Dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thụ trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh là một chất hấp thụ trơ như : silicagel hoặc alumin … pha tĩn
Trang 2I THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC)
A LÝ THUYẾT
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là kĩ thuật rất quan trọng cho phân tách nhanh
và phân tích định tính hợp chất với số lượng nhỏ Dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thụ trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua pha tĩnh là một chất hấp thụ trơ như : silicagel hoặc alumin … pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, nhôm
Mẫu chất : thường là hỗn hợp gồm nhiều chất có độ phân cực khác
nhau Sử dụng khoảng 1 micolit có độ pha loãng 2-5%
Pha tĩnh : một lớp mỏng khoảng 0,25mm của một loại chất hấp thụ
như : Silicagel hoặc alumin … chất hấp thụ trên giá đỡ được nhờ sunfat calci khan hoặc polymer hữu cơ
Pha động : dung môi hoặc hỗn hợp dung môi di chuyển chậm dọc theo
tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất di theo nó, dung môi di chuyển lên cao nhờ tính mao dẫn, mỗi thành phần của mẫu chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau tùy thuộc vào lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn lưu giữ lại và tùy thuộc vào độ tan của mẫu chất trong dung môi
Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ bằng thủy tinh có nắp đậy
I.1 Các nguyên tắc của sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (TLC) là một kĩ thuật phân tách rắn-lỏng Tuy nhiên,pha động lỏng không được phép thẩm thấu xuống chất hấp thụ, nó đượcgây ra để di chuyển lên bản mỏng của chất hấp thụ bao phủ trên một bề
Trang 3mặt chất trơ Lớp mỏng của chất hấp thụ được trải ra tấm kính phẳng và
để cho khô Một tấm kính phẳng, hay tấm kim loại và được bao phủđược gọi là một bản mỏng hoặc một lớp trượt bản mỏng Khi một bảnmỏng được đặt thẳng đứng trong một cái bình chứa một ít dung môi,dung môi di chuyển lên theo lớp của chất hấp phụ trên bản mỏng bằnglực mao dẫn
Trong TLC, mẫu được chấm vào bản mỏng trước khi dung môiđược cho di chuyển lên bản hấp thụ Mẫu thường được chấm vào nhưmột vết nhỏ gần gốc của bản mỏng; kĩ thuật này thường được xem như
kĩ thuật chấm Bản mỏng được chấm bởi sự chấm lặp đi lặp lại của mộtdung dịch mẫu từ một pipet mao dẫn nhỏ Khi pipet đầy chạm vào đĩa,phản ứng mao dẫn chuyển dung lượng của nó lên bàn mỏng và một vếtnhỏ được tạo thành
Khi dung môi di chuyển lên bản mỏng, mẫu bị chia ra giữa phađộng lỏng và pha tĩnh rắn Trong suốt quá trình này, các thành phần khácnhau trong hỗn hợp đưa vào được tách ra Sự tách dựa trên sự tác độngcủa hợp chất cần phân tích với pha động và pha tĩnh là yếu tố quyết địnhhiệu quả tách của sắc ký Chất ít phân cực tiến lên nhanh hơn các chấtphân cực nhiều Các kết quả phân tách do các sự khác nhau trong tỉ lệcác thành phần riêng lẻ của hỗn hợp tiến lên trên bản mỏng Khi nhiềuchất hiện diện trong một hỗn hợp, mỗi chất có tính hòa tan riêng và tínhhút bám riêng, phụ thuộc vào nhóm chức trong cấu trúc của nó Nhìnchung, pha tĩnh là các chất phân cực mạnh và có ái lực mạnh Pha độnglỏng thường là các chất ít phân cực hơn chất hút bám và là chất hòa tannhiều một cách dễ dàng và thường ít phân cực hay thậm chí không phâncực Vì vậy, các chất phân cực nhiều di chuyển châm về phía trước, hoặckhông di chuyển, và các chất không phân cực di chuyển nhanh hơn
