Phương pháp xác định lmonocytogenes

̶ Đối với xét nghiệm Listeria trong thực phẩm, bước tiền tăng sinh thường được thực hiện bằng cách tăng sinh bước một trên môi trường không chọn lọc trong 4 giờ, sau đó tăng sinh chọn lọ

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Kiểm nghiệm vi sinh trong thực phẩm

Phương pháp xác định L.monocytogenes

Giáo viên hướng dẫn Sinh viên thực hiện

PHẠM MINH DUY NGUYỄN THANH MINH

I/ GIỚI THIỆU CHUNG VỀ LISTERIA MONOCYTOGENES

Kingdom: Bacteria

Division: Firmicutes

Class: Bacilli

Order: Bacillales

Family: Listeriaceae

Genus: Listeria

Species: Listeria monocytogenes

I.1 ĐẶC ĐIỂM

̶ Listeria monocytogenes là vi khuẩn Gram +, không bào

tử, yếm khí và có thể phát triển trong điều kiện lạnh 2-4 oC, nhiệt

độ tối ưu là 35-37oC

̶ Khuẩn lạc tròn đều, màu nâu đen hoặc xanh đen Đường

kính: 2-3 mm và môi trường xung quanh khuẩn lạc có màu đen

với trung tâm khuẩn lạc lõm xuống Đây là đặc điểm đặc trưng

của giống Listeria

̶ Listeria không chứa độc tố, gây bệnh bằng lượng tế bào sống

xâm nhiễm vào vật chủ

̶ Trong số bảy loại Listeria được biết đến, chỉ có

L.monocytogenes mới là tác nhân thật sự của những ca nhiễm khuẩn

từ thực phẩm (infection alimentaire) Có tất cả 11 chủng huyết

thanh (sérotypes) trong đó 90% trường hợp bệnh Listériosis ở người

đều do các serotype 1a, 1b và 4b gây nên Trong ba nhóm vừa kể,

thì 4b là serotype độc hại nhất

I.2 TÁC HẠI

mang tên listeriosis Triệu chứng đầu tiên thường là tác động đối với hệ thống đường ruột, gây ra

buồn nôn, nôn và tiêu chảy Gây viêm não và viêm màng não, nhiễm khuẩn máu và đôi khi có

thể gây áp xe não Thời gian phát bệnh thường là hơn 12 giờ sau khi nhiễm L monocytogenes

Bệnh có thể kéo dài từ ba ngày đến ba tuần

̶ Sự biểu hiện không thường xuyên khác của listeriosis đối với người còn là viêm màng

tim gây thương tổn tim, nhiễm trùng gây viêm khớp, viêm tuỷ xương, nhiễm trùng màng phổi và viêm màng bụng

̶ Với phụ nữ đang mang thai, có thể gây xảy thai, sinh non, hoặc thai chết lưu

I.3 PHÂN BỐ

̶ Vi khuẩn L.monocytogenes rất phổ biến trong môi sinh

Chúng được thấy trong đất cát, trong nước, trong phân thú vật và

cả trong phân người

̶ Thừơng xuất hiện trong các loại thực phẩm như: Sữa tươi

không được hấp khử trùng , thịt gà, cua và thịt nguội , phomat,

xúc xich, rau,…

̶ Thú vật có thể chứa vi khuẩn nhưng không bị bệnh

Chúng có thể lây nhiễm vào tất cả thực phẩm như thịt, sữa, fromage, thịt nguội và đồ biển

̶ Vi khuẩn có thể nhiễm vào chúng ta qua các vật dụng nhà bếp như dao, thớt bẩn hoặc từ tay đã bị nhiễm trùng

̶ Chúng ta cũng có thể bị nhiễm khuẩn L.monocytogenes nếu có sự tiếp xúc trực tiếp với thú có mang vi khuẩn này

