Công nghệ tế bào C8

Công nghệ tế bào

Chương 8

Công nghệ DNA tái tổ hợp

Công cụ chính trong công nghệ sinh học hiện đại là công nghệ DNA tái tổ hợp1 hay còn gọi là kỹ thuật di truyền Công nghệ này cho phép thao tác trực tiếp trên các nguyên liệu di truyền của các tế bào riêng biệt Bằng cách đưa các thông tin di truyền ngoại lai vào trong các cơ thể vi sinh vật, các tế bào động vật và thực vật sinh trưởng nhanh, chúng ta có thể sản xuất

ra các sản phẩm của gen ngoại lai (các protein) với các tốc độ và hiệu suất cao hơn mà thường không thể thực hiện ở các hệ thống tế bào khác

Chương này trình bày những nét chính của các nguyên lý cơ bản trong

kỹ thuật di truyền và các vấn đề liên quan đến nuôi cấy tế bào đã được chuyển gen ngoại lai

I DNA và RNA

Deoxyribonucleotide acid (DNA) là phân tử quan trọng nhất trong các

tế bào sống và chứa tất cả thông tin đặc trưng của tế bào DNA và ribonucleotide acid (RNA) là các đại phân tử2 polymer mạch thẳng được xây dựng trên các tiểu đơn vị riêng rẽ là các nucleotides Một đơn vị monomer (nucleotide) có ba thành phần sau (Hình 8.1):

- Đường năm carbon mạch vòng (pentose): deoxyribose cho DNA và ribose cho RNA

- Một nitrogen base của dẫn xuất hoặc purine hoặc pyrimidine liên kết đồng hóa trị với nguyên tử carbon thứ nhất của đường bằng liên kết kết N-glycoside (Hình 8.1)

+ Purine: adenine (A), guanine (G)

+ Pyrimidine: cytosine (C), thymine (T) cho DNA và uracil (U) chỉ cho RNA

- Một gốc phosphate gắn vào carbon vị trí thứ 5 của đường bằng liên kết phosphoester

1 Xem chương 1 giới thiệu chung về công nghệ sinh học

2 Đại phân tử (macromolecular): là một polymer được tạo thành từ hơn 100 monomers

Phosphoric acid

Base Đường

deoxyribose

Base

ribose

Hình 8.1 Cấu trúc của nucleotide

Các nucleotide của DNA được gọi là deoxyribonucleotide, vì chúng chứa đường deoxyribose, trong khi đó nucleotide của RNA được gọi là ribonucleotide vì chúng chứa đường ribose Mỗi nucleotide chứa một vùng đặc trưng và một vùng không đặc trưng Các nhóm đường và phosphate là phần không đặc trưng của nucleotide, trong khi các base purine và pyrimidine tạo nên phần đặc trưng của nucleotide

Một nucleotide này sẽ được kết hợp với các nucleotide khác bằng một liên kết hóa học giữa các nguyên tử trong các vùng không đặc trưng tạo ra các polynucleotide (Hình 8.2) Sự liên kết (được gọi là các liên kết phosphodiester) xảy ra giữa một nhóm phosphate và một nhóm OH trên thành phần đường

Điểm đặc trưng nhất của DNA là nó thường bao gồm hai sợi bổ sung xoắn gần như song song xung quanh một trục chung tạo thành một xoắn kép (double helix) tương tự như một cầu thang xoắn ốc (Hình 8.3) Mỗi sợi là một polynucleotide Đường kính của xoắn (chiều ngang bậc thang) khoảng

20 , Chiều cao của mỗi vòng xoắn là 34 , gồm 10 bậc thang nghĩa là mỗi vòng xoắn có 10 nucleotide trên mỗi sợi

ổn định cao bởi liên kết hydrogen giữa các base bổ sung

Hơn nữa, đặc trưng của sự bắt cặp base này cho phép truyền thông tin

di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Khi sự nhân đôi tế bào xuất hiện, xoắn kép của DNA tháo ra, và hai sợi DNA mới được tạo thành bổ sung cho

3 Một liên kết hydrogen giữa hai sợi là một lực hút yếu giữa một nguyên tử hydrogen được liên kết đồng hóa trị (H-N) và một nguyên tử ketonic oxygen điện tích âm (C=O)

hai sợi gốc Như vậy, mỗi tế bào mới chứa một sợi DNA gốc và một sợi DNA mới được tổng hợp trong xoắn kép của nó

