CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH CHẾ ENZIM

Giai đoạn 1: dựa trên các tính chất lý – hoá học tác động lên các chất phân tử lượng lớn.

CHƯƠNG 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH

CHẾ ENZIM

• Giai đoạn 1: dựa trên các tính chất lý – hoá học tác động lên các chất phân tử lượng lớn.

• Giai đoạn 2:

 Khai thác các tính chất đặc trưng khác nhau của protein cầu.

 Phân tách dựa trên các thông số riêng như trọng lượng phân tử, điện tích của protein.

• Giai đoạn 3: dựa trên những tương tác đặc hiệu và có tính rhuận nghịch giữa enzim và:

ξ 2 NGUYÊN TẮC CHỌN PHƯƠNG PHÁP TINH

CHẾ ENZIM

 Xác định enzim mong muốn là gì và chọn nguyên liệu giàu enzim.

 Xác định các đặc trưng của nguyên liệu:

 Bản chất của NL: lỏng, rắn

 Dạng chung của NL: động vật, thực vật, VSV.

 Cấu trúc sinh học của NL: tế bào VSV, tế bào thực vật.

 Xác định vùng chứa enzim: ty thể, tế bào chất, màng tế bào.

 Xác định các tính chất cấu trúc và lý hoá của enzim: trọng lượng PT, cấu trúc PT, hằng số động học, tính ổn định PT, pH tối ưu, điểm đẳng điện, chất hoạt hoá, chất kìm hãm…

 Phải có phương pháp giải phóng protein dưới dạng hoà tan mà không làm mất hoạt tính của nó.

Xử lý phải thực hiện ở T thấp (+4OC); môi trường có chất đệm; tác

nhân bảo về (nếu cần như EDTA, 2-mecaptoetanol…); thời gian xử lý ngắn.

ξ 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA ĐỂ PHÂN

ĐOẠN ENZIM

1 Kết tủa phân đoạn bằng muối trung tính

• Nguyên tắc:

 Protein hoà tan trong các dung dịch muối có pH xa với điểm đẳng điện

 Độ hoà tan của P chỉ tăng cùng với lực ion MT trong một khoảng nhất định của [muối], Nồng độ muối cao hơn protein enzim có thể kết tủa

 Mối enzim có một khoảng [muối] mà enzim kết tủa hoàn toàn, gọi là nồng

độ muối tích Dựa vào tính tan khác nhau mà phân đoạn enzim

• Cách tiến hành

 Bổ sung vào dịch chứa enzim một thể tích muối bão hoà hoặc một lượng muối trung tính dạng rắn để đạt được độ phần trăm bão hoà nào đó của muối này

 Nếu kết tủa là những phần tử không phải enzim mong muốn thì tách hai pha lỏng rắn và loại bỏ kết tủa thu hồi dịch trong

 Nếu enzim cần tinh chế kết tủa thì sau khi phân tách hai pha lỏng - rắn hoà tan kết tủa trong một lượng nhỏ dung dịch đệm

• Loại muối và cách tính lượng muối sử dụng

 Muối sulfat amôn và muối sulfat natri: giá rẻ, khả năng kết tủa cao, độ hoà tan lớn, protein ít bị biến tính, thao tác đơn giản

 Các công thức tính lượng muối cần thiết đưa vào dung dịch như sau:

100

S

S

S Y

.

1 , 0

2

1 2

g

V S

G S

S A

Trong đó:G số gam (NH4)2SO4 trong 1000ml dung dịch bão hoà

(G = 515g ở 0oC; 530,7g ở 15oC; 536g ở 20oC

Vg thể tích riêng biểu kiến của dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà (Vg/1000 = 0,271 ở 0oC; Vg/1000 = 0,288 ở 15oC; Vg/1000 = 0,29 ở 20oC.Y: dung dịch muối bão hoà (ml) bổ sung vào 100ml dịch enzim

A: trọng lượng muối tinh thể (g) bổ sung vào 100ml dịch enzim

S1: độ bão hoà ban đầu của dung dịch

S2: độ bão hoà của dung dịch cuối nhận được

• Kết tinh enzim

 Kết tủa enzim thu hồi được phân tách nhờ dung dịch muối sulfat amôn có nồng độ giảm dần ở 0oC Các protein nhiễm tạp hoà tan ở nồng độ muối

cao hơn enzim sẽ được loại ra

Ví dụ: một enzim kết tủa trong khoảng độ bão hoà 45 – 60% sẽ được tách chiết với các dung dịch muối bão hoà 65; 58; 52%.

