xác định gián tiếp cloxacillin bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử

Ở nước ta phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử đã là một trong các phương pháp tiêu chuẩn để phân tích lượng vết các kim loại trong nhiều đối tượng khác nhau như: đất, nước, không

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Luận

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 7

1.1 Giới thiệu chung chất kháng sinh 7

1.1.1 Lịch sử ra đời 7

1.1.2 Phân loại 7

1.1.3 Đánh giá tác dụng 8

1.2 Giới thiệu Cloxacilin 8

1.2.1 Cấu tạo phân tử và tính chất 8

1.2.2 Đặc điểm và tác dụng 9

1.2.3 Điều chế chung 10

1.2.4 Giới hạn cho phép của Cloxacilin trong thực phẩm 11

1.2.5 Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay 11

1.3 Các phương pháp phân tích Cloxacilin 14

1.3.1 Phương pháp quang học 14

1.3.2 Phương pháp điện hóa 15

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) 16

1.3.4 Sắc ký bản mỏng (TLC) 18

1.3.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 19

1.3.6 Phương pháp phân tích vi sinh (ELISA) 22

1.3.7 Phương pháp phân tích dòng chảy (FIA) 22

1.3.8 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử 23

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 26

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu 26

2.1.2 Phương pháp áp dụng 26

2.1.3 Nội dung ngiên cứu 27

2.2 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất 28

2.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ 28

2.2.2 Hoá chất 28

CHƯƠNG 3 - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Khảo sát điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa của Ag 30

3.1.1 Khảo sát chọn vạch phổ hấp thụ 30

3.1.2 Khảo sát khe đo 31

3.1.3 Khảo sát cường độ dòng đèn catot rỗng 32

3.1.4 Khảo sát thành phần hỗn hợp khí cháy 33

3.1.5 Khảo sát tốc độ dẫn mẫu 34

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới phép đo phổ F – AAS của Ag 35

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của các loại axit và nồng độ axit 35

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng thành phần nền của mẫu 36

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của các cation 39

3.3 Xây dựng đường chuẩn và đánh giá phép đo F – AAS của Ag 47

3.3.1 Khảo sát xác định khoảng nồng độ tuyến tính và xây dựng đường chuẩn 47

3.3.2 Kiểm tra hằng số trong phương trình hồi quy 50

3.3.3 Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)51 3.3.4 Tính nồng độ chất phân tích dựa trên dường chuẩn 52

3.4 Đánh giá sai số và độ lặp lại của phương pháp đo Ag 53

3.6 Khảo sát các điều kiện phân huỷ Cloxacilin 55

3.6.1 Ảnh hưởng của môi trường KOH đến hiệu suất phân huỷ Cloxacilin giải phóng clo 56

3.6.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất 57

3.6.3 Ảnh hưởng của thời gian phân huỷ Cloxacilin đến hiệu suất 58

3.6.4 Ảnh hưởng của thời gian đến kết tủa AgCl 59

3.7 Giới hạn phát hiện 60

3.8 Xác định Cloxacilin trong mẫu thực 61

3.8.1 Lấy mẫu 61

3.8.2 Xử lý mẫu 62

3.8.3 Chuẩn bị mẫu và phân tích mẫu 63

3.8.4 Xác định độ thu hồi 65

3.9 Kết quả phân tích một số mẫu thực 66

KẾT LUẬN 68

BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử)

(Độ hấp thụ quang của Ag)

(Điện di mao quản vùng)

(Độ lệch chuẩn tương đối)

MỞ ĐẦU

Từ lâu việc sử dụng rộng rãi các kháng sinh bổ sung vào thức ăn gia súc cho thấy chúng không những được dùng để chống nấm mốc mà còn có tác dụng kích thích tăng trưởng, tăng cường hiệu quả sử dụng thức ăn, giảm tỉ lệ chết và còi cọc, tăng khả năng sinh sản Tuy nhiên, sử dụng thức ăn có bổ sung kháng sinh trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh trong sản phẩm, lượng kháng sinh tồn dư này có thể gây dị ứng, gây bệnh cho con người khi sử dụng sản phẩm đó Đồng thời bổ sung kháng sinh vào thức ăn gia súc sẽ gây hiện tượng nhờn thuốc phát triển các loại vi khuẩn độc hại kháng thuốc

Ở Việt Nam, theo nghiên cứu của một số tác giả, kháng sinh được sử dụng tràn lan trong thức ăn cho lợn, gia cầm và tình trạng tồn dư kháng sinh trong thịt

là phổ biến Các nghiên cứu đều cho rằng hầu hết các cơ sở chăn nuôi đều sử dụng kháng sinh không hợp lí (không xét nghiệm kháng sinh đồ, sử dụng theo kinh nghệm không đúng liều lượng), một số cơ sở chăn nuôi không dùng thuốc đúng quy định, bán chạy khi sử dụng thuốc không hiệu quả Từ đó dẫn đến tồn

dư kháng sinh trong thực phẩm cao gấp hàng chục cho đến hàng nghìn lần so với tiêu chuẩn quốc tế(CODEX)

Chính vì vậy, kháng sinh là một trong những đối tượng cần phải kiểm soát

dư lượng trong thực phẩm bởi những độc tính, những tác dụng phụ có thể gây ra cho con người khi sử dụng thực phẩm có tồn dư lượng kháng sinh

Việc nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tích mới để xác định dư lượng kháng sinh trong thực phẩm là yêu cầu cần thiết

Trên thế giới, phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) đã được ứng dụng rất phổ biến Phương pháp này có nhiều ưu điểm: độ nhạy và độ

chọn lọc cao, có thể xác định nhiều ion trong cùng một dung dịch, cho phép phân tích nhanh hàng loạt với độ chính xác và lặp lại cao, các thao tác tiến hành đơn giản và thuận tiện, có thể tự động hoá quá trình phân tích Ở nước ta phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử đã là một trong các phương pháp tiêu chuẩn để phân tích lượng vết các kim loại trong nhiều đối tượng khác nhau như: đất, nước, không khí, thực phẩm,…Ngày nay bằng cách gián tiếp người ta đã xác định hàng trăm chất hữu cơ và các phi kim với độ nhạy, độ chính xác cao Với các kết quả đó chúng tôi nhận thấy phương pháp AAS là một phương pháp thích hợp để xác định gián tiếp Cloxacilin trong thực phẩm