20 Ao

o

A 3,4 Rãnh nhỏ

Trục giữa

Hình 8.3 Mô hình xoắn kép của phân tử DNA

Trình tự của các base (A, G, T và C) trong một sợi DNA đặc trưng cho một trình tự của các amino acid sẽ được lắp ráp để tạo thành một phân

tử protein Mã di truyền là tập hợp các trình tự base tương ứng cho mỗi amino acid (codon) Vì chỉ có 4 base trong DNA và 20 amino acid trong protein, cho nên mỗi codon phải chứa ít nhất 3 base4 Hai base không thể làm thành một codon bởi vì chỉ có 42 cặp hợp lý của 4 base Nhưng 3 base thì có thể bởi vì sẽ có 43 = 64 bộ ba hợp lý Vì số lượng bộ ba hợp lý lớn hơn 20, cho nên một vài codon chỉ định cùng một amino acid Trong một nghĩa khác, mã di truyền là rất phức tạp, ví dụ: UCU, UCC, UCA, UCG, AGU và AGC đều cùng mã hóa cho serine (Bảng 8.1)

4 Hai mươi amino acid được tìm thấy trong các phân tử protein là: Alanine (Ala), Arginine (Arg), Asparagine (Asn), Aspartic acid (Asp), Cysteine (Cys), Glutamic acid (Glu), Glutamine (Gln), Glycine (Gly), Histidine (His), Isoleucine (Ile), Leucine (Leu), Lysine (Lys), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Proline (Pro), Serine (Ser), Threonine (Thr), Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr) và Valine (Val)

A Met Thr Lys Arg G

II Tạo dòng gen

Tạo dòng một gen là công việc trung tâm của công nghệ DNA tái tổ hợp Gen là đơn vị cơ sở của thông tin di truyền nằm trên nhiễm sắc thể của

tế bào Các nhiễm sắc thể là các cấu trúc sợi dài và mảnh nằm ở trong nhân, bao gồm chủ yếu là DNA Thông tin di truyền được bảo quản trong một chuỗi trình tự của các base nucleotide, gồm có một đoạn DNA Mỗi gen ghi

rõ cấu trúc của một sản phẩm gen đặc biệt, thường là một protein

1 Các trình tự DNA

Để thao tác gen, cần phải biết về tất cả các tổ chức của các trình tự DNA và các đơn vị chức năng của DNA tương tác với các các đơn vị khác trong tất cả các đơn vị di truyền của cơ thể (genome) là như thế nào Việc

phát hiện ra các enzyme hạn chế (restriction endonucleases, RE) của vi khuẩn cắt DNA ở những trình tự đặc trưng, đã giúp cho việc thao tác dễ dàng hơn, vì nó có thể giảm chiều dài của các phân tử DNA thành một tập hợp bao gồm các đoạn ngắn hơn

Các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế bào vi khuẩn để ngăn cản DNA ngoại lai tiếp quản bộ máy tổng hợp protein của tế bào DNA của chính chúng sẽ được bảo vệ khỏi tác dụng của enzyme hạn chế, nhờ sự có mặt của các enzyme nội bào có thể methyl hóa (methylation) các nucleotide đặc biệt, vì thế các nucleotide này không thể bị nhận biết bởi các enzyme hạn chế

Mỗi enzyme hạn chế nhận biết và cắt một trình tự DNA đặc biệt

thường chứa bốn hoặc sáu cặp nucleotide Ví dụ enzyme EcoRI chiết từ E

coli cắt trình tự GAATTC, enzyme BalI của Brevibacterium albidum cắt

trình tự TGGCCA (Hình 8.4) Có hơn 500 enzyme hạn chế khác nhau được tinh sạch từ khoảng 250 vi sinh vật khác nhau Các enzyme hạn chế cắt gãy các phân tử DNA sợi đôi theo hai cách khác nhau như trình bày ở hình 8.4:

- Cắt trên một đường thẳng đối xứng để tạo ra các phân tử đầu bằng

- Cắt trên những vị trí nằm đối xứng quanh một đường thẳng đối xứng

để tạo ra những phân tử đầu so le (đầu kết dính)