Ví dụ : các chất tan kém phân cực như hydrocacbon bị silicagelhoặc alumin hấp thụ kém và giữ lại kém hoặc không giữ lại còn các chấttan có tính phân cực mạnh như alcol , axit cacboxylic hấp thụ mạnh vàgiữ lại chặt Còn khi phân tích các hợp chất axit (phenol axit,cacboxylic) hay bazo (axit amin) thì từ thực nghiệm cho thấy các hợpchất có tính axit thì bị pha tĩnh alumin giữ lại mạnh còn các hợp chấtbazo thì bị silicagel giữ lại mạnh
Bản mỏng tráng silicagel
Trang 4Khi dung môi đã di chuyển lên hết bản mỏng, nó được lấy ra từ bình sắc
ký và để khô cho đến khi dung môi bay hơi hết Nếu hỗn hợp đã chấmđầu tiên trên bản mỏng được phân tách, sẽ có 1 loạt các vết cao nhất trênđĩa Mỗi vết tương ứng với một thành phần phân tách hoặc hợp chất từhỗn hợp đầu tiên Nếu các thành phần của hỗn hợp là các chất có màu,các vết khác nhau sẽ hiển thị rõ ràng sau khi chạy sắc ký Tuy nhiên,thường là các vết sẽ không hiển thị bởi vì chúng tương ứng với các chấtkhông có màu Nếu các vết không rõ ràng, chúng có thể được làm hiểnthị chỉ khi dùng phương pháp trực quan Thường thì các vết có thể đượcthấy khi đĩa bản mỏng được giữ dưới tia UV; đèn UV là một phươngpháp trực quan thông dụng Cũng thông dụng là dùng hơi Iot Các đĩađược đặt trong một cái bình (champer) chứa tinh thể Iot và để đứng trongmột thời gian ngắn Phản ứng Iot với các thành phần khác nhau hấp thụtrên bản mỏng để cho các hỗn hợp màu hiển thị một cách rõ rang Bởi vìIot thường thay đổi các hợp chất bằng phản ứng, các thành phần của hỗnhợp thường không thể được khôi phục lại từ đĩa khi dùng phương phápIot
I.2 Chuẩn bị bản mỏng
2.a Các bản mỏng được làm sẵn trên thị trường
Bản mỏng TLC tiện lợi nhất là bản mỏng được làm sẵn và được bán ở dạng sẵn sàng sử dụng Nhiều nhà sản xuất cung cấp các bản mỏngthủy tinh bao phủ lại với một bản bền của silica gel hoặc alumina Tiện lợi hơn, các đĩa cũng có thể có đáy plastic dẻo hoặc đáy aluminum Loại bản mỏng TLC thương mại thông dụng nhất là được làm bằng tấm plastic được bao phủ với silica gel và polyacrylic acid cung cấp như là một chất liên kết Chất chỉ thị fluorescent có thể được trộn với silica gel
Do sự hiện diện của các hợp chất trong mẫu, chất chỉ thị làm cho các vết hiển thị dưới tia UV Mặc dù các bản mỏng này tương đối đắt tiền so vớicác bản mỏng được chuẩn bị trong phòng thí nghiệm, chúng sử dụng tiện lợi hơn và cung cấp các kết quả đồng nhất hơn Các bản mỏng được sản xuất hoàn toàn đồng bộ Bởi vì phần đế plastic dẻo, một lợi thế nữa
là lớp bao phủ không bong ra khỏi bản mỏng một cách dễ dàng Các tấm plastic (thường hình vuông 8 in x 8 in.) có thể được cắt bằng kéo hoặc dụng cụ cắt giấy thành bất cứ kích cỡ nào được yêu cầu
Nếu các bản TLC này , chúng nên được làm khô trước khi dùng Làm khô các bản mỏng bằng cách đặt chúng vào một lò ở 100oC trong 30 phút và đặt chúng trong tủ sấy đến khi chúng được dùng
2.b Chuẩn bị các bản mỏng
Dải băng
Các bản mỏng thương mại đã chuẩn bị là sử dụng tiện lợi nhất, vàchúng tôi khuyên rằng nên sử dụng chúng cho hầu hết các ứng dụng.Nếu bạn phải tự chuẩn các bản mỏng , phần này cung cấp các hướng dẫncho bạn làm Hai vật liệu hấp thụ thường dùng nhiều nhất cho TLC làalumina G (aluminum oxide) và silica gel G (silicic acid) Chữ G là viếttắt của thạch cao (calcium sulfate) Thạch cao nung CaSO4.1/2H2O tốthơn Khi tiếp xúc với nước hoặc độ ẩm, thạch cao đặc lại trong một khốicứng CaSO4.2H2O, cái mà liên kết chất hấp phụ lại với nhau và dùng cácphiến thủy tinh như một nền hỗ trợ Trong các chất hấp thụ dùng choTLC, khoảng 10-13% khối lượng thạch cao được thêm vào như một chấtliên kết Vật liệu cho công việc bản mỏng là một loại bột mịn Nếu dùng
Trang 5silica gel, vữa nên được chuẩn bị theo tỉ lệ khoảng 1g silica gel G vớimỗi 2ml nước.