Vì vậy trong bản luận văn này chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm điều kiện phù hợp để xây dựng quy trình xác định Cloxacilin trong thực phẩm Từ kết quả thực nghiệm xây dựng một quy trình xác định gián tiếp Cloxacilin bằng phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS)

CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung chất kháng sinh (1,2,26)

1.1.1 Lịch sử ra đời

Năm 1929, Alexander Fleming phát hiện ra khả năng kháng khuẩn của

nấm Penicillium notatum, mở đầu cho nghiên cứu và sử dụng kháng sinh, và sau

đó là hàng loạt những nghiên cứu, sản xuất và sử dụng kháng sinh phát triển mạnh do tác dụng hơn hẳn trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn so với các thuốc kháng sinh khác

Giới y học định nghĩa: Kháng sinh là những chất tạo thành do chuyển hoá

sinh học, có tác dụng ngăn cản sự tồn tại hoặc phát triển của vi khuẩn ở nồng độ thấp, được sản xuất bằng sinh tổng hợp hoặc tổng hợp theo mẫu các kháng sinh

1.1.3 Đánh giá tác dụng

Theo đơn vị tác dụng (IU): Thường dùng cho các sản phẩm kháng sinh

thiên nhiên, không nguyên chất

Theo khối lượng chất chuẩn (g, mg,…) : Thường dùng cho các chế phẩm

kháng sinh bán tổng hợp

1.2 Giới thiệu Cloxacilin

Cloxacilin là một thành viên trong nhóm kháng sinh penicillin thuộc họ lactamase

β-1.2.1 Cấu tạo phân tử và tính chất

a Cấu tạo phân tử

N O

S COONH

N O

CH3

CH3

COOH Cl

Hình 1.1 Cấu tạo phân tử cloxacillin

b Tính chất vật lý

Thuốc ở dạng bột kết tinh trắng hoặc hầu như trắng, hơi có mùi, vị đắng

dễ hút ẩm Dễ tan trong nước và methanol, tan trong etanol 96%, thực tế không tan trong ethylacetat

Có hoạt phổ hẹp, chủ yếu trên vi khuẩn gram(+) Phổ IR được dùng phổ biến để định tính phổ Hấp thụ quang UV có cực đại hấp thụ chủ yếu do nhân phenyl

Cloxacilin kém bền với ánh sáng Vì vậy ta phải bảo quản chúng trong lọ kín, tối tránh ánh sáng trực tiếp

Ngăn cản xây dựng và giảm độ bền của màng tế bào vi khuẩn nên chủ yếu kìm hãm sự tồn tại và phát triển của vi khuẩn

Kháng thuốc:

Thuốc đã bị nhiều loại vi khuẩn kháng lại do nó được sử dụng rộng rãi trong điều trị cũng như làm thức ăn bổ sung như: vi khuẩn đường ruột, nhiều chủng tụ cầu, liên cầu, phế cầu

Độc tính:

Kháng sinh Cloxacilin có độc tính thấp, nhưng cũng dễ gây dị ứng thuốc:

dị ứng, mày đay, vàng da, gây độc với thận, rối loạn tiêu hóa…nguy hiểm nhất là sốc phản vệ

Thuốc không dùng cho trẻ sơ sinh và bà mẹ trong thời kỳ cho con bú Chống chỉ định dị ứng với thành phần của thuốc

Ngoài ra Cloxacilin còn có tác dụng phụ là làm chuyển màu xỉn men răng, giảm liên kết răng lợi, giòn xương và cản trở sự phát triển xương, răng ở trẻ em trong thời kỳ phát trển (dưới 8 tuổi)

Cloxacilin được dùng rất phổ biến

1.2.3 Điều chế chung

Sinh tổng hợp:

Là phương pháp chủ yếu nuôi cấy chủng nấm Penicillium nonatum hoặc

Penicillium chrysogennum trong môi trường và điều kiện thích hợp Chiết xuất

dạng kết tinh và muối natri hoặc kali Để cho hiệu suất cao thường gây đột biến bằng mù tạt, tia X hoặc tia UV, rồi chọn lọc lấy chủng nấm tốt theo ý muốn, đồng thời thêm vào môi trường nuôi cấy các tiền chất thích hợp để định hướng cho quá trình sinh tổng hợp Ví dụ khi sản xuất penicillin G, tiền chất thêm vào

là acid phenylacetic Tuy nhiên không phải tiền chất nào cũng định hướng được quá trình lên men Trong môi trường nuôi cấy có tạo ra các acid amin → peptid

→ polypeptide Penicillin tạo thành từ một tripeptid, sau đó acyl hoá bởi men

Bán tổng hợp:

Các penicillin bán tổng hợp bằng cách chế tạo acid 6-amino penicillanic

Nuôi cấy nấm penicillium không thêm tiền chất, Khi đó môi trường dồi dào A6AP, chiết lấy trực tiếp

acylase thích hợp rồi chiết lấy A6AP Acyl hoá A6AP với clorid acid trong môi trường acetone, có mặt triethylamin để hấp thu HCl giải phóng ra trong phản ứng được penicillin khác

Tổng hợp hoá học:

Chưa được ứng dụng rộng rãi

1.2.4 Giới hạn cho phép của Cloxacilin trong thực phẩm

Theo công văn số: 571 QLCL-CL1 ngày 14/04/2011 [4] của Cục quản lí chất lượng Nông lâm sản và Thuỷ sản cho phép mức dư lượng thuốc thú y tối đa trong thực phẩm có nguồn gốc động vật để giết thịt bao gồm cả gia cầm và cá nuôi ao, nuôi lồng như sau:

Bảng 1.1 Hàm lượng tối đa cho phép Cloxacilin trong thực phẩm [4]

Như trên cho thấy, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các

cơ chế khác nhau đối với các vi trùng khác nhau Kháng sinh chỉ có tác dụng với

các bệnh do vi trùng (bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus) Để điều trị bệnh nhiễm trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp Vì thiếu hiểu biết và vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển, người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và không đúng cách

Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R Gonzales [5,27], 3/4 số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi 60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không điều trị được bằng kháng sinh Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin Theo báo cáo của A.W McCormick [13] năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa kỳ, tác giả dự tính đến năm

2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin Tỉ lệ vi trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao

Các vi trùng kháng thuốc không khu trú ở một địa phương nào vì với phương tiện giao thông mau lẹ, vi trùng có thể di chuyển đến khắp nơi trên thế giới trong vòng 24 giờ D.P Raymond [19] mỗi năm ở Hoa kỳ có 2 triệu người

bị nhiễm trùng vì lây lan trong bệnh viện, hơn một nửa số này là do vi trùng kháng thuốc, gây tử vong cho 70 ngàn người và làm tốn của ngân sách từ 5 đến

10 tỉ đô-la

Tại Việt Nam, theo báo cáo của Nguyễn Kim Phượng và J Chalker [10], năm 1997 tại 23 trạm y tế ở Hải phòng, 69% bệnh nhân được cho kháng sinh, 71% bệnh nhân không dùng kháng sinh đúng liều lượng và đúng thời gian (dưới

Theo [10] qua thống kê tại khoa Dị ứng - Miễn dịch lâm sàng Bệnh viện Bạch Mai cho thấy, hơn 70% bệnh nhân dị ứng do dùng kháng sinh, trong đó có không ít trẻ em Sốc phản vệ do dùng kháng sinh là tai biến nghiêm trọng nhất,

dễ gây tử vong Nhiều trường hợp dị ứng thuốc gây giảm hồng cầu, bạch cầu, thiếu máu huyết tán, xuất huyết giảm tiểu cầu, tổn thương tế bào gan Phó giám đốc Bệnh viện Nhi Trung ương Nguyễn Văn Lộc thừa nhận, tiền mua kháng sinh đang chiếm tới 60% tổng kinh phí mua thuốc của bệnh viện Nhiều loại kháng sinh gần như đã bị kháng hoàn toàn Đối với vi khuẩn E.coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm phổi, nhiễm trùng huyết), tỉ lệ kháng thuốc ở Ampiciline là 88%, Amoxiciline là 38,9% Đối với vi khuẩn Klebsiella (gây bệnh nhiễm trùng huyết

và viêm phổi), tỉ lệ kháng thuốc của Ampiciline gần 97% và Amoxiciline là 42%

Các nhà chuyên môn đã báo động về hậu quả nguy hiểm của sự lạm dụng kháng sinh từ nhiều chục năm nay Năm 1981, sau hội nghị ở Santa Domingo, các nhà chuyên môn đã thành lập “Liên Hiệp vì sự Sử Dụng Kháng Sinh Hợp Lý” (Alliance for the Prudent use of Antibiotics) có thành viên thuộc 93 quốc gia nhằm chống lại sự lan tràn của các bệnh do vi trùng kháng thuốc tại các nước đang phát triển

Năm 2001, Tổ Chức Y Tế Thế Giới đã đề ra “Kế hoạch toàn cầu để kiểm soát sự đề kháng Kháng sinh” Kế hoạch đề cập đến mọi hoạt động y tế của tất cả các quốc gia đã phát triển cũng như đang phát triển: Phòng thí nghiệm phải tăng cường khả năng chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng, giúp chẩn đoán nhanh chóng

và chính xác, đo lường độ nhạy của kháng sinh, đo nồng độ kháng sinh trong máu Ngành dược cần cung cấp đầy đủ thuốc thiết yếu, ngăn ngừa sự lưu hành của các thuốc giả, 5% lượng thuốc lưu hành tại các nước đang phát triển là thuốc giả mạo, không đúng phẩm chất, hàm lượng hoặc không có hoạt chất

Nếu ngăn ngừa được sự phát triển của các vi trùng kháng thuốc chúng ta

sẽ bảo vệ được môi trường sống, duy trì được sự hữu hiệu của thuốc kháng sinh, hạn chế được chi phí về y tế và cứu đươc nhiều sinh mạng

1.3 Các phương pháp phân tích Cloxacilin

1.3.1 Phương pháp quang học

Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang… Các phương pháp này đơn giản, dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định β-lactam, đặc biệt trong dược phẩm Tuy nhiên khả năng ứng dụng của phương pháp này bị giới hạn vì trong dược phẩm thường chứa các tá dược có khả năng hấp thụ ánh sáng tại vùng phổ phân tích, gây sự chen lấn phổ

Các penicillin hấp thụ UV nhưng không nhiều cực đại hấp thụ, chúng cũng tạo phức với một số ion kim loại giúp nâng cao độ nhạy của phép đo Trong nhiều trường hợp, các penicillin được thủy phân thành các chất đơn giản hơn để phân tích

Các phương pháp phát quang có thể dùng xác định các kháng sinh lactam với độ nhạy khá cao dựa trên đặc tính tạo phức với ion kim loại hay phản ứng quang hóa của các β-lactam