Hình 8.4 Hai kiểu cắt của enzyme hạn chế

(a) tạo ra đầu bằng, và (b) tạo ra đầu so le

Vì một enzyme hạn chế nhận biết một trình tự duy nhất, cho nên số vị trí cắt trên một phân tử DNA đặc biệt thường là nhỏ Các đoạn DNA được cắt bởi enzyme hạn chế có thể được phân tách theo kích thước bằng điện di agarose gel để nghiên cứu Do sự tương tự của tổ chức phân tử trong tất cả

các cơ thể, cho nên DNA vi khuẩn, DNA thực vật và DNA động vật có vú tương hợp nhau về cấu trúc Vì thế, một đoạn DNA từ một dạng sống này có thể dễ dàng được pha trộn với DNA của một dạng sống khác Sự tương tự này cũng phù hợp đối với plasmid, nhân tố di truyền ngoài nhân được tìm thấy trong nhiều loài vi khuẩn khác nhau Chúng là những phân tử DNA mạch vòng đóng sợi đôi được dùng làm vector mang các đoạn DNA ngoại lai dùng trong công nghệ DNA tái tổ hợp

2 Sự kết hợp của các phân tử DNA

Các phương thức cơ bản của công nghệ DNA tái tổ hợp là: (1) Kết hợp một đoạn DNA vào một phân tử DNA (như là vector5) có thể tái bản, và (2) Cung cấp một môi trường cho phép sao chép phân tử DNA đã được kết hợp

Có ba loại vector phổ biến được dùng để tạo dòng các đoạn DNA

ngoại lai và tái bản (sao chép) trong E coli Đó là plasmid, bacteriophage λ

và cosmid Tất cả những vector này phải có một số tính chất cần thiết sau:

- Có khả năng tự tái bản trong E coli

- Chứa các gen chỉ thị chọn lọc để dễ dàng phân biệt và tinh sạch vector của thể tái tổ hợp với các dạng khác

- Có các vùng DNA không cần thiết cho sự sinh sản trong vi khuẩn, vì thế DNA ngoại lai có thể được đưa vào trong các vùng này

- Có thể biến nạp vào tế bào vật chủ một cách dễ dàng

DNA plasmid có thể được phân lập từ nuôi cấy vi khuẩn chứa plasmid bằng cách bổ sung chất tẩy (như là sodium dodecyl sulfate6) và bằng cách ly tâm sự sinh tan (lysate) Phức hợp nhiễm sắc thể vi khuẩn, lớn hơn plasmid nhiều, sẽ lắng xuống đáy của tube ly tâm, plasmid siêu xoắn và các đoạn nhiễm sắc thể mạch thẳng giữ lại trong thể nổi Plasmid siêu xoắn một lần nữa được phân tách bằng ly tâm sau khi xử lý với CsCl và EtBr

Plasmid chứa các gen mã hóa cho các enzyme thường có lợi cho vi khuẩn vật chủ Các plasmid mang các kiểu hình khác nhau như: kháng kháng sinh, sản xuất kháng sinh, phân hủy các hợp chất hữu cơ phức tạp, sản xuất các enzyme hạn chế và enzyme biến đổi (modification enzymes) Các plasmid có thể được chuyển vào trong vi khuẩn sau khi vi khuẩn được xử lý sao cho tế bào có thể thấm qua nhất thời các phân tử DNA nhỏ Quá trình này được biết như là sự biến nạp (transformation) Vi khuẩn được biến nạp thành công có thể được chọn lọc dựa trên kiểu hình mới mà chúng nhận được từ plasmid, chẳng hạn khả năng kháng các kháng sinh

Một số plasmid hiện diện trong tế bào có số bản sao thấp (một hoặc một vài bản sao trên tế bào) do DNA plasmid chỉ sao chép một hoặc hai lần trước khi tế bào phân chia Tuy nhiên, các plasmid khác tồn tại một số bản sao lớn hơn (10 tới 100 bản sao trên một tế bào) do DNA tái bản lặp lại cho đến khi đạt được số bản sao thích hợp Các plasmid có số bản sao lớn được gọi là plasmid tái bản dạng lỏng lẽo (relaxed plasmid), và đây là một trong những tính chất hữu ích của vector tạo dòng