Phiến thủy tinh dùng cho đĩa bản mỏng nên được rửa, để khô, và đặt trên một tờ báo Đặt hai dải băng che dọc hai cạnh của đĩa Dùng nhiều hơn một bản băng che nếu một lớp phủ dày được trên bản mỏng Một vữa được chuẩn bị, lắc đều, và đổ dọc một trong cạnh không băng của bản mỏng
Một que thủy tinh nặng, đủ dài để bắc qua các cạnh đã băng, được dùng để san phẳng và trải vữa trên bản mỏng Trong khi que đang ngừnglại trên băng, nó được đẩy dọc theo đĩa từ điểm cuối tại nơi vữa được đổ
về phía đối diện điểm cuối của đĩa Sau khi vữa được trải ra, các tấm băng được lấy ra, và đĩa được làm khô trong một lò 110oC trong khoảng
1 tiếng Các đĩa kích thước 200-250cm2 dễ dàng chuẩn bị bằng phương pháp này Lưu ý độ dày của bản mỏng là 250micromet mỏng khoảng 0,5 -2,0 mm, bề mặt phải phẳng mịn không có chỗ lồi
lõm
Rót
Đặt các phiến thủy tinh vào lòng bàn tay trái giữ cho các ngón taykhông chạn vào thành phiến thủy tinh , rót nhẹ và hết dung dịch silicagellên bề mặt bản rồi nghiêng nhẹ qua bên phải bên trái cho phủ đều khắp
bề mặt
Trang 6Kỷ thuật rót bản mỏng
Chú ý Tránh hít bụi silica hoặc methylene chloride, chuẩn bị và dùng vữa khi đeo dụng cụ bảo hộ, và tránh methylene chloride hoặc hỗn hợp vữa đụng vào da Thực hiện sự phủ khi dùng dụng cụ bảo hộ.
I.3 Chuẩn bị Micropipet ( ống vi quản )
Để đưa mẫu phân tách vào bản mỏng, dùng một ống vi quản Một cái ống vi quản có đường kính khoảng từ 1-2 mm thì dễ dàng làm từ một thủy tinh dài 10-20cm Hai tay cầm đầu ống , hơ đoạn giữa ống vừa hơ vừa xoay vòng vòng để khoảng giữa được nóng đều Khi thùy tinh mềmdẻo dùng tay kéo dãn ra Nhớ tay luôn giữ ở hai đầu ống cho đến khi thủy tinh nguội cứng lại mới thôi
( 1 ).Hai tay cầm ống thủy tinh hơ trên ngon lửa xanh của đèn cồn vừa xoay tròn để vi quản nóng đều
( 2 ).Khi thấy vi quản vừa nóng chảy vừa đem vi quản ra khỏi lửa vừa kéo dài 2 đầu ống ra xa khoảng từ 4-5cm , rồi giữ yên cho thủy tinh đặc cứng trở lại
Trang 7Dùng một lọ thủy tinh , chứa 1 ít acetone để đựng và bảo quản ống vi quản Khi cần chấm mẫu , lấy ống vi quản ra khỏi lọ acetone dí nhẹ đầu vi quản lên 1 tờ giấy thấm để loại bỏ hết acetone trong ống làm vàilần Sau đó chấm mẫu lên bản mỏng , sau khi chấm xong muốn dùng ống vi quản đó chấm tiếp cần nhúng đầu vi quản đó vào acetone vài lần ( tốt nhât nên sử dụng cái mới đễ chấm mẫu khác) Sau khi làm xong nhúng lại vào dung dịch acetone và bỏ vào lại hủ chứa acetone đểbảo quản
I.4 Chấm mẫu lên bản mỏng
Để gắn một mẫu vào bản mỏng, cho khoảng 1mg chất thử rắn hoặc
1 giọt chất thử lỏng trong một dụng cụ chứa nhỏ như một đĩa Petrihoặc một ống nghiệm Hòa tan mẫu trong một vài giọt dung môi dễhòa tan Acetone hoặc methylene chloride thường là dung môi thíchhợp Dung dịch được thử nghiệm, có thể được dùng trực tiếp mà khôngcần pha loãng ( pha loãng trong trường hợp là dung dịch quá sệt hoặcchất rắn Nồng độ sau khi hòa tan là 2-5%)