II.Giới thiệu về các phương pháp phân tích

II.1 Chuẩn bị mẫu

̶ Hầu hết các phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng phân tử đều yêu cầu việc chuẩn bị và

xử lý mẫu trước khi thực hiện Các bước này bao gồm pha mẫu, cô đặc vi sinh vật, tiền tăng sinh

và tách chiết DNA

̶ Pha mẫu lấy vi sinh vật có thể được thực hiện bằng nhiều phương pháp: rửa, phun xịt, khuấy bằng sóng âm hay xoáy nước (sử dụng cho mẫu dụng cụ như bàn, chai lọ…), khuấy bằng cánh khuấy (blender), stomacher và pulsifier

̶ Cô đặc có thể được thực hiện với ly tâm, lọc qua màng, dielectrophoresis hoặc phương pháp miễn dịch từ tính

̶ Đối với xét nghiệm Listeria trong thực phẩm, bước tiền tăng sinh thường được thực hiện bằng cách tăng sinh bước một trên môi trường không chọn lọc trong 4 giờ, sau đó tăng sinh chọn lọc trên môi trường Buffered Listeria Enrichment Broth Base (BLEB) trong 4 giờ ở 30oC, sau đó

bổ sung thành phần chọn lọc và nuôi cấy tiếp 20-44 giờ nữa

Môi trường BLEB:

Formula / Liter

Enzymatic Digest of Casein 17 g Enzymatic Digest of Soybean Meal 3 g Yeast Extract 6g Dextrose 2.5 g Sodium Chloride 5 g Monpotassium Phosphate 1.35 g Dipotassium Phosphate 2.5 g Disodium Phosphate 9.6 g Final pH: 7.3 ± 0.2 at 25°C

BLEB Base Supplements/225mL

Acriflavine HCl, 0.5%

Nalidixic Acid, 0.5%

Cycloheximide, 1.0%

̶ Tách chiết DNA có thể được thực hiện với nhiều phương pháp khác nhau: sử dụng dung dịch đệm enzyme, nhiệt hoặc phá tế bào bằng các hạt kim loại

̶ Quy trình tách chiết DNA của L monocytogenes bằng enzyme có thể được thực hiện như sau: Sau khi tăng sinh, 400 μl broth được trộn với 800 μl dung dịch đệm ly giải (0.5%

N-laurylsarcosine, 50 mM Tris-Cl, 25 mM EDTA; pH 8.0) Hỗn hợp được ly tâm ở 20800 x g trong

5 phút Phần lắng được trộn với 400 μl dung dịch ly giải chứa glycogen (0,03 μg/μl) 1 μl proteinase K (20 mg/ml) được thêm vào, và dung dịch được ủ trong 1 giờ ở 37oC Sau khi ủ, 600

μl của một dung dịch NaI (6 M NaI trong 50 mMTris-Cl-25 mM EDTA [ph 8.0]) và 1 ml

isopropanol được thêm vào, và hỗn hợp được ly tâm ở 20800 x g trong 5 phút Phần lắng được rửa với isopropanol 35%, làm khô trong thời gian ngắn và hòa tan lại vào 50 μl nước cất

II.2 Các phương pháp không nhân bản

Xác định tỉ lệ G+C:

̶ Tỉ lệ G+C trong bộ gen của vi khuẩn trải dài từ 20% đến 80% và có khuynh hướng không thay đổi giữa các loài họ hàng gần, cũng như ít bị ảnh hưởng do tái sắp xếp nhiễm sắc thể, mất gen hay lặp gen Ví dụ như tỉ lệ G+C của họ Listeria vào khoảng 37% trong khi E.coli vào khoảng 50% Do đó có thể dựa vào tỉ lệ G+C của bộ gen để xác định sơ bộ loài vi sinh vật

̶ Một phương nhanh chóng và thuận tiện để xác định tỉ lệ G+C là bằng cách đo nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi Tỉ lệ G+C trong DNA ảnh hưởng nhiều đến nhiệt độ nóng chảy của mạch đôi (hình 1b) Mandel và cộng sự (1970) đã lập ra công thức tính toán tỉ lệ G+C theo Tm dựa vào một DNA chuẩn:

mol% (G+C)x = mol% (G+C)r + 1,99(Tmx - Tmr)

trong đó x là DNA chưa biết, còn r là một DNA chuẩn, thường lấy E coli dòng B với tỉ lệ G+C được tính là 50-51 mol% Tuy nhiên công thức trên không chính xác cho các DNA có tỉ lệ G+C quá thấp hoặc quá cao