Theo [21], F Belal và cộng sự xác định AMO và AMP trong thuốc uống

kháng sinh với HCl 1M, NaOH 1M sau đó thêm PdCl2, KCl 2M Kết quả tạo ra phức màu vàng được đo tại bước sóng 335 nm Khoảng tuyến tính từ 8- 40 mg/l

và giới hạn phát hiện của AMO là 0,73 mg/l, AMP là 0,76 mg/l

Wei Liu và cộng sự [28], sử dụng phản ứng quang hóa của β-lactam với hệ luminol-K3Fe(CN)6 kết hợp phương pháp chiết pha rắn mắc trực tiếp đã phân tích một số β-lactam (penicillin, cefradine, cefadroxil, CEP ) trong sữa đạt độ nhạy cao: PEN là 0,5 mg/l, cefradine 0,04 mg/l, cefadroxil là 0,08 mg/l, 0.1 mg/l CEP Kết quả được kiểm chứng lại bằng phương pháp HPLC, detector UV-VIS, nồng độ CEP trong mẫu là 0,1 mg/l

Tuy nhiên, nếu không kết hợp với phương pháp chiết pha rắn mắc nối tiếp, các phương pháp quang học chủ yếu chỉ dùng xác định riêng rẽ từng chất kháng sinh và trong các đối tượng có nhiều yếu tố ảnh hưởng hay chất tương tự chất phân tích, việc xác định sẽ kém chính xác Ngoài ra, trong nhiều trường hợp chất phân tích cần thủy phân mới phát hiện được cũng là sự hạn chế của phương pháp này

1.3.2 Phương pháp điện hóa

Nguyên tắc của phương pháp này là đo thế cân bằng của các điện cực nghiên cứu để xác định nồng độ chất cần phân tích hoặc theo dõi sự biến thiên nồng độ chất trong phản ứng chuẩn độ của nó

Một số phương pháp điện hóa đã được ứng dụng để phân tích các kháng sinh nhưng không phổ biến nhiều

Theo [18], Daniela P Santos và cộng sự sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0,1M pH=5,2

C.M Couto, J.L.F.C Lima, M Conceicao, B.S.M Montenegro đã xác định Chlortetracyclin bằng việc sử dụng phương pháp điện thế kết hợp với phương pháp dòng chảy, dùng điện cực màng ống kép, màng là tinh thể đồng

giảm nồng độ Cu(II) do tạo phức với Chlortetracyclin [6]

Saad.S.M.Hassan và M.H.Eldesouki đã xác định Chlortetracyclin trong các chế phẩm dược có sử dụng điện cực chọn lọc ion cadmi Phương pháp dựa trên phản ứng khử nhóm nitro bằng cadmi kim loại, phản ứng xảy ra hoàn toàn

và định lượng trong môi trường axit HCl, ion cadmi giải phóng ra và được định lượng bằng cách chuẩn độ với EDTA ở pH = 10 Hiệu suất thu hồi của phương

1.3.3 Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE)

Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định các kháng sinh β-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau

L Nozal, L Arce1,A.R´ıos, M Valcárcel [25] sử dụng phương pháp điện

di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) với thành phần dung dịch đệm điện di gồm 40 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH 8,5 Tiến hành phân tích tại thế

tách 6 kháng sinh gồm: AMO, AMP, PENG, OXA, penicillin V và CLO ứng dụng phân tích trong mẫu nước thải của trang trại chăn nuôi Giới hạn phát hiện

từ 0,14 đến 0,27 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 0,25 đến 0,86%, diện tích pic 1,3 đến 4,15% Độ thu hồi trên 96%

Biyang Deng và cộng sự [16] đã sử dụng phương pháp điện di với detector điện quang hóa xác định AMO trong nước tiểu người với giới hạn phát hiện thấp 0,31 μg/l, khoảng tuyến tính rộng 1 μg/l – 8 mg/l cùng độ thu hồi cao 95,77%, độ lệch chuẩn tương đối không lớn hơn 2,2% và thời gian phân tích ngắn 6 phút/ mẫu

Attila Gaspar và cộng sự [14] đã tách và xác định thành công 14 kháng sinh họ cephalosporin bằng phương pháp điện di mao quản vùng (capillary zone electrophoresis – CZE) Quá trình tách dùng đệm photphat 25 mM có pH = 6,8 Phương pháp này tách được 14 kháng sinh trong vòng 20 phút, giới hạn phát hiện 14 kháng sinh cefalosporin C, cefoxitin, cefazolin, cefadroxil, cefoperazon, cefamandol, cefaclor, CEP, CEF, ceftibuten, cefuroxim, ceftazidim, cefotaxim, ceftriaxon với giới hạn phát hiện 0,42 – 1,62 mg/l Trong đó CEP và CEF có giới hạn phát hiện tương ứng 1,62 và 0,89 mg/l; khoảng tuyến tính 5 – 200 mg/l Mục đích của phương pháp được ứng dụng để nghiên cứu độ bền của kháng sinh họ

C, +40C và -180C) Kết quả cho thấy các kháng sinh giảm nồng độ không lớn hơn 20% tại nhiệt độ phòng sau khi pha loãng

Theo [12], Chen và Gu đã tách đồng thời oxytetracylin, tetracylin, chlortetracylin trong sữa, huyết thanh và nước tiểu bằng CE Các mẫu được deprotein bằng đệm succinat và các tetracylin ở dạng huyền phù được làm sạch bằng cột sắc ký ái lực chelat kim loại Các muối được giải hấp từ cột được loại

bỏ bằng trimetylsilan C18 Độ thu hồi của các kháng sinh tetracylin từ các mẫu

M.I.Bailon-Perez và cộng sự [25] sử dụng phương pháp CZE và detector

UV – DAD, pha động dùng hệ đệm tris 175 mM pH 8 và 20% (v/v) ethanol,

dùng kĩ thuật chiết pha rắn làm sạch và làm giàu mẫu ứng dụng phân tích đồng thời AMP, AMO, dicloxacillin, CLO, OXA, PEN, nafcillin trong nền mẫu nước ( nước sông, nước thải…) Giới hạn phát hiện tương ứng 0,8; 0,8; 0,25; 0,30; 0,30; 0,9; 0,08 μg/l cùng độ thu hồi đạt 94 – 99 % với độ lệch chuẩn tương đối thấp hơn 10%