Ống vi quản, chuẩn bị như miêu tả, được làm đầy bằng cách nhúngđầu hút vào dung dịch được thử nghiệm Lực mao dẫn làm đầy pipet.Rồi đặt nhẹ nhàng vào bản mỏng tại một điểm khoảng 1cm từ phầnđáy, vết phải vừa đủ cao để nó không hòa tan vào dung môi pha động.Quan trọng là phải chạm vào đĩa rất nhẹ nhàng và không đục một lỗtrong phần hấp thụ (pha tĩnh) Khi pipet chạm vào bản mỏng, dungdịch được truyền vào bản mỏng như một vết nhỏ Ống vi quản nênchạm vào bản mỏng rất nhanh, gọn Ống vi quản được giữ trên bảnmỏng, tất cả dung lượng trong ống vi quản sẽ truyền vào bản mỏngtạo sẽ làm cho vết loang to Chỉ cần chấm một lượng nhỏ mẫu Thường
có ích khi thổi nhẹ nhàng vào bản mòng khi mẫu được gắn vào Điềunày giúp giữ vết chấm nhỏ bởi làm bay hơi dung môi trước khi nó cóthể dàn đều trên bản mòng Vết chấm càng nhỏ ( khoảng 2-5mm), kếtquả phân tách càng tốt Bạn nên lặp lại quá trình với nhiều lần lượngnhỏ hơn là chấm một lần với lượng lớn Dung môi nên được làm bayhơi giữa các lần chấm Nếu vết không nhỏ mà lớp thì nên thay mộtbản mỏng mới Ống vi quản có thể được dùng nhiều lần nếu nó đượcrửa, rửa giữa các lần dùng Nó được nhúng lặp đi lặp lại vào một phầnnhỏ của dung môi để rửa nó và chạm vào khăn giấy để làm cạn nó
I.5 Chuẩn bị dung môi ly giải
Dung môi sử dụng cho sắc ký phụ thuộc vào mẫu được phân tách.Bạn có thể phải thử nhiều loại dung môi trước khi đạt được sự phântách vừa ý Bởi vì các đĩa TLC nhỏ có thể được chuẩn bị và triển khai
Trang 8nhanh, một sự lựa chọn dung môi theo thực nghiệm thường không khó
để làm
Nguyên tắc của việc chon dung môi là phải cần một lượng lớn rẽtiền có độ tinh khiết cao, tránh chứa các vệt kim loại, dung môi khôngquà dễ bay hơi
Methylene chloride và toluene là các dung môi có tính phân cựctrung bình và là sự lựa chọn tốt cho việc phân tách các nhóm chứckhác nhau xa Đối với các mẫu là hydrocarbon, các lựa chọn tốt nhất làhexane, petroleum ether (ligroin), hoặc toluene Hexane hay petroleumether với các tỉ lệ khác nhau của toluene hay ether cho các hỗn hợpdung môi có tính phân cực vừa phải thích hợp cho nhiều nhóm chứcthong dụng Các mẫu phân cực có thể yêu cầu ethyl acetate, acetone,hoặc methanol Một cách nhanh để xác định một dung môi tốt là chấmnhiều mẫu trên một đĩa Các vết chấm nên được chấm cách nhau ítnhất 1cm Một Ống vi quan được hút đầy một dung môi và chạm nhẹnhàng vào một trong các điểm chấm Dung môi mở rộng ra ngoài trongmột vòng tròn Mức dung môi nên được đánh dấu với bút chì Mộtdung môi khác được chấm vào mỗi vết khác nhau không trùng lênnhau cách nhau 1cm Khi các dung môi trải rộng ra ngoài, các vếtchấm trải rộng ra như các vòng tròn đồng tâm
Bảng dung môi có tính phân cưc tăng dần dựa vào hằng số điên môi