̶ Người ta có thể đo Tm đơn giản bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm với một máy quang phổ kế (hình 1a), hoặc đo với màu huỳnh quang SYBR Green

Hình 1: a – Độ hấp thụ ở bước sóng 260nm theo nhiệt độ nóng chảy

b – Phần trăm cặp G+C theo nhiệt độ nóng chảy

Lai DNA-DNA:

̶ Trong protocol lai DNA-DNA truyền thống, DNA từ một dòng chuẩn được cắt bằng sóng

âm và trộn với DNA của dòng cần kiểm tra đã được cắt và đánh dấu phóng xạ Hỗn hợp được đun nóng 100oC từ 3-4 phút và giữ ở 60 hoặc 75oC trong 16 giờ Sau khi loại bỏ các đoạn DNA mạch đơn không gắn bằng một cột hydroxyapatite, các đoạn DNA mạch đôi đã gắn được thu lại,

từ đó mức độ lai có thể được xác định bằng cách đo lượng phóng xạ còn lại Trong các protocol sau này, enzyme, biotin, và SYBR green được dùng thay cho đồng vị phóng xạ Tuy nhiên, vì phương pháp này yêu cầu kỹ thuật cao và giá trị liên kết của DNA không luôn luôn thể hiện nhận dạng trình tự thật sự hoặc mức khác biệt trong bộ gen, nên ít được dùng trong các ứng dụng xét nghiệm thường xuyên

Lai gen probe:

̶ Gen probe là một đoạn nucleic acid mạch đơn ngắn đặc hiệu được đánh dấu với enzyme, màu huỳnh quang, biotin hoặc đồng vị phóng xạ và được sử dụng để phát hiện các trình tự nucleic acid mục tiêu bổ sung với nó được gắn trên một bề mặt rắn (thường là gen Listeriolysin

O hoặc msp) Để thực hiện lai gen probe, vi sinh vật cần kiểm tra trước tiên phải được tăng sinh

và phân lập từ dòng thuần và gắn lên một ma trận cơ chất (ví dụ như màng nitrocellulose, màng nylon, hoặc đĩa microtiter) rồi được ly giải để giải phóng DNA gắn lên cơ chất Sau đó nó được lai với một probe có đánh dấu đặc hiệu cho Listeria (có thể là một đoạn gen được cắt ra từ DNA của Listeria hoặc tổng hợp từ 16S và 23S rRNA hoặc những yếu tố di truyền khác) Các đoạn không gắn được rửa đi và những đoạn lai còn lại được phát hiện với một lượng cơ chất thích hợp hoặc chụp hình phóng xạ Nếu mức độ màu hoặc phóng xạ cao hơn mức độ tương ứng của mẫu đối chứng âm chứng tỏ có Listeria hiện diện trong mẫu Vì quy trình này thực hiện được với các loài Listeria khác nhau ở mức độ di truyền, nó chắc chắn là đặc hiệu hơn phương pháp dựa trên kiểu hình

̶ Một số probe cho Listeria đã được thương mại hóa, bao gồm Accuprobe (Gen-Probe Inc., San Diego, California) tập trung vào mRNA của gen gây bệnh; GeneTrak DNA hybridization kit (Neogen Corporation, Lansing, Michigan), dùng probe đánh dấu peroxidase của cây horseradish phát hiện bằng máy đo màu; và công nghệ phát hiện vermicon (VITｮ, Munich, Germany), phát hiện RNA trong tế bào với probe oligonucleotide đánh dấu huỳnh quang Tuy nhiên, vì lai gen probe không bao hàm việc khuếch đại nucleic acid, nó thường cho độ nhạy giới hạn (cần ít nhất