 Nâng nhiệt độ của các phần phân đoạn nhận được tới nhiệt độ môi trường

và protein enzim kết tinh Qúa trình kết tinh có thể thực hiện chỉ trong một vài phút hoặc vài giờ

 Các đoạn protein enzim thu được sau đó phải được loại bỏ muối bằng

phương pháp thẩm tích hoặc phương pháp lọc gel

• Ưu nhược điểm của phương pháp

 Kỹ thuật này cho phép nhận được một phần phân đoạn được làm giàu enzim

từ thể tích lớn: loại bỏ các protein, enzim liên kết hạy các tạp chất khác

không hoà tan trước và sau phần phân đoạn có chứa enzim cần tách chiết

 Thao tác đơn giản, dễ áp dụng nên được dùng phổ biến, nhưng khi làm việc với thể tích lớn có nhiều khó khăn do đòi hỏi thiết bị phải chịu độ ăn mòn của muối cao (inox)

 Khoảng nồng độ muối tích của các protein thường hay trùng nhau nên không bao giờ có thể thu được các phần phân đoạn enzim tinh khiết hoàn toàn

 Thường sử dụng phương pháp này vào giai đoạn đầu của quá trình tinh chế enzim

2 Kết tủa đẳngđiện

• Nguyên tắc:

– Enzim có độ hoà tan tối thiểu xung quanh điểm đẳng điện (pI),

vì phân tử protein enzim có tổng điện tích bằng không.

– Không có lực đẩy tĩnh điện nên các phân tử protein enzim sẽ kết hợp với nhau tạo nên kết tủa.

– Mỗi protein có một pI khác nhau phụ thuộc thành phần axit amin trong chuỗi mạch bên ion hoá, do đó kết tủa được enzim mong muốn hoặc các protein tạp khác.

• Cách tiến hành

– Điều chỉnh pH của dịch hỗn hợp chứa enzim tới điểm đẳng điện của enzim cần phân tách hoặc của các protein tạp.

– Lọc hay ly tâm để thu hoặc loại bỏ các kết tủa.

• Ưu nhược điểm của phương pháp

– Kỹ thuật đơn giản, dễ áp dụng.

– Quá trình điều chỉnh pH môi trường có thể dẫn tới biến tính

protein enzim ở một vài pH.

– Dựa vào sự khác nhau về độ ổn định của

protein enzim ở nhiệt độ cao để phân huỷ một cách chọn lọc một số enzim nhiễm tạp.

• Ưu nhược điểm của phương pháp

– Kỹ thuật đòi hỏi giá thành cao.

– Cần phải kiểm soát chặt chẽ để tránh tổn thất enzim mong muốn.

4 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ

• Nguyên tắc:

– Dung môi hữu cơ trung tính hoà tan trong nước sẽ làm thay đổi hằng số

điện môi của dung dịch, làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein.– Khi bổ sung lượng dung môi tăng dần thì phức hợp giữa các phân tử protein

enzim tích điện trái dấu lớn dần cho tới khi kết tủa

– Tuỳ tính chất từng loại protein enzim, dung môi hữu cơ và điều kiện kết tủa

mà mỗi enzim được kết tủa được kết tủa ở nồng độ dung môi hữu cơ khác nhau

Protease kết tủa với etanol 76 – 78% (v/v)

α-amylase kết tủa với etanol 70%; hoặc izopropanol 55%; hoặc axeton 60%.Glucoamylase kết tủa với etanol 45%

• Ưu nhược điểm của phương pháp

– Một số dung môi sau khi sử dụng có thể chưng cất và thu hồi lại được.