Dung Môi Nhiệt độ sôi diện môi Hằng số
n-Hexan 68,8 1,9 Ciclohexan 80,8 2,0 Tetraclorur carbon CCl4 76,7 2,2 1,4-Dioxan 101,4 2,2 Trietylamin (CH3CH2)3N 89,0 2,4 Benzen 80,1 2,3 Toluen C6H5-CH3 110,6 2,4 Sulfur carbon CS2 46,2 2,6 Dietyl eter CH3CH2OCH2CH3 34,6 4,2 Dimetylsulfoxid (viết tắt là
DMSO)
189,0 4,7
Cloroform 61,2 4,7 Clorobenzen 132,0 5,6 Piperidin 106,0 5,8 Etyl acetate 77,1 6,0 Acid acetic 118,5 6,2 Anilin 184,4 7,0 Tetrahydrofuran (viết tắt là
THF)
65,4 7,4
Diclorometan 39,8 8,9 Tert-butanol 82,5 12,2
Trang 9Pyridin 115,5 12,3 Aceton 56,2 20,7 Etanol 78,3 24,3 Benzonitril C6H5-CN 190,7 25,2 Metanol 65,0 32,6 Dimetylformamid (viết tắt là
DMF)
153,0 36,7
Acetonitril CH3-CN 81,6 37,5 Nước 100,0 78,5 Nitrometan CH3-NO2 101,1 38,6
Bảng hỗn hợp hai dung môi được sắp xếp theo khă năng ly giải tăng dần
Hệ dung môi Tỷ lệ pha
Trang 10Benzen:dietyl eter 1:9 Dietyl eter:methanol 99:1 Dietyl eter
Etyl eter:dimetylformamid 99:1 Etyl acetate
Etyl acetate:methanol 99:1 Benzen:acetone 1:1 Cloroform:methanol 9:1 Dioxan
Aceton Metanol Dioxan:nước 9:1
I.6 Chạy các bản mỏng (TLC)
6.a chuẩn bị bình sắc ký
Một cái bình chạy sắc ký thuận lợi cho các đĩa TLC có thể làm từ một cái bình có miệng rộng có nắp đậy (to hay nhỏ tùy thuộc vào kích cở bản mỏng) phải có nắp Bên trong cái bình nên được lót với một miếng giấylọc, cắt sao cho nó không hoàn toàn trải rộng xung quanh bên trong bình, chừa khoảng cách giữa hai mép khoảng cách nhỏ (2-3cm) để dễ quan sát khichạy sắc ký Trước khi chạy, giấy lọc bên trong bình nên được làm ẩm hoàntoàn với dung môi chạy sắc ký Lớp giấy lót bão hòa dung môi giúp giữ cái bình bão hòa với hơi dung môi, do đó làm tăng tốc độ chạy Một khi lớp giấy lót đã bão hòa, mực dung môi dưới đáy bình triển khai được điều chỉnh
có độ sâu khoảng 5mm, và cái bình được đậy lại (hoặc bao lại bằng giấy nhôm) và đặt một bên cho đến khi dùng nó Một bình triển khai được chuẩn
bị đúng (với đĩa TLC trong đó) được trình bày trong hình 20.4
6.b Đặt bản mỏng vào bình sắc ký
Khi các điểm được chấm trên đĩa bản mỏng và dung môi đã được chọn (phần I.5), bản mỏng được đặt trong bình triển khai Bản mỏng nên được đặt vào bình một cách cẩn thận để không phần nào của đĩa chạm vào lớp giấy lọc lót Thêm vào đó, mực dung môi dưới đáy bình không nên ở trên các điểm đã chấm trên bản mỏng, nếu không vật liệu đã chấm sẽ hòa tanvào lượng dung môi thay vì trải qua sắc ký Khi các bản mỏng đã được đặt đúng, đậy nắp bình triển khai lại và chờ cho dung môi di chuyển lên bản mỏng bằng lực mao dẫn Điều này thường xảy ra nhanh, và bạn nên xem cẩnthận Khi dung môi dâng lên, các bản mỏng trở nên ẩm ướt rõ ràng Khi dung môi đã di chuyển lên trong phạm vi 5mm phần cuối của mặt bao phủ, bản mỏng nên được lấy ra và vị trí của mực dung môi nên được đánh dấu ngay lập tức bằng cách gạch trên bản mỏng dọc theo đường dung môi bằng bút chì Mực dung môi không nên được phép di chuyển quá phần cuối của mặt bao phủ Bản mỏng nên được lấy ra trước khi điều này xảy ra Dung môi
