ giống ở lạnh sâu (g/l): glyxerol- 12%

MgSO4.7H2O K6: KH2PO4MgSO4.7H2O 1 ; NH4NO3MgSO4.7H2O 2 ; MgSO4.7H2OMgSO4.7H2O 0.2 ; CaCl2.2H2OMgSO4.7H2O 0.02 ; MnSO4MgSO4.7H2O 0.004

; Na2MoO4 2H2O-0.0002 ; FeSO4.7H2O-0.00025 ; pH5.5 (Paranthamen et al., 2009)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xử lí mẫu đất

Cân 10 gram đất vào bình tam giác 250 ml có chứa 90ml nước muối sinh lí (NaCl 0,9% ) được nồng độ 10-1 Các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng để đảm bảo không có sự nhiễm chéo giữa các mẫu đất Sau đó, bình tam giác được lắc trên máy lắc ở tốc độ 220 vòng/ phút để đất hoà tan vào nước và giải phóng tế bào bám trên đất vào nước muối sinh lí Đặt yên tĩnh bình tam giác trong 10 phút để đất lắng xuống dưới Nhẹ nhàng hút 1ml phần dịch nổi vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lí được nồng độ 10-2, dùng máy voltex trộn đều hỗn hợp Sau đó thực hiện tiếp thao tác này ta được nồng độ 10-3

2.2.2 Phương pháp phân lập và giữ giống

Hút 100 μl các dịch pha loãng trên ra đĩa Petri chứa môi trường phân lập Nuôi cấy vi sinh vật được tiến hành ở 30oC trong 72h Lựa chọn các khuẩn lạc có đặc điểm khác biệt về màu sắc, kích thước, cấu trúc bề mặt và mép viền ngoài sang đĩa Petri khác nuôi cấy ở 30oC Đồng thời cũng cấy các chủng của VTCC vào môi trường phân lập Sau 48h đối với nấm men và vi khuẩn, 72h đối với nấm sợi và xạ khuẩn, khuẩn lạc thuần mọc trên đĩa thạch được lưu giữ và bảo quản ở - 20oC trong môi trường dịch thể chứa 12% glycerol

2.2.3 Phương pháp đếm số lượng bào tử

Lấy 10(g) mẫu đã nuôi vi sinh vật vào bình tam giác 250ml có chứa Tween 80

(0.01%) được nồng độ 10-1 Tiến hành pha loãng như phần 2.2.1 đến nồng độ 10-8 Hút 100 μl các dịch pha loãng trên ra đĩa Petri chứa môi trường PDA Nuôi cấy vi sinh vật được tiến hành ở 30oC trong 72 giờ Số lượng khuẩn lạc mọc trên đĩa Petri được đếm tại nồng độ pha loãng thích hợp

2.2.3 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hoá

a, Phương pháp quan sát khuẩn lạc nấm sợi