Phương pháp MEKC cũng được M.I Bail´on P´erez, L Cuadros Rodr´ ıguez, C Cruces-Blanco [25] xác định 9 loại kháng sinh gồm CLO, dicloxacillin, OXA, PENG, penicillinV, AMP, nafcillin, piperacillin, AMO trong mẫu dược phẩm Các điều kiện tối ưu được chọn là 26 mM đệm Borat, 100 mM SDS pH = 8,5 làm chất nền điện di và thế điện di 25 kV Giới hạn phát hiện LOD 0,35 đến 1,42 mg/l, giới hạn định lượng 2,73 đến 5,74 mg/l, độ lệch chuẩn tương đối thời gian lưu từ 1,5 đến 1,7% Độ thu hồi từ 91 – 95,6%

1.3.4 Sắc ký bản mỏng (TLC)

Sắc ký bản mỏng là khái niệm đưa ra phương pháp sử dụng lớp mỏng pha tĩnh phủ trên một bản mỏng thuỷ tinh hay nhựa plastic Pha động là các dung môi khác nhau có thể là phân cực hoặc không phân cực hoặc dung dịch đệm

Sau khi phủ lớp pha tĩnh lên bản mỏng, nạp chất phân tích vào một phía sau của bản mỏng rồi cho bản mỏng tiếp xúc với pha động ở phía mẫu (nên thực hiện trong hệ kín, không khí bão hoà pha động) Sau một thời gian nhất định, lấy bản mỏng ra cho hiện chất phân tích Tiến hành định tính và định lượng chất phân tích

Trong sắc ký bản mỏng pha tĩnh rất đa dạng: chất hấp phụ, trao đổi ion, chất rây phân tử Do vậy sắc ký bản mỏng cũng có đầy đủ bốn cơ chế tách là hấp phụ, trao đổi ion, phân bố hoặc rây phân tử tuỳ thuộc vào pha tĩnh sử dụng.[6,12]

Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để kiểm tra đánh giá sơ bộ các chất phân tích tỏ ra tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu cùng một lúc song song rất tiện lợi Khi TLC được trang bị phần phát hiện là một máy đo quang có thể phân tích định tính và định lượng Phương pháp này được sử dụng để phân tích các đối tượng khác nhau như: phân tích các cation kim loại nặng, phân tích glucoza, tách các amin…trong công nghiệp, lâm sàng, dược phẩm

1.3.5 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là lĩnh vực hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất thiên nhiên, phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất

Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh β-lactam bằng phương pháp HPLC

Theo [28], Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa Điều kiện

sữa 2-10 μg/kg, trong thịt 25-100 μg/kg

J.M Cha và cộng sự [26] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích

(2,1 mm×50 mm, 2,5 μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C = Acetonitril (ACN); chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phút A/B/C=50:40:10, 20 phút A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0,25 ml/phút;

nhiệt độ cột 450C; thời gian 20 phút Áp dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin có giới hạn phát hiện của phương pháp là 8 – 10 ng/l với nước

bề mặt, 13 – 18 ng/l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng/l với nước thải sau xử

Tác giả Chu Đình Bính trong luận văn thạc sĩ của mình đã ứng dụng kĩ thuật HPLC để tách và xác định đồng thời Chloramphenicol, Dexamethason acetate và Hydrocortison acetate trong mẫu dược phẩm Cột tách sử dụng chất

Các chất phát hiện tại bước sóng 248nm Kết quả thu được có độ lặp lại, độ chính xác, độ thu hồi tốt, và không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố tá dược trong mẫu [3]

Trong [23, 24], Boison J.O và cộng sự sử dụng cột Spherisorb ODS2

0,1M pH 6,5; tốc độ pha động 1ml/phút, detector UV 325nm, phân tích đồng thời AMO, AMP, PEN, CLO trong sữa và thịt bò đạt giới hạn phát hiện 2-

Ngoài ra, còn dùng các detector khác như detector điện hóa, detector độ dẫn… để phân tích các β-lactam

Trong [17], D.Hurtaud và cộng sự sử dụng etylaxetat để chiết tách CLO, OXA, dicloxacillin từ thịt bò đạt hiệu suất thu hồi tương ứng 88%, 94%, 91% Còn trong [28], WJ Blanchflower và cộng sự dùng diclometan và hexan để tách penịillin V, PEN, oxacillin, CLO, dicloxacillin trong thận, thịt và sữa, hiệu suất đạt 89-117%

ion dựa trên đặc tính kém phân cực và chứa đồng thời nhóm axit, amin hữu cơ

rửa giải là MeOH để tách PEN, AMP, CLO, dicloxacillin, nafcillin từ sữa đạt hiệu suất thu hồi 83-89%

Còn trong [22] sử dụng cột Oasis HLB (60mg, 3ml) để tách và làm giàu AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirin trong mẫu nước môi trường đạt hiệu suất thu hồi 77,1-95,9%

Trong [20] sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion) để tách AMO, AMP, PEN, penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillintrong nước thải cho hiệu suất thu hồi 76-100%

Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm, mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi qui trình xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu và có nhiều chất nhiễu cần loại trừ Do đó việc kết hợp phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu

đạt độ tối ưu cao trong việc phân tích -lactam do có độ nhạy, độ chính xác và

độ lặp lại cao

1.3.6 Phương pháp phân tích vi sinh (ELISA)

Phương pháp này dựa vào khả năng phản ứng của chất phân tích trong điều kiện phản ứng xảy ra được xúc tác bằng các loại enzyme đặc hiệu trong một môi trường nuôi cấy thích hợp Phản ứng thường tạo thành các hợp chất màu hay các hợp chất có khả năng phát huỳnh quang

Phương pháp này có ưu điểm là phân tích nhanh, độ nhạy cao nhưng độ chính xác và độ lập không cao do bản thân phương pháp bị ảnh hưởng của các điều kiện môi trường tiến hành phản ứng và các phản ứng cạnh tranh, độ chọn lọc cũng kém