– Xử lý phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (trên điểm lạnh đông) vì dung môi

là các chất dễ cháy (-5oC)

– Phương pháp chr sử dụng đối với enzim ít bị biến tính bởi dung môi hữu cơ.– Dùng với qui mô nhỏ do chi phí cao

5 Kết tủa bằng các polyme có khối lượng phân tử lớn

– Các polyme như dextran, polyetylen glycol thường rất háo nước sẽ làm

mất lớp vỏ solvat hoá của các phân tử protein enzim, kéo theo sự thay đổi hằng số điện môi của môi trường xung quanh, thay đổi các tương tác

không gian của các nhóm háo nước trong các phân tử protein enzim

– Polyetylen glycol ở nồng độ 5% (theo trọng lượng) trong nước có thể làm

kết tủa phần lớn các protein nồng độ 6 – 20%

– Hiệu suất kết tủa phụ thuộc vào nhiệt độ, lực ion, pH, nồng độ protein và

khối lượng phân tử của các enzim

6 Kết tủa bằng ion kim loại và các tác nhân đặc hiệu

– Liên kết ion kim loại – protein làm giảm độ hoà tan của protein.

– Kỹ thuật này không áp dụng để tạo kết tủa enzim mong muốn vì phức tạo

nên thường không phải là thuận nghịch (dẫn suất sulhydryl) và biến tính protein enzim

– Kỹ thuật này được áp dụng để tách axit nucleic ra khỏi hỗn hợp sau khi

phá vỡ tế bào VSV Ion kim loại (Mn+2) tạo muối kết tủa với axit nucleic và được loại ra ngoài Axit nucleic chiếm khoảng 7% ở E coli, có độ nhớt cao ảnh hưởng lớn tới quá trình tinh chế enzim

– Axit nucliec có nhóm axit mạnh liên kết với nhóm amin cuỉa protein enzim

trong môi trường axit làm kết tủa chúng Bổ sung protein kiềm tính như protamin sẽ thay thế được vị trí của protein trong phức hợp và enzim sẽ tồn tại trong dung dịch Ly tâm để laọi bỏ phức này

– Các chất phản ứng thường sử dụng là muối mangan, sulfat streptomycin,

sulfat protamin, bromcetytrimetylamôn, polyetylenimin (polyme cationic) Kinh tế nhất là sử dụng chế phẩm enzim nuclease (ribo và desoxyribo nuclease)

ξ 3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÁCH

LỎNG - LỎNG VÀ LỎNG - RẮN

1 Phân tách lỏng - lỏng

 Phân tách trong dung dịch có hai polyme không trộn lẫn nhau

• Hai polyme tự phân thành hai pha phân biệt nhau, mỗi pha hoà tan được một trong các protein

• Sự phân tách phụ thuộc vào khối lượng phân tử và nồng độ của các polyme; khối lượng phân tử của protein; nhiệt độ và lực ion

• Hệ dung môi sử dụng có thể là polyetylen glycol/ dextran hay polyetylen glycol/ sulfat amôn

• Phương pháp này ít được sử dụng trong công nghiệp do giá thành cao

 Phân tách dựa vào sự thay đổi tính hoà tan

• Thay đổi pH: kết tủa ở điểm đẳng điện.

• Thay đổi lực ion: kết tủa bằng muối trung tính.

• Làm giảm hằng số điện môi: dung môi hữu cơ hoà tan trong nước.

 Phân tách dựa vào điện tích: điện di, sắc ký trao đổi ion

 Phân tách dựa vào khối lượng phân tử: ly tâm, lọc gel, thẩm tích, siêu lọc

 Phân tách dựa vào vị trí liên kết đặc hiệu bề mặt: sắc ký ái lực

 Phân tách dựa vào tính ổn định: tác động nhiệt, axit hoặc kiềm

 Đặt túi trong thể tích lớn dung dịch đệm không chứa chất hoà tan cần loại bỏ.

 Chất hoà tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều gradient nồng độ cho đến khi đạt trạng thái cân bằng

 Thay dung dich đệm mới cho tới khi đạt độ tinh sạch mong muốn

 Phương pháp trường điện: chất hoà tan dịch chuyển do trường điện

 Phương pháp tác động áp suất lên dung dịch phía trước màng lọc: dung môi

đi qua (thẩm thấu ngược); các phần tử nhỏ đi qua (siêu lọc) Phương pháp sử dụng vào cuối QT tinh chế để loại bỏ các tác nhân tách rửa (sắc ký)

ξ 4 CÁC PHƯƠNG PHÁP sắc ký

1 Các khái niệm về sắc ký

 Nguyên tắc : Sự phân tách có được nhờ sự chuyển dịch khác nhau trong pha

động của các chất hoà tan ban đầu được gắn trên pha tĩnh ở trạng thái rắn.