sẽ không thực sự tiến lên vượt quá phần cuối của bản mỏng, nhưng các vết được phép đứng trên bản mỏng ẩm hoàn toàn trên đó dung môi không có trong sự di chuyển trải rộng ra bằng khuếch tán Khi bản mỏng đã khô, bất
kì vết hiển thị nào cũng nên được phác họa trên bản mỏng bằng bút chì Nếu không có vết nào xuất hiện, một phương pháp trực quan có thể cần thiết
Trang 11I.7 Các phương pháp trực quan
May mắn khi các hợp chất phân tách bằng TLC có màu vì sự phântách có thể thấy được Tuy nhiên, thường thì không như vậy, các hợp chấtkhông có màu Trong trường hợp đó, một vài tác nhân hay một vài phươngpháp nên được dùng để các vật liệu phân tách hiển thị Các tác nhân làmhiện lên các vết có màu được gọi là các tác nhân trực quan Các phươngpháp của tầm nhìn làm các vết rõ ràng là các phương pháp trực quan.Phương pháp trực quan thông dụng nhất là dùng một đèn ultraviolet (UV).Dưới tia UV, các hợp chất thường trông như các vệt sáng trên bản mỏng Điều này thường gợi ra cấu trúc của hợp chất Chắc chắn các loại hợp chấtphát sáng rất rõ ràng dưới tia UV vì chúng phát huỳnh quang
Các bản mỏng có thể được mua với một chất chỉ thị huỳnh quang thêm vàophần hấp thụ Một hỗn hợp của kẽm và các cadmium sulfide thường đượcdùng Khi xử lí theo cách này và giữ dưới tia UV, toàn bộ đĩa phát huỳnhquang Tuy nhiên, các vệt tối xuất hiện trên bản mỏng nơi các hợp chất phântách được thấy làm hết huỳnh quang này
Iot cũng được dùng cho các đĩa trực quan Các phản ứng Iot vớinhiều vật liệu hữu cơ để tạo các hỗn hợp màu nâu hoặc màu vàng Trongphương pháp trực quan này, bản mỏng TLC triển khai và khô được đặt trongmột bình nắp vặn, miệng rộng bên trong chứa một vài tinh thể Iot Cái bìnhđược đậy lại và làm ấm nhẹ nhàng trên một cái bồn hơi nước hoặc một đĩa
hơ nóng ở nhiệt độ thấp Cái bình tràn đầy hơi Iot, và các vết bắt đầu xuấthiện Khi các vết đủ mạnh, cái bản mỏng được lấy ra khỏi bình và các vếtđược phác thảo với bút chì Các vết không tồn tại lâu Các kết quả xuất hiện
là từ sự hình thành các hỗn hợp do Iot tạo thành với các chất hữu cơ Khi Iotthăng hoa khỏi đĩa, các vết nhạt đi Do đó, chúng nên được đánh dấu ngaylập tức Gần như tất cả các hợp chất (ngoại trừ các hydrocarbon no và alkylhalide) tạo thành các hỗn hợp với Iot Độ mạnh của các vết không cho biếtchính xác lượng mẫu hiện diện, ngoại trừ trong cách thô nhất
Thêm vào các phương pháp trước, nhiều phương pháp hóa học có thể pháhủy hoặc thay đổi vĩnh viễn các hợp chất phân tách thong qua phản ứng.Nhiều phương pháp trong các phương pháp này đặc trưng cho các nhómchức cụ thể