D S Aga, R Goldfish và P Kuksrestha đã sử dụng phương pháp để xác định Chlortetracyclin trong phân súc vật, theo dõi sự thay đổi của kháng sinh trong đất được bón loại phân này Kháng sinh được đo độ hấp thụ ở bước sóng

450 nm Giới hạn phát hiện là 0,5ppm và khoảng xác định là 0,5ppm đến 200ppm [6]

1.3.7 Phương pháp phân tích dòng chảy (FIA)

Dựa trên kĩ thuật bơm trực tiếp một thể tích mẫu xác định dung dịch mẫu phân tích vào một dòng chất mang có thành phần thích hợp (thường chứa thuốc thử phân tích), chảy liên tục với tốc độ không đổi Chất phân tích trong dung dịch mẫu tạo với thuốc thử trong dòng chất mang một vùng nhỏ chứa sản phẩm tạo ra, có thể phát hiện theo một tính chất hoá lí nhất định, phù hợp nhất và được dòng chất mang đưa đến bình dòng chảy của detector Detector đo tín hiệu và được máy ghi dưới dạng pic Nếu trong điều kiện thuận lợi thích hợp thì chiều

cao hoặc diện tích pic tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích Quá trình này thường được thực hiện một cách tự động với tốc độ phân tích nhanh

Kĩ thuật FIA được phát triển và sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực kiểm tra sản xuất và kiểm tra môi trường bởi các tính ưu việt của nó như: Kĩ thuật phân tích nhanh, có độ nhạy, độ lập lại và độ chính xác tương đối cao, tốc

độ phân tích mẫu lớn 40 – 200 mẫu/giờ Lượng mẫu tiêu hao ít, thích hợp cho phân tích hàng loạt mẫu cùng đối tượng

Tác giả Thiraporn Caaroenraks, Sanit Palaham, Kate Grudpan, Weena Siangproh và Orawon Chailapakul đã xác định Chlotetracyclin trong thuốc với kĩ

1.3.8 Phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử

Khi ta chiếu đám hơi nguyên tử tự do một chùm sáng đơn sắc có năng lượng phù hợp, có bước sóng trùng với vạch phổ phát xạ đặc trưng của nguyên

tố cần phân tích, chúng sẽ hấp thụ tia sáng đó và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử

Cơ sở phân tích định lượng theo AAS là dựa vào mối quan hệ giữa cường

độ vạch phổ hấp thụ với nồng độ nguyên tố cần phân tích theo phương trình:

Ak = k b

C ( 0< b 1) Trong đó:

k: hệ số thực nghiệm C: nồng độ nguyên tố b: hằng số bản chất

Sự phụ thuộc tuyến tính giữa Ak và C nằm trong khoảng nhất định Đo

chuẩn để định lượng nguyên tố cần phân tích

Ưu điểm của phương pháp:

- Có độ nhạy và độ chọn lọc tương đối cao Có thể xác định gần 60

10  10 %

- Có độ nhạy cao nên trong nhiều phương pháp không cần làm giàu nguyên tố cần xác định trước khi phân tích, tốn ít nguyên liệu mẫu, tốn ít thời gian, thích hợp để xác định lượng nhỏ và vết

Phép đo phổ hấp thụ AAS có thể phân tích được lượng vết của hầu hất các kim loại và cả những hợp chất hữư cơ hay anion không có phổ hấp thụ nguyên

tử Nó được ứng dụng rộng rãi trong các ngành: địa chất, công nghiệp hoá học, hoá dầu, y học, sinh học, công nghiệp dược phẩm, nông nghiệp và thực phẩm,…với độ chính xác và độ nhạy cao, đơn giản, thiết bị không quá cồng kềnh

và thích hơp cho phân tích hàng loạt

Tuỳ thuộc vào kỹ thuật nguyên tử hoá mẫu người ta phân biệt phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa (F-AAS) có độ nhạy đến 0,1ppm và phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa (GF-AAS) độ nhạy cỡ ppb

Saad.S.M.Hassan cùng các cộng sự xác định gián tiếp Chloramphenicol trong một số bào chế thuốc mà không cần tách trước Chloramphenicol ra khỏi mẫu Phương pháp này dựa trên phản ứng khử định lượng Chloramphenicol bằng cadmi kim loại trong môi trường axit HCl 0,05M, ion Cd2+

giải phóng ra sau phản ứng được định lượng bằng phép đo phổ AAS ở bước sóng 228,8 nm Hàm lượng Chloramphenicol xác định được là dưới 3 mg, độ thu hồi là 99,5% và độ

Thạc sỹ Phạm Thị Quỳnh Lương [11] đã ứng dụng kĩ thuật AAS để định lượng gián tiếp Chloramphenicol trong thuốc viên, thuốc nhỏ mắt và kem bôi da,

môi trường axit theo phương trình:

R-NO2 + 6HCl + 2Cd  R-NH2 + 3CdCl2 + H2O (a)

sinh ra thì sẽ tính được hàm lượng Chloramphenicol theo phản ứng (a) Điều kiện phản ứng là nồng độ axit 0,05M, nhiệt độ tiến hành phản ứng là 901000C và thời giam để phản ứng xảy ra

CHƯƠNG 2 - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu

Kháng sinh sử dụng trong thức ăn, điều trị bệnh gia súc, gia cầm và những tồn dư của nó trong thực phẩm chăn nuôi sẽ làm tăng nguy cơ nhiễm bệnh của con người khi sử dụng thực phẩm này Xa hơn nữa sẽ tạo sự kháng thuốc cho các dòng vi khuẩn gây bệnh ở động vật và chúng có khả năng lan truyền sang cho con người Kết quả là khi con người bị nhiễm bệnh sẽ làm cho khả năng chữa trị khó, lâu dài và phức tạp hơn

Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất độc hại là một vấn

đề cấp thiết đang được quan tâm Trong đó chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và mẫu sinh học là một mảng đề tài rất thực tế và quan trọng Như chúng tôi đã đề cập trong bản luận văn này, vấn đề lạm dụng không đúng hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khoẻ con người

Vì vậy đối tượng nghiên cứu của chúng tôi là kháng sinh Cloxacilin trong thực phẩm có nguồn gốc động vật

Mục đích nghiên cứu của chúng tôi là tiến hành nghiên cứu chọn các điều kiện phù hợp để xây dựng được một quy trình xác định Cloxacilin trong thực phẩm bằng phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (F-AAS) nhằm góp phần vào việc kiểm tra chất lượng thực phẩm có nguồn gốc động vật

2.1.2 Phương pháp áp dụng

Phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) là phương pháp xác định lượng vết của hầu hết các kim loại với độ chính xác cao, kết quả phân tích ổn

xác định gián tiếp thông qua một kim loại có phổ hấp thụ nguyên tử nhạy nhờ một phản ứng hoá học trung gian có tính chất định lượng như: Phản ứng tạo kết tủa, tạo phức, đẩy kim loại hay hoà tan kim loại…giữa kim loại đo phổ và chất cần phân tích Sử dụng phương pháp AAS có thể tiến hành phân tích hàng loạt,

có thể xác định đồng thời nhiều mẫu

Do Cloxacilin không có phổ hấp thụ nguyên tử, chúng tôi tiến hành xác định gián tiếp hàm lượng của nó thông qua phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của

Ag dư, sau khi đã li tâm tách bỏ kết tủa AgCl được tạo thành từ phản ứng có tính

Cloxacilin, vì một phân tử Cloxacilin có một nguyên tử Clo, theo phản ứng:

Cloxacilin Cl- + CO2 + H2O

-Cl + Ag+  AgCl Với điều kiện trang thiết bị có sẵn và những ưu điểm của phương pháp đo phổ hấp thụ nguyên tử AAS nêu trên, chúng tôi đã sử dụng phương pháp này để xây dựng một quy trình xác định Cloxacilin gián tiếp thông qua việc đo phổ F-AAS của Ag

2.1.3 Nội dung nghiên cứu

- Tối ưu hoá các thông số máy cho phép đo phổ hấp thụ nguyên tử của Ag

- Tối ưu hoá các điều kiện nguyên tử hoá mẫu

- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến phép xác định Ag bằng phương pháp F-AAS như: loại axit, nồng độ axit, chất nền, các cation, các anion khác có trong mẫu

- Khảo sát khoảng tuyến tính khi xác định Cloxacilin theo lượng dư Ag

- Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng

- Đáng giá sai số và độ lặp lại của phương pháp

- Tối ưu hoá các điều kiện phân huỷ mẫu lấy Cl trong Cloxacilin

- Xây dựng quy trình phân tích

- Ứng dụng quy trình nghiên cứu để xác định Cloxacilin trong một số mẫu thực phẩm

2.2 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất

2.2.1 Trang thiết bị và dụng cụ

- Máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử NovAA 400 của hãng Analytik Jena (CHLB Đức) – Phòng máy bộ môn Hóa học phân tích – Khoa Hóa học – ĐHKHTN – ĐHQGHN

- Cân phân tích, cân kỹ thuật và một số thiết bị, dụng cụ khác

- Máy ly tâm, bếp đun cách thuỷ,…

2.2.2 Hoá chất

- Metanol tinh khiết dung cho phân tích

- Chất chuẩn Cloxacilin bột tinh khiết

- Dung dịch đệm McIlvaine-EDTA, axit oxalic

* Dung dịch đệm:

mức 1 lít và hòa tan bằng nước cất rồi định mức tới vạch, lắc đều hỗn hợp Cân

21 gam axit xitric monohydrat vào bình định mức 1 lít khác, hòa tan bằng nước cất và định mức tới vạch, lắc kỹ Lấy 1 lit axít xitric ở trên trộn với 625ml

HCl 0,1M hoặc NaOH 0,1M Dung dịch này sử dụng trong một tuần

1,625 lít đệm McIlvaine và trộn hỗn hợp tới khi tan hết Dung dịch này sử dụng trong một tuần

Axit oxalic trong metanol: Hòa tan 1,26 gam axit oxalic trong bình định mức 1 lít, pha loãng dung dịch tới vạch định mức bằng metanol và trộn đều hỗn hợp Dung dịch này được sử dụng trong một ngày

CHƯƠNG 3 - THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát điều kiện đo phổ hấp thụ nguyên tử ngọn lửa của Ag

Để quá trình phân tích đạt kết quả tốt, thì việc nghiên cứu chọn các thông

số đo phù hợp với phép phân tích định lượng một chất là một công việc hết sức cần thiết và quan trọng trong kĩ thuật AAS

Để tối ưu hoá các thông số máy tôi chọn các dung dịch sau để khảo sát:

Giá trị đưa ra ở mỗi bảng là kết quả ba lần sau khi đã trừ blank (mẫu trắng)

3.1.1 Khảo sát chọn vạch phổ hấp thụ

Mỗi loại nguyên tử của một nguyên tố hóa học chỉ có thể hấp thụ những bức xạ có bước sóng mà chính nó có thể phát ra trong quá trình phát xạ Nhưng thực tế không phải mỗi loại nguyên tử có thể hấp thụ tất cả các bức xạ mà nó phát ra, quá trình hấp thụ chỉ tốt và nhạy chủ yếu đối với các vạch đặc trưng hay vạch cộng hưởng Đối với một nguyên tố vạch phổ nào có khả năng hấp thụ càng mạnh thì phép đo vạch đó có độ nhạy càng cao Như vậy đối với một nguyên tố các vạch phổ khác nhau sẽ có độ nhạy khác nhau, đồng thời với mỗi vạch này có thể có rất nhiều các nguyên tố khác trong mẫu có những vạch phổ gần với vạch phổ này, nó có thể chen lấn hay gây nhiễu tới vạch phổ của nguyên tố phân tích làm cho việc đo cường độ vạch phân tích là rất khó khăn và thiếu chính xác Vì vậy ta khảo sát tìm ra vạch phổ có độ nhạy cao và hạn chế được ảnh hưởng của các nguyên tố có vạch phổ lân cận