104 bản sao gen mục tiêu trên microliter để phát hiện nếu không khuếch đại tín hiệu và cải thiện đến 500 bản sao gen mục tiêu trên microliter với khuếch đại tín hiệu), điều này không thích hợp

với việc phát hiện trực tiếp L monocytogenes từ các mẫu bệnh phẩm/ thực phẩm Công nghệ

khuếch đại nucleic acid vì thế đã làm giảm đáng kể mối quan tâm tới hệ thống lai gen probe trong xét nghiệm Listeria thường xuyên

Southern Blot:

̶ Biến đổi từ lai gen probe, Southern blot nhận diện và xác định vị trí các trình tự DNA bổ sung với gen probe được phân tách bởi điện di trên gel agarose Trong quy trình này, DNA trước tiên được cắt với enzyme cắt giới hạn thành các phần nhỏ với kích thước khác nhau rồi được phân tách bằng điện di trên agarose gel Bản gel chứa các đoạn DNA đã phân tách được xử lý với kiềm (ví dụ NAOH) để chuyển DNA mạch đôi thành mạch đơn, làm DNA dễ bám trên màng hơn và lai được với gen probe DNA biến tính sau đó được chuyển (blot) từ bản gel lên màng lai bằng mao dẫn, và màng chứa các đoạn DNA được nướng (trong trường hợp màng nitrocellulose) hoặc chiếu tia cực tím (màng nylon) để gắn DNA vào màng Màng sau đó được đem lai với probe DNA hoặc RNA, được gắn với màu huỳnh quang, chất sinh màu hoặc đồng vị phóng xạ Sau khi rửa đi các probe dư, các phần lai có thể nhận thấy được bằng màu trên màng hoặc bằng chụp phóng xạ với phim x-ray Southern blot đã được dùng trong nhiều nghiên cứu phân loại loài

Listeria, xác định serotype dòng 4b và subgroup IIIA, IIIB và IIIC của L monocytogenesI.

II.3 II.3 Phương pháp PCR

̶ PCR là một phương pháp được

chứng minh là có độ nhạy cao, chỉ cần

khoảng 10x10-12 g DNA là có thể thu nhận

kết quả trên gel agarose Do đó PCR được

coi là phương pháp có độ nhạy cao để xác

định bacteria trong đó có Lesteria Một vài

phương pháp kiểm tra bằng PCR được

thương mại như BAX® PCR system

(Qualicon, Wilmington, Delaware), Probelie

assay (Sanofi Diagnostic Pasteur, Marne la

Coquette, France), LightCycler foodproof

(Roche Diagnostics, Indianapolis, Indiana)

và Warnex L.mono Assey (Warnex Inc.,

Laval, Quecbec, Canada)

̶ Tuy nhiên, cho dù đây có là một công cụ mạnh mẽ nhưng không có nghĩa là PCR không

có những khuyết điểm Một khuyết điểm đầu tiên là phản ứng PCR có thể bị nhiễm dẫn đến kết quả dương tính giả Một cách thức để loại bỏ sự tạp nhiễm là sử dụng dUTP thay vì dTTP, sau khi phản ứng PCR thì U-DNA (containing DNA) có thể được loại bỏ bằng enzyme uracil-DNA-gycosylase; sau đó có thể kiểm tra mẫu tiếp theo

Nested PCR

̶ Đây là một biến thể của PCR

thường, Nested PCR sử dụng hai cặp

primer oligonucleotide trong phản ứng

riêng rẽ, làm tăng độ nhạy và tính

chuyên biệt, là hướng giải quyết cho

việc chỉ có một lượng mẫu nhỏ Sau

quy trình đầu nhân bản DNA trong

15-30 chu trình với 1 cặp primer, sản

phẩm sau đó được chuyển vào một

ống mới cho việc nhân bản lần 2 với

cặp primer khác, có trình tự ở trong

sản phẩm của phản ứng 1 Do đó

Nested PCR thì chuyên biệt và nhạy

hơn so với PCR thông thường Một ví

dụ để thấy rõ vấn đề này là: sử dụng

Primer từ vùng 16S rRNA ở giai đoạn

thứ nhất, và những vùng chuyên biệt

cho từng loài, chủng ở giai đoạn thứ

hai; Nested PCR có thể xác định ở

mức độ 4x10-15 g DNA/phản ứng do

đó có thể nhận biết đoạn gene đặc trưng của L.monocytogenes Phương pháp này có thể xác định

tới khoảng 10 tế bào Tuy nhiên, ngoài việc tốn một khoảng thời gian cho quá trình nhân bản lần hai thì Nested PCR cần phải đảm bảo việc vô trùng trong quá trình chuyển sản phẩm từ quá trình một sang ống hai để thực hiện chu trình hai

