Báo cáo thư viện gen và thư viện CDNA

TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DNALấy mẫu vật (nuôi cấy vi sinh vật, nghiền mẫu mô động vật, thực vật ở nhiệt độ thấp).Phá vỡ màng tế bào và màng nhân.Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là protein.(chiết xuất bằng phenol).Cô đặc DNA lại bằng ethanol hay isopropanol lạnh.Rửa lại DNA bằng ethanol lạnh và đem bảo quản DNA trong dung dịch TE (ở nhiệt độ thấp).

THƯ VIỆN BỘ GEN

VÀ

THƯ VIỆN cDNA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MH KỸ THUẬT DI TRUYỀN

GVHD: TS Trần Thị Dung

NỘI DUNG CHÍNH

THƯ VIỆN cDNA THƯ VIỆN

BỘ GEN

THƯ VIỆN BỘ GEN

KHÁI NIỆM

QUÁ TRÌNH THÀNH LẬP

TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH DNA

»Lấy mẫu vật (nuôi cấy vi sinh vật, nghiền mẫu mô động vật, thực vật ở nhiệt độ thấp)

»Phá vỡ màng tế bào và màng nhân

»Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là protein.(chiết xuất bằng phenol)

»Cô đặc DNA lại bằng ethanol hay iso-propanol lạnh

»Rửa lại DNA bằng ethanol lạnh và đem bảo quản DNA trong dung dịch TE (ở nhiệt độ thấp)

PHÂN CẮT DNA BỘ GEN

• Sử dụng enzyme cắt giới hạn RT (Reverse Transcriptase)

• Mỗi loại enzyme cắt tại một vị trí đặc hiệu trên DNA và vector chuyển gen

=> Tạo ra 2 thư viện gen khác nhau khi cắt bằng 2 loại enzyme RT

• Sử dụng enzyme Alkaline phosphatase

• Enzyme được dùng để :

 Loại nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA trước khi đánh dấu phóng xạ

 Loại nhóm 5’ phosphate của DNA hay RNA Không bị nối vòng khi cắt bằng RT

 T4 polinucleotide kinase và alkaline phosphatase thường được sử dụng đồng thời trên vector và đoạn DNA cần gắn xen trong kỉ thuật tạo dòng

TẠO DNA TÁI TỔ HỢP

• Sử dụng enzyme nối Ligase

ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ

ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ

• Loại tế bào chủ

1. E coli

2. Eukaryote

ĐƯA DNA TÁI TỔ HỢP VÀO TẾ BÀO CHỦ

• Phương pháp thực hiện:

– Hóa biến nạp: CaCl2 + sốc nhiệt

– Điện biến nạp: dòng điện cao thế cục bộ

TẠO DÒNG

• Tế bào được nuôi cấy tạo thành những dòng mới chứa DNA tái tổ hợp

• Môi trường nuôi cấy tạo dòng thường là:

– M9 (Thành phần dinh dưỡng xác định)

– LB (Thành phần dinh dưỡng chưa xác định)

• Chuẩn bị cho giai đoạn sàng lọc

SÀNG LỌC THƯ VIỆN ĐỂ NHẬN TRÌNH TỰ ĐÍCH

• Sau khi thư viện gen được tạo ra Các phương pháp thông dụng được sử dụng để nhận dạng:

– Lai DNA với mẫu dò DNA đánh dấu sau đó sàng lọc để chọn dấu mẫu dò bằng phép chụp ảnh phóng xạ

– Sàng lọc để chọn sản phẩm protein bằng phương pháp miễn dịch, thử hoạt tính protein, hoặc thử nghiệm bổ trợ (di truyền) chức năng

THƯ VIỆN cDNA

KHÁI NIỆM

PHƯƠNG PHÁP

ĐÁNH GIÁ

ỨNG DỤNG VÀ THÀNH TỰU

KHÁI NIỆM

DNA bổ trợ (complementary DNA)

DNA tổng hợp từ mRNA với xúc tác của enzyme RT (reverse

transcriptase)

cDNA

KHÁI NIỆM

• Tập hợp các cADN tổng hợp từ các mARN

• Thiết lập trên vector (plasmid hoặc phage lambda)

• Đối tượng áp dụng: eukaryoteThư viện cDNA

(Ngân hàng cDNA)

KHÁI NIỆM

1. Tập hợp các phân đoạn của DNA bộ gen

2. Chứa toàn bộ DNA của sinh vật

3. Tạo DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào vật chủ.

4. Vật chủ: E.coli, Eukaryote

5. Vector: plasmid

1. tập hợp các bản sao cDNA từ tất cả các mARN

2. thiết lập từ một tế bào xác định

3. gen cần nghiên cứu phải biểu hiện thành mARN

4. Vector: phage lambda; plasmid

PHÂN LẬP RNA

– Các RNA khác trôi khỏi cột mRNA được giữ lại.

– Biến tính để thu hồi mRNA

HOẠT ĐỘNG CỦA RT

CẤU TRÚC “KẸP TÓC”

GẮN BẰNG TERMINAL TRANSFERASE

Rnase H

cDNA linker

cDNA adapter

DNA ligase

CÁC VECTOR

• Bacteriophage lambda:

– Dung nạp đoạn gen có kích thước lớn

– Vector lambda mang vùng đệm (suffer) nếu cắt bỏ sẽ không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của phage lambda

– Loại bỏ vùng này và thay bằng đoạn cDNA

– Trong tạo dòng cDNA, thường dùng bacteriophage lambda gt10, gt11, và lambda ZAP

I, II là thế hệ bacteriophage lambda mới

• Plasmid:

– Dung nạp đoạn gen có kích thước dưới 3kb

CÁC VECTOR

XÁC ĐỊNH DÒNG

• Các phương pháp thông dụng được sử dụng để nhận dạng:

- Lai cDNA với mẫu dò DNA đánh dấu sau đó sàng lọc để chọn dấu mẫu dò bằng phép chụp ảnh phóng xạ

- Sàng lọc để chọn sản phẩm protein bằng phương pháp miễn dịch, thử hoạt tính protein, hoặc thử nghiệm bổ trợ (di truyền) chức năng

Phương pháp tương tự như với lập thư viện bộ gen

ĐÁNH GIÁ

• ƯU ĐIỂM

– Các dòng cDNA chứa trình tự liên tục mã hóa của một gen

– Những tế bào chuyên hóa tạo ra một số lớn các protein một loại và mRNA tương ứng của protein giàu đó sẽ dễ tách ra để tạo ngân hàng cDNA Biến nạp cDNA khắc phục được hiện tượng tế bào vi khuẩn không dung nạp gen có cấu trúc mang phần không mã hóa

• KHUYẾT ĐIỂM

– Kỹ thuật tạo cDNA cho ta nhiều gen khác nhau

– Mỗi giai đoạn phát triển khác nhau của cơ thể thì sự phiên mã ngược của hệ gen là khác nhau

=> Thiết lập ngân hàng cDNA chọn lọc gen mong muốn đòi hỏi công phu tỷ mỉ và tốn nhiều thời gian

ĐÁNH GIÁ

ỨNG DỤNG

• Tạo dòng các gen mã hóa cho globin của người, động vật và chim, cho protein thủy phân ở mắt bò, cho ovalbumin, cho fibroin tơ tằm,…