Theo W.J.Price các vạch phổ đặc trưng của Ag:

Ag: 328,1 nm và 338,3 nm

Kết quả khảo sát chọn vạch phổ của dung dịch Ag 3ppm trong HNO3 2%

cho phép đo phổ của Ag vì tại vạch phổ này, phép đo cho độ nhạy và độ ổn định tốt nhất

3.1.2 Khảo sát khe đo

Theo nguyên tắc hoạt động của hệ thống đơn sắc trong máy quang phổ hấp thụ nguyên tử, chùm tia phát xạ cộng hưởng của nguyên tố cần xác định được phát ra từ đèn catot rỗng sau khi đi qua môi trường hấp thụ sẽ được hướng vào khe đo của máy, được trực chuẩn, được phân ly và sau đó chỉ một vạch phổ cần đo được chọn và hướng vào khe đo để tác dụng vào nhân quang điện để phát hiện và xác định cường độ của vạch phổ Do vậy khe đo của máy phải được chọn chính xác và phù hợp với từng vạch phổ, có độ lặp lại cao trong mỗi phép đo và lấy hết được độ rộng của vạch phổ Chúng tôi đã tiến hành khảo sát sự hấp thụ

quả được chỉ ra ở bảng 3.2:

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ rộng khe đo

Khe đo

(nm)

Abs

RSD (%)

3.1.3 Khảo sát cường độ dòng đèn catot rỗng

Trong phép đo phổ hấp thụ nguyên tử dùng ngọn lửa trực tiếp (F-AAS) thì nguồn phát tia bức xạ đơn sắc của nguyên tố cần xác định thường là đèn catôt rỗng (HCL) Đèn HCL làm việc tại mỗi chế độ dòng nhất định sẽ cho chùm phát

xạ có cường độ nhất định Cường độ làm việc của đèn catot rỗng (HCL) có liên quan chặt chẽ tới cường độ hấp thụ của vạch phổ Dòng điện làm việc đèn HCL của mỗi nguyên tố là rất khác nhau Mỗi đèn HCL đều có dòng giới hạn cực đại (Imax) được ghi trên vỏ đèn Theo lý thuyết và thực nghiệm phân tích phổ hấp

nếu ở điều kiện dòng cực đại thì đèn làm việc không ổn định và rất chóng hỏng, đồng thời phép đo có độ nhạy và độ lặp lại kém

Với đèn HCL của bạc khảo sát tại máy quang phổ hấp thụ nguyên tử

chúng tôi đã tiến hành khảo sát cường độ đèn HCL trong vùng từ 60 ÷ 80% Imax

nồng

Bảng 3.3 Sự phụ thuộc phổ hấp thụ nguyên tử của Ag vào cường độ

Kết quả chỉ ra ở bảng 3.3 cho thấy tại cường độ đèn bằng 10mA với phép

đo Ag cho độ hấp thụ quang lớn và độ ổn định cao Vì vậy chúng tôi chọn cường

độ dòng đèn catốt rỗng bằng 10 mA cho phép đo Ag

3.1.4 Khảo sát thành phần hỗn hợp khí cháy

Trong phép đo F – AAS, nhiệt độ của ngọn lửa là yếu tố quyết định quá trình hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu Nhiệt độ ngọn lửa đèn khí lại phụ thuộc vào bản chất và thành phần của hỗn hợp khí đốt tạo ra ngọn lửa Điều đó có nghĩa là với mỗi một hỗn hợp khí đốt sẽ cho ngọn lửa có nhiệt độ khác nhau Hai loại hỗn hợp khí đã và đang được sử dụng phổ biến trong phép đo F – AAS là hỗn hợp

ngọn lửa của hỗn hợp không khí nén và axetilen là phù hợp nhất Để khảo sát

điều kiện tối ưu hóa ngọn lửa ta sử dụng dung dịch Ag 3 ppm trong HNO3 2%

cho đến khi chọn được tín hiệu đo cao nhất và ổn định nhất Kết quả khảo sát được chỉ ra ở bảng 3.4:

Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ dẫn khí đến độ hấp thụ của Ag

(l/h)

Burner (mm)

được các điều kiện tối ưu nhất Vì vậy ta chọn thông số khảo sát tại tốc độ dẫn khí là 50l/h và tỉ lệ C2H2/KK bằng 0,144

3.1.5 Khảo sát tốc độ dẫn mẫu

Tốc độ dẫn mẫu cũng ảnh hương nhiều đến cường độ vạch phổ cần đo Đối với một hệ thống máy nhất định, tốc độ dẫn mẫu phụ thuộc vào độ nhớt của mỗi loại dung dịch Do đó tôi tiến hành khảo sát tốc độ dẫn mẫu của dung dịch, kết quả thu được ở bảng 3.5:

3.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới phép đo phổ F – AAS của Ag

3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của các loại axit và nồng độ axit

Trong phép đo phổ F – AAS, với mẫu phân tích kim loại nặng thì dung dịch mẫu phải được axit hóa để tránh hiện tượng tạo phức hidroxo, thủy phân của ion kim loại Nhưng nồng độ axit và các loại axit khác nhau trong dung dịch mẫu lại luôn ảnh hưởng đến cường độ vạch phổ của nguyên tố phân tích thông qua tốc độ dẫn mẫu, khả năng hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu

Nói chung, các loại axit dễ bay hơi gây ảnh hưởng nhỏ, các loại axit khó bay hơi và bền nhiệt gây ảnh hưởng lớn hơn Các loại axit làm giảm cường độ vạch phổ hấp thụ của nguyên tố cần phân tích theo thứ tự:

HClO4 < HCl < HNO3 < H3PO4 < HF