Multiplex PCR

̶ Một biến thể khác của PCR, Multiplex PCR đơn giản là sử dụng 2 hoặc nhiều cặp primer cho những mục tiêu khác nhau trong cùng một phản ứng, kết quả là nhân bản nhiều đoạn gene trong cùng thời gian Nên nó cho phép phát hiện nhiều mầm bệnh của cùng một loài Sản phẩm của Multiplex PCR sẽ được phân tách ra bằng điện di trên gel agarose Tuy nhiên đối với những sản phẩm có kích thước tương đương nhau thì không thấy rõ sự khác biệt Với việc sử dụng những loại thuốc nhuộm huỳnh quang khác nhau cho mỗi cặp primer thì việc nhận biết sản phẩm của Multiplex PCR sẽ thuận tiện hơn, nó giống như là real-time Ví dụ dùng primer bổ sung với vùng bảo toàn cao ở Listeria là 23S rRNA và L.monocytogenes hly gene, cả Listeria và L.moncytogenes đều có thể được nhận biết cùng lúc thông qua real-time PCR

̶ Trong một phiên bản chi tiết hóa của Multiplex PCR, universal primer thu nhận từ Prokaryotic 23S rRNA được đánh dấu với biotin Sản phẩm PCR được làm biến tính và sau đó trộn lẫn với những quả cầu nhỏ (microphere) đã được đánh dấu huỳnh quang, mỗi một oligonucleotide đặc trưng cho một bệnh (pathogen-specific) thì sẽ có vạch quang phổ khác nhau

Sau khi thêm vào streptavidin-R-phycoerythrin, chất gây tác động đến biotin trong quá trình nhân bản DNA và trong bước sóng khác nhau của các microphere, và trong quá trình phân biệt các mảnh DNA chứa nguồn bệnh khác nhau Việc ứng dụng Multiplex PCR cho đoạn gene iap

có thể phân biệt cả 6 loài Lesteria chỉ trong một kiểm nghiệm Tuy nhiên vấn đề thêm vào nhiều primer trong một ống thì cần phải thiết kế cẩn thận và tối ưu hóa các điều kiện như nhiệt độ ủ,…

Reverse transcription PCR (RT-PCR)

̶ Đầu tiên là tạo cDNA từ mRNA, sau đó cDNA được nhân bản lên trong phản ứng PCR

Cả hai quá trình có thể thực hiện bởi một enzyme là Tth DNA polymerase, đóng vai trò là reverse transcriptase và DNA polymerase RT-PCR là một kỹ thuật có độ nhạy cao khi chỉ cần một lượng nhỏ mRNA là có thể nhân bản và nhận biết Sự có mặt của trình tự mRA đặc biệt thì

có thể chỉ ra được khả năng của tế bào, mRNA bị phân hủy rất nhanh (trong khoảng 1-20 phút) ngay sau khi tế bào tế ; DNA thì vững bền sau nhiều năm, phụ thuộc vào điều kiện lưu giữ Thực vậy, RT-PCR nhân bản của mRNA từ L.monocytogenes Scott A tổn thương bởi nhiệt đã được được sử dụng nhiều hơn là dùng PCR trực tiếp để tránh dương tính giả bởi những tế bào chết

Real-time PCR

̶ Là phương pháp cho phép phát hiện và định lượng sản phẩm PCR ngay khi phản ứng đang xảy ra Việc này thực hiện được nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang, mà sự gia tăng lượng DNA sẽ làm gia tăng lượng huỳnh quang phát ra

Quantitative PCR (Q-PCR : PCR định lượng)