Hình 8.5 trình bày một trong các vector plasmid dạng lỏng lẽo, pBR322 (thế hệ thứ hai), dài 4.363 bp, vector này chứa hai gen kháng kháng sinh là Ampicillin (Amp) và Tetracycline (Tet) Số thứ tự của các nucleotide

trên vector được bắt đầu với vị trí EcoRI duy nhất: T đầu tiên trong chuỗi

GAATTC được quy ước là nucleotide thứ nhất Các số thứ tự sau đó được tiếp tục quanh phân tử vector theo hướng từ gen kháng Tet tới gen kháng Amp

Plasmid có thể được cắt ở một số thứ tự nào đó trong các vị trí xác định bằng enzyme hạn chế Vì thế, các đoạn được tạo ra có thể tạo vòng bằng cách kết hợp các đầu kết dính bổ trợ Hơn nữa, các đoạn được tạo ra bởi một enzyme đặc biệt hoạt động trên một phân tử DNA sẽ có cùng đầu kết dính với đoạn được tạo ra bởi cùng một enzyme hoạt động trên một phân

tử DNA khác Vì thế, các đoạn từ hai phân tử DNA khác nhau từ hai cơ thể khác nhau có thể kết hợp bằng các liên kết hydrogen thuận nghịch khi các đoạn này được trộn lại

Nếu sự kết hợp được gắn lại sau khi bắt cặp, thì các đoạn được kết hợp cố định bền vững, sự kết hợp của các đoạn này được thực hiện nhờ enzyme ligase (còn gọi là polynucleotide ligase) liên kết đồng hóa trị các

phân tử tái tổ hợp bằng cách tạo ra liên kết phosphodiester giữa đầu 5’-PO4của một polynucleotide với đầu 3’-OH của polynucleotide khác

Hình 8.5 Plasmid vector pBR 322 Ampr và Tetr : gen kháng ampicillin và

tetracycline, ori: trình tự khởi đầu sao chép, và một số vị trí nhận biết cho các RE

Hình 8.6 trình bày toàn bộ phương thức sản xuất DNA tái tổ hợp (tạo dòng gen) Plasmid được cắt ở các vị trí xác định bằng enzyme hạn chế DNA của một genome ngoại lai được cắt cùng một loại enzyme, một số đoạn trong đó có thể có gen quan tâm Plasmid và các đoạn của genome được phối trộn và kết hợp nhờ enzyme ligase Các plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào vi khuẩn bằng đồng nuôi cấy plasmid và vi khuẩn

III Khả năng ổn định của các vi sinh vật tái tổ hợp

Khi các vi sinh vật tái tổ hợp được nuôi cấy để sản xuất protein tái tổ hợp, thì hiệu suất của sản phẩm protein có thể bị giảm do sự tổn thất của plasmid trong cơ thể khi chúng trải qua nhiều lần sinh sản trong quá trình sinh trưởng của vi sinh vật Khả năng mất ổn định có thể do: (1) Sự phân chia khiếm khuyết của plasmid trong quá trình phân chia của tế bào, hoặc (2) Mất khả năng ổn định cấu trúc tạo ra các đột biến của DNA plasmid

Để ổn định sự phân chia của plasmid, các tế bào cần được sao chép sao cho số lượng trung bình của các bản sao plasmid trên một tế bào được nhân gấp đôi chỉ trong một thế hệ, và các bản sao plasmid cần được phân phối bằng nhau tới các tế bào con khi phân chia tế bào Một số kết quả nghiên cứu cho thấy sự không ổn định của plasmid đã được phát hiện trong

các hệ thống cơ thể vật chủ như: E coli, Bacillus subtilis cũng như nấm

men

Gắn DNA DNA được tạo dòng

Nuôi cấy vi khuẩn chứa một lượng lớn tế bào, sinh trưởng qua đêm

ở 37 o C sẽ sản xuất khoảng 10 9 tế bào/mL

Hình 8.6 Phương thức cơ bản để tạo dòng gen

Một bộ phận các tế bào mang plasmid trong quần thể tổng số được xem như là một hàm số lượng các thế hệ sinh trưởng Vì thế, khi thể tích của

hệ lên men tăng lên thì số lượng các thế hệ sinh trưởng (generation of

growth) cũng tăng, nhưng một bộ phận các tế bào mang plasmid và hiệu suất sản phẩm lại giảm Sự không ổn định của plasmid sẽ tiếp tục nếu hệ lên men quy mô lớn được hoạt động liên tục