 Pha tĩnh: khả năng gắn các chất hoà tan phải lớn Tương tác giữa CHT và pha tĩnh là kết quả của cơ chế hấp phụ, phân chia, tương tác ion, rây lọc phân tử,

tương tác kỵ nước hay tương tác sinh học đặc hiệu

• SK hấp phụ: CHT gắn vào pha tĩnh bằng LK kỵ nước; lực Van der Waals

• SK trao đổi ion: CHT gắn vào pha tĩnh bằng LK ion giữa các điện tích của CHT

và pha tĩnh

• SK lọc gel: CHT khuếch tán vào trong pha tĩnh có dạng hạt xốp tuỳ theo kích thước các phân tử

• SK kỵ nước: Phần kỵ nước trong CHT tạo LK với phần kỵ nước của pha tĩnh

• SK đặc hiệu sinh học: CHT và pha tĩnh có liên kết sinh học đặc hiệu enzim –

cơ chất; kháng nguyên – kháng thể

 Pha động: chất lỏng có khả năng làm thay đổi dần tương tác giữa CHT và pha tĩnh, bằng cách lôi cuốn CHT cùng với nó

2 Sắc ký lọc gel

 Nguyên tắc : Khi dung dịch hỗn hợp protein chảy qua cột tuỳ theo khối lượng, kích thước và hình dạng của CHT chúng sẽ xâm nhập nhiều hay ít vào trong pha tĩnh xốp (là các hạt gel xốp chứa đầy trong cột)

• Các phân tử có đường kính lớn hơn lỗ xốp của pha tĩnh, không thể kuếch tán vào trong nên bị loại trừ, chúng ra khỏi cột cùng với thể tích rửa bằng thể tích giữa các hạt gel Vo

• Các phân tử bé nhất sẽ kuếch tán tối đa vào trong hạt gel Thể tích dịch rửa của chúng sẽ bằng tổng thể tích pha lỏng của cột (Vt)

• Các phân tử có kích thước trung gian sẽ khuếch tán hạn chế vào trong hạt.thể

bỏ qua nêu các protein trong hỗn hợp đều là hình cầu

Phân đoạn hỗn hợp protein theo khối lượng, kích thước và hình dạng phân tử Mức độ phân tách rộng hẹp khác nhau tuỳ theo mức độ tạo mạng của gel Kích thước phân tử càng nhỏ, đường đi càng lớn, thể tích dịch rửa càng lớn.

• Chất rửa cột sắc ký thu hồi trong các bình chứa được kết nối với detecteur UV

 Gel Sephadex

• Gel Sephadex là một loại bột khô, không tan trong nước, nhưng khi ngâm trương ra và tạo thành gel.

• Gel Sephadex bền trong MT axit yếu, kiềm yếu Liên kết glucozit trong gel sẽ

bị thuỷ phân trong MT axit / hoặc kiềm mạnh

• Đặc tính gel của Sephadex như sau:

 gel dextran có liên kết ngang giữa các mạch polysacarit với nhau tạo thành mạng lưới ba chiều

 Gel trung hoà về điện tích nên không có tương tác anion và cation

 Mức độ liên kết ngang quyết định kích thước mắt lưới Nếu ít liên kết thì mắt lưới lớn, ngậm nứoc nhiều và ngưộc lại

 Tuỳ thuộc mức độ liên kết chia gel Sephadex làm các loại

Loại Sephadex Giới hạn phân tử bị loại trừ hoàn

toàn

Phạm vi phân tách các chất

có M từ

G-25G-50G-75G-100G-200

5.00010.00050.000100.000200.000

100 – 5.0005.000 – 10.00010.000 – 50.00050.000 – 100.000100.000 – 200.000

• Một số gel khác

 Gel Sepharose và Superose: dẫn suất của agarose.

 Gel Sephacryl: dẫn suất của dextran.

 Gel Gel Ultrogel: hỗn hợp dẫn suất của agarose và polyacrylamit

3 Sắc ký trao đổi ion

 Sử dụng tính chất lưỡng tính của protein enzim đại phân tử với nhiều

nhóm chức tích điện và có tính chất như polyelectrode Nếu sử dụng vật liệu mang điện tích trái dấu với điện tích của protein cần tách sẽ giữ lại được protein cần tách Ngược lại sẽ giữ protein nhiễm tạp

 Các protein của hỗn hợp có các nhóm bên ion hoá khác nhau, do đó ở

một pH nhất định các protein sẽ có điện tích không giống nhau Kảh năng được giữ trên nhựa khác nhau

 Chất mang

 Nhựa trao đổi ion: là khung vật liệu rắn không hoà tan, trên đó có gắn bằng liên

kết đồng hoá trị với các nhóm ion hoá được Các nhóm này lại liên kết với các ion đối và các ion đối lại có thể trao đỏi thuận nghịch với các ion trái dấu.