Alkyl halide có thể được làm hiển thị nếu một dung môi loãng củabạc nitrat được phun lên bản mỏng Bạc halide được tạo thành Nhữnghalide này phân hủy nếu phơi ra ánh sáng, gây ra các vệt tối trên đĩa TLC.Hầu hết các nhóm chức hữu cơ có thể được làm hiển thị nếu chúng đốt vớisulfuric acid Acid sulfuric cô đặc được trải trên bản mỏng, sau đó đun nóngtrong một cái lò ở 110oC để đốt hoàn toàn Các vết vĩnh cửu do đó được tạo
ra
Các hợp chất có màu có thể được chuẩn bị từ các hợp chất khôngmàu bằng cách tạo ra các chất dẫn xuất trước khi chấm chúng trên bảnmỏng Một ví dụ của điều này là sự chuẩn bị 2,4-dinitrophenylhydrazone
từ aldehyde và ketone để tạo ra các hợp chất màu vàng và màu cam Bạncũng có thể phun tác nhân 2,4-dinitrophenylhydrazine trên bản mỏng saukhi ketone hay aldehyde đã phân tách Các vết đỏ và vàng tạo thành nơicác hợp chất được đặt vào Các ví dụ khác của phươngpháp này là dùngSắt chloride để hiển thị phenol và dùng bromocresol green để nhận thấyacid carboxylic Chromium trioxide, Kali dichromate, và Kalipermanganate (thuốc tím) có thể được dùng để hiển thị các hợp chất dễ bị
Trang 12oxy hóa P-Dimethylaminobenzaldehyde dễ dàng nhận thấy amine Cácphản ứng ninhydrin với amino acid làm chúng hiển thị
4 Lượng tương quan của vật liệu chấm
Dưới một khuynh hướng thiết lập của các điều kiện như vậy, mộthợp chất được cho luôn luôn di chuyển một khoảng cách ổn định tương quanvới khỏang cách mực dung môi di chuyển Tỉ lệ này của khoảng cách hợpchất di chuyển so với khoảng cách mực dung môi di chuyển được gọi là giátrị Rf Kí hiệu Rf thay thế cho “retardation factor” hoặc “ratio to front”, và
nó được diễn tả như một phân số thập phân:
Rf = khoảng cách di chuyển bởi chất / khoảng cách di chuyển bởimực dung môi
Khi các điều kiện đo lường được ghi rõ đầy đủ, giá trị Rf là khôngthay đổi đối với bất kì hợp chất được cho nào, và nó tương ứng với tính chấtvật lý của hợp chất đó
Giá trị Rf có để được dùng để xác định một hợp chất chưa biết Nhưng nhưbất kì sự nhận diện dựa trên một dữ liệu nào, giá trị Rf tốt nhất là xác địnhthêm một vài dữ liệu Nhiều hợp chất có thể có giá trị Rf bằng nhau, như lànhiều hợp chất có nhiệt độ nóng chảy bằng nhau
Không phải luôn luôn có thể, trong đo giá trị Rf, làm giống hệt một cáchchính xác các điều kiện đo lường mà nhà nghiên cứu khác đã sử dụng Do
đó, các giá trị Rf hướng tới dùng một nhà nghiên cứu trong 1 phòng thínghiệm hơn là nhiều nhà nghiên cứu trong các phòng thí nghiệm khác nhau.Chỉ ngoại trừ khi xảy ra 2 nhà nghiên cứu dùng các bản mỏng TLC từ nguồngiống nhau, như các bản mỏng thương mại, hoặc biết các chi tiết chính xác
về các bản mỏng được chuẩn bị như thế nào Tuy nhiên, giá trị Rf có thể làmột hướng dẫn hữu ích Nếu các giá trị chính xác không thể dựa vào, các giátrị liên quan có thể cung cấp cho nhà nghiên cứu khác thông tin hữu ích vềđiều được mong chờ Bất cứ người nào dùng các giá trị Rf đã được công bố