1 Động học lên men của các nuôi cấy tái tổ hợp

Nếu gọi xác suất để các tế bào mang plasmid sản sinh ra các tế bào không mang plasmid sau một lần phân chia là p Khi ấy với N tế bào mang plasmid, sau một lần phân chia sẽ sản sinh ra N(1-p) tế bào mang plasmid và Np tế bào không mang plasmid

)(X+

)(X−

Tổng số tế bào sẽ là N(2-p) Trong suốt thời kỳ sinh trưởng theo

hàm mũ, tốc độ sinh trưởng của các tế bào mang plasmid sẽ được biểu diễn như sau:

)(X+

Trong đó: là tốc độ sinh trưởng đặc trưng của các tế bào mang plasmid, là số lượng các tế bào mang plasmid trên một đơn vị thể tích Nếu khối lượng tế bào tương ứng xấp xỉ với số lượng tế bào, thì phương trình tốc độ sinh trưởng đã cho cũng có thể áp dụng được khi là khối lượng tế bào trên một đơn vị thể tích

Mặt khác, tốc độ sinh trưởng của các tế bào không mang plasmid sẽ là:

− +

−

µ

−

X C

Nếu chúng ta chấp nhận rằng và p là hằng số, thì tích phân của

phương trình (8.1) sẽ là:

+

µ[ p t]

Trong trường hợp các tế bào không mang plasmid, thay thế phương trình (8.3) vào (8.2) ta được:

− +

+

− +

+

+

=

X X

X C C

(

exp

) 1 ( exp

0 0

0

0

t C

t t

p p

C p t p C

t p C

f

X

X X

X

−

− +

− +

+ +

+

− +

−

−

=

µ µ

µ µ

µ

µ µ

Trong suốt thời kỳ sinh trưởng theo hàm mũ, số lượng thế hệ (n) của

các tế bào mang plasmid có thể được tính toán từ mối quan hệ sau:

2ln

t n

+

Kết hợp các phương trình (8.7) và (8.8) sẽ có kết quả phương trình của

f theo thế hệ thứ n như sau:

[2 ( 1 )]

1

1

− +

+

=µ

µ

Phương trình (8.9) có thể được dùng để dự báo sự thay đổi của f theo

số thế hệ cho một loạt quá trình lên men mẻ, nếu chúng ta chấp nhận rằng các tế bào nhân lên theo hàm mũ trong khi nuôi cấy từng mẻ một Hình 8.7

cho thấy ảnh hưởng của p và α lên f25 (f của 25 thế hệ), là thông số bị giảm khi tăng α và p Khi p ≤ 0,01 và α < 1, thì f25 gần bằng 1, khi đó các tế bào

mang plasmid rất ổn định Tuy nhiên, khi α tiến tới 2, f25 cũng trở thành 0

Giá trị đặc trưng của α giao động từ 1 đến 2

Hình 8.7 Bộ phận tế

bào mang plasmid sau

Hình 8.8 cho thấy sự thay đổi của f như là một hàm của n và α Giá trị

p được đặt không đổi là 0,01 Giá trị của f giảm nhanh khi n và α tăng lên

Khi α bằng 1,4 tất cả tế bào mang plasmid đã mất plasmid của chúng sau

2 Nuôi cấy trong hệ thống lên men thùng khuấy liên tục (CSTF)

Nói chung, chúng ta cần phải kiểm tra khả năng ổn định của các tế bào tái tổ hợp trong hệ thống lên men thùng khuấy liên tục Cân bằng nguyên liệu cho các tế bào mang plasmid chung quanh một CSTF sản xuất như sau:

dt

dC C

p

X X

+ +

Tương tự, cân bằng nguyên liệu cho các tế bào không mang plasmid

đã được đưa ra như sau:

dt

dC C

p C p

X X

X

−

− +

C D C

X X X

X

)(

)(

)

+

=+

−+ −

)

+

X X X

)exp(