- Khung mang nhóm tích điện dương và ion đối điện tích âm được gopị là

nhựa trao đổi anion.

- Khung mang nhóm tích điện âm và ion đối tích điện dương gọi là nhựa trao

đổi cation.

 Nhựa trao đổi ion có bản chất hoá học khác nhau nhằm đáp ứng mọt số đặc tính

cần thiết: độ xốp lớn, háo nước, chịu lực cao, khả năng giữ nước cao, độ phân tách cao, có tính ổn định hoá học và nhiệt, kết quả phân tách ổn định, độ bền cột cao.

Nhựa trao

đổi Bản chất hoá học khung nhựa Nhóm ion hoá Khả năng trao đổi

DEAE-Sephadex Các mạch dextrin liên kết chéo Dietylamin etyl Trao đổi anion yếu

AmbelitE-Ỉ120 Polystyren liên kết chéo bằng

divinylbeen Sulfonat Trao đổi cation mạnh

CM-Sepharose Agarose liên kết chéo bằng

2,3-dipromopropanol Cacboxymetyl Trao đổi cation yếu

 Nhựa trao đổi ion từ dẫn xuất của xenlulose:

Kích thước lỗ lớn; khả năng giữ thấp hơn Cho phép rửa cột trong ĐK mềm dịu hơn Dạng sợi hay vi hạt Hệ số nén cao nên gây khó khăn khi tiến hành

 Nhựa trao đổi cation: cacboxylmetyl xenlulose; photpho xenlulose; sulfo xenlulose Dùng để tinh sạch enzim kiềm tính Ion trao đổi là H+ theo sơ đồ:

X-CH2-COOH X-CH2COO- + H+

X là gốc xenlulose

 Nhựa trao đổi anion: dietylamino etyl xenlulose (DEAE-xenlulose);

trietylamino etyl xenlulose Dùng để tinh sạch enzim axit tính Ion trao đổi là H+ theo sơ đồ:

X-C2H4N(C2H5)2 + H2O X-C2H4N+H(C2H5)2 + OH

-X là gốc xenlulose

 Hồi lưu dung dịch rửa (dung dịch sắc ký có cùng pH và lực ion ở cửa vào

và ra của cột) qua cột nhựa trước khi hoạt động: làm trương nở xenlulose, đuổi hết bọt khí trong cột, loại các phần tử nhỏ, cân bằng cột để gel có khả năng hấp phụ tốt

 Nhựa dẫn xuất của agarose liên kết chéo (Sepharose CL-6B) và nhựa polyme tổng hợp (Trisacryl): công suất cao; hệ số nén không đáng kể; không thay đổi thể tích theo pH và cường độ ion; tái tạo lại nhựa mà không cần tách khỏi cột

 Quá trình phân tách trên cột

 Giai đoạn 1: hấp phụ thuận nghịch protein enzim cần tinh sạch vào nhựa trao đổi i0n

 Giai đoạn 2: khử hấp phụ các protein đã được hấp phụ bằng một trong các cách:

• Thay đổi pH của dịch rửa: thay đổi mức độ ion hoá, do đó tahy đổi điện tích tổng của protein

• Tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh

 Các phương thức rửa

 Với cột ngắn CHT không nằm trên cột: rửa bằng dung dịch đệm ban đầu

 Với cột dài hơn (loại bỏ được tạp chất; các chất có tính chất sắc ký gần giống enzim được hấp phụ: rửa thực hiện nhờ gradient pH và/ hay lực ion (bổ sung KCl, NaCl ) tăng hay giảm liên tục hoặc gián đoạn, tuyến tính hay không tuyến tính Có thể dùng các dung dịch đệm photphat, axetat, borat, xitrat

Loại rửa đặc biệt: thực hiện nhờ cơ chất, chất giống cơ chất hay coenzim

có nồng độ nhất định