̶ Đây là công cụ bắt buộc trong chuẩn đoán nguồn bệnh, những biến thể của PCR thì không thực sự hiệu quả trong việc xác định chính xác nguồn bệnh trong mẫu Q-PCR là một thiết

kế đặc biệt để thực hiện việc này, hiện nay có ba phương pháp phát hiện dựa trên Q-PCR : phân tích dựa trên điện di gel agarose, gồm cả thuốc nhuộm SYBR green, và sử dụng probe có phát huỳnh quang Mặc dù phát hiện sản phẩm Q-PCR bằng điện di trên gel agarose thì tiết kiệm, dùng SYBR green hay probe gắn huỳnh quang trong real-time Q-PCR thì ngày càng được sử dụng nhiều hơn bởi chúng có độ nhạy cao

̶ Nhiều phiên bản của Q-PCR (như 5’ nuclease PCR hoặc sự thay đổi huỳnh quang (fluorescent resonance energy transfer) [FRET]-based Q-PCR) dựa vào đặc tính endogenous 5’

 3’ nuclease của DNA polymerase chịu nhiệt (như Taq, Tth và Tfl DNA polymerase) để tạo ra những dấu hiệu định lượng bằng sự thủy phân dual-fluorophore-labeled oligonucleotide probe trong quá trình nhân bản Các probe gắn với các chất phát huỳnh quang và hấp thụ huỳnh quang,

và được thêm trực tiếp vào phản ứng PCR Fluorogenic reporter probe được phóng thích bởi DNA polymerase, như vậy đây sẽ là dấu hiệu để định lượng mẫu Fluorogenic 5’ nuclease PCR

đã được sử dụng thành công trong việc phát hiện L.monocytogenes với trình tự mục tiêu là DNA

hay RNA Như vậy hệ thống Q-PCR thì có độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong việc phát hiện L.monocytogenes với giới hạn phát hiện là 104 CFU.ml-1 sau 35 chu kỳ và 102 CFU.ml-1 sau 45 chu kỳ

Phương pháp 5’ nuclease reverse transcriptase (RT) PCR trong xác định

Phương pháp 5’ nuclease được phát triển để phát hiện L.monocytogenes Mục tiêu của phương pháp này là Hemolysin A (hlyA), phần chỉ được tìm thấy trong L.monocytogenes.

Trong quá trình chế biến thì Listeria monocytogenes bị giết một phần bởi nhiệt, nhưng qua việc bảo quản thì L.monocytogene có thể xâm nhiễm/tái sinh trở lại Nhằm bảo đảm an toàn cho người sử dụng thì cần phải kiểm tra xem có hay không L.monocytogenes trong sản phẩm Việc

kiểm tra cần phải nhanh chóng và chính xác nhằm đảm bảo sản phẩm vẫn giữ được hương vị khi đến tay người sử dụng Phương pháp fluorogenic 5’ nuclease PCR trong phân tích real-time RT-PCR nhằm phát hiện mRNA, do mRNA chỉ xuất hiện xuất hiện trong những tế bào sống Trong phương pháp này chúng ta kết hợp giữa 5’ nuclease RT-PCR với nuôi cấy kị khí trong PSU

(Penn State University) nhằm phát hiện L.monocytogenes.

Materials and Methods

Bacterial strains and culture conditions

L.monocytogenes Scott A (NADC 2045) được bảo quản (4°C) trong tryptic soy agar bổ sung

0,6% yeast extract (TSAYE; Difco Laboratories, Detroit, MI), trên thạch nghiêng và được cấy truyền hàng tháng Để xâm nhiễm vào lợn, L.monocytogenes Scott A được sinh trưởng (37°C, 18h ở 150rpm) ở tryptic soy broth bổ sung 0,6% yeast extract (TSBYE; Difco Laboratories) Quá trình gây nhiễm nhân tạo ở lơn, 1ml culture (~109 CFU) được ly tâm (5000X g trong 10 phút), giọt nhỏ (pellet) được cho vào 10ml nước peptone 0,1%, lượng tế bào ở ~ 108 CFU/ml

Heat treatment of L.monocytogenes in Ground Pork