sẽ thấy nó là một ý kiến tốt khi kiểm tra chúng bằng cách so sánh chúng vớicác chất chuẩn đã được xác nhận và các giá trị Rf đã biết
Để tính giá trị Rf cho hợp chất đã cho, đo khoảng cách mà chất đã dichuyển từ điểm chấm đầu tiên Đối với những vết không quá lớn, đo trungtâm của vết di chuyển vào Đối với những vết lớn, sự đo lường nên được lặplại ở đĩa mới, dùng ít vật liệu Đối với những vết thấy được đuôi, sự đolường được làm ở “trung tâm của sự hút” của vết Khoảng cách đo được đầutiên này chia cho khoảng cách của mực dung môi đã di chuyển từ vết đầu
Trang 13tiên giống nhau Một sự tính toán mẫu các giá trị Rf của hai hợp chất đượcminh họa trong hình.
I.9 Các bản sắc ký co thể thu hồi sản phẩn tách
Nếu bạn dùng các đĩa lớn, các mẫu có thể được phân tách và các thành phần đã phân tách có thể được phục hồi độc lập từ các bản mỏng Các bản mỏng dùng trong cách này được gọi là các bản mỏng điều chế Đối với các bản mỏng điều chế, thường dùng một chất hấp phụ bản dày Thay vì được chấm như một điểm hoặc 1 loạt các điểm, hỗn hợp được phân tách được chấmvào như một hàng của mẫu khoảng 1cm từ phía cuối của đĩa Khi bản mỏng được chạy, các mẫu phân tách tạo thành các dải Sau khi chạy, bạn có thể quan sát các dải phân tách, thường bằng tia UV, và phác họa các vùng bằng bút chì Nếu phương pháp trực quan là phá hủy, hầu hết các bản mỏng được bao phủ bằng giấy để bảo vệ nó, và tác nhân phá hủy chỉ được cho vào tại ngoài rìa bản mỏng
Một khi các vùng đã được xác định, chất hấp phụ trong những dải đó được được bỏ ra khỏi đĩa và được chiết xuất với dung môi để loại bỏ vật liệu hấp phụ Sự lọc loại bỏ chất hấp phụ, và sự bay hơi của dung môi làm thành phần phục hồi từ hỗn hợp
I.10 Sắc ký bản mỏng và ứng dụng trong hóa hữu cơ
Sắc ký bản mỏng có nhiều ứng dụng trong hóa hữu cơ Nó có thể được dùngtrong các ứng dụng sau đây:
6 Giám sát quá trình của một phản ứng
Trong tất cả những ứng dụng này, TLC có thuận lợi là chỉ cần một lượng nhỏmẫu Không lãng phí mẫu Với nhiều phương pháp trực quan, lượng mẫu íthơn một phần mười của một microgram (10-7) có thể được phát hiện Mặtkhác, các mẫu lớn như milligram có thể được dùng Với các đĩa lớn đã chuẩn
bị (khoảng 9 inch một cạnh) và có lớp hấp phụ bao phủ tương đối dày (>500micromet) thường có thể phân tách từ 0.2 đến 0.5 g vật liệu mỗi lần Cáikhông thuận lợi chính của TLC là những mẫu dễ bay hơi có thể không được sửdụng bởi vì chúng bay hơi từ các bản mỏng
Sắc ký bản mỏng có thể xác định 2 hợp chất đang nghi ngờ là giống nhau trênthực tế là như nhau Đơn giản là chấm cả hai hợp chất bên cạnh nhau trên cùngmột bản mỏng và chạy bản mỏng Nếu cả hai hợp chất di chuyển một khoảng
